CN114224869A - 一种高效递送siRNA的载药纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效递送siRNA的载药纳米粒及其制备方法与应用，该siRNA载药纳米粒由Zn²⁺、槲皮素、siRNA和苯硼酸‑透明质酸共轭物通过自组装形成，Zn²⁺与槲皮素络合后包载siRNA形成载药内核，再由苯硼酸‑透明质酸共轭物包裹载药内核组装成高效递送siRNA的载药纳米粒。本发明的载药纳米粒通过Zn²⁺与槲皮素及siRNA的配位络合作用形成一种新型“以药载药”内核，并以苯硼酸基团修饰的HA作为外壳，构建双重酸敏感型联合载药纳米粒，可以实现靶向SIRT1的基因药物和小分子药物的共递送和协同治疗；同时该载药纳米粒包含磷酸锌配位键和苯硼酸酯键双重酸敏官能团，在胞内溶酶体酸性环境中迅速断裂，使载体有效解散，并诱发溶酶体内渗透压升高以促进药物的高效递送与释放。

Description

一种高效递送siRNA的载药纳米粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及纳米材料和纳米生物医药领域，具体涉及一种高效递送siRNA的载药纳米粒及其制备方法与应用。

背景技术

膀胱癌是常见的肿瘤恶性。据2018年美国癌症统计数据显示，仅在美国其新发病例大约7.7万，且发病率呈上升趋势。膀胱癌高昂的治疗费用及其高死亡率已成为全球严重的社会问题。辅助化疗可以降低癌症复发率，预防或延缓癌症的进展，然而，常规的化疗手段缺乏靶向性，所产生的严重的毒副作用极大的降低了患者顺应性和生存质量；相比而言，联合用药可降低明显降低单一药物的给药剂量，减少毒副作用的发生，已成为抗肿瘤化疗的研究热点。

我们研究发现，Sirtuin 1(去乙酰化酶1,SIRT1)在膀胱癌细胞中过表达，Sirtuin1与葡萄糖转运关键蛋白GLUT1表达正向相关，且Sirtuin 1的过表达可促进GLUT1蛋白的表达，进一步诱导肿瘤的糖代谢活跃而促肿瘤增殖；与之相反，SIRT1抑制剂则可降低GLUT1的表达，进而降低肿瘤细胞的糖摄取，诱导细胞凋亡。为此，我们创新性地提出SIRT1与肿瘤相互作用的新机制，即通过干扰GLUT1表达，实现对肿瘤的调控。基因药物是分子靶向治疗研究的一个重要方向，其可在基因水平抑制相关蛋白的表达，从而实现靶点的沉默效应。与传统化疗药物相比，基因药物可特异性抑制肿瘤而无明显毒副反应，然而，siRNA在体内稳定性、靶向性及细胞摄能力差，其在体内的输送需依赖递送载体。

槲皮素(Quercetin)是从豆科植物有效成分芦丁中提取的疏水性黄酮类化合物，属于酪氨酸激酶抑制剂(RTKs inhibitors)。研究表明，槲皮素可通过表皮生长因子受体(EGFR)介导的机制抑制基质金属蛋白酶9(MMP9)的分泌，从而限制肿瘤细胞的侵袭能力，抑制Twist基因表达从而诱导肿瘤细胞凋亡，显著抑制癌细胞的增殖，

专利CN112353950A公开了一种“以药载药”的siRNA纳米递送系统，利用槲皮素与siRNA通过π-π键、亲疏水作用和氢键作用自组装形成纳米药物，以期实现槲皮素与siRNA协同作用于肿瘤细胞，但是所述siRNA纳米递送系统存在明显缺陷：1)仅通过槲皮素包载siRNA的稳定性不高，在人体转运过程中容易裂解，递送效率不高；2)槲皮素与siRNA形成的纳米系统在被细胞摄入后，细胞中的溶酶体能够清除外源性大分子物质，同时溶酶体中富含的核酸酶对于进入细胞内的siRNA具有高效消化分解作用，会导致该纳米递送系统难以突破细胞自身的防御属性，也就难以进一步作用于抑制肿瘤细胞；3)该纳米递送系统不具有肿瘤靶向功能，不能实现对于肿瘤细胞的靶向作用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种高效递送siRNA的载药纳米粒及其制备方法与应用，其目的是构建一种高效递送siRNA的纳米粒子，既可以在人体中实现稳定转运，又能靶向目标肿瘤细胞，并且还可以突破细胞的溶酶体防御体系，最终实现对于肿瘤细胞的联合抑制，在膀胱癌基因药物治疗中具有良好的应用前景。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种高效递送siRNA的载药纳米粒，所述siRNA载药纳米粒由Zn²⁺、槲皮素、siRNA和苯硼酸-透明质酸共轭物通过自组装形成，所述Zn²⁺与槲皮素络合后包载siRNA形成载药内核，所述苯硼酸-透明质酸共轭物包裹载药内核组装成高效递送siRNA的载药纳米粒。

