CN107805303A - 具有氧化还原敏感性的靶向聚合物及其载药胶束的制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学医药领域，具体涉及具有氧化还原敏感性的靶向聚合物及其载药胶束的制备方法和用途。本发明提供了一种具有氧化还原敏感性的靶向聚合物，其结构如式Ⅰ所示。本发明还提供了上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物及其载药胶束的制备方法和用途。本发明提供的具有氧化还原敏感性的载带疏水性抗肿瘤小分子药物(Drug)的靶向聚合物的Drug‑R‑PGPM对肿瘤靶向治疗具有很大的应用前景。

Description

具有氧化还原敏感性的靶向聚合物及其载药胶束的制备方法 和用途
技术领域
本发明属于化学医药领域，具体涉及具有氧化还原敏感性的靶向聚合物及其载药胶束的制备方法和用途。
背景技术
随着我们对肿瘤生物学的研究越来越深入，对癌症也有了新的诊断和治疗方法，但癌症仍然是威胁人类生命健康的主要原因之一。这是由于我们无法获得能够选择性地靶向肿瘤细胞，而不会对正常组织产生损害的治疗药物或制剂。目前对于大多数癌症的治疗手段是手术切除，放疗和化疗的结合。但这些疗法对正常细胞非特异性的损害作用，使得患者发病率和死亡率都非常高。所以需要开发能够选择性靶向肿瘤组织，并克服生物屏障，根据肿瘤微环境具有智能化响应机制的制剂。
随着纳米技术与抗肿瘤靶向治疗的相互结合，通过开发各种新型纳米载药系统用于靶向抗肿瘤治疗，成为肿瘤治疗的新挑战。靶向纳米载药系统是通过在其表面修饰受体，抗原或一些靶向分子来靶向肿瘤组织，从而减少其对正常组织的毒副作用。近年来，通过在脂质体或聚合物载药颗粒等纳米载药系统表面修饰靶向肿瘤细胞配体分子，从而达到靶向治疗的目的。并通过增加血液循环时间，来增加局部递送的效果，也已取得了良好的进展。
纳米载药系统已被证实可以提高癌症患者药物化疗的效果。最近研究表明，纳米载药系统表面的修饰不同的靶向试剂，可以进一步提高其治疗效果。这种主动靶向颗粒可以特异性识别大量存在于肿瘤细胞表面的相应受体，从而有效地被肿瘤细胞通过配体/受体介导而内吞，进入肿瘤细胞后，在细胞器如细胞质或细胞核释放化学药物，才能发挥其治疗效果[1-5]。常用靶向配体主要包括抗体、小分子和核酸适配体等[6,7]。例如，许多肿瘤细胞表面有高表达叶酸受体(FRs)，但正常细胞表面很少表达。于是，研究者常在聚合物胶束表面修饰叶酸(FA)来主动靶向肿瘤靶细胞，从而提高治疗效果[8-10]。
多柔比星(DOX)，是一种FDA批准的蒽环类抗生素，在临床化疗中具有广谱的抗肿瘤活性[11-13]。然而，由于其较短的体内循环时间和非特异性的分布，导致疗效较差，而且产生大的毒副作用，尤其是急性和心脏累积毒性[14]。因此，需要利用各种纳米载体将DOX包裹，以提高治疗的疗效和安全性，这样制备成纳米载药系统不仅改变粒径，但也很好的控制其组成和性质[15]。然而，一些传统的载载药系统通常具有较低的载药量伴随着不理想的释放[16]。过早的释放导致血液循环中的药物损失，甚至可能会导致严重的毒副作用，而缓慢的细胞内药物释放则导致药物的生物利用度降低，以致不足以杀死癌细胞，并可能导致多药耐药性[17,18]。
制备出对肿瘤细胞特有微环境具有刺激-响应性的聚合物胶束，可以实现胶束在体循环过程中保持稳定，而到达肿瘤组织或细胞后载体能迅速裂解释放药物的目的[19-22]。最近研究表明，自组装形成内部交联的聚合物胶束已成为有效的策略来减少药物在体循环的损失[23,24]。在各种纳米材料中，含有二硫键的聚合物材料使用最为广泛。由于二硫键在还原性条件下易断裂，如还原性的谷胱甘肽(GSH)。GSH是一种主要存在细胞内含巯基寡肽，其在肿瘤组织浓度比正常组织至少高4倍[25]。研究表明，含有二硫键交联的聚合物载药胶束具有很好的载药效率，并在肿瘤细胞内能快速地释放药物[26,27]。然而，这种聚合物载药胶束虽然能够减少药物在血液渗漏，但不能特异性的靶向肿瘤部位。
发明内容
本发明提供了一种具有氧化还原敏感性的靶向聚合物，其结构如式Ⅰ所示：
其中，A为疏水性的氨基酸；R为肿瘤靶向分子；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000。
作为本发明优选的方案，A为苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或蛋氨酸；R为叶酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或Angiopep-2；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000。
优选的，A为苯丙氨酸；R为叶酸；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000。
作为本发明优选的方案，当A为苯丙氨酸时，上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物，其结构如式Ⅱ所示：
其中，R为叶酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或Angiopep-2；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000。
优选的，R为叶酸；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000。
上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的分子量为10600～13300。
本发明还提供了上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其反应路线为：
其中，A为疏水性的氨基酸；R为肿瘤靶向分子；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000。
本发明还提供了上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，包括以下步骤：
