CN109453186A - 一种miRNA在制备降低神经干细胞中ascl2表达的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种miRNA在制备降低神经干细胞中ascl2表达的药物中的应用，属于神经干细胞研究领域，所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，还提供了降低神经干细胞中ascl2表达的试剂，包括所述的miRNA、opti‑MEM溶剂和RNAiMAX。本发明提供的miRNA能够有效地降低神经干细胞中ascl2表达，从而防止细胞移植过程中因免疫反应引起的神经干细胞分化及凋亡。根据实施例记载，将本发明所述的miRNA及其抑制剂转染神经干细胞后，考察ascl2蛋白表达情况，miR26a可显著降低ascl2表达。

Description

一种miRNA在制备降低神经干细胞中ascl2表达的药物中的 应用

技术领域

本发明属于神经干细胞研究领域，尤其涉及一种miRNA在制备降低神经干细胞中ascl2表达的药物中的应用。

背景技术

神经干细胞及其衍生物在多种神经系统紊乱及退行性疾病中都有潜在应用价值，例如帕金森病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症和脊髓损伤等。自体移植与同种异体移植的策略各有其优缺点，所以这两种移植方式在不久的临床应用中将共存。研究发现对小鼠进行同种异体神经干细胞移植会在小鼠脑内引发免疫反应。免疫反应由小胶质细胞及其分泌的细胞因子如TNFα介导，对内源神经干细胞及外源移植细胞均会产生影响。在神经系统的神经干细胞移植过程中所引发的免疫反应会激起TNFα的分泌，TNFα进而产生ascl2的高表达。而所述ascl2的高表达会导致的神经干细胞分化及凋亡，目前尚没有有效的防治ascl2的高表达导致的神经干细胞分化及凋亡的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miRNA在制备降低神经干细胞中ascl2表达的药物中的应用，所述miRNA能够有效的降低神经干细胞中ascl2的表达，从而防止细胞移植过程中因免疫反应引起的神经干细胞分化及凋亡。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种miRNA在制备降低神经干细胞中ascl2表达的药物中的应用，所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种降低神经干细胞中ascl2表达的试剂，包括所述的miRNA、opti-MEM溶剂和RNAiMAX。

优选的，所述试剂为液体制剂。

优选的，所述试剂中miRNA的存储浓度为15～25pmol/μl；

优选的，所述试剂中miRNA的使用浓度为0.8～2pmol/μl。

本发明提供了所述试剂在制备抑制神经细胞分化和凋亡的药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的miRNA能够有效地降低神经干细胞中ascl2表达，从而防止细胞移植过程中因免疫反应引起的神经干细胞分化及凋亡。根据实施例记载，将本发明所述的miRNA及其抑制剂转染神经干细胞后，考察ascl2蛋白表达情况，miR26a而非其抑制剂可显著降低ascl2表达。

附图说明

图1为Mir26-a及其抑制剂对神经干细胞中Ascl2表达量的影响；

图2为神经干细胞经TNFa处理前后细胞状态；

图3为神经干细胞在TNFa不同处理条件下Ascl2的表达；

图4为Mir-26a介导TNFα对ascl2的调控；

图5为过表达Ascl2对神经干细胞分化的影响；

图6为实验规划与Ascl2及GFP阳性细胞的流式筛选；

图7为增殖培养条件下Ascl2过表达对神经干细胞增殖及分化的影响；

图8为Ascl2对神经干细胞细胞周期的影响；

图9为Ascl2对神经球生长发育的影响；

图10为Ascl2对神经球生长发育的影响；

图11为鸡胚电转模式图；

图12为体内Ascl2对神经发生功能的研究。

具体实施方式

本发明提供了一种miRNA在制备降低神经干细胞中ascl2表达的药物中的应用，所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述miRNA为miR26-a，具体的核苷酸序列为UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU。

本发明对所述miRNA的来源和制备方法没有特殊限定，采用市售产品或合成的方法制备的产品即可。

本发明提供了一种降低神经干细胞中ascl2表达的试剂，包括所述的miRNA、opti-MEM溶剂和RNAiMAX。

在本发明中所述opti-MEM溶剂为市售产品，在本发明具体实施过程中，所述opti-MEM购自Thermo Fisher Scientific，货号31985062。本发明中，所述opti-MEM作为溶剂，对所述miRNA和所述RNAiMAX进行溶解。本发明中所述RNAiMAX为转染试剂，所述RNAiMAX为市售产品，优选的购自Thermo Fisher Scientific，货号13778030；所述RNAiMAX用于miRNA的高效转染。

