CN112353950A - 一种siRNA纳米递送系统的制备方法及其在前列腺癌中的应用 - Google Patents

一种siRNA纳米递送系统的制备方法及其在前列腺癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型siRNA纳米递送系统的制备及其在前列腺癌中的应用。制备方法是将靶向skp2的siRNA与天然黄酮类药物槲皮素通过氢键，π‑π作用，疏水作用组装形成纳米粒子。本发明可将槲皮素和siRNA同时携带进入前列腺肿瘤细胞，二者协同促进skp2蛋白下调，抑制前列腺癌细胞增殖迁移。本发明通过分子水平及体外活性评价，证明了该系统优于同时输送各单一组分，能够显著提高其抗癌活性，具有明确的协同治疗效果。本发明抗肿瘤效果明确，所用材料均有抗肿瘤效果，且具有良好生物相容性、可生物降解性、无毒性。制备工艺简单，易于操作。

Description

一种siRNA纳米递送系统的制备方法及其在前列腺癌中的 应用
技术领域
本发明属于纳米药物领域，具体地涉及以槲皮素为载体递送siRNA的制备方法及其在前列腺癌中的应用。
背景技术
siRNA可以选择性下调靶基因，在多种疾病治疗中具有广泛的应用前景。然而，由于siRNA不易递送，降低了其治疗效果。因此，在基于siRNA治疗的临床转化中，一个好的递送系统起到了重要的作用。目前，阳离子聚合物及脂质体是siRNA递送主要的载体。然而，这些载体由于带正电荷，易产生潜在毒性，限制了其在临床上的应用。除此之外，阳离子纳米复合物会吸附血浆蛋白，导致其易被网状内皮系统清除。因此，急需开发一种新型的siRNA递送系统。
槲皮素是一种黄酮醇类化合物，具有抗氧化，抗癌的作用。其可以通过促进肿瘤细胞凋亡和细胞周期停滞而抑制肿瘤细胞增殖。有研究表明，药物之间可以通过亲疏水作用和氢键作用进行自组装形成纳米颗粒，协同发挥抗癌效果。受此启发，本发明设计利用槲皮素（Quercetin,Que）与siRNA 通过π-π作用、亲疏水作用和氢键作用自组装形成纳米药物，递送siRNA。该siRNA纳米粒子中的槲皮素不仅可作为载体，也具有抗癌活性，与siRNA共同发挥双重抗肿瘤效果。该发明以药物作为载体进行制备siRNA递送系统，实现“ 零载体”概念。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型siRNA纳米递送系统的制备及其在前列腺癌中的应用。本发明新型siRNA纳米粒子是利用靶向skp2的siRNA与具有抗肿瘤效果的天然黄酮类药物槲皮素通过氢键，π-π作用，疏水作用，组装形成纳米粒子。本发明可将槲皮素和siRNA同时携带进入前列腺肿瘤细胞，二者协同促进skp2蛋白下调，抑制前列腺癌细胞增殖迁移。siRNA序列：sense5'-3'：GGAGUGACAAAGACUUUGU，antisense5'-3'：ACAAAGUCUUUGUCACUCC。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种新型siRNA纳米粒子的制备方法，所述新型siRNA纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
1）在无菌操作台中将 5 nmol siRNA 干粉溶于25 ul DMSO配成 200 uM，0.0035 g槲皮素粉末（Quercetin,Que）在1158.12 ul DMSO 中充分溶解,配制成10 mM（浓度）；
2） 取步骤1）槲皮素母液1 ul与10 ul siRNA 溶液充分混匀，轻微震荡 10 s，再加入89 ul DEPC 水充分混匀；
3）将步骤2）所得溶液 置于金属浴中 95℃中反应 5 min，缓慢降至室温；
4) 将步骤3）所得溶液用透析管（100kDa）透析24h，换4次DEPC水，除去未反应的槲皮素与siRNA，即得槲皮素与siRNA自组装纳米粒子，置于 4℃ 保存备用。
本发明的有益效果在于：本发明设计利用槲皮素（Quercetin,Que）与siRNA 通过π-π作用、亲疏水作用和氢键作用自组装形成纳米药物，递送siRNA。该siRNA纳米粒子中的槲皮素不仅可作为载体，也具有抗癌活性，与siRNA共同发挥双重抗肿瘤效果。该发明以药物作为载体进行制备siRNA递送系统，实现“ 零载体”概念。
附图说明
图1为本发明新型siRNA纳米递送系统的透射电镜图。
