CN113181374B - 一种球形microRNA及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体提供一种球形microRNA及其制备方法和应用，所述球形microRNA，其通过非编码单链核苷酸与纳米金偶联后经氰化钾溶解构建而成；所述非编码单链核苷酸含有两个茎环结构，且反义链的5’末端含有巯基修饰，可与纳米金通过金‑硫键结合。所制备的球形microRNA对胃癌细胞具有抑制作用，可应用于食管癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤的治疗。

Description

一种球形microRNA及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体提供了一种球形microRNA及其制备方法和应用，进一步地涉及一种纳米金miR-193b微球及其制备方法和应用。
背景技术
胃癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，大部分病例来自亚洲，为国内发病率排名第二的恶性肿瘤，对人民的生命健康造成了巨大威胁。早期诊断和治疗对早期胃癌有重要作用，可有较长生存质量和生存期。而晚期患者，经常转移扩散，即使手术治疗后进行化疗、放疗，仍然预后较差。而我国胃镜常规检查未普及，胃癌发现事已处于进展期，给胃癌的临床治疗带来了很大的困难。胃癌的侵袭和转移是影响病人预后的重要因素，目前对于癌基因和抑癌基因参与胃癌转移已有一定结论，但相关分子机制仍不明确，其重要信号通路及关键分子靶标的研究受到越来越多的关注。
微小RNA(microRNA, miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为18-24 个核苷酸的非编码单链小RNA分子，参与转录后基因表达调控。目前，miRNA在肿瘤发生发展中的作用受到广泛关注，它表达的改变与肿瘤的进展和预后高度相关，在人体细胞中发挥重要的作用。miRNA的表达水平能够调节肿瘤发生的重要生物学过程，包括细胞分化、增殖和凋亡等。在胃癌中miRNA的异常表达也会对疾病的进程产生促进或者抑制作用。对于致癌的miRNA，用miRNA抑制剂可以有效地抑制miRNA在体内的功能；而对于肿瘤抑制性miRNA，用miRNA模拟物可起到抗肿瘤作用。因此，某些miRNA甚至可以作为癌症诊断和治疗的靶标，影响了肿瘤细胞内生物学通路并获得良好的治疗效果。每个miRNA可调控多至200个目标基因的表达，因此估计有1/3~1/2的蛋白质编码基因的表达受到 miRNA 的调节。同时一个目标基因也可受多个miRNA调节，从而miRNA与其靶基因间形成一个复杂的调节网络，实现对细胞及个体生命活动的调控。
前期研究中，我们发现转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可以促进胃癌细胞的侵袭和转移，同时应用miRNA芯片检测了TGF-β1处理胃癌细胞后microRNA表达谱的变化，发现TGF-β1能够下调miR-193b的表达。进一步研究发现miR-193b瞬时转染胃癌细胞后，miR-193b的表达水平升高，Transwell实验和裸鼠成瘤实验表明：升高miR-193b能够抑制腹腔肝脏转移瘤的形成，降低胃癌细胞侵袭转移的能力；miR-193binhibitor瞬时转染胃癌细胞后，抑制了miR-193b的表达，Transwell实验、划痕实验和裸鼠成瘤实验表明胃癌细胞BGC823的运动、迁移、侵袭和转移的能力明显增强。由此提示：miR-193b可能通过靶向胃癌中高水平表达的uPA基因，调节其蛋白表达，抑制其下游ECM的降解，从而抑制胃癌细胞的侵袭和转移。
人microRNA-193b(hsa-mir-193b)位于16号染色体上，前体序列为GUGGUCUCAGAAUCGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGAGUUUAUGUUUUAUCCAACUGGCCCUCAAAGUCCCGCUUUUGGGGUCAU，含有两个成熟microRNA: hsa-miR-193b* (序列为CGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGA)和hsa-miR-193b(序列为AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU)。研究证实，miR-193b与胃癌细胞BGC823的浸润转移有关，下调miR-193b的表达，具有增强胃癌细胞浸润转移的能力。它主要通过调控尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-plasminogenactivator, uPA)负向影响胃癌细胞浸润转移。在胃癌细胞 BGC823中uPA作为miR-193b的直接靶点，miR-193b通过抑制uPA转录后翻译影响uPA的蛋白表达，调控胃癌的浸润转移能力。同样的，在乳腺癌中miR-193b的下调，增加了uPA的表达，促进了人乳腺癌的侵袭、浸润和转移。且miR-193b能通过诱导细胞周期阻滞，抑制人原发性肝癌的侵袭和转移。在人子宫内膜腺癌组织中，miR-193b也有明显下调。因此，miR-193b与肿瘤的发生、转移和浸润有着密切的关系。