作为优选，所述siRNA为干扰去乙酰化酶基因表达的基因片段。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种高效递送siRNA的载药纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

S1、将槲皮素与无水乙醇混合，加热搅拌溶解后加入Na₂CO₃，继续搅拌1～2h，最后加入锕化锌，经过搅拌、抽滤、无水乙醇洗涤后再抽滤，得到槲皮素与Zn²⁺的络合物；

S2、在透明质酸水溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH4～5活化0.5～1h，再加入4-氨甲基苯硼酸密闭反应24～36h，透析除杂后收集固体，冷冻干燥得到苯硼酸-透明质酸共轭物；

S3、将步骤S1制备的槲皮素与Zn²⁺的络合物和siRNA混合，弱碱性环境恒温孵育1～2h，随后滴加步骤S2制备得到的苯硼酸-透明质酸共轭物，最后滴加缓冲液，恒温孵育1～2h后过滤干燥得到高效递送siRNA的载药纳米粒。

作为优选，所述步骤S1中槲皮素、Na₂CO₃和锕化锌的摩尔比为1:2:2～4。

作为优选，所述步骤S2中透明质酸、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和4-氨甲基苯硼酸的摩尔比为1:1～2:1～2:1～2。

作为优选，所述步骤S2中透明质酸的分子量为48～780kDa。

作为优选，所述槲皮素与Zn²⁺的络合物、siRNA和苯硼酸-透明质酸共轭物的摩尔比为20:1～2:2～4。

作为优选，所述步骤S3中恒温孵育温度为35～40℃。

作为优选，所述步骤S3中缓冲液为HEPES缓冲液。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种高效递送siRNA的载药纳米粒在制备膀胱癌的基因共载药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过槲皮素与Zn²⁺的络合，一方面可以增强槲皮素的活性，另一方面通过金属配位键包载siRNA，构建一种新型的以药(槲皮素)载药(siRNA)系统，增强siRNA递送效率，实现小分子药物与基因药物的共递送和协同治疗目的。

2、本发明通过苯硼酸-透明质酸共轭物来修饰包裹槲皮素包载siRNA后形成的内核，包裹后的内核稳定性显著提升，可以使得该siRNA载药纳米粒可以在人体稳定转运，有效避免药物的泄漏与降解，降低体系的毒副作用，还具备主动靶向能力；同时，可使两种药物以固定比例同时到达肿瘤细胞并发挥协同治疗的效应。

3、本发明利用Zn²⁺与siRNA磷酸骨架的共价配位作用形成磷酸锌配位键，将槲皮素与Zn²⁺的配位物和siRNA共同包载于核心，这可以显著提升siRNA包载的稳定性。

4、本发明方案中透明质酸与苯硼酸酰胺化反应形成的苯硼酸酯键，与Zn²⁺与siRNA磷酸骨架的共价配位作用形成磷酸锌配位键，共同组成本方案中siRNA载药纳米粒的双重酸敏官能团，在进入细胞内溶酶体酸性环境中迅速断裂，使载体有效解散；同时，磷酸锌配位键和苯硼酸酯键两个酸敏化学键溶酶体环境中迅速断裂过程中，会消耗大量H+从而诱发溶酶体内渗透压升高，以完成药物的溶酶体逃逸，促进药物的有效释放并发挥其相应的肿瘤细胞抑制作用。

