CN104694542A - 一种促进组织工程骨血管化的 microRNA 及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进组织工程骨血管化的microRNA及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的microRNA为miR-26a，序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明利用小鼠颅骨缺损再生模型，在新生骨中发现了miR-26a的优势表达，经过体外将miR-26a mimics及inhibitor转入细胞实现miR-26a的表达上升及下降之后，在三个成骨相关的细胞模型中进行miR-26a对血管生成相关的生长因子调节作用的体外观察，利用体内原位骨缺损与异位骨再生模型进行了miR-26a促血管化作用的进一步体内验证。

Description

一种促进组织工程骨血管化的 microRNA 及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种促进组织工程骨血管化的microRNA及其应用。

背景技术

骨创伤与骨肿瘤导致的大面积骨缺损高发，迫使骨科的医生及相关学科的工作者一直努力寻求合适、有效的移植物加以修复。组织工程骨以其良好的生物安全性、可塑性以及不受供体来源限制等多发面的优势越来越成为研究的热点。组织工程骨构建主要是种子细胞与支架材料复合的过程。但是，目前组织工程骨的临床应用却面临着诸多的难题，其中，所面临的最大的障碍是移植骨在短期内无法获得充足血供而导致大部分种子细胞会因为缺乏营养支持而死亡。因此，促进组织工程骨的血管化能力是目前亟待解决的问题。

研究证实：对支架材料采用促血管生长因子(VEGF)等细胞因子修饰的方法可以有效的促进移植区血管的生长。但是，单纯使用VEGF诱导会因无法形成成熟稳定的新生血管而发生血管渗漏。因此，有必要采用一种混合多种发挥不同功能的生长因子的修饰方案，即既包括促进血管生成同时也含有稳定血管结构的生长因子，这些生长因子除VEGF外还应包括：血管生成素(ANG-1)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PGF)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)以及转化生长因子(TGF-β)等。有学者采用一种可控的缓释系统可将以上生长因子都释放至移植物中从而同时产生诱导作用，但该缓释系统阻碍了在移植区血管生成中发挥主要作用的宿主来源的血管内皮细胞向移植物的迁移，因此并未产生理想的促进血管化的作用。通过蛋白质修饰的手段促进干细胞的定向分化与组织工程骨的构建大多会因为生长因子的浓度过高或过低而不能达到理想的修复效果，相比较而言，通过基因如RNA修饰的方法能够通过调控基因表达而更加精细的调节生长因子的分泌，从而达到更为理想的修复效果。

Micro RNA(microRNA)与siRNA同为小片断非编码RNA，它们都做为转录后调控因子广泛存在于真核生物中，在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。自发现以来越来越多的引起研究人员的关注。microRNA与siRNA同可作为干扰性的RNA(RNAi)通过调节和关闭基因的表达进而调控细胞的各种高级生命活动。RNAi的发现不仅提升了人们对RNA分子的认识，还大大推进基因功能的研究，更为各种类型的传染病和癌症提供了一种新的手段。近年来，有关RNAi研究成果令人眼花缭乱：人们利用RNAi途径来人为调节特定基因的表达以达到治疗遗传疾病甚至癌症的目的，而且已经有不少的成功信息公布。

近期研究发现，microRNA对血管的发育也起着关键的调控作用。由于一个microRNA可以调控数以万计的靶基因，因此，一个microRNA便可以通过与多条与血管形成相关的信号通路作用从而同时调控VEGF、ANG-1、HGF、PDGF-BB等多个生长因子的表达。目前已知资料证明：对骨组织发育起重要影响作用的mir26a在多条血管相关的信号通路也具有正向调节作用，可以同时促进VEGF、ANG-1与HGF的表达，从而促进移植骨的血管化能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进组织工程骨血管化的microRNA及其应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种促进组织工程骨血管化的microRNA，所述microRNA为miR-26a，序列如SEQ.ID.NO.1所示。

miR-26a在制备促进组织工程骨血管化的药物中的应用。

所述的药物为诱导促血管生长因子VEGF表达的药物。

所述的药物为诱导促血管生长因子ANG-1表达的药物。

所述的药物为诱导VEGF和ANG-1同时表达的药物。

所述的药物为增加血管官腔面积的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了一种促进组织工程骨血管化的microRNA及其应用，该microRNA为miR-26a，序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明利用小鼠颅骨缺损再生模型，在新生骨中发现了miR-26a的优势表达，经过体外将miR-26a mimics及inhibitor转入细胞实现miR-26a的表达上升及下降之后，在三个成骨相关的细胞模型中进行miR-26a对血管生成相关的生长因子调节作用的体外观察，利用体内原位骨缺损与异位骨再生模型进行了miR-26a促血管化作用的进一步体内验证。证实本发明的促进组织工程骨血管化的miR-26a具有以下优势：