分子靶向性研究主要通过病毒载体、质粒载体、脂质体介导、转染等方法将miRNA导入细胞中。纳米技术的应用解决了上述方法中存在的免疫反应、细胞毒性、低靶向性和携带效率低等不良作用。而球形microRNA能够进入细胞或动物组织而不借助其他载体，规避了其它载体引入所带来的毒副作用，表面的核苷酸能够抵抗核酸酶的降解作用，更加稳定且免疫反应小，进入细胞后有较强靶向性，针对肿瘤细胞进行治疗。至今尚未有应用球形microRNA治疗胃癌的应用报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种球形microRNA及其制备方法和应用，所述球形microRNA由miR-193b通过采用巯基偶联形成纳米金制剂后，经氰化钾溶解形成。所制备的球形microRNA对胃癌细胞具有抑制作用，可应用于食管癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤的治疗。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种球形microRNA，其通过非编码单链核苷酸与纳米金偶联后经氰化钾溶解构建而成。所述球形microRNA形成过程如下：首先非编码单链核苷酸与纳米金通过金-硫键结合，以纳米金为核，miR-193b通过金-硫键结合于纳米金表面；其次，通过氰化钾溶解纳米金内核，从而构建形成球形microRNA。
进一步地，所述非编码单链核苷酸含有两个茎环结构，且反义链的5’末端含有巯基修饰，可与纳米金通过金-硫键结合。
进一步地，所述非编码单链核苷酸为含有22个碱基的非编码单链miR-193b，或者，与单链miR-193b序列同源性在95~100%编码相同功能单链核苷酸。
进一步地，所述非编码单链核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体结构为：AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU；本发明所述非编码单链核苷酸结构能够使单链miR-193b进入细胞后能顺利被酶切出成熟的miR-193b序列。
另一方面，本发明还提供了一种球形microRNA的制备方法，包括以下步骤：
1）纳米金制备：将HAuCl4水溶液加热冷凝回流后加入柠檬酸水溶液进行反应制得柠檬酸钠稳定的纳米金；
2）偶联：将步骤1）制备的纳米金与经TCEP预处理的miR-193b混合孵育后，滴加NaCl溶液，孵育过夜；
3）纯化处理：将步骤2）所得样品离心、重悬处理后，得到纳米金miR-193b偶联物；
4）球形microRNA制备：将步骤3）所得产品经KCN处理后透析获得microRNA。
进一步地，所述纳米金制备过程如下：向HAuCl4水溶液中加入水，加热并冷凝回流后向其中快速加入柠檬酸钠水溶液，继续回流后停止加热，搅拌冷却至室温，离心即可收集得到柠檬酸钠稳定的纳米金。
进一步地，所述纳米金制备过程如下：向三颈圆底烧瓶中加入98 mL水和2 mL浓度为50 mM的HAuCl4水溶液，150℃加热并冷凝回流；然后向其中快速加入1 mL浓度为388 mM的柠檬酸钠水溶液，继续回流20 min后停止加热，搅拌冷却至室温，16000 rpm离心10 min即可收集得到柠檬酸钠稳定的纳米金。
进一步地，所述偶联步骤如下：取步骤1）制备的纳米金，加入经TCEP预处理的miR-193b，混合孵育后，向其中滴加NaCl溶液，使NaCl终浓度为50 mM；其后每一段时间滴加一次NaCl，增加NaCl浓度50 mM；待NaCl浓度达到300 mM，将样品孵育过夜。
进一步地，所述偶联步骤如下：取10 mL步骤1）制备的纳米金（10 nM），加入经TCEP预处理的miR-193b，使miR-193b与纳米金的摩尔比为300:1，混合孵育16 h；然后向其中滴加浓度为1 M的NaCl溶液，使NaCl终浓度为50 mM；其后每8 h滴加一次NaCl，增加NaCl浓度50 mM；待NaCl浓度达到300 mM，将样品孵育过夜。
进一步地，所述经TCEP预处理的miR-193b制备过程如下：a)设计并化学合成单链miR-193b核苷酸，序列为：AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU；b)miR-193核苷酸预处理：取miR-193b核苷酸，溶于超纯水，分装避光保存于-80℃冰箱；使用时取适量于无酶管中，加入TCEP溶液（终浓度1 mM），然后于室温孵育1 h，即得。TCEP溶液为三(2-羧乙基)膦溶液。
