KR101984227B1 - 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 층분리 배양 및 이를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포의 증식 방법에 관한 것이다. 본 발명의 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법에 따르면, 단일 클로날 줄기세포를 빠르고 오염없이 수득할 수 있는 층분리 배양법의 장점에 더하여, 단일 클로날 줄기세포의 빠른 증식을 통해 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포의 대량 수득이 가능하므로, 줄기세포 치료제의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법 {The method for isolation of stem cells from bone marrow using subfractionation culturing method and proliferation thereof}
본 발명은 줄기세포의 층분리 배양 및 이를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포의 증식 방법에 관한 것이다.
줄기세포는 우리 몸의 210여개 모든 기관의 조직으로 성장할 수 있는 잠재적 능력을 갖고 있고, 무한히 분열할 수 있으며 적절한 조작을 통해 원하는 장기로 분화할 수 있다.　이와 같은 줄기세포의 특성 때문에 줄기세포는 새로운 치료제로 각광받고 있으며, 줄기세포를 이용한 난치병의 치료가능성은 대단히 높아 백혈병, 골다공증, 간염, 파킨슨씨병, 노인성 치매, 화상 등 수많은 질병 치료가 가능할 것으로 기대되고 있다.
그러나 줄기세포의 경우, 이를 대량으로 수득하기 어렵다는 점에서 여전히 많은 제약사항이 있다. 줄기세포를 수득하는 방법으로 냉동 배아세포에서 얻는 방법이 효율적이라고 할 수 있지만 윤리적인 면에서 아직도 많은 논란이 있다. 이와 같은 문제점을 해소하기 위하여 체세포 핵이식 방법이나 성체 줄기세포를 이용하여 줄기세포를 수득하는 방법 역시 많은 연구가 진행되었다. 배아줄기세포에 대한 연구보다 활발히 행해지는 분야는 성체줄기세포 연구이다.　성체줄기세포는 중추신경계나 골수 등 각종 장기에 남아 성장기의 장기발달과 손상시의 재생에 참여하는 세포로 각종 장기에 존재하기 때문에 골수, 비장, 지방세포 등을 포함한 여러 부위에서 얻을 수 있으나 골수에서 얻는 방법이 가장 흔히 시행된다.　그러나 많은 여러 종류의 골수세포들 중에서 중간엽 줄기세포들을 분리, 배양하는 데 있어 항상 균일한 형태의 세포를 얻는 데는 어려움이 있어 이러한 문제점들을 보완하기 위한 연구가 행해지고 있다.
분리 초기에 단핵세포들만을 Ficoll-paque이라는 방법을 사용하여 분리하여 세포를 배양용기에 부착시키는 방법인 Friedenstein 등이 사용한 분리 방법이 아직도 많이 사용되고 있지만 이러한 방법을 사용할 경우 세포의 특성이 일정하지 않고, 중간엽 줄기세포와 기타 단핵세포들이 같이 존재할 수 있어 단일성 세포군들을 만들기가 어렵다.　따라서 보다 동일한 세포를 얻기 위한 여러 방법이 고안되었는데 배양용기 바닥에 붙어 자라는 모든 세포를 분리하는 Luria et al.의 방법은 중간엽 줄기세포가 아닌 타 줄기세포가 섞여서 분리될 수 있다는 단점이 있고 (Luria et al., Transfusion, 11:345-349, 1971)　Simmons et al의 방법은 중간엽 줄기세포 세포표면 항원 중 Sca-1, STRO-1에 대한 특이 항체를 사용한 항체를 이용한 방법이기 때문에 비용이 많이 들고, 오염문제가 항상 존재한다 (Simmons et al., Blood, 78:55-62, 2002).　Hung et al.의 방법은 세포크기의 차이를 이용한 중간엽 줄기 세포 분리방법으로 이 역시 중간엽 줄기세포의 순도가 일정하지 않고, 타 줄기세포가 섞일 수 있다는 단점이 있다 (Hung et al., Stem Cells, 20:249-258, 2002).　
상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자는 새롭게 층분리 배양법이라고 명명된 줄기세포의 분리방법을 발명한 바 있으며, 대한민국 특허출원 KR 10-2006-0075676 호를 통해 특허 출원하고 이를 등록 받았다. 상기 층분리 배양법은 다른 방법에 비해 적은 비용으로 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 오염 문제가 없으며 타 줄기세포가 섞일 염려 없이 단일 클로날 중간엽 줄기세포(MSC)를 효과적으로 얻을 수 있다는 점에 있어서 다른 줄기세포 수득 방법에 비해 탁월한 우수성을 가지고 있다.
본 발명자에 의해 고안된 신규한 층분리 배양법 (subfractionation culturing method, SCM)은 단일 세포 유래의 단일 클로날 MSCs 를 마우스 및 인간세포로부터 수득할 수 있게 하며 원심분리 또는 효소분해가 불필요하다. 상기 층분리 배양법의 원리는 세포 밀도 및 배양 플레이트 부착을 기반으로 MSCs를 분리하는 것에 있다.
그러나 상기 방법의 우수성에도 불구하고, 층분리 배양법은 단일 클로날 MSC 를 대량 생산하여 최종 산물로 사용하기 위해서는 워킹 셀 뱅크를 제조하고, 이를 통해 최종 산물을 수득하는 공정을 거쳐야 충분한 양의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있으며 약 10 내지 12 계대의 배양이 필요하다는 점에서 빠른 단일 클로날 중간엽 줄기세포 집단 수득이 어려운 한계점이 있었다.