1)合成Fmoc-PEG-OH(9-芴甲氧羰基-聚乙二醇)：OH-PEG-OH(聚乙二醇)、Fmoc-Phe(N-芴甲氧羰基保护的疏水性氨基酸)、EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶解在干燥的有机溶剂中，常温下反应24～48h；反应结束后，反应液经1mM盐酸萃取，有机相经干燥、过滤、浓缩后，经柱层析分离纯化，然后在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Fmoc-PEG-OH；
2)合成Mal-PEG-NH2(马来酰亚胺己酸-聚乙二醇-A)：Fmoc-PEG-OH、EMCA(6-马来酰亚胺基己酸)、EDCI和DMAP在干燥的有机溶剂中常温下反应24～48h；反应结束后，反应液经稀盐酸萃取，有机相经干燥、过滤、浓缩后，经柱层析分离纯化，然后在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Fmoc-PEG-Mal(9-芴甲氧羰基-聚乙二醇-马来酰亚胺基己酸)；将Fmoc-PEG-Mal溶解在干燥的有机溶剂中，加入哌啶，常温下反应3～5h，过滤除去固体，将反应液浓缩后在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Mal-PEG-NH2；
3)合成Mal-PEG-PLGB-PPhe(马来酰亚胺己酸-聚乙二醇-聚谷氨酸酯-聚苯丙氨酸酯)：将Mal-PEG-NH2和BLG-NCA(谷氨酸苄酯-N-羟酸酐)溶解在干燥的有机溶剂中，在N2保护下，42～48℃反应48～56h，然后取出部分反应液，在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Mal-PEG-PLGB(马来酰亚胺己酸-聚乙二醇-聚谷氨酸酯)；继续向上述剩余的反应液中加入Phe-NCA(苯丙氨酸-N-羟酸酐)，在42～48℃，N2保护下反应48h～56h，待反应液冷却后，直接在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Mal-PEG-PLGB-PPhe；
4)合成R-PEG-PLGB-PPhe(靶向分子-聚乙二醇-聚谷氨酸酯-聚苯丙氨酸酯)：将Mal-PEG-PLGB-PPhe和R-SH溶解在干燥的有机溶剂中，在N2保护下于15～25℃反应48h～72h；反应结束后，将反应液在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到固体；将该固体溶解在DMF中，倒入透析袋中透析48h，每隔12h换一次水，除去少量R-SH，然后冻干透析液液得到R-PEG-PLGB-PPhe；
5)合成R-PEG-PLG(HS)-Pphe(靶向分子-聚乙二醇-聚(5-巯基乙氨谷氨酸酯)-聚苯丙氨酸酯)：将R-PEG-PLBG-PPhe和胱胺盐酸盐溶解在干燥有机溶剂中，加入三乙胺使反应液的pH值为8～9，常温下反应24～36h；在反应液加入过量的DTT，反应24～36h。反应结束后，将反应液倒入透析袋中，透析48h，每隔12h换一次水，然后冻干透析液得到R-PEG-PLG(HS)-PPhe，即为具有氧化还原敏感性的靶向聚合物。
上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法中，步骤1)所述OH-PEG-OH、Fmoc-A、EDCI和DMAP的摩尔比为1:1.2～2.0:1.5～2.5:1.2～2.5。
步骤1)、2)和3)所述的有机溶剂为DCM(二氯甲烷)、氯仿或四氢呋喃中的任意一种。
上述制备方法中，步骤2)所述Fmoc-PEG-OH、EMCA、EDCI和DMAP的摩尔比为1:1.5～2.5:1.2～2.5:1.2～2。所述Fmoc-PEG-Mal与哌啶的摩尔比为1:5～8。
上述制备方法中，步骤3)所述BLG-NCA和Phe-NCA的制备方法按照参考文献合成：H.Y.Tian,C.Deng,H.Lin,J.R.Sun,M.X.Deng,X.S.Chen,Biodegradable cationic PEG-PEI-PBLG hyperbranched block copolymer:synthesis and micellecharacterization.Biomaterials,2005(26)4209-4217。
上述制备方法中，步骤3)所述Mal-PEG-NH2与BLG-NCA的摩尔比为1:13.5～20。所述Mal-PEG-NH2与Phe-NCA的摩尔比为1:17.5～23。
上述制备方法中，步骤4)所述的有机溶剂为DMF(N，N-二甲基甲酰胺)或DMSO(二甲基亚砜)。
上述制备方法中，步骤4)所述Mal-PEG-PLGB-PPhe和R-SH的摩尔比为1:1.2～1.5。
上述制备方法中，步骤4)和5)所述透析袋的截留分子量为3500～8000。
上述制备方法中，步骤5)所述的有机溶剂为DMSO或DMF。
上述制备方法中，步骤5)所述R-PEG-PLBG-PPhe和胱胺盐酸盐的摩尔比为1:10～15。
本发明还提供了上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物自组装形成的胶束。
上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物胶束(R-PGPM)是采用透析法制备的，包括以下步骤：将聚合物R-PEG-PLG(SH)-PPhe完全溶解在DMSO中，加10倍当量的硼氢化钠，搅拌30～40min后，然后加入PBS(1mM磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.4)，并在40～50℃条件下搅拌1～2h；然后将上述混合液倒入截留分子量为1000Da透析袋中，常温下透析36～48h，每隔12h换一次PBS；透析完毕后，将该胶束溶液过0.45μm注射式微孔滤膜，得到具有氧化还原敏感性的靶向聚合物自组装形成的胶束。该胶束可于4℃下密封保存备用。
本发明还提供了上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物在制备纳米载药系统中的用途。
进一步地，所述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物包裹抗肿瘤小分子疏水性药物，制备得到载带药物的聚合物胶束。所述的抗肿瘤小分子疏水性药物为多柔比星、紫杉醇、多西他赛、厚朴酚、姜黄素、槲皮素、甲环亚硝脲、阿糖胞苷、卡培他滨、柔红霉素、表柔比星、吡柔比星、米托蒽醌、他莫昔芬、鸦胆子油、长春新碱、长春花碱、羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、依托泊甙、奥沙利铂、卡铂、顺铂、长春地辛、呋喃啶、双呋喃啶、卡莫氟或平阳霉素中的任意一种。