进一步地，所述纯化处理过程如下：将将步骤2）所得样品离心，弃上清，沉淀加PBS重悬，重复离心及重悬过程3次，得到纳米金miR-193b偶联物。
进一步地，所述纯化处理过程如下：将将步骤2）所得样品16000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀加0.5 mL PBS重悬，重复离心及重悬过程3次，得到纳米金miR-193b偶联物。
进一步地，所述球形microRNA制备过程如下： 向纯化处理的纳米金miR-193b偶联物中加入 KCN，混匀后将其置于振荡器上，振荡后将其转移至透析袋中，分别在NaCl溶液和PBS缓冲液中透析，即得球形microRNA。
进一步地，向纯化处理的纳米金miR-193b偶联物中加入1M KCN 30 μL，混匀后将其置于振荡器上，800 rpm振荡30 min；然后将其转移至透析袋（MWCO=5 kDa）中，分别在0.5M NaCl溶液和PBS缓冲液中透析1 d，即得球形microRNA。
另一方面，本发明还提供了一种球形microRNA的制备方法，包括以下步骤：
1）纳米金制备：向三颈圆底烧瓶中加入水和HAuCl4水溶液，加热并冷凝回流；然后向其中快速加入柠檬酸钠水溶液，继续回流后停止加热，搅拌冷却至室温，离心即可收集得到柠檬酸钠稳定的纳米金；
2）偶联： 取收集重悬的纳米金，加入经TCEP预处理的miR-193b，使miR-193b与纳米金的摩尔比为300:1，混合孵育；然后向其中滴加NaCl溶液，使NaCl终浓度为50 mM；其后每8 h滴加一次NaCl，增加NaCl浓度50 mM；待NaCl浓度达到300 mM，将样品孵育过夜；
3）纯化处理： 将上述样品离心，弃上清，沉淀加PBS重悬，重复上述离心及重悬过程3次，得到纳米金miR-193b偶联物；
4）球形microRNA制备： 向纯化处理的纳米金miR-193b偶联物中加入KCN，混匀后将其置于振荡器上，振荡；然后将其转移至透析袋中，分别在NaCl溶液和PBS缓冲液中透析，即得球形microRNA。
进一步地，所述方法的步骤如下：
1）纳米金制备：向三颈圆底烧瓶中加入98 mL水和2 mL浓度为50 mM的HAuCl4水溶液，150℃加热并冷凝回流；然后向其中快速加入1 mL浓度为388 mM的柠檬酸钠水溶液，继续回流20 min后停止加热，搅拌冷却至室温，16000 rpm离心10 min即可收集得到柠檬酸钠稳定的纳米金；
2）偶联： 取10 mL收集重悬的纳米金（10 nM），加入经TCEP预处理的miR-193b，使miR-193b与纳米金的摩尔比为300:1，混合孵育16 h；然后向其中滴加浓度为1 M的NaCl溶液，使NaCl终浓度为50 mM；其后每8 h滴加一次NaCl，增加NaCl浓度50 mM；待NaCl浓度达到300 mM，将样品孵育过夜；
3）纯化处理： 将上述样品16000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀加0.5 mL PBS重悬，重复上述离心及重悬过程3次，得到纳米金miR-193b偶联物；
4）球形microRNA制备： 向纯化处理的纳米金miR-193b偶联物中加入1M KCN 30 μL，混匀后将其置于振荡器上，800 rpm振荡30 min；然后将其转移至透析袋（MWCO=5 kDa）中，分别在0.5 M NaCl溶液和PBS缓冲液中透析1 d，即得球形microRNA。
另一方面，本发明还提供了一种球形microRNA在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
进一步地，所述癌症包括胃癌、食管癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌和子宫内膜癌。
microRNA（miR）是一种是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与转录后基因表达调控。在胃癌细胞中，miR-193b表达降低，而外源性的导入miR-193b可抑制肿瘤增殖与迁移，是潜在基因治疗药物，但其在生理环境下极易降解，且无法自由跨过细胞膜。为解决以上问题，本发明对miR-193b进行巯基修饰，通过金-硫键将该miR键合于纳米金表面，形成高密度核壳结构；进一步加入氰化钾，溶解纳米金内核，构建球形microRNA，从而规避纳米金导致的潜在毒副作用。该球形核酸可显著增强miR在生理条件的稳定性，并可自由通过肿瘤细胞，实现对胃癌增殖与迁移的抑制。本发明所述球形microRNA形成过程如下：首先miR-193b与纳米金通过金-硫键结合，以纳米金为核，miR-193b通过金-硫键结合于纳米金表面；其次，通过氰化钾溶解纳米金内核，从而构建形成球形microRNA。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明首先对miR-193b进行巯基修饰，然后通过金-硫键将该miR-193b键合于纳米金表面，形成高密度核壳结构；进一步加入氰化钾，溶解纳米金内核，构建球形microRNA，从而规避纳米金导致的潜在毒副作用。该球形microRNA可显著增强miR-193b在生理条件的稳定性，并可自由通过肿瘤细胞，实现对胃癌增殖与迁移的抑制。