상기와 같은 층분리 배양법의 개선을 통해 단일 클로날 줄기세포의 빠른 증식을 유도하기 위한 연구를 하던 중, 본 발명자들은 단일 클로날 줄기세포의 배양 세포 밀도를 낮게 조절하고 항산화제를 첨가하여 배양하는 경우, 효과적인 세포 증식률 증가를 유도할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 기존의 층분리 배양법을 개선한 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 배양하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 상층액만 새로운 용기로 이동시켜 배양하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 상층액만을 분리하여 배양용기에서 37℃에서 1시간 내지 3시간 배양 후 37℃에서 12 내지 36 시간 배양을 2 내지 3회 반복하고 이어서 37℃에서 24 내지 72시간으로 배양하며, 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 반복 배양하는 단계; 4) 최종 배양 용기에서 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 포함하는 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법에 따르면, 단일 클로날 줄기세포를 빠르고 오염없이 수득할 수 있는 층분리 배양법의 장점에 더하여, 단일 클로날 줄기세포의 빠른 증식을 통해 단 시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포의 대량 수득이 가능하므로, 줄기세포 치료제의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 사람 골수로부터의 중간엽 줄기세포를 분리하는 층분리 배양법을 나타낸 도이다.
도 2는 세포 배양 밀도 및 세포 배양 계대에 따른 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화를 현미경 관찰을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 세포 배양 밀도 및 세포 배양 계대에 따른 중간엽 줄기세포의 세포 크기 및 입도 (granularity)의 변화를 FACS 분석을 통해 FSC (A) 및 SSC (B) 의 평균값으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 4는 세포 배양 밀도 및 세포 배양 계대를 달리한 중간엽 줄기세포를 베타-gal-염색법을 통해 염색한 후, 세포의 노화 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 계대 15 의 중간엽 줄기세포를 세포 배양 밀도를 달리하여 배양한 후 노화 관련 유전자인 p15, p16 및 증식 마커인 PCNA 를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 세포 배양 밀도 및 세포 배양 계대에 따른 중간엽 줄기세포의 증식능을 PDT(Population doubling time) 및 PDL (Population doubling level) 을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 7은 세포 배양 밀도 및 세포 배양 계대에 따른 중간엽 줄기세포의 분화능을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005). 도 7의 A는 세포 배양 및 세포 배양 계대에 따른 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 Oil red O 조직학적 염색을 통하여 확인한 결과이며 도 7의 B는 A의 조직학적 염색 정도를 정량화하여 나타낸 도이다. 도7의 C는 세포배양 및 세포 배양 계대에 따른 중간엽 줄기세포의 골화 세포로의 분화능을 Alizarin red S 조직학적 염색을 통하여 확인한 결과이며, 도 7의 D는 C의 조직학적 염색 정도를 정량화하여 나타낸 도이다.
도 8은 세포 배양 밀도 및 세포 배양 계대에 따라 중간엽 줄기세포에서 생산되는 총 ROS 생산 (A) 및 이에 따른 DNA 손상을 comet assay를 통해 확인 (B) 한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 9는 세포 배양 밀도 및 세포 배양 계대에 따라 생산되는 ROS에 의한 DNA 손상 정도를 확인하기 위하여 8-OHdG (8-hydroxy-deoxyguanosine) 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 10은 계대 11 내지 15의 중간엽 줄기세포를 고밀도 조건 단독(HD) 또는 고밀도 조건+아스코르브산 추가(HD+AA) 를 통해 배양한 후 세포 증식능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 계대 15의 중간엽 줄기세포를 고밀도 조건 단독(HD) 또는 고밀도 조건+아스코르브산 추가(HD+AA) 로 배양한 후, 생산되는 ROS 수준을 비교한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 12는 층분리 배양법 개량을 위한 실험 방법을 모식화하여 나타낸 도이다.
도 13 내지 도 20 은 층분리 배양법을 통해 수득된 SCM01 내지 SCM08 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 1000 또는 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 밀도로 접종하고 항산화제 첨가 유무를 달리한 LG-DMEM, α-MEM 배양 배지를 이용하여 배양한 세포의 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 각 도의 A 는 각 실험군의 계대 1 (P1) 내지 계대 5 (P5) 에 따른 세포 수의 변화를, 각 도의 B는 각 실험군의 PDT 및 PDL 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 항산화제가 첨가되지 않은 LG-DMEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 항산화제가 첨가되지 않은 LG-DMEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 PDT 및 PDL 을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 항산화제가 첨가된 α-MEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 항산화제가 첨가된 α-MEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 PDT 및 PDL을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 세포 밀도를 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 밀도로 고정하고, 배양 배지를 LG-DMEM 또는 α-MEM 배지로 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 세포 밀도를 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 밀도로 고정하고, 배양 배지를 LG-DMEM 또는 α-MEM 배지로 달리한 실험군에서의 PDT 및 PDL을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 기존 층분리 배양법을 개량한 방법으로, 단일 클로날 줄기세포, 바람직하게는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 빠르고 오염없이 수득할 수 있는 층분리 배양법의 장점에 더하여, 단일 클로날 줄기세포, 바람직하게는 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 빠른 증식을 통해 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포를 대량 수득할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 배양하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 상층액만 새로운 용기로 이동시켜 배양하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 상층액만을 분리하여 배양용기에서 37℃에서 1시간 내지 3시간 배양 후 37℃에서 12 내지 36 시간 배양을 2 내지 3회 반복하고 이어서 37℃에서 24 내지 72 시간으로 배양하며, 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 반복 배양하는 단계; 4) 최종 배양 용기에서 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 포함하는 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법을 제공한다.
상기 1) 내지 3) 단계는 KR 10-2006-0075676호에 기재된 층분리 배양 방법과 동일하게 수행될 수 있으며, KR 10-2006-0075676호는 본 발명에 전체로서 참고될 수 있다.