当Drug(药物)与R-PEG-PLG(SH)-PPhe的质量比为1:10时，包封率(EE)为90～97wt％，载药效率(DL)为9.0～9.7wt％。所述载带药物的聚合物胶束的平均粒径为55～75nm。所述载带药物的聚合物胶束的Zeta电位为-16.5mV～-9.15mV。TEM显示该载带药物的聚合物胶束呈规则球形，并无聚集和粘连，具有良好的分散性。
本发明还提供了上述载带药物的聚合物胶束的制备方法，包括以下步骤：采用透析法制备包载药物的R-PEG-PLG(SH)-PPhe的胶束(Drug-R-PGPM)。称取聚合物R-PEG-PLG(SH)-PPhe和Drug·HCl完全溶解在DMSO中，加入三乙胺，再加入硼氢化钠；搅拌30～40min后，加入PBS(pH 7.4)，向其中不断通入氧气，并在40～50℃条件下搅拌40～90min。然后将该混合液倒入截留分子量为1000Da透析袋中，常温下透析36～48h，每隔12h换一次水(PBS，1L)，期间也不短向其中通入氧气。透析完毕后，将该胶束溶液过0.45μm注射式微孔滤膜，4℃下密封保存备用。
上述载带药物的聚合物胶束制备方法中，所述Drug·HCl和三乙胺摩尔比为1︰1.2～1.5；所述R-PEG-PLG(SH)-PPhe和硼氢化钠的摩尔比1︰10～12。所述R-PEG-PLG(SH)-PPhe和Drug·HCl的质量比为5～20:1。
上述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物还可以包裹其他小分子疏水性药物。根据其病变部位和器官的微环境，制备得到相应的载带药物的聚合物胶束。
本发明提供的载带药物的聚合物胶束，其中疏水性的PPhe与药物相互作用，形成内核；亲水部分PEG则作为壳，起稳定性作用，可以延长体循环时间；聚谷氨酸酯侧链连接的巯基则作为交联基团。聚合物在水溶液中自组装形成聚合物胶束，在氧气存在的条件下，中间部分的巯基会相互交联，形成二硫键将药物更好的包裹在胶束的中心。当胶束处于肿瘤细胞内强还原性环境中，双硫键就会快被打断，药物则会快速释放出来，从而达到好的治疗效果。同时，本发明提供的载带药物的聚合物胶束可有效的靶向在肿瘤部位，并能减小药物的毒性。本发明提供的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的Drug-R-PGPM对肿瘤靶向治疗具有很大的应用前景。
附图说明
图1(A)中间产物Mal-PEG-PLGB-PPhe的1H NMR谱；(B)聚合物Mal-PEG-PLGB，Mal-PEG-PLGB-PPhe，falote-PEG-PLG(HS)-PPhe的凝胶色谱图。
图2芘荧光强度I336/I332比值与folate-PEG-PLG(HS)-PPhe浓度的曲线图。
图3 DOX-fPGPM的粒径和形貌图。
图4 DOX-fPGPM的Zeta电位分布图。
图5 DOX-fPGPM的体外释放曲线。
图6流式细胞仪检测H460细胞对DOX(a-c)、Doxil(d-f)和DOX-fPGPM(g-i)摄取情况图DOX浓度5μg/mL，孵育时间3h)。
图7不同浓度空白fPGPM(A)和游离DOX、Doxil和DOX-fPGPM(B)对H460细胞的细胞毒性。(结果为三次测量的平均值，误差棒表示标准偏差n＝3)。
图8不同DOX制剂组在H460非小细胞肺癌的动物模型上的治疗效果。A为肿瘤体积图，B为小鼠体重变化图。
图9 H460移植模型中研究fPGPM对肿瘤靶向性。尾静脉注射DID-fPGPM，不同时间点将小鼠在活体成像仪观察，96h处死小鼠，取出肿瘤和各组织器官，在活体成像仪观察。
图10不同DOX制剂组治疗小鼠心脏组织的HE染色。给药剂量和分组：A为生理盐水，B为游离DOX(4mg/kg)，C为Doxil(4mg/kg)，D为DOX-fPGPM(4mg/kg)，E为DOX-fPGPM(8mg/kg)。
具体实施方式
试剂：聚乙二醇(OH-PEG-OH，Mw＝5000)，6-马来酰亚胺基己酸(EMCA)，盐酸多柔比星盐(DOX)和叶酸(folate)均购于美国Sigma-Aldrich公司。L-谷氨酸-γ-苄酯(BLG)，L-苯丙氨酸(Phe)，Fmoc-L-苯丙氨酸(Fmoc-Phe)，二硫苏糖醇(DTT)均购于阿拉丁生化科技股份有限公司。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，二甲基亚砜(DMSO)均购于成都化工试剂公司，使用前存于干燥4A分子筛中备用。无水乙醇和四氢呋喃(THF)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，四氢呋喃使用前现蒸现用。细胞膜红色荧光(DID)染料购于凯基生物技术股份有限公司。5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)氨基乙醇(EA)，二环己基碳二亚胺(DCC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)成都聚慧化工科技有限公司。磷酸盐缓冲液(PBS pH＝7.4)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。噻唑蓝(MTT)和Hoechst33342均购于美国Sigma-Aldrich公司。MTT用生理盐水配制成5mg/mL储存液，置-20℃冰箱避光保存备用。合成Doxil所需的氢化大豆卵磷脂(HSPC)，胆固醇和PEG-DSPE购买于Avanti Polar Lipids,Inc(USA)。除特殊注明外，用于本发明的原料、试剂和溶剂均为分析纯。
仪器：旋转蒸发仪(RII，瑞士Buchi)，纯水仪(Milli-Q，美国Millipore)，恒温摇床(THZ-100，上海一恒科学仪器有限公司)，分析天平(AUW120D，日本Shimadzu)，恒温加热磁力搅拌器(DF-101S河南巩义市予华仪器设备有限公司)，冷冻干燥机(FD-1A-50，北京博医实验仪器有限公司)，真空干燥箱(ZKD-4025A，上海智城分析仪器制造有限公司)，透析袋(MWCO＝1000、3500，美国Amresco公司)离心机(SORVALL ST16，美国Thermo Scientific公司)，pH酸度计(DELTA 320，瑞士梅特勒-托利多)，紫外分光光度仪(UV-3150，Shimadzu，Japan)，核磁共振谱仪(AV-11 400MHz，瑞士Bruker)，胶束粒度仪(Zetasizer Nano ZS，英国马尔文公司)，透射电镜(H-6009IV，日本Hitachi)，多功能酶标仪：SpectraMax M5，荧光显微镜(Olympus IX71,Olympus,Japan)，细胞流式仪(NovoExpressTM Analyzer，ACEABiosciences,Inc)。ESI-Q-TOF质谱仪((Micromass,Manchester,UK))，凝胶渗透色谱仪(GPC HLC-8320,Japan)。