本发明的球形microRNA具有良好的药学特性，在4℃的PBS或超纯水溶液中有很好的稳定性，无须外源性的载体或转染试剂就能进入细胞，有效提高miR-193b的表达量，有效抑制了肿瘤的浸润和迁移。该球形microRNA在体外对胃癌细胞以及在体内对胃癌裸鼠移植瘤都具有显著的抑制生长作用，在胃癌的治疗应用方面效果显著，将来还可应用于其他消化系统肿瘤和乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
球形microRNA制备过程的表征图：
图1为纳米金与加入KCN的纳米金miR-193b偶联物的紫外吸收光谱。与纳米金（AuNPs）相比，加入KCN的纳米金miR-193b偶联物(S-miR)的最大吸收峰蓝移，证明纳米金核心的逐渐溶解。
图2为纳米金（AuNPs）和球形microRNA（记为S-miR）的粒径分布图。球形microRNA较纳米金粒径增大。
图3为球形microRNA在PBS和10% DMEM中的稳定性，在48 h内粒径均无明显变化。
图4为游离microRNA和球形microRNA（记为S-miR）在不同浓度FBS中的稳定性，游离microRNA在FBS中易被降解，而球形microRNA可维持其在FBS中的稳定性。
图5为以RAW264.7细胞为模型细胞，对游离microRNA和球形microRNA（记为S-miR）的摄取荧光成像图。可见游离microRNA不能有效的进入细胞，而球形microRNA无转染试剂即可高效进入细胞。
图6为经不同处理后胃癌细胞内uPA mRNA的表达水平。可见与空白对照、游离microRNA和球形随机序列（记为S-RS）相比，球形microRNA（记为S-miR）处理可明显降低细胞内uPA mRNA的表达水平。
图7为经不同处理后胃癌细胞内uPA蛋白的表达水平。可见与空白对照、游离microRNA和球形随机序列（记为S-RS）相比，球形microRNA处理可明显降低细胞内uPA蛋白的表达水平。
图8为不同浓度球形microRNA对胃癌细胞增殖的抑制作用，可见球形microRNA可明显抑制胃癌细胞的增殖。
图9为经不同处理后胃癌细胞的侵袭和迁移的能力，可见球形microRNA可明显抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。
图10为裸鼠胃癌细胞BGC823移植瘤的体积-时间曲线。可见与PBS、游离microRNA和球形随机序列（记为S-RS）相比，球形microRNA可显著抑制肿瘤的生长。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
球形microRNA制备方法，步骤如下：
1）纳米金制备：向三颈圆底烧瓶中加入98 mL水和2 mL浓度为50 mM的HAuCl4水溶液，150℃加热并冷凝回流。然后向其中快速加入1 mL浓度为388 mM的柠檬酸钠水溶液，继续回流20 min后停止加热，搅拌冷却至室温，16000 rpm离心10 min即可收集得到柠檬酸钠稳定的纳米金；
2）设计并化学合成单链miR-193b核苷酸，序列为：AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU。
3）miR-193核苷酸预处理：取8 nmol的miR-193b核苷酸，溶于889 μL超纯水，分装避光保存于-80℃冰箱；使用时取适量于无酶管中，加入TCEP溶液（终浓度1 mM），然后于室温孵育1 h；
4）偶联：取10 mL收集重悬的纳米金（10 nM），加入经TCEP预处理的miR-193b，使miR-193b与纳米金的摩尔比为300:1，混合孵育16 h。然后向其中滴加浓度为1 M的NaCl溶液，使NaCl终浓度为50 mM。其后每8 h滴加一次NaCl，增加NaCl浓度50 mM。待NaCl浓度达到300 mM，将样品孵育过夜。
5）纯化处理：将上述样品16000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀加0.5 mL PBS重悬，重复上述离心及重悬过程3次，得到纳米金miR-193b偶联物。
6）球形microRNA制备：向纯化处理的纳米金miR-193b偶联物中加入1M KCN 30 μL，混匀后将其置于振荡器上，800 rpm振荡30 min。然后将其转移至透析袋（MWCO=5 kDa）中，分别在0.5 M NaCl溶液和PBS缓冲液中透析1 d，即得球形microRNA。
