CN112891365B - 一种可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体的制备及其应用 - Google Patents

一种可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体的制备及其应用，提供一种生物核酸类药物的新型给药途径，有效降低核酸药物体内降解的可能性，也提供一种3D仿生植入体内载细胞的制备方法。本发明将microRNA的表达质粒转染到产生细胞外泌体的工程细胞中，使核酸分子以外泌体内含物形式分泌到细胞外，同时以已被认可的3D打印仿生植入体装载该工程细胞，通过模拟血管中营养物质向周围组织扩散的仿生原理，使内载的活体基因工程细胞以外泌体形式长效稳定释放重组核酸药物miR377，以实现体内自主产药的血管仿生线性植入体的新型核酸药物递送途径。本发明中用于抗食道癌耐药的miR377的3D仿生细胞植入体，该基因工程载入细胞为重组核酸类药物开创了一个药物体内分泌平台技术。

Description

一种可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体的制备及 其应用
技术领域
本发明属3D仿生植入体与新型药物载体的交叉领域，更具体地说，本发明涉及一种可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体的制备及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁我国居民健康和阻碍社会经济发展的重大疾病。食管癌是常见的消化道肿瘤，在中国新增的病例和死亡人数均居世界首位。我国食管癌的特点与欧美等发达地区不同，以胸中段鳞癌为多，其中食管鳞癌(Esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC)的比例高达90％以上。Lancet在2013年的最新统计中指出，世界范围内的食管癌患者5年生存率大概10-30％。主要的原因有：1)食管癌的手术切除只是应用于较早期的食管癌患者，而大部分的患者确诊时已经属于中晚期，肿瘤已经扩散或转移，而无法接受手术治疗；2)化学治疗日益重要，但癌细胞经常对化疗药物产生耐药性，从而引发肿瘤复发转移，从而使化学治疗最终无药可用而失败。有资料甚至提出，90％的肿瘤死亡与肿瘤的化疗耐药和转移有关。所以，迫切需要预防、抑制肿瘤化疗耐药的有效治疗药物。
在前期工作中，我们利用基因芯片(cDNAmicroarray)和生物信息学等方法针对食管癌高度耐药细胞进行基因组表达变化的系统分析，对重要基因进行功能研究。近年我们运用微小RNA(microRNA，miRNA)芯片筛选平台对比高度耐药和其相对应的母细胞株，发现一系列在食管癌高度耐药细胞株有显著降低的microRNA。我们对多个表达差异显著microRNA的生物学功能和分子调控机制进行筛选，发现在高度耐药细胞中显著降低的miR-377和miR-29c具有重要价值。一系列实验结果显示miR-377和miR-29c在食管癌的发生、发展、耐药、转移均有明确抑制作用。
miR-377可同时靶向CD133和VEGF，对食管癌细胞的侵袭和转移有明显抑制作用。miR-29c可以调控FBXO31-p38信号通路，直接结合并抑制FBXO31的表达水平，并且miR-29c可以通过调控FBXO31-p38信号通路使食管癌细胞对5-FU治疗敏感，系统递送miR-29c寡核苷酸可以显著减轻ESCC肿瘤的5-FU耐药。癌细胞对药物的抗药性已经成为癌症化疗中的一大障碍和难题。本miR377和miR29c的发现为食管癌化疗耐药难题提供了有潜力的防治途径。
核酸类重组药物在疾病治疗中发挥极其重要的作用，多用于治疗肿瘤、艾滋病、心脑血管病、肝炎等重大疾病，被认是为21世纪药物研究开发中最有前景的领域之一。重组核酸类药物因其半衰期短、体内易被酶分解等特点限制了应用，如何提高生物大分子药物的生物利用度，最大程度地保留其生物活性、降低其免疫原性并将其传递至靶部位及靶细胞，是实现生物大分子药物高效化传递亟待解决的关键问题。
微小RNA(miRNA)是一类广泛存在于生物体内、长约18-25个核苷酸的单链非编码RNA,通过结合到mRNA的3’非编码区(3’UTR)，降解mRNA或抑制其翻译过程，从而抑制转录后基因表达。据统计，有超过60％的人类蛋白质编码基因可受控于微小RNA的调控，提示其调节细胞生命活动中发挥着重要作用。miRNA在肿瘤的诊断、预后及治疗中具有巨大的研究和应用潜力，其重要性已越来越多地为基础和临床医学专家所认识。