图2为前列腺癌细胞对本发明siRNA纳米递送系统或游离siRNA的摄取图。
图3为槲皮素（Que）或同时单独加槲皮素与游离siRNA（siSkp2+Que）或对照siRNA纳米递送系统（siNC/Que NPs）或本发明skp2沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）对前列腺肿瘤细胞的skp2靶蛋白的抑制效果。
图4为同时单独加槲皮素与游离siRNA（siSkp2+Que）或对照siRNA纳米递送系统（siNC/Que NPs）或skp2沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）对前列腺肿瘤细胞生长的抑制效果。
图5为本发明同时单独加槲皮素与游离siRNA（siSkp2+Que）或对照siRNA纳米递送系统（siNC/Que NPs）或skp2沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）对前列腺肿瘤细胞迁移的抑制效果。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1 新型siRNA纳米粒子的制备：
在无菌操作台中将 5 nmol siRNA 干粉溶于25 ul DMSO配成 200 uM，0.0035g槲皮素粉末（Quercetin,Que）在1158.12 ul DMSO 中充分溶解,配制成10mM （浓度）；槲皮素母液1ul与10 ul siRNA 溶液充分混匀，轻微震荡 10 s，再加入89 ul DEPC 水充分混匀；将所得溶液置于金属浴中 95℃中反应 5 min，缓慢降至室温；用透析管（100kDa）透析24h，换4次DEPC水，除去未反应的槲皮素与siRNA，即得槲皮素与siRNA自组装纳米粒子，置于 4℃ 保存备用。
图1为所得新型siRNA纳米递送系统的TEM图。图中可以看出其为单分散、平均粒径77.4 nm的球形纳米粒子。
实施例2 前列腺细胞对本发明siRNA纳米递送系统与游离siRNA的摄取能力考察
1. 制备Cy5-siSkp2和Cy5-siSkp2/Que NPs：
为确定siRNA纳米递送系统是否可以有效促进siRNA被细胞摄取，设计siRNA的antisense链5’端修饰Cy5荧光分子，从上海吉玛制药技术有限公司订购。用标记有Cy5荧光分子的siRNA(Cy5-siSkp2)按实施例1合成新型siRNA纳米粒子（Cy5-siSkp2/Que NPs）。
2. Cy5-siSkp2和Cy5-siSkp2/Que NPs的细胞摄取实验：
将培养的前列腺癌细胞用 0.05%胰酶消化，然后重悬在含有终浓度10%FBS， 1%双抗的1640 完全培养基中并计数；将均匀分散好的细胞接种在共聚焦皿中， 3 ×104 个细胞/皿；在含 5% CO2 的培养箱中孵育 24 h，然后将 Cy5-siRNA/Que NPs 或游离Cy5-siRNA分散在 500 μL 培养基溶液并加到相应的共聚焦皿中，轻柔混合均匀后继续在培养箱中孵育 4 h；吸出培养基，用无菌 PBS 清洗 3 次；加入 Hoechst 33342（10 μg/mL）染液，用于细胞核的染色； 15 min 后吸出染液，并用无菌 PBS 轻柔洗 3 次，使用激光共聚焦显微镜系统采集荧光图像。
图2 为前列腺癌细胞H33342对本发明siRNA纳米递送系统或游离siRNA的摄取图：结果显示与游离的 Cy5-siSkp 2 相比，细胞浆中 Cy5-siSkp2/Que NPs 的荧光更强， 说明siSkp2 与 Que NPs 形成纳米递送系统后更易被细胞摄取， 有利于 siSkp2 发挥基因沉默的作用。
实施例3 本发明新型siRNA纳米递送系统对前列腺肿瘤细胞的skp2靶蛋白的抑制效果考察。
1.游离siRNA与槲皮素混合组（siSkp2+Que），对照siRNA纳米递送系统组（siNC/Que NPs）siSkp2 沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）的制备：