본 발명의 "층분리 배양" 은 줄기세포를 비중에 따라 분리하는 방법을 의미하며, 먼저 사람 골수를 추출하여 세포배양액에 배양한 후, 상층액만 수득하여 이를 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기로 옮겨 배양한 후, 동일 과정을 몇 차례 반복하는 공정을 말한다. 이와 같은 층분리 배양은 원심분리 과정 없이 상층액을 반복적으로 수득하여 배양하는 공정을 반복하는 것을 특징으로 하며, 최종적으로 다른 세포의 오염없이 단일 클로날 줄기세포, 바람직하게는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있는 장점이 있다.
상기 2) 및 3) 단계의 배양은 37℃에서 4시간 이하, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분 배양하고, 반복배양은 37℃에서 4시간 이하 배양 후(바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분) 37℃에서 12 내지 36시간 배양을 2 내지 3회 반복하고 (바람직하게는 18 시간 내지 30시간) 이어서 37℃에서 24 내지 72시간으로 배양하며 (바람직하게는 36시간 내지 60시간), 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 수행할 수 있다. 본 발명의 실시예에서 분리한 방법을 간단히 요약하면 다음과 같다.　
Figure 112017109994295-pat00001
배양한 세포들은 단일 클로날 세포군을 형성하는데, 이 단일 클로날 세포군들을 분리한 후 계대 배양을 수행할 수 있으며 본 발명은 층분리 배양을 통해 수득된 단일 클로날 줄기세포를 대량으로 신속하게 수득하기 위하여 5) 단계의 배양 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 5) 단계는 단일 클로날 줄기세포를 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 이하의 세포 밀도, 바람직하게는 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계이다.
상기 배양은 바람직하게는 계대 1 내지 계대 5의 배양인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 따르면 빠른 단일 클로날 줄기세포의 증식을 유도할 수 있으므로, 최종 산물을 빠르게 수득할 수 있으며, 계대 1 내지 계대 5의 배양을 통해 MCB (Master Cell Bank) 를 제조할 수 있다.
본 발명의 단일 클로날 줄기세포는 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 을 초과하여 기존의 공정과 같이 4000 세포/cm2 (cells/cm2)의 고밀도로 배양되는 경우 세포 증식능이 현저하게 감소하고 중간엽 줄기세포의 마커가 변화되고, 줄기세포의 분화능이 상실될 수 있다. 따라서 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 줄기세포는 저밀도 내지 중간 정도의 밀도, 즉 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 이하의 세포 밀도, 바람직하게는 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포 밀도, 더욱 바람직하게는 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포 밀도로 배양될 수 있다.
1000 세포/cm2 (cells/cm2) 이하의 세포 밀도로 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우, 세포의 증식능은 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 같이 고밀도로 배양된 중간엽 줄기세포와 비교하여 장기간의 배양기간 내내 현저히 높게 유지되므로, 많은 계대를 반복하지 않아도 원하는 양의 대량 단일 클로날 세포를 빠르게 수득할 수 있는 장점이 있다. 또한 상기 세포 밀도로 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우 해당 세포는 DNA 손상이 적으며, 노화가 억제되어 줄기세포의 분화능을 효과적으로 유지할 수 있는 장점이 있어 빠르고 신속하게 우수한 줄기세포 특성을 갖는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있다.
본 발명에 사용되는 배지는 항산화제를 포함하지 않는 배지, 상기 배지에 항산화제가 추가된 배지 또는 항산화제를 포함하는 배지를 모두 포함할 수 있다.
항산화제를 포함하지 않는 배지로는 이에 제한되는 것은 아니나 DMEM 배지를 사용할 수 있으며, 필요에 따라 상기 배지에 항산화제를 더 추가하여 배양을 수행할 수 있다. 또한 필요에 따라 항산화제가 포함된 α-MEM 배지를 이용하여 배양을 수행할 수 있다.
본 발명의 항산화제는 세포 배양에 사용될 수 있는 항산화제를 제한 없이 포함할 수 있으며, 글루타리온, 시스테인, 시스테아민, 유비퀴놀, 베타-머캅토에탄올 및 아스코르브산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 항산화제가 배지에 추가되는 경우, 상기 항산화제는 10 내지 50, 바람직하게는 10 내지 30, 더욱 바람직하게는 25μg/ml의 농도로 추가될 수 있다.
본 발명의 일 예에서는 항산화제를 포함하지 않는 배지로 DMEM, 더욱 바람직하게는 LG-DMEM 배지를 사용하며, 항산화제로 아스코르브산을 포함하는 배지로 α-MEM 배지를 사용한다.
한편 본 발명의 방법에 따르면 단일 클로날 줄기세포를 매우 효과적으로 증식할 수 있으므로, MCB 를 이용하여 WCB (Working Cell Bank)를 제조하는 공정이 생략될 수 있다. 이는 기존의 층분리 배양법이 MCB 제조 후 WCB 를 제조하는 공정을 수반해야 하는 것과 비교하여 공정을 단순화한 것이다.
본 발명의 상기 5) 단계의 배양은 계대 1 내지 계대 5 배양 시 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 이하의 세포 밀도로 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 계대 1 배양 시 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포 밀도로 단일 클로날 줄기세포를 배지에 접종하고 배양하며, 이를 증식시킨 후, 계대 2 내지 계대 5 배양 시 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 이하의 세포, 더욱 바람직하게는 700 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포, 더더욱 바람직하게는 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포 밀도로 단일 클로날 줄기세포를 배지에 접종하고 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 배양 배지로 항산화제를 포함하는 배지를 이용하는 경우, 상기 배양 배지에는 항생제로 젠타마이신이 추가될 수 있다.
본 발명의 방법을 통해 수득된 중간엽 줄기세포는 최종적으로 계대 5 내지 계대 10의 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 계대 6 내지 계대 8의 중간엽 줄기세포일 수 있다. 이는 최소 계대 10 내지 계대 12의 중간엽 줄기세포가 최종 산물로 수득되는 기존의 공정 대비 더 낮은 계대수이며, 세포 접종 밀도 조절을 통해 낮은 계대에서 빠르게 증식된 중간엽 줄기세포를 손쉽게 대량 수득할 수 있음을 나타낸다.