近年来，鉴于肿瘤的靶向miRNA的治疗实验研究初步展现良好的安全性和疗效，针对miRNA的治疗策略将成为肿瘤治疗的一个新的研究方向，尤其系统性治疗成为临床普遍接受的miRNA治疗研究策略。相对于未修饰过的外源miRNA存在的在血液中易被降解的问题，病毒载体介导的miRNA给药系统虽然效率较高，其潜在的毒副作用和不良免疫反应却限制了其临床应用。而对于miRNA、siRNA和反义寡核苷酸等核酸药物，由于细胞摄取效率极低，严重限制了其应用。针对这一问题，已有脂质微粒或PEG化的环糊精衍生物包裹的siRNA制剂进入临床研究，以期能够提高细胞传递效率。
目前，随着新兴的纳米材料、高分子生物材料，及脂质体包被载体的核酸药物等技术的蓬勃发展，已为miRNA的临床应用提供了新的思路和策略，相关研究已经在动物模型上展示出较好的抑制肿瘤生长和转移的治疗效果，毒副作用不明显，令人喜悦！但包被材料国内没有具有知识产权的相关产品，所以研究开辟新的药物递送方式，对我们已有良好研究基础的靶分子尤为重要。
近年，关于疾病治疗的药物递送系统成为研究的热门，生物大分子药物的研发模式已由传统的新药创制开发模式逐渐转变为包括药物传送系统齐头并进的创新模式。美国FDA批准的生物新药中，约一半为创新型药物传送系统制剂。
载药植入体可通过非注射的途径释放药物进入人体，在体内实现长效地控制药物释放，并将药物输送到靶向器官的体系。相较于传统的注射和口服给药途径，载药植入体可以改善难溶性药物的吸收，提高生物利用度；可以通过特定部位植入，改善药物的体内分布，提高药物的组织特异性浓度与药物的靶向性；可以控制药物以均一速度、在一定时间内从材料中释放，延长药物的体内循环时间，增强药物疗效。已有研究表明红细胞具有长达120天的体内循环时间，良好的稳定性和伸缩性，无外移植物的免疫原性，是一种很好的药物递送载体，目前尚在探索阶段。
目前多用的基体材料与药物的组合的载药植入体是近年研发的一个新亮点，将生物大分子先行载入植入体的模式虽然有效改善了药物半衰期，克服了脂质体运载体系的应用挑战，并未改善药物分子的免疫原性和被降解等性质。
3D打印的载药植入体已成为新型药物递送体系，ApreciaPharmaceuticals于2016年3月宣布，第一个利用3D打印技术被FDA批准的处方药产品SPRITAM速溶片(左乙拉西坦)正式上市，用于治疗癫痫病发作。SPRITAM适用于局部性癫痫、肌阵挛性癫痫和原发性全身性强直阵挛性癫痫发作的辅助治疗。Aprecia是世界上第一个也是唯一在商业化规模利用3D打印技术来发展和生产医药产品的公司，采用了专有的ZipDose技术开创了新的用药方式。同年，美国FDA批准3D打印药物Spitam上市，Goyanes已用3D制备载药的水凝胶用于痤疮治疗。近来国内外均报道使用同轴3D打印方式制造的内外层为不同材料的线材，并制备出纳米级多孔结构，为细胞、生长因子的搭载提供空间，为不同材料的空间分布区分提供可能。
很多研究表明，运用制剂的方法可以增强蛋白(肽)药物在运输中和体内的稳定性。如将蛋白质包载于PLGA微球中可以提高蛋白质的稳定性，而且显示出了一定的缓释效果。生物大分子药物被靶部位的细胞摄取，是这类药物发挥药效的前提。为了提高蛋白、多肽类大分子物质进入细胞的能力，可将细胞穿膜肽(CPP)如TAT、R8等与载体连接，以促进生物大分子进入细胞的能力。蛋白质类药物进入细胞后，需要及时从溶酶体中释放出来以发挥药效。因此，除了载体的穿膜性质外，其溶酶体逃逸能力对于药物的胞内释放更为重要。
细胞外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，发现其可被其他细胞吸收远程传递生物信号，在机体内以外泌体传递重组生物药物也不失为良好的药物递送方式，外泌体携带的内容物中有miRNA、蛋白质、mRNA等，其转录后调控mRNA的翻译和稳定性。
细胞外泌体已被证明可被细胞吞饮并释放出内容物发挥作用，显然可为作为药物的细胞递送的理想载体。将外泌体相关的囊泡运输基因导入细胞内可使其外泌体产生水平显著增加，前期关于间充质干细胞(MSC)转入Rab27A基因改善外泌体生成并在其中测得重组蛋白的研究，提示了一些需氧性较弱的细胞可以作为外泌体形式释放重组核酸的基因工程细胞，此为构建3D仿生细胞植入体打下基础。
发明内容
本发明目的在于，在前期研究发现miR377和miR29c在食管癌的发生发展、转移和耐药方面具有重要作用和应用潜力的基础上，拟构建“3D仿生基因工程细胞植入体”——具有多孔膜结构的小型产药植入体，进一步解决miRNA、siRNA和反义寡核苷酸等核酸药物的细胞摄取效率低下且易被降解等问题，使该新型给药技术可用于多种疾病治疗或在相关医疗器械、药品中发挥作用。
本发明提供了一种可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体的制备及其应用，尤其是可用于抗食道癌耐药的miR377。