为比较siRNA纳米递送系统是否可以有效递送siRNA,提高siRNA的治疗效果。设计游离siRNA与槲皮素混合组（siSkp2+Que），对照siRNA纳米递送系统组（siNC/Que NPs）作为对照。siSkp2+Que：游离的siRNA与培养液混合加样，再加入槲皮素。siNC/Que NPs：从上海吉玛制药技术有限公司订购作为随机对照的无作用的siRNA,命名为siNC，序列为：sense（5'-3'）：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，antisense（5'-3'）：ACGUGACACGUUCGGAGA ATT。按实施例1合成对照siRNA纳米粒子（siNC/Que NPs）。从上海吉玛制药技术有限公司订购skp2沉默性siRNA。siRNA序列：sense（5'-3'）：GGAGUGACAAAGACUUUGU，antisense（5'-3'）：ACAAAGUCUUUGUCACUCC。按实施例1所述方法制备siSkp2 沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）
2.蛋白质印迹实验
1）将细胞接种至 6孔板中培养，细胞贴壁后加入不同浓度槲皮素，以及siSkp2+Que，siNC/Que NPs，siSkp2/Que NPs。另外，设置一组空白对照组（control组）即不加任何药物处理，其他操作相同的组别。药物与细胞孵育30h后，用细胞刮刀收取细胞；按照 100:1 的比例加入 RIPA（裂解液） :PMSF（蛋白酶抑制剂）；用BCA 试剂盒测定所提取蛋白的浓度。
2）蛋白变性： 取提好的蛋白上清于新的 1.5 mL 离心管中，加入 5× loadingbuffer混匀（二者体积比为 4:1）；上述离心管夹好防爆夹后，置于 100℃沸水煮 10 min，接着冷却至室温，放于-20℃保存备用；
3）制胶：先制分离胶，加入 200 μL 异丙醇封顶，凝胶洗净，再制浓缩胶；上样：按Marker 4 μL，Tubulin 5 μg，目的蛋白skp2 25 μg 的上样量上样，先在 90 V 电压下电泳至溴酚蓝染料从浓缩胶进入分离胶后，将电压调至120 V 继续电泳；
4）转膜： PVDF 膜先在甲醇中浸泡 30 s，再放入电转液中， 100 V 转膜 1 h（具体时间根据蛋白分子量大小调整）；
5）封闭：取 PVDF 膜，蛋白面朝上， 放入 TBST 中洗 5 min，封闭 1 h，再放入 TBST洗 10 min 倒掉，重复一次；
6）抗体孵育：将封闭好的 PVDF 膜放入稀释后的一抗（skp2（D3G5）XP Rabbit mAb）中，封口室温孵育 1h 后再放于 4℃孵育过夜，后用 TBST 洗 3 次， 每次 5 min；加入二抗（Anti-rabbit lgG,HRP-linked Antibody），室温孵育 1 h，后用 TBST 洗 3 次， 每次 8min；
7）显影：将膜放入化学发光成像仪中，利用 ECL 发光液进行显影并拍照。
图3A 结果显示， 与空白对照组（control组）相比，槲皮素（Que） 可以下调前列腺癌细胞中 Skp2 的蛋白表达量，但是需要达到比较高的浓度。图3B结果显示， 在前列腺癌细胞中，siSkp2 沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）能够提高 siRNA 沉默靶基因 Skp2 在蛋白水平表达的能力。
实施例4 本发明新型siRNA纳米递送系统对前列腺癌细胞增殖及迁移能力考察
1.游离siRNA与槲皮素混合组（siSkp2+Que），对照siRNA纳米递送系统组（siNC/QueNPs）siSkp2 沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）的制备
按实施例3所述方法制备游离siRNA与槲皮素混合组（siSkp2+Que），对照siRNA纳米递送系统组（siNC/Que NPs），siSkp2 沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）。
2. 采用实时无标记细胞分析仪记录细胞生长曲线，每2天加一次药，监测4天。考察同时单独加槲皮素与游离siRNA（siSkp2+Que）或对照siRNA纳米递送系统（siNC/QueNPs）或skp2沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）对前列腺肿瘤细胞生长的抑制效果，并与空白对照组（control组）进行对比。空白对照组即不加任何药物处理，其他操作相同的组别。