细胞株：人肺癌非小细胞株H460购自于美国模式菌种收集中心(American TypeCulture Collection，ATCC)，由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验保存。H460细胞株均采用RPMI 1640培养基培养(含10％FBS,10IU/mL青霉素和10μg/mL链霉素)，置于含5％CO2，37℃恒温培养箱中培养传代。RPMI 1640培养基及胰蛋白酶，胎牛血清(FBS)均购于美国HyClone公司。
动物：6～8周龄雌性裸鼠，SPF级，体重18～20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，在四川大学生物治疗国家重点实验室SPF级动物房饲养，温度20±2℃，相对湿度50-60％，12小时明暗交替，动物自由取食饮水，实验前至少饲养一周，待动物适应环境后开始实验。
实施例1folate(叶酸)-PEG-PLG(SH)-Pphe聚合物的合成
(1)合成folate-SH：称取叶酸0.44g(1mM)，DCC 0.3g(1.5mM)和NHS 0.14g(1.2mM)溶解在30mL干燥的DMSO中，常温下反应24小时；加入氨基乙醇28mg(0.36mM)和0.0730mL三乙胺，继续常温下反应2天。反应结束后，将反应液倒入透析袋(截留分子量＝3500)，透析48小时，每隔12小时换一次水，然后冻干反应液得到黄色固体folate-SH。产率80％。
(2)合成Mal-PEG-NH2：PEG 5g(1mM)，Fmoc-Phe 0.74g(2mM)，EDCI 0.22g(1.2mM)和DMAP 0.15g(1.2mM)溶解在100mL干燥的DCM中，常温下反应48小时。反应结束后，反应液经1mM盐酸(100mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，过硅胶色谱柱分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，并且采用梯度洗脱(20:1～9:1)。纯化后，在无水乙醚中沉淀，真空干燥得白色固体Fmoc-PEG-OH。产率40％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:3.11-3.34(dt,2H),3.65(t,2H),4.46(t,1H),7.09-7.28(dt,2H),7.40(t,2H),7.57(t,2H)。
称取Fmoc-PEG-OH 1.5g(0.28mM)，EMCA 0.089g(0.42mM)，EDCI 0.08g(0.42mM)和0.054g(0.45mM)DMAP溶解在80mL干燥的DCM中，常温下反应48小时。反应结束后，反应液经稀盐酸(100mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，在无水乙醚中沉淀，真空干燥得到白色固体Fmoc-PEG-Mal。产率75％。
称取Fmoc-PEG-Mal 1g(0.18mM)溶解在50mL干燥的DCM，加入8mL哌啶，常温下反应3小时，有白色固体析出，将固体过滤，减压浓缩反应液，在无水乙醚中沉淀，真空干燥得到白色固体Mal-PEG-NH2。产率80.6％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:1.29(m,2H),1.45(s,3H),3.11-3.34(dt,2H),3.65(t,2H),6.92(s,1H),7.40(t,2H),7.57(t,2H)。
(3)合成folate-PEG-PLG(HS)-PPhe：首先按照参考文献[32]合成BLG-NCA和Phe-NCA。称取一定量的Mal-PEG-NH2和BLG-NCA(摩尔比Mal-PEG-NH2︰BLG-NCA＝1︰15)溶解在10mL干燥的DMF中，在45℃ N2保护下反应48h，然后取出少量反应液，在无水乙醚中沉淀，真空干燥得到Mal-PEG-PLGB；继续向反应液中加入一定量的Phe-NCA(摩尔比Mal-PEG-NH2︰Phe-NCA＝1︰20)，在45℃，N2保护下反应48h，待反应液冷却后，直接在无水乙醚中沉淀，真空干燥得到白色固体Mal-PEG-PLGB-PPhe。产率：75％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:1.29(m,2H),1.45(s,3H),2.18-2.30(t,2H),3.11-3.34(dt,2H),3.65(t,2H),4.02(s,1H),5.08(s,2H),6.92(s,1H),7.40(t,2H),7.57(t,2H)。
称取Mal-PEG-PLGB-PPhe1.2g(0.08mM)0.052g(0.1mmol)folate-SH 4mL of DMSO溶解在10mL干燥的DMF中，在45℃ N2保护下反应48h。反应结束后，将反应液在无水乙醚中沉淀，真空干燥得到浅黄色固体。将该固体溶解在5mLDMF中，倒入透析袋中(截留分子量为3500)，透析48h，每隔12h换一次水，除去少量folate-SH，然后冻干透析液液得到黄色固体folate-PEG-PLGB-PPhe。产率83.4％。
称取folate-PEG-PLBG-PPhe 0.8g(0.05mM)，胱胺盐酸盐0.225g(1mM)溶解在4mL干燥DMSO中加入三乙胺0.3g(3mM)，常温下反应36小时。在反应液加入过量的DTT，反应24h。反应结束后，将反应液倒入透析袋中(截留分子量＝3500)，透析48h，每隔12h换一次水，然后冻干透析液得到黄色固体folate-PEG-PLG(HS)-PPhe。产率78％。
通过Ellman试剂测定，平均一个folate-PEG-PLG(HS)-PPh含有巯基个数为8个。