将囊泡基因Rab27A改造并转入microRNA表达质粒的MSC干细胞，大量产生包含microRNA等的细胞外泌体。用同源重组构建这种产药的工程细胞，将其作为植入体内载细胞与植入体一并植入体内，使其在体内稳定产生细胞外泌体释放药物。
本发明所涉及的“3D仿生基因工程细胞植入体”，是具有多孔膜管结构的线性产药植入体，其直径为2～3mm，长度为5～8mm，外层为具有纳米孔隙的膜壁，内载可长效释放药物的活体细胞，通过模拟血管中营养物资向组织扩散的仿生原理，高效长时地产药释药。研究技术路线如图1所示。
本发明中载入的产药细胞选用脐带血来源的MSC干细胞经同源重组导入Rab27A以高效产生外泌体，同时转入miR377表达质粒以产生含重组核酸的细胞外泌体。
本发明的新型产药植入体包含如下特点：(1)植入人体后持续分泌含有目标microRNA的细胞外泌体，通过外层纳米孔膜扩散至周围组织缓释入血；(2)实现重组核酸药物的体内长效释药和细胞靶向性递送；(3)隔离免疫细胞作用，细胞外泌体使目标药物分子逃脱酶解和免疫原性。
相对于现有技术，绝大多数核酸分子存在易被降解、由于自身电荷特性不易被细胞摄取等制约核酸药物发展的问题。而本发明经研究发现，构建的“3D仿生基因工程细胞植入体”在植入体内后可持续分泌包含miR377的细胞外泌体，并通过外层纳米孔膜扩散至周围组织缓释入血，实现了重组核酸药物的体内长效释药和细胞靶向递送，相比目前注射或口服的用药途径，其有效提高了生物靶组织的利用度，为核酸分子类药物的应用开辟了新方式。
附图说明
图1为可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体研究技术路线图。
图2为实施例1pcDNA3.1(+)/miR377质粒谱图。
图3为实施例1转染后稳定高表达Rab27A细胞克隆的筛选(注：Lane1：MSC细胞；Lane2：空载体细胞；Lane3：pcDNA3.1(+)-Rab27A细胞)。
图4为实施例1质粒pMD18-T-Kex2-EK菌落PCR(左)及双酶切鉴定(右)图(注：左：M：DL500 DNA Marker；泳道1：转染pMD18-T-Kex2-EK质粒的菌株；泳道2：转染pMD18-T载体的菌株。右：M1：DL4500 DNA Marker；M2：DL500DNA Marker；泳道1：pMD18-T-Kex2-EK质粒；泳道2：pMD18-T质粒)。
图5为实施例1重组质粒pcDNA3.1(+)/miR377菌落PCR检测(左)和双酶切鉴定(右)(注：左：M为DL2000 DNA Marker；泳道1为Kex2+miR377基因PCR产物。右：M为DL15000 DNAMarker；泳道1为pcDNA3.1(+)/miR377双酶切；泳道2为pcDNA3.1(+)双酶切)。
图6为实施例1pcDNA3.1(+)/miR377质粒转染MSC-Rab27A细胞后miR377的表达检测(注：与转染pcDNA3.1(+)相比，*表示P<0.05，**表示P＜0.01)。
图7为实施例1扫描电镜检测MSC-Rab27A细胞外泌体的形状。
图8为实施例1qNano检测MSC-Rab27A细胞外泌体的粒径大小。
图9为实施例1蛋白质印迹检测MSC和MSC-Rab27A-miR377外泌体(E)与细胞裂解物(C)中外泌体标记物(CD9(25kDa)、TSG101(47kDa)、HSP70(70kDa)和顺式高尔基体标记物GM130(112kDa)蛋白质)。
图10为实施例1在相同培养条件下，每毫升条件培养基中MSC、MSC-Rab27A和MSC-Rab27A-miR377细胞产生的外泌体数量的定量。
图11为实施例2DNA含量检测。
图12为实施例2活/死细胞染色检测。
图13为实施例3不同时间大鼠血液中microRNA377的浓度。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例一可高效分泌miRNA核酸药物外泌体的MSC-Rab27A内载细胞构建
1实验方法
1.1MSC细胞的复苏、培养及冻存
饲养层细胞准备：加入足量的基质胶均匀铺到皿底部，以能覆盖全部底部为准。37℃培养箱放置至少30min，从培养箱中取出皿，轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖，然后立即吸弃基质胶。加入适量成纤维细胞完全培养基(37℃预孵育超过10min)，从液氮中取出冻存的失活过的MEF细胞，立即投入37℃水浴中，迅速解冻(1min内)。根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的皿中，混匀。推荐的饲养层细胞密度为3万cells/cm2。