实施例2
球形microRNA直接进入胃癌细胞并上调miR-193b的检测：
1）细胞培养：RAW264.7细胞培养于含有10%胎牛血清的1640培养基中，于37℃、5%CO2以及饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞铺满瓶底约80-90%时，弃去旧培养液，PBS洗涤1次，加5ml新鲜含完全培养基，沿培养瓶边缘反复轻轻吹打刮下细胞，形成均匀的单细胞悬液，将细胞接种于6孔板中，接种密度为40%~50%左右，约1.2×106个细胞/孔，接种1天后进行实验处理。
2）各组处理：设置游离microRNA组和球形microRNA组，在含10%胎牛血清的1640培养液中各加入游离microRNA或球形microRNA使其终浓度均为50nM。实验当天弃去前一天6孔板中的旧培养基，并将处理好的各组培养基加入6孔板中，每组设置3个复孔，共孵育48h。
3）细胞摄取：荧光显微镜下观察球形microRNA的细胞摄取情况，孵育48h后的细胞，PBS漂洗3次，DAPI每孔200μl染色5min，PBS再次漂洗3次，各加入1ml PBS于培养板中，在荧光显微镜下观察球形microRNA进入细胞的情况。同视野下，细胞核被DAPI染成蓝色荧光，而microRNA由于标有荧光基团Cy3而呈现红色荧光。
4）在荧光视野下，有Cy3标记的microRNA在进入的细胞内将发出红色荧光，并主要分布在细胞质内，细胞核被DAPI标为蓝色。
图5为细胞对游离microRNA和球形microRNA的摄取荧光成像图，图中可见：游离microRNA不能有效进入细胞，而球形microRNA在无转染试剂的情况下也可高效进入细胞。
实施例3 经不同处理后胃癌细胞内uPA mRNA的表达水平。
1）细胞培养：胃癌细胞BGC-823细胞接种于加有完全培养基（10%胎牛血清的DMEM培养基）的细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2以及饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞铺满瓶底约80-90%时，弃去旧培养液，PBS洗涤1次，加入0.25%胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察，发现细胞变圆回缩，间隙增大后，弃消化液，加5ml新鲜含完全培养基终止消化，沿培养瓶边缘反复轻轻吹打贴壁细胞，形成均匀的单细胞悬液，将细胞接种于6孔板中，接种密度为40%~50%左右，约1.2×106个细胞/孔。
2）各组处理：设置完全空白对照组（Blank control）、游离microRNA组、球形随机序列组和球形microRNA组，在含10%胎牛血清的DMEM培养液中各加入游离microRNA、两种球形microRNA使其终浓度为100nM。细胞种板后放入培养箱中培养1天，实验当天弃去旧培养基，并将处理好的各组培养基加入6孔板中，每组设置3个复孔，共孵育48h。
3）uPA mRNA的表达量检测：处理后48h应用RNA抽提试剂盒抽提RNA，采用qRT-PCR的方法检测球形microRNA上调uPA mRNA表达水平的变化。
样品稀释：取原始样品RNA加适量灭菌3dH2O至终浓度为200ng/μl。
逆转录：
5.5μl RNA样品(200ng/μl) + 0.5μl primer
65℃5min后冰箱迅速冷却30s
下述试剂先混合，后加入冷却后的RNA primer混合物中
Components Volume per reaction
5×reaction buffer 2μl
Ribolock RNase Inhibitor 0.5μl
10mM dNTP mix 1μl
Revert Aid Reverse Transcriptase 0.5μl
逆转录反应：
温度（℃） 时间（min）
25 15
42 60
70 5
4 无限时
检测cDNA浓度，稀释至500ng/μl
PCR：
以下试剂先混合
Components Volume per reaction
上引物（10μM） 0.6
下引物（10μM） 0.6
DdH<sub>2</sub>O 2.8
加入mix 5μl和cDNA（500ng/μl）1μl，反应温度和时间设置如下：
温度（℃） 时间 Cycles
94 3min 30
94 30s
59.8 30s
72 1min
72 5min
数据分析：用2-△△Ct法分析real-time PCR数据，并应用Student’s t test 进行各样本间的比较。
如图6所示：与空白对照、游离microRNA和球形随机序列相比，球形microRNA处理可明显降低细胞内uPA mRNA的表达水平。
实施例4