图1(A)中间产物Mal-PEG-PLGB-PPhe的1H NMR谱，PBLG结构中f，PPhe结构中i和PEG结构中a质子吸收峰的峰面积比值可以求算出聚合物的分子量，求算出结构中谷氨酸和苯丙氨酸的重复单元为13.5和17.2。
通过凝胶色谱GPC来检测该聚合物的分子量，如图1(B)所示，Mal-PEG-PLGB，Mal-PEG-PLGB-PPhe和falote-PEG-PLG(HS)-PPhe的流出曲线都为单峰并且都具有非常窄的分布。其中，falote-PEG-PLG(HS)-PPhe共聚物的平均分子量为11882(PDI＝1.2)。
实施例2聚合物临界胶束的制备
采用透析法制备folate-PEG-PLG(SH)-PPhe的胶束(fPGPM)。称取100mg聚合物folate-PEG-PLG(SH)-PPhe溶解在4mL DMSO中，待完全溶解后，加10倍当量的硼氢化钠，打断双硫键。搅拌30min后，加入5mL PBS(pH 7.4)，并在50℃条件下搅拌1h。然后将该混合液倒入截留分子量为1000Da透析袋中，常温下透析36h，每隔12h换一次水(PBS)。透析完毕后，将该胶束溶液过0.45μm注射式微孔滤膜，4℃下密封保存备用。
配制6×10-7M的荜的甲醇溶液，将1mL的芘溶液加入到棕色西林瓶中，待甲醇挥发后，通过对原胶束溶液的稀释，在西林瓶中配制成从2.5×10-4g/L到2.5g/L的一系列浓度胶束溶液，在50℃水浴条件下放置3-4h。用荧光分光光度计(F-7000,Hitach,Japan)测定芘的激发光谱，发射波长为390nm，峰宽为5nm；激发波长分别为336nm和332nm。通过计算I336/I332比值与胶束浓度的曲线的突变值来确定CMC。
从图2中两条拟合直线可求得folate-PEG-PLG(SH)-PPhe的CMC值为39mg/L。
实施例3载DOX的folate-PEG-PLG(HS)-PPhe(DOX-fPGPM)胶束的制备
采用透析法制备包载DOX的folate-PEG-PLG(SH)-PPhe的胶束(DOX-fPGPM)。称取50mg聚合物folate-PEG-PLG(SH)-PPhe和5.4mg DOX·HCl溶解在2mL DMSO中，待完全溶解后，加入5μL三乙胺使DOX去质子化，再加10倍当量的硼氢化钠，打断双硫键。搅拌半小时后，加入4mL PBS(pH 7.4)，向其中不断通入氧气，并在50℃条件下搅拌1小时。然后将该混合液倒入截留分子量为1000Da透析袋中，常温下透析36h，每隔12h换一次水(PBS)，期间也不短向其中通入氧气。透析完毕后，将该胶束溶液过0.45μm注射式微孔滤膜，4℃下密封保存备用。另外取部分胶束冻干备用。Doxil脂质体的制备参考文献[28]。
实施例4载DOX的folate-PEG-PLG(HS)-PPhe胶束的表征
对DOX-fPGPM进行了粒径仪(DLS)和透射电镜(TEM)表征。
采用马尔文激光衍射粒度仪(Zetasizer Nano ZS)测定DOX-fPGPM的粒径分布，取上述胶束溶液1mL，于25℃测定粒径范围及Zeta电位，测定前平衡2分钟。每个样品平行测定3次。
采用透射电镜(TEM H-6009IV，Hitachi Japan)观察DOX-fPGPM的微观形态。取上述胶束溶液(浓度约3-5mg/mL)滴至硝酸纤维覆盖的铜网上，经磷酸钨酸负染色，待室温下干燥后在TEM下观察胶束形貌。
结果表明，胶束的平均粒径为66nm(如图3)，并且具有较均匀的粒径分布(PDI值为0.142)，从图中可以看出峰形为对称且集中的单峰，说明粒径分布较均匀。从透射电镜图上可以看出，DOX-fPGPM的为呈规则球形，并无聚集和粘连，具有良好的分散性。载药胶束的粒径的水合粒径均小于100nm，进而更有利于胶束通过EPR效应，在肿瘤组织富集。
图4为胶束DOX-fPGPM的Zeta电位分布图，测得其平均Zeta电位为-11.55mV。并且有文献报道[29]，带负电荷的纳米颗粒具有抗耐药性和并且可以延长体内的血液循环时间。载药量和包封率是载药系统重要的参数，紫外分光光度计测得DOX的载药量和包封率分别为EE和LD分别为DOX-fPGPM是92.68wt％和9.26wt％。
实施例5不同DOX与fPGPM投料比的胶束制备
采用与实施例3相同的制备操作步骤，按照表1的投料比制备DOX-fPGPM胶束。
包封率和载药量是评价胶束制剂质量好坏的一个重要指标，可影响制剂的效果和毒副作用。包封率(encapsulation efficiency,EE)是指包入胶束中的药物量与药物投料量的质量百分比，载药量(drug loading,DL)是指包入胶束中的药物量与药物和聚合物投料总质量的百分比。
精密取DOX-fPGPM冻干样品20mg，在DMF溶解并稀释，采用紫外分光光度计(UV-3150，Shimadzu，Japan)测定在482.5nm吸光度，计算DOX的含量。样品平行制备三份，实验数据为三次测定的平均值。包封率和载药量的计算方法分别参考公式如下：
表1不同DOX/fPGPM投料比的胶束制备
结果如表1所示，在较低DOX比例的条件下，各胶束的粒径无明显变化；当DOX︰fPGPM＝1︰5时，胶束的粒径增加至109nm，并且在透析过程中，有大量游离DOX析出。随着DOX比例的增加，稳定时间减少，空白胶束放置一周，溶液仍然澄清；当DOX︰fPGPM＝1︰10时，常温下可放置放置4-5天；当投药比为1︰5时，胶束的稳定性变差，放置一晚便有沉淀析出。所以我们选择了DOX︰fPGPM＝1︰10来制备胶束，根据以上结果，可以看出DOX成功包裹到DOX-fPGPM中。
实施例6DOX-fPGPM体外释放
在模拟生理条件下(pH＝7.4PBS，37℃)，研究在DOX-fPGPM中DOX释放行为。
采用透析法考察DOX-fPGPM胶束体外药物释放行为。取0.6mL DOX-fPGPM溶液(1mg/mL)置于预处理后的透析袋中(截留分子量＝3500)作为试验组。透析袋密封后分别浸泡在30mL(1)PBS溶液，(2)含5mM GHS的PBS溶液中，(3)含10mM GHS的PBS溶液，置于37℃的恒温空气浴摇床中(100rpm)。分别在0h、2h、4h、8h、12h、20h、24h、42h和50h取样1mL释放介质，同时补加预热至37℃的等量新鲜介质，采用紫外分光光度计测定DOX的含量。累计释放度的计算方法见公式(3)，每组样品平行制备三份，实验结果用平均值±标准偏差表示。
如图5，在10mM GSH(谷胱甘肽)存在条件下，24h后DOX的累积释放达80％。