细胞复苏：解冻人MSC细胞，从液氮中取出冰冻的人类MSC细胞冻存管，立即投入37℃水浴中快速的旋转以迅速解冻(控制在1min内)(水不要淹没瓶盖)。当只有一片冰晶存在时，从水中取出冻存管。用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍，以去除水缸中的微生物。将细胞转移到一个预装有2mL人类胚胎干细胞完全培养基的15ml离心管中，混匀。200×g(1000rpm)，离心5min。吸弃上清液。用4mL的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的皿中，补加人类胚胎干细胞完全培养基至总体积为5mL。将瓶放入37℃的CO2培养箱中，观察细胞每天的生长情况。
细胞传代：从培养皿中吸出旧的人胚胎干细胞培养液，立即加入3-4mL的IV型胶原酶(需在37℃预热)到皿中，温柔的摇晃培养瓶使之覆盖到所有的细胞。将培养皿重新放回37℃培养箱中，放置约20～30min。消化期间可以处理预铺了饲养层细胞准备用来传代的新的培养瓶，处理如下：吸弃里面的成纤维细胞完全培养基，加入1mL人类胚胎干细胞培养液(不含bFGF)洗涤feeder(只要将瓶底盖过)，吸弃，然后加入4-5mL新的人类胚胎干细胞完全培养基，以备传代。待克隆消化下来后，取出培养瓶，将瓶中液体连同脱落的克隆转移到15mL离心管里。加入2mL的人类胚胎干细胞培养液(不含bFGF)，混匀。待干细胞团块沉降下来后，吸弃上清液。加入2mL新鲜的人类胚胎干细胞培养液(不含bFGF)洗涤细胞(即吹打重悬)，待细胞沉降下来后，吸弃上清。加入2mL新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞，并用移液枪吹打克隆到适合大小，然后根据需要按比例传代。
细胞冻存：当细胞生长良好时，消化细胞(具体步骤同上述传代过程)，将消化下的细胞洗涤两次，用2mL新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞并吹打至传代大小，待克隆沉降下来后，吸弃上清。加入0.25mL新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞，加入0.25mL人胚胎干细胞冻存液(2×)，快速混匀。将上述0.5mL细胞悬液转移至2mL冻存管中。迅速将冻存管放入冻存盒中，-80℃冰箱过夜。最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
细胞构建
(1)总RNA抽提及RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)
用TRIzol(Life Technologies)提取293T细胞的总RNA。用RNA合成cDNA的EcoDryTMPremix试剂盒(Clontech)合成cDNA。按
Figure GDA0003732495530000071
Green PCR Master Mix试剂盒(LifeTechnologies)说明书进行PCR。PCR引物及反应条件如下：
Figure GDA0003732495530000081
(2)含有Rab27A的真核表达质粒的构建
用从293T细胞中提取的RNA来扩增Rab27A的开放阅读框(ORF)，在其两端各加入酶切位点HindⅢ和EcoRⅠ，将其定向克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+)，最后由生工生物工程(上海)股份有限公司构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Rab27A。
将MSC细胞接种于12孔板中过夜，用Lipofectamine2000将重组质粒pcDNA3.1(+)-Rab27A转染入MSC细胞，通过G418筛选稳定高表达Rab27A的细胞株；转染pcDNA3.1(+)的空质粒作为对照。
表达质粒pcDNA3.1(+)/miR377的构建
查找PubMed的人类基因组数据库，显示microRNA377位于14q32.31，即位于该染色体的101062050-101062118bp，基因序列如下：
TTGAGCAGAGGTTGCCCTTGGTGAATTCGCTTTATTTATGTTGAATCACACAAAGGCAACTTTTGTTTG。
按照构建miRNA的要求，在基因miR377所在位置上下游各延长约200bp，即基因组中定位于14号染色体101061800-101062399bp的片段，得到如下序列：序列中黑体加粗序列为与上下游引物匹配的序列部分；下划线序列为pre-miR377(miR377前体)对应基因组序列部分；双下划线序列为成熟miR377所对应的基因组序列部分。
Figure GDA0003732495530000091