상기와 같이 수득된 중간엽 줄기세포는 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 줄기세포일 뿐만 아니라, 줄기세포 분화능이 효과적으로 유지되어 있는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 특히 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 이하의 세포 밀도로 배양되는 단일 클로날 줄기세포는 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 를 초과하는 고밀도의 세포 밀도로 배양되는 단일 클로날 줄기세포와 비교하여 골세포 분화능이 더 효과적으로 유지되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명의 내용이 하기 실시예로 한정되지는 않는다.
< 실시예 1> 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포 분석
국내특허출원 10-2006-0075676 호에 기재된 층분리 배양법을 보다 개량한 중간엽 줄기세포의 층분리 배양법 및 증식방법을 제공하기 위하여, 배양 조건 중 세포 밀도 및 배양 배지를 변화시켰으며, 이에 따른 중간엽 줄기세포의 특성을 비교 분석하였다.
이하 실험에서는 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 중간엽 줄기세포 (MSC)의 세포 배양 밀도를 각각 50 세포/cm2 (cells/cm2) (저밀도), 1000 세포/cm2 (cells/cm2) (중간 밀도), 4,000 세포/cm2 (cells/cm2) (고밀도) 로 달리하고 그에 따른 세포의 특성을 분석하였다.
1.1 세포 밀도에 따른 MSC 의 형태학적 변화 확인
먼저 장기간 배양에서 세포 밀도에 따른 MSC의 형태학적 변화를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 장기간 배양 조건을 주기 위하여 계대 5(P5), 계대 10(P10), 계대 15(P15)의 MSC 를 이용하였으며, 각각 저밀도, 중간 밀도, 고밀도의 조건으로 DMEM 배지에 접종하였다. 이 후 세포의 형태학적 변화를 현미경을 통해 관찰하여 줄기세포의 노화여부를 판단하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, P5 및 P10에서는 세포 밀도에 따라 세포 크기와 형태학적 패턴에서 차이를 나타냈으며, 특히 P15의 경우 고밀도 배양 조건에서 편평하며 커진 형태의 MSC가 관찰되었다. 이와 같은 형태는 전형적인 MSC의 노화를 나타내는 것으로, 장기간 배양에서 세포의 밀도 조절이 MSC의 노화를 조절할 수 있음을 확인하였다.
1.2 세포 밀도에 따른 MSC 세포 크기 및 입도 확인
세포 밀도에 따른 줄기세포의 변화를 추가적으로 확인하기 위하여, 노화된 세포에서 증가하는 것으로 알려져 있는 세포 크기 및 세포의 입도(granularity) 를 FACS 분석을 통해 정략 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포의 크기는 P5 에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, P10 및 P15인 경우 세포 밀도에 따라 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였다. 특히 P10 및 P15에서는 높은 세포 밀도의 배양 조건에서 세포의 크기가 유의적으로 증가하여 세포 노화가 더욱 촉진됨을 확인할 수 있었다. 이와 동일하게 세포의 입도 역시 모든 계대에서 세포의 밀도가 높아질수록 유의적으로 증가하는 결과를 나타내었다. 따라서 MSC 의 장기간 배양에 있어 세포의 밀도 조절이 세포 노화를 조절하는 인자가 될 수 있음을 확인하였으며, 세포 배양 밀도를 낮춤으로써 후기 계대에서 나타나는 형태학적 변화를 개선할 수 있음을 확인하였다.
1.3 배양 세포 밀도에 따른 MSC 의 노화 확인
실시예 1.1 및 1.2에서 확인된 형태학적 변화가 실제로 MSC의 노화 의존적 (age-dependent) 현상인지를 확인하기 위하여, 노화 세포를 선택적으로 염색할 수 있는 β-gal-염색분석법을 수행하고, 노화 관련 유전자인 p15, p16 및 증식 마커인 PCNA 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 비교하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, P5 및 P10에서는 모든 세포 밀도에서 노화된 세포의 염색을 확인할 수 없었으나, P15에서는 세포 밀도가 높아질수록 노화된 세포의 염색이 뚜렷하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 5에 나타낸 바와 같이, P15에서는 세포의 배양 밀도가 증가할수록 노화관련 유전자인 CDK 억제제 p15 및 p16 의 유전자 발현이 증가하였으며, 증식 마커인 PCNA는 감소하였다.
이러한 결과는 MSC의 형태학적 변화가 MSC의 노화와 관련 있음을 나타내는 결과이며, 세포 배양 밀도의 조절이 MSC의 노화를 조절할 수 있음을 나타내는 결과이다.
1.4 배양 세포 밀도에 따른 MSC 의 증식능 변화 확인
MSC의 증식 능력은 계대가 진행되고, 세포의 노화가 진행됨에 따라 점차적으로 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서 증식능은 MSC의 노화를 확인할 수 있는 기준으로 사용될 수 있으며, 장기간 세포 배양 시 세포 배양 밀도에 따른 MSC 의 증식능 비교를 수행하였다. 각 세포의 증식능은 초기 접종 세포 수와 배양이 끝난 후 얻어지는 세포의 수를 통해 각 계대에 따른 증식률을 계산하여 확인하였고, 그 결과를 표 1 및 도 6에 나타내었다.