相同条件下，在5mM GSH环境中，24h后大约有40％的DOX释放。在没有GSH条件下，DOX的释放则相当缓慢，在开始的12h大约有8％的突释，48h后只有15％的药物释放。这是二硫键形成了交联DOX-fPGPM胶束后，仍有少量游离的DOX吸附在胶束表面，12h后基本上没有DOX释放。基于以上研究结果，可以预计DOX-fPGPM在全身循环中，只有少量的DOX会释放出来，从而减少了药物在介质中的暴露时间。
实施例7DOX-fPGPM胶束的细胞摄取
采用荧光显微镜考察H460细胞对DOX-fPGPM的摄取行为。将2mL浓度为1×105个/毫升的H460细胞接种于含有载玻片的6孔板中，孵育过夜。分别加入游离DOX，Doxil和DOX-fPGPM(DOX浓度都为5μg/mL)，孵育3h。培养结束后，用冷的PBS洗涤三次，并用4％(w/v)的多聚甲醛固定30min，再用Hoechst33342(1μg/mL)染核。然后采用荧光显微镜(Olympus IX71,Olympus,Japan)观察细胞对DOX的摄取效果。
通过流式细胞仪检测H460细胞对DOX-fPGPM定量摄取。按照上述方法2×105个/毫升的H460细胞接种于6孔板中。分别加入游离DOX，Doxil和DOX-fPGPM(DOX浓度都为5μgmL-1)，在37℃孵育3小时后，细胞用冷PBS洗三次，并悬浮于500μL PBS中，在细胞流式仪(NovoExpress TM Analyzer)检测细胞摄取效果。每个样本检测细胞个数20000个。
结果如图6所示，H460细胞对游离DOX组，Doxil组和DOX-fPGPM组摄取平均荧光强度值分别2130，4536和6142。可以看出经DOX-fPGPM孵育的细胞的平均荧光强度的最高水平，并且细胞对DOX-fPGPM摄取能力分别是游离DOX组和Doxil组的3倍和1.4倍。
实施例8DOX-fPGPM的体外抗肿瘤活性评价
采用MTT法考察DOX-fPGPM胶束的体外抗肿瘤效果。分别收集对数生长期的H460细胞，用培养基稀释成相应适宜浓度的细胞悬浮液后，以每孔100μL的体积接种到96孔板中，置于37℃恒温孵箱中培养。待细胞生长24h贴壁后，加入100μL用培养基稀释成的不同浓度梯度的fPGPM聚合物，游离DOX，Doxil和DOX-fPGPM胶束，每个浓度梯度设置3个复孔，阴性对照为只加入100μL的空白培养基。
加药完后将孔板放入37℃含5％CO2的恒温培养箱中培养24h或48h，培养完毕后，在避光条件下每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，放入恒温培养箱中继续培养3-4h后，取出孔板，小心地吸去上清液，每孔加入150μL DMSO，置于摇床上室温振摇10min，待蓝色结晶充分溶解后，用酶标仪测定每孔在570nm条件下的吸光度(OD值)，记录结果。细胞存活率计算方法见公式：
其中ODcontrol为不添加药物时的吸光度值，ODcontrol为添加药物时的吸光度值，实验结果用三个复孔的平均值±标准偏差表示。细胞IC50定义为抑制率为50％时的药物浓度。
如图7(A)所示，各组浓度的空白胶束与H460细胞孵育48h后，仍有超过85％的细胞仍然存活，表明fPGPM的毒性较小，生物相容性好。
图7(B)为经游离DOX，Doxil和DOX-fPGPM三组制剂处理48h后，H460细胞的生存率。结果表明，三组制剂对细胞抑制作用都呈剂量依赖的关系，即随着DOX浓度增加，肿瘤细胞存活率呈下降趋势。游离DOX组，Doxil组和DOX-fPGPM组的细胞IC50值分别为组7.41μg/mL，12.09μg/mL和5.39μg/mL。其中DOX-fPGPM对H460细胞具有较强的生长抑制作用，IC50值为5.39μg/mL，低于游离DOX和Doxil组。由图也可以看出，Doxil的细胞毒性较游离DOX稍低，这是由于DOX脂质体进入细胞后，无法快速的在细胞中释放。而文献也有报道[30]临床上使用的DOX脂质体制剂(如Doxil、Caelix)，它们虽然可以通过EPR效应在肿瘤部位聚集，但它们仍无法快速持续续释放出DOX，这是这类脂质体的一个明显的缺点。本实验制备的这种还原敏感性内部交联的DOX-fPGPM可以增强DOX的细胞毒性，当胶束DOX-fPGPM被肿瘤细胞经叶酸受体介导内吞以后，在肿瘤细胞内浓度较高的GSH环境中，双硫键被打断，DOX很快释放出来，从而大大提高肿瘤靶向治疗的效果。
实施例9DOX-fPGPM体内抗肿瘤活性评价
H460细胞经传代培养到一定数量后，收集生长良好的细胞，所得细胞用无血清、无抗生素的RPMI 1640培养基洗涤2次，计数后用上述培养基稀释成约5×107个/mL的细胞悬浮液。无菌条件下，将肿瘤细胞悬液接种于裸鼠右侧腋部皮下，每只小鼠接种体积为100μL，每鼠细胞接种数目约为5×106个。
10天后，瘤块体积达3000mm3左右，无菌条件下取出实体瘤，剥去周围正常组织，剔除中心坏死组织，挑选出肿瘤边缘生长活跃组织，剪成2mm×2mm左右的瘤块，置灭菌后的PBS中漂洗备用。将裸鼠用乙醚麻醉，剪开右侧腋部皮下，将瘤块植入，用火棉胶缝合。
H460瘤块接种后第9天，数显游标卡尺测量肿瘤长径和短径，肿瘤体积约为80mm3，该天记为第0天。将小鼠随机分为5组，每组5只，分别静脉给予生理盐水，DOX 4mg/kg，Doxil胶束4mg/kg，DOX-fPGPM 4mg/kg和DOX-fPGPM 8mg/kg，分别在第0天，3天，6天和9天给裸鼠给药。每隔一天用，测量精确至0.1mm，同时记录老鼠体重作为系统毒性评价指标。肿瘤体积计算方法参考公式为0.52×长×宽2。
采用瘤块接种法在裸鼠接种H460瘤块来评价DOX-fPGPM的体内抗肿瘤活性。当肿瘤体积生长到100mm3，选择大小一致的小鼠随分5分组，每组5只进行实验。根据先前的研究报道[31]，裸鼠DOX最佳给药剂量为DOX5-8mg/kg。在本实验中，以下给药方案进行静脉注射：对照组注射生理盐水，给药组分别为游离DOX组(4mg/kg)，Doxil组(4mg/kg)，DOX-fPGPM低剂量组(4mg/kg)和DOX-fPGPM高剂量组(8mg/kg)。给药后用数显游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，并记录裸鼠的体重。