使用DNA抽提试剂盒提取食管癌母细胞株基因组DNA，利用PCR技术将上述片段从基因组DNA上扩增下来，所用PCR引物为(5’段分别带有限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅤ的识别序列)：
Upperprimer(上游引物)：5’-TTGAGCAGAGGTTGCCCTTGGTGAA-3’
Lowerprimer(下游引物)：5’-CAAACAAAAGTTGCCTTTGTGTGAT-3’
反应条件为：94℃、3min，94℃、30s，60℃、30s，72℃、45s，30个循环。
将得到的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，进行PCR产物分析。电泳后，使用胶回收试剂盒回收目的基因片段。分别用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅤ对回收的目的片段和pcDNA3.1(+)质粒空载体进行酶切。目的片段40μL酶切体系：回收的DNA片段30μL；10×缓冲液4μL；100×BSA0.4μL；限制性内切酶2μL；去离子水3.6μL。pcDNA3.1(+)质粒空载体20μL酶切体系：质粒载体5μL；10×缓冲液4μL；100×BSA0.2μL；限制性内切酶1μL；去离子水9.8μL。酶切反应过夜。纯化回收酶切过后的目的片段和质粒空载。
将上述的500bp的目的片段插入到质粒pcDNA3.1(+)的限制性内切酶的BamHⅠ和EcoRⅤ位点上。即将已酶切的目的基因片段与质粒空载进行连接。10μL的连接反应体系：纯化回收的已酶切质粒2μL；纯化回收的已酶切的目的基因片段6μL；T4DNA连接酶1μL；10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，连接反应过夜。
将得到的连接产物转化到感受态细胞DH5α中，操作均按无菌条件的标准进行。在超净工作台中从各转化平板上用已灭菌牙签挑取饱满匀称的菌落，将其置于事先已加入适量LA液体培养基的摇菌管中，将摇菌管置于摇床上，37℃摇菌过夜。采用Genstar公司的StarPrep快速质粒小提试剂盒从转化细菌中提取重组质粒。
采用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅤ进行双酶切，酶切反应体系为20μL双酶切反应体系：提取的重组质粒5μL；10×缓冲液2μL；限制性内切酶BamHⅠ1μL；限制性内切酶EcoRⅤ1μL；去离子水11μL。酶切反应30min后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。将重组质粒送擎科生物公司测序，即可验证得到pcDNA3.1(+)/miR377质粒，谱图如图2所示。
转染MSC-Rab27A细胞
MSC-Rab27A细胞复苏后，以含新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养，收集连续培养三代后的细胞用于电穿孔。取对数生长期中期或末期且状态良好的iPS细胞，1000rpm离心5min收集细胞，用人类胚胎干细胞培养液(不含bFGF)重悬细胞至密度为每100μL约3×106～4×106个细胞，分别以20μg重组质粒pcDNA3.1(+)/miR377和20μg空质粒pcDNA3.1(+)作为实验组和对照组与100μL细胞悬液混合，各自转移至冰浴的电穿孔杯中，在150V、22ms的条件下进行穿孔。电穿孔后立即加入500～900μL新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基，并将电穿孔过的细胞转移到合适的培养器皿中，加入培养基维持细胞继续生长。
转染后的细胞培养24h时，在荧光显微镜下大致估计其转染效果，然后取样200μL以流式细胞仪精确测定其转染效率。转染后培养36h时，1000rpm离心5min收集细胞用于提取总RNA，进行RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)实验。PCR反应体系一般为20μL：合成的cDNA模板1μL，SYBRR PremixEx TaqⅡ(2×)10μL，上游引物0.75μL，下游引物0.75μL，灭菌ddH2O7.5μL。共进行25个循环，每个循环包含95℃变性30s，56～60℃退火1min，72℃延伸30s。对于miR377模板使用miR377的RT产物，内参GAPDH的模板使用cDNA。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像系统进行分析。
胞外检测载药外泌体的含量和目的蛋白表达量
(1)转染后MSC-Rab27A细胞外泌体的提取分离