球形microRNA降低uPA蛋白表达：Western-blot
1）细胞培养：胃癌细胞BGC-823细胞接种于加有完全培养基（10%胎牛血清的DMEM培养基）的细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2以及饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞铺满瓶底约80-90%时，弃去旧培养液，PBS洗涤1次，加入0.25%胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察，发现细胞变圆回缩，间隙增大后，弃消化液，加5ml新鲜含完全培养基终止消化，沿培养瓶边缘反复轻轻吹打贴壁细胞，形成均匀的单细胞悬液，将细胞接种于6孔板中，接种密度为1.2×106个细胞/孔。
2）各组处理：设置完全空白对照组（Blank control）、游离microRNA组、球形随机序列组和球形microRNA组，在含10%胎牛血清的DMEM培养液中各加入游离microRNA、两种球形microRNA使其终浓度为100nM。细胞种板后放入培养箱中培养1天，实验当天弃去旧培养基，并将处理好的各组培养基加入6孔板中，每组设置3-4个复孔。
3）制备蛋白样品：
蛋白提取：PBS洗涤细胞3次，每孔加入80~100μl细胞裂解液，收集细胞。冰浴30min后，离心12000rpm（4℃），25min，离心得到的上清即为蛋白。
蛋白浓度测定：按Beyotime BCA蛋白试剂盒操作说明进行；
蛋白变性：按4:1比例，在蛋白样品中加入5×SDS Loading Buffer，水浴锅中100℃，5min，迅速放置冰上，冷却至室温。
配胶：将1.5/1.0mm的玻璃板彻底洗净晾干，薄板和厚板对齐后放入制胶架中卡紧，按凝胶制备试剂盒操作说明灌制10%的下层分离胶，上层加入异丙醇压平分界线，待分离胶凝固后，按比例灌制5%的上层浓缩胶。待胶凝固后，4℃过夜备用；
上样：将25μg变性蛋白依次上样，多余孔用1×SDS Loading Buffer补齐；
电泳：浓缩胶部分电泳60~80V，50min，进入分离胶后电泳100~120V，70min，至溴酚蓝跑至胶底即可终止；
转膜：剪下适宜大小的PVDF膜，在甲醇里激活，准备好海绵、滤纸，与膜一起浸泡于转膜液中，按照海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵的顺序自阴极至阳极排列好，赶走每一层的气泡，放入转膜槽内，于4℃环境中200mA恒流转膜60min，根据不同蛋白分子量适宜调整时间（分子量越大转膜时间越长）；
封闭：转膜完成后取出PVDF膜用TBST冲洗，放入封闭液（用TBST配制的5%脱脂奶粉)中，室温封闭2h；
一抗孵育：封闭结束后将膜用TBST冲洗一遍，加入稀释好的一抗（uPA工作浓度为1:500），4℃摇床震荡过夜；
二抗解育：将膜取出，回收一抗，TBST震荡洗膜，10min×3次，加入1:5000用5%脱脂奶粉稀释的二抗（与一抗同源），37℃温箱孵育40min~1h；
曝光显影：TBST洗膜10min×3次，将ECL发光液（A、B液按1:1避光配制）滴加至膜上，置于成像系统中曝光。
如图7所示：与空白对照、游离microRNA和球形随机序列相比，经球形microRNA处理可明显降低细胞内uPA蛋白的表达水平。
实施例5
球形microRNA体外对胃癌细胞的抑制作用：
细胞培养：胃癌BGC-823细胞接种于加有完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM培养基）的细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2以及饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞铺满瓶底约80-90%时，弃去旧培养液，PBS洗涤1次，加入0.25%胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察，发现细胞变圆回缩，间隙增大后，弃消化液，加5ml新鲜含完全培养基终止消化，沿培养瓶边缘反复轻轻吹打贴壁细胞，形成均匀的单细胞悬液。将细胞接种于96孔板中，接种密度为5000个细胞/孔，加入完全培养基、放入培养箱中培养，第二天进行实验处理。
各组处理：设置不同浓度的球形microRNA组，分为空白对照组、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM组，在含10%胎牛血清的DMEM培养液中各加入不同浓度的球形microRNA。种板一天后弃去96孔板中的旧培养基，并将处理好的不同浓度球形microRNA加入96孔板中，每组设置6个复孔。