5、本发明提供的高效递送siRNA的载药纳米粒制备方法简单可控，具有良好的生物安全性，为膀胱癌的基因协同治疗提供了一种新的角度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验例1测定siRNA/ZnQ-BHA粒径的透射电镜图，其中，图1(A)为粒径分布图；图1(B)为电镜图。

图2为本发明实验例2检测siRNA/ZnQ-BHA载药系统的体外稳定性结果，其中，图2(A)为siRNA/ZnQ-BHA稀释后稳定性；图2(B)为siRNA/ZnQ-BHA放置稳定性；图2(C)为siRNA/ZnQ-BHA在不同培养基的稳定性；图2(D)为游离siRNA和siRNA/ZnQ-BHA在牛血清中的稳定性。

图3为本发明实验例3检测siRNA/ZnQ-BHA结构中的槲皮素及siRNA在不同pH值下的释放情况，其中，图3(A)为槲皮素在不同pH值下的释放情况；图3(B)为siRNA在不同pH值下的释放情况。

图4为本发明实验例4流式细胞术检测对照组、游离siRNA、Lipofectamine 2000和FAM-NC/ZnQ-BHA的细胞摄取结果。

图5为本发明实验例4激光共聚焦显微镜观察对照组、游离siRNA、Lipofectamine2000和FAM-NC/ZnQ-BHA的细胞摄取结果。

图6为本发明实验例5中包载有FAM-siRNA的NC/ZnQ-BHA纳米粒、FAM-siRNA/Lipo以及Que/siRNA的溶酶体逃逸共聚焦显微镜结果。

图7为本发明实验例6中NC/ZnQ-BHA纳米粒、FAM-siRNA/Lipo以及Que/siRNA的溶血特性结果。

图8为本发明实验例7小鼠注射游离siRNA以及siRNA/ZnQ-BHA的体内分布结果。

图9为本发明实验例7荷瘤小鼠经5％葡萄糖溶液、游离siRNA组、游离槲皮素组、si-NC/ZnQ-BHA，si-SIRT1/ZnQ-BHA治疗后肿瘤生长结果。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1

槲皮素与Zn²⁺络合物(ZnQ)的制备

在装有搅拌器和冷凝管的100mL三口烧瓶中加入0.3mmol槲皮素和2.5mL无水乙醇，加热搅拌溶解得黄色澄清溶液，向该溶液中加入0.6mmol无水Na2CO3后继续搅拌1h，，然后加入0.6mmol无水Zn(Ac)₂回流搅拌4h，抽滤得浅棕色固体，将固体用热无水乙醇洗涤抽干得到ZnQ。

实施例2

苯硼酸-透明质酸共轭物(BHA)的制备

于100mL茄形瓶中加入分子量为48kDa的透明质酸0.5mmol，加入20mL去离子水溶解，投入EDC 0.75mmol和NHS 0.75mmol，完全溶解后，调节pH为4-5活化0.5h；称量4-氨甲基苯硼酸0.5mmol并加入上述混合液，密闭室温反应24h(pH维持在4-5)，透析4天除去未反应的4-氨甲基苯硼酸和其余杂质等，使用冷冻干燥机冻干，称量所得样品约4mg溶于0.5mL重水中，得到BHA溶液。

实施例3

高效递送siRNA的载药纳米粒(siRNA/ZnQ-BHA)的制备

取10μL实施例1制备的ZnQ(500mM)和10μL siRNA(4.8μM)混合均匀，37℃孵育1h；随后将20μL实施例2制备的BHA逐滴加入并混合均匀，37℃孵育1h；最后，逐滴加入20μLHEPES缓冲液混合均匀，37℃孵育1h，得到siRNA/ZnQ-BHA纳米粒(最终pH＝7.4)，4℃保存备用。

实验例1

实施例3制备的siRNA/ZnQ-BHA载药纳米粒的表征

A.采用动态光散射粒径仪(DLS)对制备的siRNA/ZnQ-BHA载药系统平均粒径，测定参数为10mW He-Ne激光(633nm)，散射角90°，温度为25度。

B.称取10μL siRNA/ZnQ-BHA样品滴加在镀有碳膜的铜网上自然挥干，使用JOEL100CX透射电子显微镜(电压100kV)观察并拍摄粒子表面形态及分布情况。