收集转染不同药物表达载体后的第3代人MSC-Rab27A细胞的培养上清，采用高速超速离心法提取外泌体，具体步骤简述如下：①通过“饥饿”预处理收集第3代转染后的人iPSRab27A细胞培养上清液200mL；②4℃、300×g低速离心10min；③4℃、2000×g离心10min；④将收集的上清液重新分装，按离心参数(10000×g、30min、4℃)离心，收集上清液；⑤4℃、100000×g条件下超速离心70min，弃去上清，即可获得外泌体，重悬于PBS中，-80℃保存备用。
(2)透射电镜检测外泌体形态
用移液枪各吸取外泌体悬液约10μL，缓慢滴于200目载样铜网上，在室温下静置2min；用薄型滤条干燥载样铜网一侧的液体，然后在同一片载样铜网上滴加20μL0.1％的磷钨酸，室温下负染5min；使用细长滤纸条从载样铜网侧面吸干负染液，在白炽灯下烤干，把载样铜网放到透射电镜下，以80kV电压观察悬浮的颗粒物形态，确定外泌体的大小。
(3)qNano测外泌体粒径分布
安装纳米孔板，调试仪器至纳米孔板内无任何气泡。取1μL标准颗粒，加专用Buffer1mL以稀释1000倍，用0.22μm滤器过滤后备用；各取5μL外泌体，加PBS45μL以稀释10倍，0.22μm滤器过滤，即可加样上机测试，每次上样量为30μL，测试粒子数量400个左右，即可点击停止按钮，待仪器自动处理数据并生成粒径分布图。
(4)BCA法测定外泌体和蛋白浓度
BCA工作液根据待测孔数按A液:B液＝50:1的比例配制；将蛋白标准品浓度稀释到0.5g/L，按0、1、2、4、8、12、16和20μL的量将标准品加入对应的孔中，加标准品稀释液到20μL；每孔加2μL待测样品，加标准品稀释液到20μL；每孔加200μLBCA工作液，37℃孵育30min；用酶标仪测出各孔的A562，绘制标准曲线，计算蛋白量。
(5)激光共聚焦检测细胞与外泌体分布情况
待MSC-Rab27A细胞生长至80％左右，将外泌体用PKH-26进行细胞膜红色荧光标记后与iPS-Rab27A细胞共培养24h，加入DAPI为MSC-Rab27A细胞进行细胞核蓝色荧光标记，洗涤后即可进行荧光共聚焦显微镜检测。
(6)外泌体及细胞总RNA的提取和cDNA合成
将提取分离收集得到的外泌体或转染后的细胞移去培养基，加入1mLTRIzol试剂裂解细胞，按照试剂说明书提取外泌体或细胞总RNA。取1μg总RNA按照iScriptcDNA合成说明书进行逆转录反应。
(7)实时荧光定量PCR检测miR377的表达水平
通过Bio-RadCFX96Real-TimePCR检测系统进行。30μl反应体系：2×SYBRGreenMasterMix15mL，10μmol/L基因特异性引物各1μl，cDNA模版2μl，以ddH2O补至30μl。PCR循环条件：95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火/延伸60s，共进行40个循环。目标药物蛋白/核酸在细胞样本中的表达水平以β-actin作为内参基因，在外泌体中的表达水平以U6作为内参基因进行均一化，目标药物蛋白/核酸的相对定量检测使用2-△△Ct法计算。检测引物由擎科公司合成。
(8)激光共聚焦检测细胞与外泌体分布情况
待MSC-Rab27A-miR377细胞生长至80％左右，将分别提取的外泌体用PKH-26(Sigma Aldrich)进行细胞膜红色荧光标记后与相同来源的细胞共培养24h，加入DAPI(SigmaAldrich)为MSC-Rab27A-miR377细胞进行细胞核蓝色荧光标记，洗涤后即可进行荧光共聚焦显微镜检测。
实验结果
2.1稳定高表达Rab27A细胞株的筛选与鉴定
用Lipofectamine2000的方法转染pcDNA3.1(+)-Rab27A至表达水平相对较低的人MSC细胞中，经G418(1000μg/mL)筛选，并通过Westernblot进行克隆鉴定。同时以亲代细胞和转染空载体的细胞作为对照。获得两个Rab27A(24.7kDa)蛋白高表达克隆(图3)。
分泌信号肽的合成与鉴定
将人工合成的Kex2-EK肽段克隆至pMD18-T载体，以构建质粒pMD18-T-Kex2-EK，如上所述进行重组质粒的鉴定，菌落PCR发现，泳道1处有个约40bp左右的片段，而对照组转染空质粒的菌株泳道2处无目的条带(图4左)，进一步的，双酶切结果表明Kex2-EK肽段被成功克隆至pMD18-T载体中(图4右)。