如图8(A)所示，对照组小鼠肿瘤体积迅速增加，而其他药物治疗组小鼠的肿瘤体积受到了不同程度上抑制。在相同剂量的情况下(4mg/kg)，Doxil和DOX-fPGPM组的肿瘤抑制作用较游离DOX组更高，但是与Doxil相比，DOX-fPGPM组小鼠的治疗效果更好。给药21天后，取出小鼠肿瘤，称重后计算抑瘤率。DOX组，Doxil和DOX-fPGPM组对小鼠的肿瘤生长抑制率(TGI)分别为39.85％、48.24％和58.90％(p＜0.05)。当增加DOX-fPGPM胶束中DOX的剂量8mg/kg时，小鼠的肿瘤抑制率(TGI)可达81.70％，说明该胶束的抗肿瘤活性进一步增强。继续考察小鼠生存期内的体重，图8(B)所示，除开游离DOX组各组小鼠的体重有下降趋势，其他各制剂组小鼠体重无明显的增加或减轻的现象，体重变化趋于平缓，其中DOX-fPGPM高剂量组也没有表现出明显体重减轻，显示出该聚合物胶束能明显减小DOX的毒性。
实施例10DOX-fPGPM胶束的靶向性评价
在裸鼠皮下接种H460瘤块，通过小鼠近红外活体成像实验检测DOX-fPGPM胶束在体内的分布，来评价该胶束的靶向性。
H460瘤块接种后第15天，小鼠静脉注射200μL DID-fPGPM(DID浓度为0.4mg/mL)。注射后，分别在第1h、24h、48h、72h和96h，将小鼠以水合氯醛麻醉，在小鼠活体成像仪下进行拍照，其中激发波长630nm，发射波长700nm，曝光时间60s。把注射DID-fPGPM 96h后的小鼠解剖，取出肿瘤和主要器官在成像系统下成像，检测其信号强度，半定量考察DID在肿瘤和其他器官的组织分布。
结果如图9(A)所示，注射后的最初24h内，DiD主要分布在心脏部位，肿瘤部位也有分布。但在注射48h和72h后，DiD在肿瘤部位的荧光强度较其他部位却处于峰值水平。
在注射DiD-fPGPM 96h后将小鼠处死，取出小鼠肿瘤和其他主要器官，在近红外成像像系统下进行量化评价，检测主要器官和肿瘤组织单位面积上的平均荧光强度，半定量分析该胶束的体内分布情况和肿瘤靶向性。
结果如图9(B)和(C)所示，由图可以看出DiD在肿瘤组织中荧光强度最强，而在心脏组织中有最低的荧光强度。同时，对不同组织的荧光强进行度半定量分析，观察到DiD在肿瘤组织中的平均荧光强度较心脏组织高10倍，表明fPGPM能很好的靶向肿瘤组织，并减少药物在心脏组织中的分布；同时，发现DiD在肝脏和肺部具有中等荧光强度。由此可见DiD-fPGPM胶束可有效的在肿瘤部位积集，而减少在其他器官中的分布，这可归结于DiD-fPGPM胶束中的具有氧化还原敏感的交联层，其在循环过程中有良好的稳定性，亲水性的PEG在胶束的表面上也可以屏蔽各种蛋白酶，延长其在体内的循环时间。
实施例11DOX-fPGPM的心脏毒性评价
H460瘤块接种后第9天，该天记为第0天。将小鼠随机分组，分别静脉给予生理盐水，DOX 4mg/kg，Doxil胶束4mg/kg、DOX-fPGPM 4mg/kg和DOX-fPGPM 8mg/kg，分别在第0天，3天，6天，9天给裸鼠给药。第21天后，处死小鼠并取出小鼠心脏，用4％的多聚甲醛进行固定后，进行HE染色。在显微镜下观察心脏切片组织。
图10为各组DOX制剂治疗组小鼠心脏组织的HE染色。与生理盐水组相比，各DOX治疗组小鼠没有表现出明显的心脏组织损伤，游离DOX治疗组小鼠的心脏病理切片显示其肌原纤维严重损失，细胞质出现空泡；在解剖的游离DOX治疗组小鼠时，打开胸腔后发现这组小鼠的心脏较其他组较小，小鼠心脏组织颜色较其他组更深更红，这可能是由于DOX的心脏累积毒性造成的。因此，以上实验结果表明，这种叶酸靶向的氧化还原敏感可内部交联DOX-fPGPM胶束可降低DOX在主要器官尤其是心脏组织的毒性。
本发明提供了可以内部交联并且偶联靶向分子的聚合物材料，并采用透析法制备包裹多柔比星的聚合物胶束(DOX-fPGPM),该胶束具有氧化还原敏感性。且H460细胞能明显增加对DOX-fPGPM摄取。同时，DOX-fPGPM的体内外抗肿瘤效果强于游离DOX和Doxil组。本发明提供的胶束可有效的靶向在肿瘤部位，并能减小DOX的心脏累积毒性。
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Claims (18)

1.具有氧化还原敏感性的靶向聚合物，其结构如式Ⅰ所示：
其中，A为疏水性的氨基酸；R为肿瘤靶向分子；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000。
2.根据权利要求1所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物，其特征在于：A为苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或蛋氨酸；R为叶酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或Angiopep-2；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000；
优选的，A为苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或蛋氨酸；R为叶酸；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000；
最优的，A为苯丙氨酸，R为叶酸；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000。
3.根据权利要求1所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物，其特征在于：当A为苯丙氨酸时，其结构如式Ⅱ所示：
其中，R为叶酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或Angiopep-2；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000；
优选的，R为叶酸；g＝15～20，m＝12～15，n＝2000～5000。
4.根据权利要3所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物，其特征在于：所述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的分子量为10600～13300。
5.具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，包括以下步骤：
1)合成Fmoc-PEG-OH：OH-PEG-OH、Fmoc-A、EDCI和DMAP溶解在干燥的有机溶剂中，常温下反应24～48h；反应结束后，反应液经1mM盐酸萃取，有机相经干燥、过滤、浓缩后，经柱层析分离纯化，然后在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Fmoc-PEG-OH；