증가 배수(Fold Increase)
(cell/cm2) P5 P10 P15
50 88.4±6.5 34.3±5.0 16.4±1.3
1000 8.5±0.3 4.9±0.5 3.1±0.4
4000 3.0±0.1 1.9±0.1 1.1±0.1
표 1에 나타낸 바와 같이, 저밀도로 배양된 MSC 의 경우 P5, 10, 15에서 증가 배수 (fold increase) 가 88.4, 34.3, 16.4 인 반면, 중간 밀도로 배양된 MSC는 8.5, 4.9, 3.1, 고밀도로 배양된 MSC는 3.0, 1.9, 1.1 인 것을 확인하였다. 또한 도 6에 나타낸 바와 같이, PDT와 PDL도 증가 배수와 같은 패턴으로 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는 장기간의 MSC 배양에서 세포 밀도를 낮춤으로써 MSC의 증식능을 유지시킬 수 있음을 보여주는 결과이며, 동일한 계대 배양을 수행하더라도, MSC의 노화를 억제시키고 MSC의 수명을 연장시킬 수 있음을 나타낸다.
1.5 배양 세포 밀도에 따른 MSC 의 분화능 변화 확인
세포 배양 밀도가 줄기세포능에 영향을 주는지 확인하기 위하여, P5 내지 P15 배양에 따른 분화능을 비교하였다. 줄기세포능으로 지방세포 분화능 및 골세포 분화능을 확인하였으며, 각각의 계대 및 밀도에서 정상, 정량 분석을 수행하였다. 구체적으로 지방세포 분화 배양액은 High Glusose DMEM 배양액에 NCS (Newborn Calf Serum) (Gibco), 10-7mol 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma), 0.5mM IBMX(Sigma), 10μg/ml 인슐린(insulin)(Sigma), 100μM 인도메타신(indomethacin) (Sigma)을 첨가한 배지를 만들어 실험하였으며, 7일 분화 후에 Oil red O 조직화학 염색을 통하여 확인하였다. 또한 Oil red O 조직화학 염색 후, 이소프로필 알코올로 용출시켰으며, 500nm에서 측정 후 정량 분석하여 확인하였다.
골세포 분화 배양액은 α-MEM 배양액에 FBS(Gibco), 50 μg/ml ascorbic 2-phosphate (sigma), 10-8mol 덱사메타손 (Sigma), 10mM β-glycerophosphate (sigma)를 첨가한 배지를 사용하였으며, 21일 분화 후에 Alizarin red S 조직화학염색을 통하여 확인하였다. 또한 Alizarin red S 조직화학 염색 후, 10% 아세트산으로 용출시켰으며, 405nm에서 측정하고 정량 분석하여 확인하였다. 상기와 같은 방법으로 지방세포 분화능 및 골세포 분화능을 확인한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화능은 계대가 진행됨에 따라 전체적으로 potential 이 감소하였으나, 밀도에 의한 차이가 뚜렷하게 나타나지 않은 반면, 골세포 분화능의 경우 고밀도 조건의 P15 배양군에서 유의하게 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 MSC의 골세포 분화능은 낮은 세포 밀도로 배양하는 경우 더욱 잘 유지될 수 있음을 확인하였다.
1.6 배양 세포 밀도에 따른 MSC 의 항원 프로파일 분석
세포 배양 밀도가 줄기세포의 항원 발현에도 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였으며, 각 계대 및 배양 밀도에 따른 양성 및 음성 항원 발현의 변화를 유세포 분석기 (flow cytometry) 로 확인하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112018065485214-pat00032
표 2에 나타낸 바와 같이, 음성 마커 발현의 변화는 뚜렷하게 확인되지 않았으나, 일부 양성 마커의 경우 같은 계대에서도 세포 배양 밀도에 따라 발현양의 변화가 나타남을 확인하였다. 특히 CD105, CD146 의 경우 세포 배양 밀도를 증가시킴에 따라 발현 양이 뚜렷하게 감소하였다. 이 외에 CD73 역시 P10 이상의 계대에서는 배양 밀도가 증가됨에 따라 발현이 현저하게 감소하는 경향을 나타내었다. 특히 P15 에서는 높은 밀도로 세포를 배양하는 경우 대부분의 양성 마커들의 발현 양이 현저하게 감소하였을 뿐만 아니라, CD73, CD105, CD105 는 음성 발현을 보여 세포 밀도를 낮게 유지하여 세포 배양을 수행하는 것이 매우 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였다.
1.7 배양 세포 밀도에 따른 ROS 생산 및 DNA 손상 비교
중간엽 줄기세포의 기능의 감소와 DNA 손상은 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 활성산소종인 ROS에 의해 유도되는 DNA 손상은 MSC 의 노화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 배양 밀도에 따라 총 ROS 생산 및 이에 따른 DNA 손상이 상이하게 나타나는지 여부를 확인하기 위하여, 계대 및 세포 배양 밀도에 따른 총 세포성 ROS 양을 형광 강도 분석을 통해 비교하고, comet 분석을 통해 DNA 손상 정도를 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 총 ROS 생산은 모든 계대에서 세포 배양 밀도가 증가할수록 증가되는 경향을 확인하였고, 특히 P10, P15에서는 유의적으로 ROS 생산이 증가됨을 확인하였다 (A). comet 분석에서는 DNA 손상이 가장 약한 CC1 부터 손상이 가장 심한 CC5로 분류하여 데이터를 분석하였으며, 손상이 가장 심한 CC5 의 경우 세포 배양 밀도가 높아질수록 유의적으로 증가함을 확인하였다. 반면, CC1 은 세포 밀도가 높아질수록 유의적으로 낮아지는 경향을 보였다 (B).
