TWI796536B

TWI796536B - 包含克隆幹細胞的用於治療胰腺炎的藥學組合物

Info

Publication number: TWI796536B
Application number: TW108145873A
Authority: TW
Inventors: 淳旭宋; 金詩那; 黃明奐
Original assignee: 韓商Ｓｃｍ生命科學有限公司
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2023-03-21
Also published as: TW202034933A; JP2022513222A; KR20200073128A; US20220047640A1; KR102247136B1; KR102247136B9; CN113382739A; WO2020122498A1; EP3909591A1; EP3909591A4; JP7389505B2

Abstract

本發明涉及包含通過改良的幹細胞層分離培養獲得的單克隆幹細胞的用於預防、治療或改善胰腺炎的組合物及其製備方法。根據本發明的改良的幹細胞的層分離培養及增殖方法，可通過單克隆幹細胞的快速增殖來在短時間內獲得大量所需的單克隆幹細胞，由此獲得的單克隆間充質幹細胞是治療胰腺炎效果增強的幹細胞，可有效地用作胰腺炎治療劑。

Description

包含克隆幹細胞的用於治療胰腺炎的藥學組合物

本發明涉及包含通過改良的幹細胞的層分離培養獲得的單克隆幹細胞的用於預防、治療或改善胰腺炎的組合物及其製備方法。

胰腺炎(pancreatitis)是由胰腺(pancreas)炎症引起的疾病，包括急性胰腺炎(acute pancreatitis)和慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)。胰腺炎是由於過量飲酒(alcohol abuse)、膽結石(gallstones)等而胰液流動不良導致胰液中所含的酶誘發胰腺自溶引起的。胰腺炎大致可分為兩種類型，包括具有間質性水腫(interstitial edema)和胰周脂肪壞死(peripancreatic fat necrosis)的輕度(mild type)胰腺炎，以及伴隨胰周(peripancreatic)及胰內(intrapancreatic)防範性脂肪壞死、胰腺實質壞死(pancreatic parenchymal necrosis)、出血的重症(severe type)胰腺炎。

尚不知道胰腺炎確切的病理生理機制，但典型的症狀是蛋白分解酶前體在胰腺內被早期活化引起的自消化過程。即，若在胰腺腺泡細胞(pancreas acinar cell)中消化酶被異常早期活化，則消化胰腺的細葉自身，進而發生炎症引起組織脫落、壞死。最近，發現對胰腺祖細胞損傷後進入胰腺的被活化的巨噬細胞通過回應組織損傷來分泌促炎性細胞因數白介素（interleukin）-1β（IL-1β），從而在炎性細胞的迴圈、胰腺水腫及胰腺實質破壞中起重要作用。

已經提出了幾種減輕胰腺炎的嚴重程度並抑制各種器官的併發症的實驗療法，但是，當將實驗療法應用於人時，其效果甚微，迄今為止，實際上沒有廣泛用於預防和治療胰腺炎的有效的治療劑。

最近，正嘗試使用幹細胞治療各種炎性疾病。幹細胞具有可生長成我們體內的所有210多種器官的組織的潛力，可以無限分裂，並且可通過適當的操作分化為所需的器官。由於幹細胞的這些特性，幹細胞作為一種新型治療劑備受關注，並且使用幹細胞治療頑固性疾病的可能性非常高，因此有望治療多種疾病，例如白血病、骨質疏鬆症、肝炎、帕金森氏病、老年性癡呆、燒傷等。

然而，在幹細胞的情況下，由於很難獲得大量幹細胞，因此仍然存在許多限制。作為獲得幹細胞的方法，從冷凍的胚胎細胞中獲得幹細胞的方法可能是有效的，但是道德方面仍然存在很多爭議。為了解決這種問題，關於利用體細胞核移植或成體幹細胞來獲得幹細胞的方法也進行了許多研究。相對於對胚胎幹細胞的研究，更積極進行對成體幹細胞的研究。成體幹細胞是保留在中樞神經系統或骨髓等各種器官中並參與生長期的器官的發育和損傷期的再生的細胞，由於它們存在於各種器官，因此可以從包括骨髓、脾臟和脂肪細胞等在內的各種部位獲得，但是從骨髓獲得的方法最常用。然而，在從許多不同種類的骨髓細胞中分離並培養間充質幹細胞中，總是很難獲得均勻形態的細胞，因此進行了用於完善這種問題的研究。