在细胞处理后的48h，Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞活力检测试剂盒室温放置30min，每孔加入10μl CCK-8溶液（尽量不要在孔中生成气泡），另加3孔做无细胞空白对照，以清除背景，将96孔细胞培养板在培养箱中（避光）继续孵育2h；
用酶标仪测定在450nm处的吸光度。所有孔的吸光度值减去无细胞空白对照的平均值为各孔的校正吸光度值。
各组取平均值并计算标准差，制作细胞增殖系数图。
如图8所示：不同浓度球形microRNA对胃癌细胞增殖均有一定的抑制作用，可见球形microRNA可明显抑制胃癌细胞的增殖，显示了较好的抑癌效应。
实施例6
球形microRNA对胃癌细胞侵袭迁移的抑制作用：
迁移实验：通过划痕实验考察球形microRNA对胃癌细胞迁移的影响：按上述方法培养胃癌BGC823细胞，将对数生长期的胃癌BGC823细胞接种于6孔板（5×105个细胞/孔）中，用完全培养基继续培养至细胞密度为95%以上。将铁质直尺放置于75%（V/V）酒精中浸泡10 min，取出后于酒精灯上烤干，冷却后放置于6孔板上。而后用200μL移液枪的枪尖沿直尺在生长有细胞的6孔板中距离均匀地划出5条划痕。弃去培养基后，加入1.0 mL PBS洗去划落的肿瘤细胞，显微镜观察划痕处无细胞且划痕边缘平直即可。加入含1% FBS的DMEM培养基，再分别加入PBS，游离microRNA、球形随机序列和球形microRNA（终浓度为100 100nM），继续培养至PBS组划痕接近完全愈合。采用光学显微镜观察所有组划痕愈合的情况并拍照。
侵袭性实验：通过Transwell实验考察球形microRNA对胃癌细胞侵袭性的影响：首先制备包被Matrigel（BD Biosciences）的Transwell小室，具体操作如下：将凝固状态的Matrigel放置于4℃至其完全溶解，采用无血清DMEM培养基稀释（Matrigel：培养基=1:8），而后快速加入Transwell小室的上层（60 μL/孔），避免气泡产生，在周围孔中加入PBS以保持湿度，放入37℃细胞孵箱，待Matrigel稀释液聚合成凝胶后水化备用。
培养胃癌BGC823细胞，采用无血清培养基重悬成细胞悬液（1×105个细胞/100 μL），而后将100 μL细胞悬液加入Transwells上室（24孔板；孔径8 μm；Corning，USA）。再分别加入PBS，游离microRNA、球形随机序列和球形microRNA（终浓度为100 100nM）。下室则加入600 μL含20%FBS的培养基作为引诱剂，注意避免下室形成气泡。于细胞孵箱中培养48 h后，取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无菌棉棒擦去Matrigel和上室细胞，PBS洗2遍后，采用4%（M/V）多聚甲醛溶液固定30 min。将小室适当风干后，加入0.1%结晶紫染色20 min，用PBS洗3次后于光学显微镜下随机观察五个视野中的细胞。
结果如图9所示，24 h后，PBS组划痕间隙几乎消失，游离microRNA组和球形随机序列组的划痕间隙也几乎消失。而球形microRNA组的划痕间隙消失不明显，说明球形microRNA可有效抑制肿瘤细胞的运动性；PBS组BGC823细胞大量侵袭至下室，游离microRNA组、球形随机序列组也有大量BGC823细胞侵袭下室，表明游离microRNA组、球形随机序列组没有明显的抑制细胞运动的能力。而球形microRNA组表现出较强的抗侵袭作用，下室的细胞较少，表明球形microRNA对细胞侵袭有明显抑制作用。
实施例7
球形microRNA对胃癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用：
BGC823胃癌细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，待细胞数量约1.5×108个时，0.25%胰酶消化，完全培养基终止消化，收集到一起1000转/分离心5min，弃上清用无血清的DMEM培养基进行重悬，以5×106个细胞/100μl/只的量，皮下注射接种于裸鼠背部以形成胃癌裸鼠移植瘤模型；
10天后，将已经成瘤的小鼠随机分为4组，每组8只。从第8天起每2天瘤内注射处理一次，同时用游标卡尺测量肿瘤大小，共注射9次。第一组为完全空白对照组，每次每只老鼠瘤内注射100μl的PBS溶液；第二组为游离microRNA组，每次每只老鼠瘤内注射100μl的游离microRNA；第三组为球形随机序列组，每次每只老鼠瘤内注射100μl的随机序列球形microRNA溶液，量为1nmol；第四组为球形microRNA组，每次每只老鼠瘤内注射100μl的球形microRNA溶液，量为1nmol。
肿瘤体积（V）根据公式V=（长×宽2）×0.5进行计算。根据计算的肿瘤体积大小绘制各组裸鼠移植瘤的生长曲线并进行统计学比较。