추가적으로 DNA 손상이 ROS 에 의해 유발된 것인지 확인하기 위하여, ROS 에 의한 DNA 손상을 확인하는 8-OHdG 의 농도를 확인하는 실험을 수행하였다. 8-OHdG 분석방법은 다음과 같다. 각각의 세포로부터 얻은 DNA 시료 50μl를 8-OHdG 가 결합된 플레이트(8-OHdG conjugate coated plate)에 넣어준 후, 상온에서 10분간 배양하였다. 그 후, 항-8-OHdG 항체(anti-8-OHdG antibody)를 추가로 넣어 상온에서 한 시간 배양하였으며, 3회 세척 후, secondary antibody enzyme conjugate를 각 웰(well) 에 넣어 준 후, 다시 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이 후 다시 3회 세척 후, 기질 용액 (substrate solution) 을 넣어 상온에서 30분간 배양하였다. 마지막으로 정지 용액 (Stop solution) 을 넣어 준 후, 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, DNA 손상이 가장 심한 것으로 나타난 P15 군에서는 세포 배양 밀도가 높아질수록 8-OHdG 의 농도가 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 고밀도 배양 조건에서 생산되는 ROS 에 의해 DNA 손상이 증가하는 것이며, 이에 의해 MSC의 노화가 촉진된다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는 세포 배양 밀도를 낮게 조절하는 것이 MSC의 ROS 생산 증가에 의한 DNA 손상으로부터 MSC를 보호하는 역할을 할 수 있음을 보여주는 결과이다.
1.8 항산화제 처리에 따른 MSC 증식 및 ROS 생산능 확인
MSC 의 증식이 고밀도 배양 조건에서 생산되는 ROS 에 의해서 영향을 받는지 여부를 확인하기 위하여, ROS 소거 실험을 수행하였다. P11 내지 P15 에서 고밀도 배양 조건 및 고밀도 배양 조건에 항산화제인 아스코르브산 25μg/ml을 배지에 첨가하여 배양한 후 두 그룹 간의 증식 Fold 증가를 비교하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 고밀도 배양 조건에서 Fold increase가 P11 내지 P15 에서 각각 2.6, 1.9, 1.6으로, 계대수가 증가할수록 증식능이 감소하면서 노화가 나타나기 시작했으나, 항산화제를 처리한 경우 모든 계대에서 약 50% 정도 증식능이 높게 유지되는 것을 확인하였다. 또한 항산화제 처리군에서 성장 증가 배수 (growth fold increase)는 P11 내지 P15 에서 각각 3.8. 2.9, 2.5로 P15까지도 증식능이 높게 유지되었다.
마지막 시점(Endpoint)인 P15에서 고밀도 배양 조건 단독 및 고밀도 배양 조건+항산화제 처리 두 그룹 간의 ROS 수준을 확인한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 항산화제인 아스코르브산을 처리하여 증식이 증가한 조건에서는 ROS 의 수준 역시 감소되어 있음을 확인하였다. 따라서 MSC 배양은 고밀도가 아닌 낮은 세포 밀도에서 수행하는 것이 바람직하며, 고밀도 세포 배양에서 유도되는 ROS 생산을 항산화제로 소거하는 경우 MSC의 증식능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 즉 고밀도 조건의 ROS 로 인해 MSC의 증식능이 억제되며, 세포 밀도가 낮아질수록 ROS 가 감소하여 MSC 증식능이 촉진될 수 있다.
이러한 결과를 종합하면, 층분리 배양을 통해 얻어진 단일 클로날 중간엽 줄기세포 의 증식, 배양 및 줄기세포능을 유지하기 위해서는 배양 조건 중 세포 밀도를 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 이하의 밀도로 조절하는 것이 중요하며, 항산화제를 첨가하여 배양하는 경우 세포 배양에서 유발될 수 있는 산화 스트레스를 억제하여 MSC 증식을 효과적으로 촉진할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 2> 개량된 층분리 배양법의 검증
상기 실시예 1 을 통해, 층분리 배양법으로 수득한 MSC 배양에 있어서 세포 밀도의 조절 및 항산화제의 첨가가 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였으므로, 국내특허출원 10-2006-0075676 호에 기재된 층분리 배양법의 기존 공정으로 수득한 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 세포 배양 밀도를 달리하고, 항산화제인 아스코르브산이 첨가된 배지로 배지를 달리하면서 단일 콜로니 MSC 의 증식능 및 이에 따른 세포 수득 효과를 비교하였다. 이전 국내특허출원 10-2006-0075676 호에서는 단일성 세포군인 콜로니들을 웰당 100 내지 600의 세포수로 이동하였으며, 그 이후의 계대 배양에서는 cm2 당 4000 개의 세포로 배양을 진행하였다.
구체적으로 본 개량 방법에서는 계대 1 (P1) 의 세포 수를 1000 세포/cm2 ( cells/cm2)로 조절하여 배양하는 방법을 통해 세포의 효과적인 증식을 유도하고, 계대 2 (P2) 이후 계대 배양에서는 낮은 밀도인 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 이하의 세포를 분주하고 이를 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포 배양의 효과와 비교하였다. 또한 세포 배양 배지를 항산화제가 포함된 α-MEM 배지와 항산화제가 미 포함된 LG-DMEM 배지로 달리하고 이에 따른 세포 증식 효과를 비교하였다.
개량된 층분리 배양법의 효과를 확인하기 위한 실험군을 하기 표 3에, 공정 개량 부분을 도 12에 모식화하여 나타내었다.
Figure 112018065485214-pat00033
세포주들은 층분리 배양 방법에 의해 분리된 세포주이며 SCM01 내지 SCM08로 각각 명명하였다.
2.1 세포주 밀도 및 배지에 따른 증식 효과 확인
상기 SCM01 내지 08 세포주를 이용하여 배양을 수행하고, 계대 5 (P5) 까지의 계대 배양에 따른 세포 증식 효과를 세포 수, PDT (Population Doubling Time), PDL (Population Doubling Level) 로 각각 비교하였으며, 이를 도 13 내지 도 20에 나타내었다.