1、本发明公开的miR-26a，克服了蛋白质性的生长因子半衰期短，价格昂贵，以及难以保持生物活性以发挥持续有效地作用这一缺点。

2、本发明公开的miR-26a，其转染方式生物安全性高，克服了以往通过病毒做为载体促进某基因表达的缺陷，因为病毒被认为会引起人体内的免疫系统的反应而对人体造成伤害。

3、本发明公开的miR-26a，是通过内源性的调控从而引起一系列的基因表达的变化，这种内源性调节能够最大程度的模拟机体自身血管成长的微环境，克服了以往通过机械的外源性的干涉如通过VEGF基因转染或人工合成的siRNA干涉所引起的形成血管不稳定，血管渗漏的现象。

附图说明

图1是新生骨组织提取总RNA后观察到miR-26a的表达结果图；

图2是miR-26a的表达对促血管生长因子VEGF表达量影响结果图；

图3是miR-26a的表达对促血管生长因子ANG-1表达量影响结果图；

图4是miR-26a的表达对促血管生长因子VEGF蛋白水平表达电泳图；

图5是miR-26a的表达对促血管生长因子ANG-1蛋白水平表达电泳图；

图6是在体外管腔形成实验miR-26a促进血管的生长显微镜照片；

图7是在体内异位成成血管模型中miR-26a促进血管生长的切片染色照

片。

具体实施方式

microRNA(microRNA)是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常为18～25bp长，能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控，是RNA干涉中一种重要的分子工具。近几年来，在动物细胞和植物组织中，上百种miRNA被陆续发现，这些小分子调控RNA是从60～200bp的具有发夹状结构的前体中被切割出来而成熟的。

在动物细胞中，microRNA基因的转录初产物(pri-miRMA)很快被核糖核酸酶ⅢDrosha(RNaseⅢDrosha)加工成为microRNA前体(pre-miRNA)，然后由细胞核转运至细胞质中，经另一种RNaseⅢDicer识别剪切为成熟microRNA。这些成熟的microRNA其他蛋白质一起组成RISC复合体(RNA-inducedsilencing complex)，与靶mRNA特异性的碱基配对识别，从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。

miRNA mimic是化学修饰的小分子RNA片段模拟细胞中内源性成熟miRNA，可以增强内源性miRNA的表达从而促进其调控作用，化学合成的方法合成miRNA inhibitors，可以特异的靶向和敲除单个的microRNA分子，从而削弱内源microRNA的表达，是microRNA功能研究重要手段。

microRNA做为转录后调节因子，其作用机制的发挥是通过与一组蛋白反应结合形成RNA-蛋白复合物,被称为miRNA诱导沉默复合物。在miRNA诱导沉默复合物中,一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中,它能识别位于靶mRNA上3′端非编码区的结合位点。加工成熟后miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译,具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能。miRNA以及RNA-蛋白质复合物在动物机体中广泛表达，具有组织特异性和时序性，决定着组织和细胞的功能特异的调节过程中起重要作用。

MAPK/ERK信号通路在血管方向分化中其关键调节作用的，其作用机制主要通过MAPKs的三级酶促级联反应，即上游激活蛋白→MAPK激酶的激酶(MAPKKK)→MAPK激酶(MAP-KK)→MAPK。在ERKs的传递途径中Ras作为上游激活蛋白，Raf作为MAPKKK，MAPK/ERK激酶(MEK)作为MAPKK，ERK即MAPK，即Ras-Raf-MEK-ERK途径，酸化激活的ERKl/2由胞质转位到核内，进而调节多种成血管相关的生长因子(VEGF，FGF，PDGF)的表达。PTEN做为该通路的抑制因子通过抑制ERK的激活为抑制血管分化。PTEN被证明为miR-26a的靶向蛋白，因此，做为对成血管信号通路中的信号蛋白具有调节作用的miR-26a，在血管方向的分化也具有重要的调节作用。

本发明提供一种促进组织工程骨血管化的microRNA及其应用，所述microRNA为miR-26a，序列为5’uucaaguaauccaggauaggcu 3’(如SEQ.ID.NO.1所示)。本发明利用小鼠颅骨缺损再生模型，在新生骨中发现了miR-26a的优势表达，经过体外将miR-26a mimics及inhibitor转入细胞实现miR-26a的表达上升及下降之后，在三个成骨相关的细胞模型中进行miR-26a对血管生成相关的生长因子调节作用的体外观察，利用体内原位骨缺损与异位骨再生模型进行了miR-26a促血管化作用的进一步体内验证。具体步骤如下：