本发明中，所述降低神经干细胞中ascl2表达的试剂优选为液体制剂；所述miRNA的存储浓度为15～25pmol/μl，优选为20pmol/μl。所述试剂中miRNA的使用浓度优选的为0.8～2pmol/μl，更优选为1.0～1.2pmol/μl。

本发明中所述降低神经干细胞中ascl2表达的试剂优选的通过以下方法制备获得：将所述miRNA溶解于opti-MEM溶剂后获得miRNA溶液，将所述miRNA溶液和RNAiMAX混合静置10～20min获得，优选的静置15min。

本发明提供了所述试剂在制备抑制神经细胞分化和凋亡的药物中的应用。本发明中由试剂制备获得的药物通过以下方法实现作用：将由所述的试剂制备获得的药物与神经纤维细胞混合培养6～8h；所述试剂与神经纤维细胞的体积比例为(3～5)：10；优选的为4:10。本发明在所述混合培养后，优选的还包括收集所述神经干细胞，对所述神经干细胞进行培养；所述培养用培养基优选为神经干细胞培养基。本发明中，所述神经干细胞培养基优选的为Neurobasal^TM-A Medium，购自thermolFisher Scientific。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

降低神经干细胞中ascl2表达的试剂的制备

Mir26-a溶液的制备：在多孔板反应器中加入2X的25μl opti-MEM溶剂(31985062,Thermo Fisher Scientific)，加入5μl的miR26-a(至终浓度为2pmol/μl)和RNAiMAX(13778030,Thermo Fisher Scientific)1.5μl混合，混合后静置10-15min；所述Mir26-a的核苷酸序列为：

UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU。

实施例2

通过TargetScan软件预测发现miR-26会高分靶向ascl的3’非编码区域。假设TNFα通过下调调节Ascl2的表达。为验证此假设，首先考察了在神经干细胞内TNF是否会降低miR26a的表达。神经干细胞在有TNFα或没有的情况下单层培养5h，miR26家族的不同成员(包括mmu-miR-26a-5p,mmu-miR-26a-1-3p,mmu-miR-26a-2-3p,mmu-miR-26b-5p，mmu-miR-26b-3p)(图4A)。其中，仅miR-26a-5p显著下调了，接下来，克隆了ascl2的3’UTR来替代pGL3-Luc的3’UTR，在293T细胞及NIH3T3细胞里(图4C)，来验证miR-26a-5p是否会影响荧光素酶的表达。在两个系统里，miR-26a-5p均可靶向ascl2的UTR，降低其表达。

将实施例1中的Mir26-a溶液加入到原代取材的小鼠神经干细胞中(添加量2pmol/ml)；培养基培养6～8h后弃去转染试剂，加入正常培养基中进行培养，检测小鼠神经干细胞中ascl2的表达量。以Mir26-a的抑制剂为对照，同样方法转染原代取材的小鼠神经干细胞中。小鼠神经干细胞中ascl2的表达量如图1A和B所示，Mir26-a溶液能够显著抑制神经干细胞中ascl2的表达。

实施例3

小鼠神经干细胞经TNFa处理后Ascl2表达量提高

首先，在神经干细胞的增殖和分化培养基中分别添加20ng/ml的TNFa，分别作用5h，10h，24h和48h，图2展示了处理10h和48h后的细胞状态。分化条件下，细胞在处理10h、48h时较正常的分化细胞相比细胞密度减小。增殖条件下的细胞密度改变不明显。Ascl2基因的实时定量RT-PCR显示无论增殖还是分化培养条件下，与未处理的细胞相比，Ascl2的表达量都随处理时间的延长而提高(图3D，图3E)；同时增殖培养条件的每个时间点上处理组细胞ascl2的表达量都显著高于未处理组(图3D)，分化条件下，在处理5h时组间有显著差异，其他时间点处理组细胞Ascl2表达量也呈现高于对照组的趋势(图3E)。同时也在增殖和分化条件下检测了随着TNFa浓度的提高Ascl2的mRNA表达量及蛋白水平表达量的改变，mRNA结果及westernblot均显示随着TNFa浓度的逐渐升高，Ascl2表达量呈逐渐升高趋势(图3A，图3B，图3C)。在增殖和分化条件下，神经干细胞可在TNFa处理下提高ascl2的表达。图3中(A-C)小鼠神经干细胞由不同浓度的TNFa处理48h时Ascl2表达量分析,(A)Ascl2mRNA表达量分析，(B)分化条件下，不同浓度TNFa处理后Ascl2蛋白表达量。(C)增殖条件下，不同浓度TNFa处理后Ascl2蛋白表达量。(D，E)神经干细胞在20ng/ml TNFa中分别培养不同时间时Ascl2表达量。***P＜0.001,**P＜0.01，*P＜0.05。