如图4结果所示，与空白对照组（control组）相比，skp2沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）对前列腺肿瘤细胞生长有明显的抑制作用，且抑制效果显著强于单独加槲皮素与游离siRNA组（siSkp2+Que）以及对照siRNA纳米递送系统组（siNC/Que NPs）。
3.采用transwell技术检测游离siRNA与槲皮素混合组（siSkp2+Que），对照siRNA纳米递送系统组（siNC/Que NPs）和siSkp2 沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）对细胞迁移能力的影响：
将培养的前列腺癌细胞用 0.05%胰酶胰酶消化，然后重悬在含有10%胎牛血清， 1%双抗的 1640 完全培养基中并计数；将均匀分散好的细胞以8 ×104 个细胞/孔接种于transwell小室中，下室加入500 µL含有 10%胎牛血清，1%双抗的1640完全培养基，在含 5%CO2 的培养箱中孵育；待细胞贴壁后，将上室换成含有siSkp2+Que、siNC/Que NPs或siSkp2/Que NPs的无血清培养基，轻柔混合均匀后继续在培养箱中孵育 24 h；另外，设置一组空白对照组（control组）即不加任何药物处理，其他操作相同的组别。弃上下室培养液，用湿润的棉签轻柔擦拭上室内表面未迁移的细胞，用PBS洗后吸干液体；每个小室加1mL 4%多聚甲醛固定15 min，弃固定液，倒置风干；用PBS洗，再用500 µL 0.1%结晶紫染色15min，弃染色液；再用PBS洗，用棉签擦拭多余液体，晾干；显微镜观察拍照，随机选取5个细胞均匀穿膜的视野（200 X）。
由图5结果显示，与空白对照组（control组）相比，skp2沉默性siRNA纳米递送系统（siSkp2/Que NPs）对前列腺肿瘤细胞迁移能力的抑制作用显著，且明显强于单独加槲皮素与游离siRNA组（siSkp2+Que）以及对照siRNA纳米递送系统组（siNC/Que NPs）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 闽江学院
<120> 一种siRNA纳米递送系统的制备方法及其在前列腺癌中的应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggagugacaa agacuuugu 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acaaagucuu ugucacucc 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (5)

1.一种siRNA纳米粒子，其特征在于，包含槲皮素和skp2沉默性siRNA；siRNA序列：sense5'-3'：GGAGUGACAAAGACUUUGU，antisense5'-3'：ACAAAGUCUUUGUCACUCC。
2.根据权利要求1所述的siRNA纳米粒子，其特征在于，skp2沉默性siRNA最终浓度为10μM-40μM，槲皮素浓度为50μM -200μM。
3.根据权利要求1所述的siRNA纳米粒子，其特征在于，skp2沉默性siRNA最终浓度为优选20μM；槲皮素浓度为100μM。
4.一种如权利要求1所述siRNA纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述siRNA属纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
1）在无菌操作台中将siRNA 干粉溶于DMSO中制备得到siRNA 溶液，槲皮素粉末在DMSO中充分溶解，得到槲皮素母液；
2） 取步骤1）槲皮素母液与siRNA 溶液充分混匀，轻微震荡 10 s，再加入到DEPC 水中，充分混匀；
3）将步骤2）所得溶液置于金属浴中 95℃中反应 5 min，缓慢降至室温；
4) 将步骤3）所得溶液用100kDa透析管透析24h，换4次水，除去未反应的槲皮素与siRNA，即得槲皮素与siRNA自组装纳米粒子，置于 4℃ 保存备用。
5.如权利要求1所述的新型siRNA纳米粒子在制备抗前列腺癌药物中的应用。
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