1)构建小鼠下肢缺血再灌注模型，不做任何处理，3个月后将新生组织取材并提取总RNA，利用qRT-PCR对与成血管关系密切的microRNA的表达进行对比分析，发现miR-26a在新生血管中呈明显的优势表达；

2)通过小干扰RNA转染技术，将miR-26a mimics与inhibitor转入细胞中，利用qRT-PCR验证转染效率，观察到miR-26a mimics与inhibitor使miR-26a的表达发生了明显的上升及下降；

3)利用qRT-PCR观察到随着miR-26a的表达的上升及下降，成血管相关的关键性的基因的表达也呈现出上升及下降的趋势；

4)将miR-26a mimics转染入血管内皮细胞致细胞内miR-26a表达升高后，利用管腔形成实验体外观察miR-26a促血管化能力；

将转染后的细胞与羟基磷灰石按4×10⁶与40mg的比例混合后，植入裸鼠皮下，组织学体内观察到miR-26a明显促进血管化。

下面结合附图对本发明做详细说明：

1、目标microRNA的筛选

1)小鼠下肢缺血再灌注模型的建立

小鼠腹腔注射1mg/ml戊巴比妥钠(小鼠每10g体重0.03ml)麻醉成功后，将小鼠仰卧位，并将四肢及门牙固定。右侧腹股沟区局部酒精消毒后用眼科剪剪开右侧腹股沟区皮肤，在体视显微镜下(放大倍数3～5倍)小心分离皮下脂肪层和筋膜，暴露髂外动脉远端及股动脉起始处、股静脉及股神经，用直型眼科镊小心分离髂外动脉起始部和股动脉，并小心将静脉和神经分开；用弯型眼科镊挑起髂外动脉，于髂外动脉远端股动脉起始处用高频电刀(功率为25W)电凝中断血流，依次分离股动脉和腘动脉并电凝，术中操作需要非常小心保护静脉和神经，避免静脉血管破裂出血或电凝中断，一旦静脉及神经受损则该模型淘汰。缝皮后结束手术，注意保暖直至苏醒。

2)小鼠下肢缺血再灌注模型的验证

a:大体观察模型制作完成后观察双侧下肢皮肤的颜色及运动功能。

b：X线成像小鼠下肢缺血模型制作后24h内，2mg/ml戊巴比妥钠过量麻醉小鼠。医用硫酸钡混悬液配制成钡水浓度为100％。剪开胸腔暴露心脏，眼科镊于右心房剪一小口，从左心室注射浓度为100％的硫酸钡溶液0.5～1.0ml，观察右心房流出白色硫酸钡后立即停止注射，置于X线机下投照，投照体位为盆腔及双侧下肢正位、左右斜位。扫描参数：35kV，100μA，曝光时间60s。

c：Micro-CT成像X线成像结束后立即进行Micro-CT扫描。扫描参数:60kV，70μA，层厚0.05mm。

d：组织病理切片HE染色断颈处死裸鼠后，生理盐水及4％多聚甲醛前后心脏灌流后取出缺血侧及正常侧下肢肌肉。组织常规石蜡包埋，切片厚度为5μm，进行苏木素-伊红(Hematoxylin&Eosin，HE)染色和Masson染色，HE染色观察形态学改变，Masson染色主要观察存活肌纤维。

3)新生组织总RNA提取

将新生组织进行取材并进一步提取总RNA。用高速均质仪进行所取得的骨组织粉碎处理,使用Trizol试剂盒新生骨组织中提取总RNA，利用RNA样品琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度计验证获得RNA的纯度、浓度和完整性，电泳结果得出，总RNA的28S和18S条带均很清晰、完整。经紫外分光光度计测定，总RNA的纯度(A260/A280)在1.90～2.00之间，其质量能够保证进行下面的利用qRT-PCR对成骨相关的microRNA表达量的比较分析。

4)利用qRT-PCR对多个血管相关的microRNA表达进行分析，结果显示miR-26a在新生骨组织的表达中明显高于其他几个血管相关的microRNA，因此初步将其确定为目标microRNA进行进一步的功能验证。