实施例4

过表达Ascl2对神经干细胞分化影响的研究

为研究Ascl2对神经干细胞可能存在的影响，制备可表达Ascl2的逆转录病毒，以载体上绿色荧光蛋白GFP的表达来指示Ascl2的表达。而Ascl2对神经干细胞分化的影响在此之前未见报道。发现在分化条件下，神经干细胞过表达Ascl248h时，Dcx阳性细胞已经出现，绿细胞中Dcx阳性比例高达73.6％，而此时，感染空病毒的对照组基本没有Dcx阳性细胞的出现(图5)。检测了Ascl2对另一神经前体标志Tuj1的影响。与Dcx结果相似，过表达ascl248h，实验组tuj1阳性细胞高达85％，而对照组仅占5％。认为Ascl2有促使神经干细胞提前分化的功能趋势。

图5中(A)为绿细胞中Dcx阳性细胞统计，过表达Ascl2组有更多的Dcx阳性细胞生成(73.6％vs 1.2％)，**P＜0.01。(B)为绿细胞中Tuj1阳性细胞统计，过表达Ascl2组有更多的Tuj1阳性细胞生成(85％vs 5％)，***P＜0.001。(C，D)Tuj1/Dcx双染代表性照片。Scale bar:100μm。

神经干细胞感染逆转录病毒并进行流式筛选

为获得更为均一的过表达Ascl2的神经干细胞，在去掉逆转录病毒约24h时对GFP阳性细胞进行流式筛选，以未做任何处理的细胞作为阴性对照，调整电压，使SSC/FSC散点图中细胞处于合适位置，如图6B，并在SSC/FITC构成的散点图中，由阴性细胞所在位置判断GFP阳性与阴性细胞间的界限，划定阳性细胞收集框，如图6C中P4矩形框。

经流式收集的细胞用于3项实验，如图6A所示，第一，将筛选的细胞进行BrdU掺入实验用于评估Ascl2对神经干细胞增殖能力的影响；第二，将筛选的细胞进行PI染色，检测Ascl2对细胞周期的影响；第三，将筛选的细胞悬浮培养，观察神经球的生长状况，并在48h固定神经球，检测增殖条件下Ascl2对神经干细胞的影响。

图6为实验规划与Ascl2及GFP阳性细胞的流式筛选，其中(A)为筛选后细胞用图BrdU掺入/PI细胞周期/神经球悬浮培养。(B)为筛选细胞时所有细胞群体，目标群体位于P1多边形门。(C)为目的细胞群体在P4门中得到。

筛选所得GFP阳性神经干细胞的BrdU掺入率检测

将筛选后的神经干细胞贴壁培养，培养液选择增殖培养基。约24h时换成含有BrdU的培养基处理1h，然后将培养基换成普通增殖培养基培养细胞15h，将胞质中所含BrdU吐净后，对细胞进行固定并应用免疫荧光的方法检测BrdU掺入率。与对照组相比，结果如图7所示，图7为增殖培养条件下Ascl2过表达对神经干细胞增殖及分化的影响；其中(A)过表达组与空载体组BrdU掺入率统计，*P＜0.05。(C)增值培养条件下，过表达组与空载体组Dcx阳性率统计，***P＜0.001。(B-D)BrdU、Dcx代表性照片，Scalebar:100um。过表达Ascl2会降低BrdU、Nestin双阳性细胞数(14.2％VS 23％)，说明Ascl2会在一定程度上，干扰神经干细胞的增殖(图7ABD)。通过Dcx和Nestin双染结果(图7BCD)，增殖条件下，过表达Ascl2可显著升高神经前体标志物Dcx的表达(23.6％)，说明Ascl2可使神经干细胞冲破增殖培养条件的束缚，发生分化(图7BCD)。