表达miR377的pcDNA3.1(+)/miR377质粒的构建与鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)/miR377由Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.构建。将上述构建的pcDNA3.1(+)/miR377表达载体通过电转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将pcDNA3.1(+)/miR377质粒进行菌落PCR鉴定，如图13左所示，获得大小为640bp的(Kex2+miR377)基因片段，大小与GenBank上报道的相等。同时对该重组质粒进行双酶切鉴定，如图5右所示。
转入MSC-Rab27A细胞
通过上述实验，证实我们获得了正确的质粒pcDNA3.1(+)/miR377。为了进一步验证该质粒能否表达出miR377小RNA，我们以pcDNA3.1(+)质粒为阴性对照，将三种质粒分别转染至人iPS-Rab27A细胞；在转染72h后，分别收集两种细胞提取其富含miRNA的总RNA；然后，通过针对miRNA的反转录方法转录细胞的microRNA，再进行实时荧光定量PCR(qPCR)，检测相比转染对照质粒pcDNA3.1(+)的细胞来说，转染pcDNA3.1(+)/miR377质粒的细胞是否能够表达出更多的miR377。结果明显增加(图6)，具有统计学差异。这证实我们所构建的pcDNA3.1(+)/miR377质粒能够在细胞中成功表达miR377。
细胞高效分泌外泌体
我们首先表征并证实从MSC-Rab27A细胞系的条件培养基中分离外泌体。通过透射电子显微镜评估，分离的外泌体的形态显示通常相关的双层球形结构(图7)。另外，外泌体具有正确的大小(图8)并显示各种标记蛋白(图9)。通过免疫印迹分析展示了各种标记蛋白，显示外泌体核心蛋白标记物呈阳性，包括CD9、HSP70和TSG101(图9，E-泳道)，而顺式高尔基体标记物GM130为阴性，其仅存在于细胞裂解物中(图9，C-泳道)。此外，我们发现MSC-Rab27A(3.14×1012个颗粒/mL)显示出比MSC细胞(1.07×1012个颗粒/ml)更高水平的外泌体分泌，而MSC-Rab27A-miR377(3.17×1012个颗粒/mL)细胞显示出与MSC Rab27A细胞相似的外泌体分泌(图10)。
实施例二载带miR377的MSC-Rab27A作为植入体的内载细胞
1实验方法
1.1稳定转染目标药物表达质粒的MSC-Rab27A细胞与3D仿生植入体共培养及细胞粘附检测
将3D仿生打印的线型植入体于70％的乙醇中浸泡2h，用PBS液充分清洗以完全除去乙醇，紫外光照射30min灭菌，转移至24孔组织培养板中，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡24h，将第2～5代稳定转染的载带药物表达质粒的MSC-Rab27A细胞调整细胞浓度至5×107L-1，并接种到24孔细胞培养板中，每孔接种1mL，孵育2h后，再在每孔中加入1mL全培。
含量测定
在接种至支架1、7、14、21d后，根据PicoGreen dsDNA检测试剂盒说明，通过检测每个样品的DNA含量来进行细胞增殖检测。在24孔板中含样品的各孔中加入含5mMEDTA、5mML-半胱氨酸、0.1MPBS、木瓜蛋白酶消化液(4000g/mL)在pH为6的环境下消化。加测试缓冲液补足到100μL，再向每孔中加入100μLPicoGreen反应试剂。用多功能酶标仪检测吸光值，采用双荧光激发，激发波长为360nm和460nm。对照标准DNA含量曲线计算出样品DNA含量。
活/死细胞染色
在接种至支架7d、14d后，去除培养基，用PBS冲洗两次，将染色剂(1mMLive-Dye和205mg/mL碘化丙啶)每孔加入0.25mL，于37℃CO2恒温培养箱中孵育20分钟。除去染色剂，用PBS充分清洗，于倒置荧光显微镜下观察。
我们进一步提取培养液进行外泌体检测，以研究制备的3D仿生植入体是否仅允许外泌体的进出，而细胞一直保留于植入体内，方法如前所述。
统计分析
定量数据以均数s.e.m表示，非参数数据采用2尾MannWhitneyu检验进行分析。参数数据采用方差分析和事后比较(Tukeymethod)。采用霍尔-西达克多次试验校正法。调整后的p值<0.05为差异有统计学意义。
实验结果
3D仿生植入体需要经过在体外培养、附着生物活性物质的过程，为载入细胞和新生组织提供一个适宜的生长环境，全程给予种子细胞需要的培养环境、营养物质和生长因子，并在适当的环节诱导植入体内的种子细胞分化成为具有特定功能的细胞。在这一过程中，种子细胞在植入体内有效地附着，并且高效地増殖、分化，是构建具有生物活性工程化组织的重要环节。因此，我们通过DNA含量测定检测了间充质干细胞在3D仿生植入体内的增殖(生长)情况，结果显示(图11)，经过21天的培养过程，在植入体内表现出的DNA含量都随时间的推移表现出了持续上升的趋势，而且从14d开始趋于稳定。