2、MiR-26a促血管作用的功能验证

1)microRNA转染

细胞汇合达到60-70％时，进行转染。将miR-26a mimics，miR-26ainhibitor，miR-negative control和脂质体转染试剂分别加入无血清无双抗的Opti-MEM培养基中，柔和混匀，室温放置5分钟，后将两者混匀，室温放置20分钟，以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents(或DNA/SiMiTransfection Reagents)复合物，并将其加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，培养箱中温育24h-48h后，除去复合物，更换培养基。通过qRT-PCR检测到miR-26a的表达随着miR-26a mimics与miR-26a inhibitor转入，分别上调与下降10倍与1.5倍，因此确定转染成功。

2)MiR-26a促血管作用的基因与蛋白水平的检测

a：miR-26a表达上调对Vegf与Ang-1基因水平表达的影响。Vegf与Ang-1的是最有效的促血管生长因子，他们分别在血管发生与成熟两个过程中起着重要的作用。这两个生长因子的表达上调会有效并且稳定的促进血管化，将转染miR-26a mimics与negative control的细胞验证转染成功后，利用qRT-PCR对其进行Vegf与Ang-1mRNA表达差异分析，发现miR-26a mimics细胞中Vegf与Ang-1的表达水平相对于negative control分别上调了6倍与2倍(如图2、图3)，因此确定，miR-26a同时有效地促进以上两个促血管生长因子的基因水平的表达。

b：Western-blot检测目的蛋白的表达。将miR-26a mimics，miR-26ainhibitor与negative control转染后的细胞提取蛋白样本后，对样本进行SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜上之后，用5％的脱脂奶室温封闭1h，用鼠源性抗Vegf与Ang-1标签单抗作为一抗，4℃孵育过夜。次日，再以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育1h，充分漂洗后，DAB显色；结果显示：miR-26a有效的促进了Vegf与Ang-1蛋白水平的表达(如图4、图5)。

c：Elisa检测miR-26a对VEGF分泌性生长因子的蛋白分泌的影响将miR-26。a mimics，miR-26a inhibitor与negative control转染后的细胞用无血清的培养基培养，采用elisa方法分别于8小时、16小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时以及84小时检测培养基中VEGF的含量，结果如图2所示，VEGF生长因子的分泌随着miR-26a的促进与抑制作用而上升和下降，在转染16h后达到高峰，作用一直持续至2天左右。

3、miR-26a促血管化的体外检测

管腔形成实验：将枪头和96孔板于-20℃预冷，将Matrigel胶放冰上,使之融化，取Matrigel胶(60μL/孔)加入到预冷的96孔板中，避免形成气泡；冰上放置5min,使Matrigel液面水平,然后放入细胞培养箱30min使之凝固；将转染miR-26a的HUVECs(细胞数5×10⁴/孔)加入到含Matrigel胶的孔中,然后加同浓度的催化因子；37℃培养8h；在显微镜下观察，参见图6，随机选择5个视野拍照(×200)，按下列公式计算管腔系数(vascularindex)：管腔系数(％)＝管腔面积/总面积×100。结果显示，miR-26a有效的促进了血管内皮细胞的管腔形成功能(如图6)。

4、MiR-26a促血管化的体内检测

1)体内异位成血管模型的建立

将4×10⁶转染miR-26amimics的细胞与40mg羟基磷灰石/磷酸三钙混合后，置于小鼠股部肌袋内。

2)组织学分析

a：苏木精-伊红染色将样本取材，固定，脱钙2周后，分别用石蜡与冰冻包埋样本。将石蜡切片采用梯度酒精脱蜡至水，苏木精液染色5min，流水稍洗去苏木精液1-3s，1％盐酸乙醇1-3s，稍水洗10-30s，蒸馏水过洗1-2s，0.5％伊红液染色1-3min，蒸馏水稍洗1-2s，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。参见图7，结果显示，microRNA转染组骨量明显高于对照组。

b:免疫荧光染色将冰冻切片丙酮固定30min，PBS冲洗后，鼠来源的抗CD31单抗作为一抗4°孵育过夜。次日，再以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗室温孵育1h，激光共聚焦观察，参见图7，可以看出，microRNA转染组血管化程度要明显高于对照组。

Claims (6)

1.一种促进组织工程骨血管化的microRNA，其特征在于，所述microRNA为miR-26a，序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.权利要求1所述的miR-26a在制备促进组织工程骨血管化的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为诱导促血管生长因子VEGF表达的药物。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为诱导促血管生长因子ANG-1表达的药物。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为诱导VEGF和ANG-1同时表达的药物。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为增加血管官腔面积的药物。