实验结果如图1所示，图1(A)为siRNA/ZnQ-BHA粒径分布图，实施例3制得的siRNA/ZnQ-BHA粒径分布均匀，平均粒径为150nm左右；图1(B)为siRNA/ZnQ-BHA电镜图，制得的纳米载药粒子球形度较高。

实验例2

siRNA/ZnQ-BHA载药系统的体外稳定性

A.稀释稳定性

取20μL siRNA/ZnQ-BHA纳米制剂，用OPTI-MEM分别稀释至原体积的8、16、32、64、128、256倍，使用马尔文激光粒度仪测定其粒径变化。

B.放置稳定性

按照上述的制备方法制备siRNA/ZnQ-BHA纳米制剂，室温分别放置1、3、5、7、10、30天，取出40μL测定其粒径大小。

C.在不同介质中的稳定性

按照上述的制备方法制备不同浓度的siRNA/ZnQ-BHA纳米制剂，各取40μL，分别使用Opti-MEM、无血清1640培养基、PBS、5％葡萄糖、HEPES缓冲液稀释10倍，测定其粒径大小。

D.血清保护评价

考察siRNA/ZnQ-BHA纳米粒在血清中的稳定性，即保护siRNA免遭RNA酶降解的能力。游离siRNA和siRNA/ZnQ-BHA分别与等体积胎牛血清混合(siRNA终浓度为1.2μM)，37℃孵育，分别于0h、3h、6h、12h、24h、36h取样，-20度中保存。取完所有样品后，各时间点样品加入含1mol/L HCl的6×RNA上样缓冲液，在含有0.5μg/mL Gelred的1％琼脂糖凝胶上80V电压电泳3min，再以100V电压电泳15min，ImagerQuant RT ECL凝胶成像系统观察gel red/siRNA荧光。

结果如图2所示，图2(A)表明siRNA/ZnQ-BHA经稀释1～256倍后，该载药纳米粒子尺寸基本无明显变化，稀释稳定性较好；图2(B)表明siRNA/ZnQ-BHA放置1～30天后，该载药纳米粒子尺寸基本等于制得的粒子原始尺寸，放置稳定性较好；图2(C)表明siRNA/ZnQ-BHA在不同介质中都能维持原本粒子大小；图2(D)为游离siRNA和siRNA/ZnQ-BHA在牛血清中的稳定性结果，由图2(D)凝胶成像结果可知，以游离siRNA为对照，siRNA/ZnQ-BHA中的siRNA可以抵抗牛血清蛋白的降解，24h小时内未见明显降解。

实验例3

siRNA及槲皮素释药特性

HPLC检测槲皮素的释放：制备系列浓度的槲皮素溶液，使用高效液相检测，绘制标准曲线；同时将制备好的制剂在不同pH(7.4和5.5)的PBS下孵育3h后，使用高效液相测定游离的槲皮素的浓度；凝胶阻滞法检测siRNA的释放：将制备好的制剂在不同pH(7.4和5.5)的PBS下孵育3h后使用1％的琼脂糖凝胶分析siRNA的释放情况。

结果如图3所示，图3(A)和图3(B)的结果表明siRNA/ZnQ-BHA中Zn²⁺与siRNA磷酸骨架的共价配位作用形成磷酸锌配位键和Zn²⁺与槲皮素形成的络合物可以在酸性环境中迅速断裂，槲皮素和siRNA在酸性环境可以快速释放，也表现出良好的酸敏感特征。

实验例4

siRNA/ZnQ-BHA的细胞摄取(以人膀胱癌5637细胞作为评价模型)

分别采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜考察siRNA/ZnQ-BHA制剂在人膀胱癌5637细胞中的靶向摄取能力及机制。

A.流式细胞术：分正常对照组，游离siRNA组，阳性对照Lipofectamine 2000组，FAM-NC/ZnQ-BHA共4组，人膀胱癌5637细胞以每孔20万接种于12孔板中，培养24h后更换为OPTI-MEM培养基，各载药纳米粒和阳性对照转染FAM-siRNA(siRNA终浓度为100nM)，37℃、5％CO₂孵育4h后，消化离心，预冷的PBS洗涤两遍并重悬细胞，立即利用流式细胞仪测量细胞中FAM荧光强度，采集10000个细胞，计算阳性细胞(即荧光强度大于10个单位的细胞)百分数和胞内平均荧光强度(MFI)，根据细胞的荧光值测定纳米载体被细胞摄取的效率。