如图10所示，可见PBS、游离microRNA和球形随机序列相比，球形microRNA可显著抑制肿瘤的生长，说明球形microRNA体内对胃癌细胞裸鼠移植瘤有明显的抑制作用。
其他未详细说明的部分均为现有技术。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种球形microRNA及其制备方法和应用
<141> 2021-05-08
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aacuggcccu caaagucccg cu 22
<210> 2
<211> 83
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
guggucucag aaucgggguu uugagggcga gaugaguuug uguuuugucc aacuggcccu 60
caaagucccg cuuuuggggu cau 83

Claims (7)

1.一种球形microRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）纳米金制备：将HAuCl4水溶液加热冷凝回流后加入柠檬酸水溶液进行反应制得柠檬酸钠稳定的纳米金；
2）偶联：将步骤1）制备的纳米金与经TCEP溶液预处理的miR-193b混合孵育后，滴加NaCl溶液，孵育过夜；TCEP溶液为三(2-羧乙基)膦溶液；
3）纯化处理：将步骤2）所得样品离心、重悬处理后，得到纳米金miR-193b偶联物；
4）球形microRNA制备： 向纯化处理的纳米金miR-193b偶联物中加入 KCN，混匀后将其置于振荡器上，振荡后将其转移至透析袋中，分别在NaCl溶液和PBS缓冲液中透析，即得球形microRNA；
所述球形microRNA通过非编码单链核苷酸与纳米金偶联后经氰化钾溶解构建而成；
所述非编码单链核苷酸含有两个茎环结构，且反义链的5’末端含有巯基修饰，与纳米金通过金-硫键结合；所述非编码单链核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述球形microRNA的制备方法，其特征在于，所述纳米金制备过程如下：向HAuCl4水溶液中加入水，加热并冷凝回流后向其中快速加入柠檬酸钠水溶液，继续回流后停止加热，搅拌冷却至室温，离心即可收集得到柠檬酸钠稳定的纳米金。
3.根据权利要求1所述球形microRNA的制备方法，其特征在于，所述偶联步骤如下：取步骤1）制备的纳米金，加入经TCEP预处理的miR-193b，混合孵育后，向其中滴加NaCl溶液，使NaCl终浓度为50 mM；其后每一段时间滴加一次NaCl，增加NaCl浓度50 mM；待NaCl浓度达到300 mM，将样品孵育过夜。
4.根据权利要求1所述球形microRNA的制备方法，其特征在于，所述经TCEP预处理的miR-193b制备过程如下：a)设计并化学合成单链miR-193b核苷酸，序列为：AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU；b)miR-193核苷酸预处理：取miR-193b核苷酸，溶于超纯水，分装避光保存于冰箱；使用时取适量于无酶管中，加入TCEP溶液，然后于室温孵育，即得。
5.根据权利要求1所述球形microRNA的制备方法，其特征在于，所述纯化处理过程如下：将步骤2）所得样品离心，弃上清，沉淀加 PBS重悬，重复离心及重悬过程，得到纳米金miR-193b偶联物。
6.根据权利要求1所述球形microRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）纳米金制备：向三颈圆底烧瓶中加入水和HAuCl4水溶液，加热并冷凝回流；然后向其中快速加入柠檬酸钠水溶液，继续回流后停止加热，搅拌冷却至室温，离心即可收集得到柠檬酸钠稳定的纳米金；
2）偶联： 取收集重悬的纳米金，加入经TCEP预处理的miR-193b，使miR-193b与纳米金的摩尔比为300:1，混合孵育；然后向其中滴加NaCl溶液，使NaCl终浓度为50 mM；其后每8 h滴加一次NaCl，增加NaCl浓度50 mM；待NaCl浓度达到300 mM，将样品孵育过夜；
3）纯化处理： 将上述样品离心，弃上清，沉淀加PBS重悬，重复上述离心及重悬过程3次，得到纳米金miR-193b偶联物；
4）球形microRNA制备： 向纯化处理的纳米金miR-193b偶联物中加入KCN，混匀后将其置于振荡器上，振荡；然后将其转移至透析袋中，分别在NaCl溶液和PBS缓冲液中透析，即得球形microRNA。
7.一种权利要求4~6任一项所述方法制备的球形microRNA在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
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