2)合成Mal-PEG-NH2：Fmoc-PEG-OH、EMCA、EDCI和DMAP在干燥的有机溶剂中常温下反应24～48h；反应结束后，反应液经稀盐酸萃取，有机相经干燥、过滤、浓缩后，经柱层析分离纯化，然后在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Fmoc-PEG-Mal；将Fmoc-PEG-Mal溶解在干燥的有机溶剂中，加入哌啶，常温下反应3～5h，过滤除去固体，将反应液浓缩后在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Mal-PEG-NH2；
3)合成Mal-PEG-PLGB-PPhe：将Mal-PEG-NH2和BLG-NCA溶解在干燥的有机溶剂中，在N2保护下，42～48℃反应48～56h，然后取出部分反应液，在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Mal-PEG-PLGB；继续向上述剩余的反应液中加入Phe-NCA，在42～48℃，N2保护下反应48h～56h，待反应液冷却后，直接在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到Mal-PEG-PLGB-PPhe；
4)合成R-PEG-PLGB-PPhe：将Mal-PEG-PLGB-PPhe和R-SH溶解在干燥的有机溶剂中，在N2保护下于15～25℃反应48h～72h；反应结束后，将反应液在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得到固体；将该固体溶解在DMF中，倒入透析袋中透析48h，每隔12h换一次水，除去少量R-SH，然后冻干透析液液得到R-PEG-PLGB-PPhe；
5)合成R-PEG-PLG(HS)-PPhe：将R-PEG-PLBG-PPhe和胱胺盐酸盐溶解在干燥有机溶剂中，加入三乙胺使反应液的pH值为8～9，常温下反应24～36h；在反应液加入过量的DTT，反应24～36h；反应结束后，将反应液倒入透析袋中，透析48h，每隔12h换一次水，然后冻干透析液得到R-PEG-PLG(HS)-PPhe，即为具有氧化还原敏感性的靶向聚合物；
其中，A为疏水性的氨基酸；R为肿瘤靶向分子。
6.根据权利要求5所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其特征在于：步骤1)所述OH-PEG-OH、Fmoc-A、EDCI和DMAP的摩尔比为1:1.2～2.0:1.5～2.5:1.2～2.5。
7.根据权利要求5所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其特征在于：步骤1)、2)和3)所述的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或四氢呋喃中的任意一种。
8.根据权利要求5所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其特征在于：步骤2)所述Fmoc-PEG-OH、EMCA、EDCI和DMAP的摩尔比为1:1.5～2.5:1.2～2.5:1.2～2；所述Fmoc-PEG-Mal与哌啶的摩尔比为1:5～8。
9.根据权利要求5所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其特征在于：步骤3)所述Mal-PEG-NH2与BLG-NCA的摩尔比为1:13.5～20；所述Mal-PEG-NH2与Phe-NCA的摩尔比为1:17.5～23。
10.根据权利要求5所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其特征在于：步骤4)所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
11.根据权利要求5所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其特征在于：步骤4)所述Mal-PEG-PLGB-PPhe和R-SH的摩尔比为1:1.2～1.5。
12.根据权利要求5所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其特征在于：步骤1)～4)所述的极性小的溶剂为无水乙醚或正己烷。
13.根据权利要求5所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其特征在于：步骤5)所述的有机溶剂为二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺。
14.根据权利要求5所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物的制备方法，其特征在于：步骤5)所述R-PEG-PLBG-PPhe和胱胺盐酸盐的摩尔比为1:10～15。
15.权利要求1～4任一项所述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物自组装形成的胶束。
16.权利要求1～4任一项所述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物在制备纳米载药系统中的用途。
17.根据权利要求16所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物在制备纳米载药系统中的用途，其特征在于：所述具有氧化还原敏感性的靶向聚合物包裹抗肿瘤小分子疏水性药物，制备得到载带药物的聚合物胶束。
18.根据权利要求17所述的具有氧化还原敏感性的靶向聚合物在制备纳米载药系统中的用途，其特征在于：所述的抗肿瘤小分子疏水性药物为多柔比星、紫杉醇、多西他赛、厚朴酚、姜黄素、槲皮素、甲环亚硝脲、阿糖胞苷、卡培他滨、柔红霉素、表柔比星、吡柔比星、米托蒽醌、他莫昔芬、鸦胆子油、长春新碱、长春花碱、羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、依托泊甙、奥沙利铂、卡铂、顺铂、长春地辛、呋喃啶、双呋喃啶、卡莫氟或平阳霉素中的任意一种。
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