도 13 내지 도 20에서 확인한 바와 같이, cm2 당 1000개의 세포 밀도로 접종하여 배양된 모든 실험군에서 cm2 당 4000개의 세포 밀도로 접종하여 배양한 실험군보다 우수한 세포 증식 효과를 나타내었다. 또한, 동일한 1000개의 세포 밀도군이라도, 항산화제인 아스코르브산이 포함된 α-MEM 배지에서 배양된 1000alpha 실험군에서 더욱 현저한 세포 증식 효과를 확인하였다.
2.2 세포주 밀도에 따른 증식 효과 비교
배양 세포 수에 따른 증식률의 보다 정확한 비교를 위하여, 배양 배지를 각각 LG DMEM 또는 α-MEM 배지로 고정하고, cm2 당 1000 또는 4000개의 세포 접종 밀도에 따른 세포 증식 효과를 비교하였으며, 그 결과를 도 21 내지 도 24 에 나타내었다.
도 21 에 나타낸 바와 같이, LG DMEM에서 배양된 SCM01 내지 SCM08 세포주의 P2 내지 P5 증식률이 cm2 당 4000 개의 세포수 접종군보다 1000 개의 세포수로 접종하여 배양하였을 때 현저하게 높은 것을 확인하였으며, 계대 5(P5) 에서 확인된 cm2 당 4000 개의 세포 접종 대비 1000개의 세포 접종군의 증식률은 최소 3.08 내지 최대 48.50 배인 것을 확인하였다. 또한 도 22에 나타낸 바와 같이, cm2 당 1000개의 세포 접종군의 PDT 값도 모든 세포주에서 cm2 당 4000개 세포주 접종보다 낮거나 비슷한 수준으로 나타났으며, PDL 값은 모든 세포주에서 cm2 당 4000개 세포 접종 대비 높은 값을 확인하였다.
또한 도 23에 나타낸 바와 같이, α-MEM 에서 배양된 SCM01 내지 SCM08 세포주 모두 1000 개의 세포수로 접종하여 배양하였을 때, DMEM 실험군과 같은 경향을 보였으며, 계대 5 에서 확인된 cm2 당 4000 개의 세포주 접종 대비 cm2 당 1000개의 세포 접종군의 증식률은 최소 6.32 내지 최대 85.63배인 것을 확인하였다. 또한 도 24에 나타낸 바와 같이, cm2 당 1000개의 세포 접종군의 PDT 값도 모든 세포주에서 cm2 당 4000개 세포 접종보다 낮거나 비슷한 수준으로 나타났으며, PDL 값은 모든 세포주에서 cm2 당 4000개 세포 접종 대비 높은 값을 확인하였다.
이러한 결과는 cm2 당 4000개의 고밀도 세포 접종 배양에 비하여 cm2 당 1000개 이하의 세포 접종을 통해 빠른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식을 유도할 수 있음을 보여주는 결과이다.
2.3 배양 배지에 따른 증식 효과 비교
앞서 실시예 2.2 를 통해 1000 세포/cm2 배양이 4000 세포/cm2 배양 대비 우수한 증식 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였으므로, 세포수를 1000개로 고정하고, 배지를 변수로 변화시키면서 세포 증식 효과를 비교함으로써, 배양 배지 조건에 의한 증식 효과를 추가적으로 검증하였고 그 결과를 도 25 및 도 26에 나타내었다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 배양 배지를 α-MEM 및 DMEM으로 달리하며 세포 증식률을 비교한 결과 LG-DMEM 대비 α-MEM 배지를 이용한 실험군에서 최소 1.77 배 내지 6.39 배의 높은 세포 증식률을 확인하였다. 또한 도 26에 나타낸 바와 같이, PDT 가 모든 α-MEM 실험군에서 낮게 나타났으며, PDL은 증가된 것을 확인하였다.
이와 같은 실험 결과는 세포 접종 밀도를 cm2 당 1000개 이하의 세포로 조절하여 계대 2 (P2) 내지 계대 5 (P5)로 배양하는 것에 더하여 항산화제가 첨가된 배지를 이용하여 배양하는 경우 세포 증식 효율을 극대화할 수 있음을 나타낸다.
< 실시예 3> 개량 공정의 수립
상기 실시예들을 통해, MSC 배양에 있어서 세포 밀도의 조절 및 항산화제의 첨가가 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였으므로, 국내특허출원 10-2006-0075676호에 기재된 층분리 배양법의 기존 공정에 더하여, 세포 배양 밀도 및 배지 조건을 달리하여 단일 콜로니의 중간엽 줄기세포를 효과적으로 수득할 수 있는 개선된 공정을 확립하였으며, 이를 종합적으로 하기 표 4 (DMEM 배지를 이용한 배양 조건) 및 표 5 (α-MEM 배지를 이용한 배양 조건) 에 나타내었다.
Figure 112018065485214-pat00034
Figure 112018065485214-pat00035
보다 구체적으로 본 발명의 골수 유래 중간엽 줄기세포의 층분리 배양 공정 및 증식 배양을 다음과 같이 수행하였다.
골수제공자의 엉덩이부분을 국소마취제로 마취시킨 후, 엉덩이뼈에 주사바늘을 찔러 골수를 채취하였다.　100 mm 배양용기에 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 14 ml DMEM(Dulbecco`s modified Eagle`s Medium, GIBCO-BRL, Life-technologies, MD, USA), 사람 골수 1 ml를 넣어 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 2시간 배양하였다.　배양 후, 배양용기를 한쪽으로 살짝 기울여 바닥에 붙은 세포들이 되도록 떨어지지 않도록 최대한 배양용기의 상층 배양액만 새로운 용기로 옮겼다.