同时通过活/死细胞染色检测间充质干细胞在植入体内的存活情况，结果显示(图12)，在3D仿生植入体内间充质干细胞表现的细胞粘附效果较好。在7d和14d，细胞粘附数量和DNA含量结果相似，实验结果表明间充质干细胞在植入体内凋亡后因不能粘附在植入体上而脱落并被洗涤去除。随着培养时间的延长，间充质干细胞在植入体内部不断积累，并维持在旺盛生长状况，但未见植入体表面存在细胞生长，表明细胞不能经纳米孔排出植入体外。
正常情况下，处于生长状况下的细胞会随时产生外泌体，因此我们进一步研究了植入体搭载的细胞产生的外泌体能否通过植入体的纳米孔排出植入体。在培养21天后，我们将植入体与培养基分离，对培养基进行超速离心以获得外泌体。对所获外泌体分别如同前所述进行扫描电镜、粒径、表面标志物等分析，所得结果与图7～10类似。因此，该结果表明MSC-Rab27A细胞载入3D仿生植入体后仍能正常分泌外泌体，且其分泌的外泌体可经植入体纳米孔排出，并可高效表达目的药物分子。
实施例三外泌体型基因工程细胞的体内药效学研究
1实验方法
1.1实验动物分组
本动物实验研究已获得暨南大学实验动物管理中心批准，实验选用36只10周龄的Spregue Dawley(SD)雄性大鼠作为实验动物，麻醉前称重，按照75mg/kg氯胺酮、10mg/kg甲苯噻嗪给予腹腔注射麻醉。麻醉后备皮消毒，在无菌条件下进行手术，沿背部中线切开皮肤，牵拉皮肤暴露视野，将南方医科大学黄文华教授课题组制备的长6mm、直径4mm的线性3D仿生植入体(已与MSC-Rab27A细胞共培养)埋入皮下。术后分笼饲养。
36只大鼠分为六组，每组6只大鼠，A组：内载MSC-Rab27A-miR377细胞的植入体组；B组：内载MSC-Rab27A细胞的植入体组；C组：内载MSC细胞的植入体组；E组：仅造模后缝合，不埋入植入体(空白对照组)。
在植入体埋入大鼠皮下的1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、14d、21d、42d、63d、84d时间点采取大鼠尾静脉血，用于进一步分析。
药物生物分子的血药浓度检测
在植入体埋入大鼠皮下的1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、14d、21d、42d、63d、84d时间点采取大鼠尾静脉血，用ELISA试剂盒检测血清中vMIP-Ⅱ和胰岛素的浓度，血清血浆miRNA提取试剂盒(新海基因HaiGene，B1804)用于检测血清中miRNA377的含量。
统计分析
定量数据以均数s.e.m表示，非参数数据采用2尾MannWhitneyu检验进行分析。参数数据采用方差分析和事后比较(Tukeymethod)。采用霍尔-西达克多次试验校正法。调整后的p值<0.05为差异有统计学意义。
实验结果
为了进一步验证植入体搭载细胞后在动物体内能否如体外一样分泌出包含目标药物分子的外泌体，我们将载入MSC-Rab27A细胞的3D仿生植入体通过局部麻醉埋入SD模型大鼠背部皮下。术后伤口缝合关闭并分笼饲养，约12h后可见所有大鼠均开始正常活动并进食。待所有大鼠体内的植入体均逐渐与周围组织融合后，作进一步实验。
接下来，我们在不同时间抽取大鼠血液以检测血清中目的药物的浓度，用血清血浆miRNA提取试剂盒(新海基因HaiGene，B1804)用于检测血清中miRNA377的含量。如图13所示，相比静脉注射miRNA377组，以植入体包载细胞的给药组在1～7天血清中药物浓度持续上升，在7～10天，其含量趋于稳定，并维持较高的药物浓度约3个月。因此，在外泌体和3D仿生植入体的保护下，miRNA377核酸药物可在体内长时有效释放。

Claims (2)

1.一种可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体在制备治疗食管癌药物中的应用，其特征在于，3D仿生基因工程细胞植入体是具有多孔膜管结构的线性产药植入体，外层为具有纳米孔隙的膜壁，内载可长效释放药物的活体细胞，通过模拟血管中营养物质向组织扩散的仿生原理，高效长时地产药释药；载入的产药细胞选用脐带血来源的MSC干细胞经同源重组导入Rab27A以持续高效产生外泌体，同时转入micRNA377表达质粒以产生含重组核酸的细胞外泌体；所用的MSC干细胞通过转基因技术导入可使microRNA核酸药物被包裹入外泌体的Kex2-EK分泌信号肽段。
2.权利要求1所述的可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体在制备治疗食管癌药物中的应用，其特征在于，细胞外泌体使目标药物分子逃脱酶解和免疫原性，实现重组核酸药物的体内长效释药和细胞靶向性递送，所包裹的药物包括microRNA核酸药物。
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