B.激光共聚焦实验：分组同上，人膀胱癌5637细胞以每孔20万接种于直径35mm的玻底小皿中，培养24h后分别用不同载药纳米粒及Lipofectamine 2000在OPTI-MEM中转染FAM-siRNA(siRNA终浓度为100nM)，转染4h后用PBS洗涤细胞两次，加入细胞组织固定液室温固定15min，PBS洗两遍，加入2μg/mL Hoechst 33258室温染核25min，PBS洗两遍，封片液(甘油：PBS＝9:1)覆盖，使用激光共聚焦显微镜观察。

结果如图4和图5所示，其中图4表明流式细胞摄取实验中，siRNA/ZnQ-BHA相对于正常对照组，游离siRNA组，阳性对照Lipofectamine 2000组被细胞摄取比率较高，图5直观可见siRNA/ZnQ-BHA被细胞摄取的数量更多，由图4和图5可知本方案提供的siRNA/ZnQ-BHA更容易被细胞摄取，递送效率高。

实验例5

siRNA/ZnQ-BHA的溶酶体逃逸

共聚焦显微镜成像考察在5637细胞中siRNA在细胞内的动态分布及从溶酶体逃逸的情况：人膀胱癌5637肿瘤细胞按3×105个/孔的密度接种于直径35mm的玻底小皿中，贴壁生长24h后，加入包载FAM-siRNA的NC/ZnQ-BHA，FAM-siRNA/Lipo 2000以及单独槲皮素载siRNA(Que/siRNA)作为对照。OPTI-MEM培养基中孵育4h，FAM-siRNA的浓度设定为100nM，孵育温度为37℃，孵育完成后，预冷PBS洗涤3次，组织细胞固定液常温固定。LysoTracker Red荧光染料将溶酶体染成红色，染色完成后，立即在激光共聚焦显微镜下观察荧光情况。结果如图6所示，相比于lipo2000与单独槲皮素组，本实验设计的纳米制剂中siRNA荧光与LysoTracker荧光共定位层度差，提示其具有更好的溶酶体逃逸性能。

实验例6

红细胞溶血实验

体外模拟制剂的溶酶体逃逸行为，从SD大鼠眼静脉丛取血，4℃1500g离心10min，弃血清，用0.9％的生理盐水洗涤分离得到的血红细胞后，分别用pH 7.38、pH 6.64和pH5.60的PBS磷酸盐缓冲液混悬制成2％(v/v)血红细胞混悬液；96孔板中加入血细胞悬液100μL，再加入100μL PBS(阴性对照)、1％Triton X-100(阳性对照)或siRNA/ZnQ-BHA制剂，37℃孵育1h，完整的血红细胞通过离心去除，用Bio-Rad酶标仪测定上清液540nm处吸光度值，计算相对溶血率，相对溶血率用下面的公式计算：

[Abs]sample-[Abs]buffer)/([Abs]Triton X-100-[Abs]buffer)×100％。

实验结果如图7所示，由图7可知，纳米制剂的溶血率低于5％，表明该制剂具有较好的生物安全性，可直接用于静脉注射。

实验例7

siRNA/ZnQ-BHA的组织分布及体内抗肿瘤效应

1、BALB/c裸鼠原位膀胱癌疾病模型的构建

5637细胞培养于1640完全培养基中，待细胞汇合至90％，用0.25％胰酶消化，中和并离心，去除上清，重新将细胞悬浮于无血清1640培养基中，将细胞浓度调整至约2×107个/mL。取100μL细胞悬液(约2×106个)接种于雌性裸鼠第四乳垫下，生长3-4周，构建原位膀胱癌疾病模型。