동일한 과정을 한 번 더 반복한 후 수득한 배양액을 바닥에 교원질(collagen)이 코팅된 배양용기(Becton Dickinson)로 옮긴 후 37℃에서 2시간 배양하였다.　배양액을 다시 새로운 교원질이 코팅된 용기로 옮기고 24시간 후 다시 새로운 용기로 옮기고 24시간 후 또 새로운 용기로 옮겨주었다. 마지막으로 48시간 후 새로운 용기로 옮겨 준 후 남아있는 세포들이 배양용기 바닥에 붙어 자라는 것을 육안으로 확인하였다.　앞의 여러 층분리 단계들을 거쳐서 이 단계에까지 올 수 있는 세포들은 세포의 비중이 타 세포들보다 월등히 작은 세포들임을 짐작할 수 있다.　약 10 내지 14일의 시간이 지나면 세포들이 단일 콜로니 (single colony)를 형성하는데, 이 단클론성 세포군들을 트립신을 처리하여 분리한 다음 50~200 세포 /cm2 (cells/cm2) 의 세포수로 6-웰 배양용기로 옮겼다. 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 4 내지 5일 배양한 후 약 80% 자랐을 때, 세포들을 0.25% trypsin/1mM EDTA(GIBCO-BRL)를 처리하여 수득한 후, 75㎠ 배양용기로 옮겨 계대배양하였다.　
이와 같이 초기 계대 2 내지 계대 5에서의 세포 밀도를 1000세포/cm2 수준으로 낮춰 배양하는 경우, 다른 공정은 모두 동일하게 조절하였음에도 MSC의 증식능 및 줄기세포 특성이 우수하게 유지되어 동일한 계대에서도 증식이 효과적으로 유도됨을 확인하였다. 특히 세포 밀도를 낮춰 배양하는 경우, 기존 공정에서 필요로 했던, MSC에서 WCB(Working Cell Bank) 를 제조하는 과정을 생략할 수 있어, 세포 제조 기간을 효과적으로 단축할 수 있다. 특히 계대를 적게 하면 노화가 비교적 덜 진행된 세포를 많은 양으로 수득할 수 있으며, 이와 같은 세포를 치료제로 이용하는 경우 치료 효능이 우수할 것으로 기대할 수 있다.
또한, 배양 배지로써 항산화제가 첨가된 α-MEM 을 이용하는 경우, 높은 밀도의 세포 배양에서 유도되는 ROS 스트레스가 항산화제 처리에 의해 효과적으로 개선되고 MSC의 세포 증식능이 회복될 수 있어, 기존의 공정 대비 세포의 계대를 현저히 단축하고, MSC 의 특성을 유지하는 노화가 진행되지 않은 신선한 상태의 단일 콜로니 MSC를 빠르고 안정적으로 수득할 수 있다는 특징이 있다.
상기와 같은 내용을 종합하면, 저밀도 세포 배양은, 단시간에 많은 세포를 얻을 수 있어 제조공정은 간소화시킬 뿐 아니라 장기간 배양(long-term culture)에서도, MSC의 특성을 온전히 유지하는 노화되지 않은 상태의 세포를 수득할 수 있으므로, 양질의 줄기세포 생산을 가능하게 함을 알 수 있다. 따라서, 세포치료제 개발을 위한 대규모 생산(large-scale production) 기술개발에 활용도가 높을 것으로 기대된다.

Claims (11)

1) 개체로부터 분리된 골수를 배양하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 상층액만 새로운 용기로 이동시켜 배양하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 상층액만을 분리하여 배양용기에서 37℃에서 1시간 내지 3시간 배양 후 37℃에서 12 내지 36 시간 배양을 2 내지 3회 반복하고 이어서 37℃에서 24 내지 72 시간으로 배양하며, 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 반복 배양하는 단계;
4) 최종 배양 용기에서 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및
5) 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2 ) 의 세포 밀도로 항산화제가 추가된 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 포함하는 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
　　　　　　　　
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 계대 1 내지 계대 5 배양인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 1000 세포/cm2 (cells/cm2 ) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 항산화제는 10 내지 30μg/ml 추가된 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 항산화제가 추가된 배지는 DMEM 에 항산화제를 추가한 배지 또는 α-MEM 인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 계대 1 배양 시 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2 ) 의 세포 밀도로 단일 클로날 줄기세포를 배지에 접종하고 배양하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 계대 2 내지 계대 5 배양 시 700 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2 ) 의 세포 밀도로 단일 클로날 줄기세포를 배지에 접종하고 배양하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양 배지는 젠타마이신이 추가된 배지인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법을 통해 수득된 줄기세포는 5 내지 10 계대의 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법을 통해 수득된 줄기세포는 골세포 분화능을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020190023A2 (ko) * 2019-03-19 2020-09-24 에스씨엠생명과학 주식회사 단일 클로날 줄기세포를 이용한 아토피 피부염 치료 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100802011B1 (ko) * 2005-08-10 2008-02-12 인하대학교 산학협력단 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6082364A (en) * 1997-12-15 2000-07-04 Musculoskeletal Development Enterprises, Llc Pluripotential bone marrow cell line and methods of using the same
KR100563859B1 (ko) 2004-07-20 2006-03-23 현대모비스 주식회사 리어현가장치의 조립용 잭
US7781211B2 (en) * 2005-06-17 2010-08-24 Homeotherapy, Co. Ltd Isolation of multi-lineage stem cells
US8796020B2 (en) * 2005-06-17 2014-08-05 Inha-Industry Partnership Institute Manufacturing process for fresh and frozen stem cells
US20080299656A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-04 Song Sun U Isolation of multi-lineage stem cells
KR101655780B1 (ko) * 2013-11-29 2016-09-09 인하대학교 산학협력단 클로날 중간엽 줄기세포를 포함하는, 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101769551B1 (ko) * 2015-07-29 2017-08-18 에스씨엠생명과학 주식회사 층분리배양법을 이용한 지방-유래 줄기세포의 분리 및 이의 이용

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100802011B1 (ko) * 2005-08-10 2008-02-12 인하대학교 산학협력단 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법

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