筛选所得GFP阳性神经干细胞的PI细胞周期检测

为进一步考察Ascl2对神经干细胞增殖可能存在的影响，将流式筛选得到的细胞培养5h恢复正常状态，用75％冰乙醇固定、PI染色，进行流式分析Ascl2对细胞周期的影响，过表达Ascl2的神经干细胞G0/G1比率显著高于对照组，S期两组细胞间无显著差异，Ascl2组G2/M期比率显著低于对照组。说明与对照组相比，神经干细胞过表达Ascl2后有更多的细胞处于静止期，增值能力减弱，如图8A。说明ascl2可以抑制神经干细胞的增值，抑制作用可能是通过促进神经干细胞异常分化实现的。图8为Ascl2对神经干细胞细胞周期的影响；其中(A)过表达Ascl2改变神经干细胞周期进程，G0/G1期(74％vs 80％)，S期(12.9％vs13.1％)，G2/M期(13％vs 6.8％)。(B，C)Ascl2组及对照组细胞周期分析模式图。

筛选所得GFP阳性神经干细胞悬浮培养及相关标记物的检测

不论是增殖还是分化条件下贴壁培养时，都发现Ascl2有促使神经干细胞分化的趋势，但神经球的生长方式更贴近神经干细胞的真实状态。因此将筛选所得Ascl2及对照组的阳性细胞以1X10⁵密度接种在国产3cm皿中悬浮培养。结果如图9所示，其中(A,B)过表达Ascl2神经干细胞筛选后悬浮培养5天时状态，(C,D)神经干细胞感染空载体病毒筛选后悬浮培养5天时状态。bar＝100um。与对照组相比，过表达Ascl2的神经球生长状态一直较差，形状松散，不能成球的死细胞较多(图9A)，在培养期间还观察到在神经球的表面存在带有突触的细胞，结合前面实验结果推测Ascl2使悬浮培养条件下的神经干细胞也发生着分化，因此出现带有突触的神经元前体。接着，神经球的免疫荧光染色进一步确认了这种推测。如图10所示，其中(A-C)分别将激活型Caspases 3/Dcx/Tuj1阳性细胞数与各自神经球体积做比值后统计，***P＜0.001,**P＜0.01。(D,E)激活型Caspases 3/Dcx/Tuj1免疫荧光代表性照片，Scale bar:50μm。过表达Ascl2筛选后2天的神经球，与对照组相比，有较高比率的细胞呈Dcx/Tuj1阳性，且凋亡标记物Caspases3也在Ascl2组中有高表达，说明Ascl2的过表达使一定比率的神经干细胞发生了凋亡。

Ascl2体内功能研究--鸡胚电转

随着Ascl2在体外功能的逐步确认，想确认Ascl2在体内是否也是如此。基于Ascl2基因在物种间的保守性，选择发育中的鸡胚作为实验模型来研究Ascl2在体内可能发挥的功能。如图11所示，其中(A)发育到HH stage 10鸡胚，出现3个原始脑泡及10个体节，红色箭头指示质粒注射位置。(B)注射完成后，指示剂fastgreen充满神经管，并且在头部溢出。(C)完成电转的胚胎继续在孵箱培养48h解剖时的状态。

选择Hamburger–Hamilton(HH)stage 10的胚胎作为研究对象，在第3-4体节处注射pCIG-Ascl2/GFP过表达质粒，利用电击时形成的瞬时电场使细胞膜上形成孔洞，带负电荷的质粒涌入正极所在区域细胞，达到转基因的目的，将电转后的胚胎继续培养48h，待发育到图11C所示阶段时，解剖种蛋，获得胚胎，进行免疫荧光分析。发现，与对照组相比，过表达Ascl2的细胞会迅速迁移到神经管的边缘，不再表达Sox2，成为Neun阳性的成熟神经元。并且过表达Ascl2侧神经管细胞中Neun阳性细胞显著高于非转基因侧。说明在体内，Ascl2也具有使神经干细胞向神经元分化的作用。

图12为体内Ascl2对神经发生功能的研究其中(A)转染pCIG-ASCL2及pCIG-GFP48h时切片，Scale bar:200um。(B,C)SOX2/NEUN阳性细胞统计***P＜0.001,*P＜0.05。(D)同一张切片上转染侧与非转染侧Neun阳性细胞数统计，*P＜0.05。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 首都医科大学宣武医院

<120> 一种miRNA在制备降低神经干细胞中ascl2表达的药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uucaaguaau ccaggauagg cu 22

Claims (6)

1.一种miRNA在制备降低神经干细胞中ascl2表达的药物中的应用，其特征在于，所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种降低神经干细胞中ascl2表达的试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的miRNA、opti-MEM溶剂和RNAiMAX。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂为液体制剂。

4.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述miRNA的存储浓度为15～25pmol/μl。

5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述miRNA的使用浓度为0.8～2pmol/μl。

6.权利要求2～5任意一项所述的试剂在制备抑制神经细胞分化和凋亡的药物中的应用。