2、体内组织分布与蓄积

肿瘤体积达到约300mm³时，尾静脉注射载有Cy5.5-siRNA的载体系统，给药剂量1mg/kg，分别在给药1h、24h后麻醉固定，用KODAK活体成像系统观察荧光。然后处死裸鼠，取出肿瘤和心、肝、脾、肺、肾观察，荧光图像由成像系统IS2000MM软件分析处理。结果如图8，通过小动物荧光活体成像发现，相比于游离siRNA，siRNA/ZnQ-BHA能更好的富集肿瘤组织(图中白色圈出部分)，提示纳米制剂可通过被动靶向效应选择性将siRNA递送至肿瘤组织，提高治疗效率。

3、体内抗肿瘤效应

肿瘤细胞接种后每天观察肿瘤生长情况，当平均肿瘤体积达到50mm³后，将裸鼠随机分为5组并标号，每组8只，采用尾静脉注射，分别给予5％葡萄糖溶液、游离siRNA组、游离槲皮素组、si-NC/ZnQ-BHA、si-SIRT1/ZnQ-BHA，siRNA的剂量为1mg/kg，隔天给药，共5次。从第一次给药起，每天观察肿瘤生长情况，用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，按公式V＝L×W2×0.52计算瘤体积，最后一次给药后2天处死，剥离肿瘤进行拍照和称重，绘制肿瘤体积-时间变化图。

图9为本发明实验例7荷瘤小鼠经不同药剂治疗后肿瘤生长情况，结果表明注射5％葡萄糖溶液、游离siRNA组和游离槲皮素组后小鼠肿瘤细胞均在继续快速生长；注射si-NC/ZnQ-BHA对于肿瘤的生长有一定的抑制作用，但是随着时间的推移抑制效果减弱，肿瘤重新开始长大；注射siRNA/ZnQ-BHA后可以实现抑制肿瘤生长，并减小肿瘤体积，且作用持续有效，提示siRNA/ZnQ-BHA中的siRNA与小分子槲皮素高效递送进入了肿瘤细胞，对肿瘤细胞的生长进行抑制并可以对肿瘤细胞进行靶向杀伤。

Claims (10)

1.一种高效递送siRNA的载药纳米粒，其特征在于，所述siRNA载药纳米粒由Zn²⁺、槲皮素、siRNA和苯硼酸-透明质酸共轭物通过自组装形成，所述Zn²⁺与槲皮素络合后包载siRNA形成载药内核，所述苯硼酸-透明质酸共轭物包裹载药内核组装成高效递送siRNA的载药纳米粒。

2.根据权利要求1所述高效递送siRNA的载药纳米粒，其特征在于，所述siRNA为干扰去乙酰化酶基因表达的基因片段。

3.一种如权利要求1所述高效递送siRNA的载药纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将槲皮素与无水乙醇混合，加热搅拌溶解后加入Na₂CO₃，继续搅拌1～2h，最后加入锕化锌,经过搅拌、抽滤、无水乙醇洗涤后再抽滤，得到槲皮素与Zn²⁺的络合物；

S2、在透明质酸水溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH4～5活化0.5～1h，再加入4-氨甲基苯硼酸密闭反应24～36h，透析除杂后收集固体，冷冻干燥得到苯硼酸-透明质酸共轭物；

S3、将步骤S1制备的槲皮素与Zn²⁺的络合物和siRNA混合，弱碱性环境恒温孵育1～2h，随后滴加步骤S2制备得到的苯硼酸-透明质酸共轭物，最后滴加缓冲液，恒温孵育1～2h后过滤干燥得到高效递送siRNA的载药纳米粒。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中槲皮素、Na₂CO₃和锕化锌的摩尔比为1:2:2～4。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中透明质酸、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和4-氨甲基苯硼酸的摩尔比为1:1～2:1～2:1～2。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中透明质酸的分子量为48～780kDa。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述槲皮素与Zn²⁺的络合物、siRNA和苯硼酸-透明质酸共轭物的摩尔比为20:1～2:2～4。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中恒温孵育温度为35～40℃。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中缓冲液为HEPES缓冲液。

10.一种如权利要求1～2任一项所述的高效递送siRNA的载药纳米粒或如权利要求3～9任一项所述的制备方法得到的高效递送siRNA的载药纳米粒在制备膀胱癌的基因共载药物中的应用。

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