本發明人發明了被命名為新型層分離培養方法的幹細胞的分離方法，通過韓國專利申請KR 10-2006-0075676號申請專利並授權。上述層分離培養法與其他幹細胞獲得方法相比具有優越的優秀性，不僅能夠以比其他方法更低的成本進行，而且沒有污染問題，並且可以有效地獲得菌落間充質幹細胞（cMSC），而不必擔心與其他幹細胞的混合。然而，儘管上述方法具有優秀性，但是層分離培養法在獲得快速單克隆間充質幹細胞群體方面有局限性，為了生產大量充質幹細胞並將其用作最終產品，必須製備工作細胞庫，並且通過由此獲得最終產物的工序，可獲得足夠量的間充質幹細胞，並且需要至少培養至第十代（Passage）以上。

尤其，為治療炎性疾病，尤其為治療胰腺炎而使用幹細胞仍然具有多種局限性，迄今為止，沒有用於有效治療胰腺炎的幹細胞的製備方法和利用其的胰腺炎治療方法。

本發明人在研究通過改良如上所述的層分離培養法來誘導幹細胞的快速增殖的過程中，在利用通過調低培養細胞密度並添加抗氧化劑來進行培養的改良的層分離培養法的情況下，僅少量傳代培養可以誘導細胞增殖率的有效增加，與現有的層分離培養方法的幹細胞相比，確認由此獲得的單克隆幹細胞具有非常顯著的胰腺炎治療效果，從而完成了本發明。

因此，本發明的目的在於，提供包含單克隆幹細胞的用於預防、治療及改善胰腺炎的組合物及其製備方法，上述單克隆幹細胞通過改良的現有層分離方法的幹細胞的層分離培養及增殖方法獲得。

為了實現上述目的，本發明提供一種用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物，包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1），在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2），僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3），培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4），將步驟3）的上述上清液作為步驟2）的第一容器的上清液，通過重複步驟2）和步驟3）一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5），以50細胞/cm² （cells/cm² ）至1000細胞/cm² 的細胞密度將步驟4）的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。

並且，本發明提供一種用於預防、改善或治療胰腺炎的藥學組合物，包括：步驟1），在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2），僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3），培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4），將步驟3）的上述上清液作為步驟2）的第一容器的上清液，通過重複步驟2）和步驟3）一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5），以50細胞/cm² 至1000細胞/cm² 的細胞密度將步驟4）的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。

並且，本發明提供一種用於預防、改善或治療胰腺炎的幹細胞，通過如下步驟獲得：步驟1），在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2），僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3），培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4），將步驟3）的上述上清液作為步驟2）的第一容器的上清液，通過重複步驟2）和步驟3）一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5），以50細胞/cm² 至1000細胞/cm² 的細胞密度將步驟4）的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。

根據本發明的改良的幹細胞的層分離培養基增殖方法，可通過單克隆幹細胞的快速增殖在短時間內獲得大量所需的單克隆幹細胞，由此獲得的單克隆間充質幹細胞為具有增強的胰腺炎治療效果的幹細胞，可有效地用作胰腺炎治療劑。

本發明涉及一種預防或治療胰腺炎的方法，包括向所需的個體給藥包含單克隆抗體的用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物或上述單克隆幹細胞的步驟，上述單克隆幹細胞通過改良的間充質幹細胞的層分離培養及增殖方法獲得。

並且，本發明涉及一種用於預防、改善或治療胰腺炎的組合物的製備方法，包括通過改良的間充質幹細胞的層分離培養及增殖方法來獲的單克隆幹細胞。

作為本發明的有效成分的單克隆幹細胞是通過改良的層分離培養方法獲得的幹細胞，上述改良的層分離培養方法除了具有能夠快速且無污染地獲得幹細胞的優點以外，通過單克隆幹細胞，優選為單克隆間充質幹細胞的快速增殖在短時間內可獲得大量所需的單克隆幹細胞，而不需要製備工作細胞庫（Working Cell Bank，WCB）的步驟。與通過現有的層分離培養方法獲得的幹細胞相比，通過上述方法獲得的單克隆幹細胞是治療胰腺炎效果增強的幹細胞。

以下，詳細說明本發明。

本發明提供一種用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物，包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1），在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2），僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3），培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4），將步驟3）的上述上清液作為步驟2）的第一容器的上清液，通過重複步驟2）和步驟3）一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5），以50細胞/cm² （cells/cm² ）至1000細胞/cm² 的細胞密度將步驟4）的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。

上述步驟2）及步驟3）的培養可以如下進行：在30℃至40℃的溫度下培養4小時以下，優選地，培養1小時至3小時，更優選地，培養1小時30分鐘至2小時30分鐘，重複培養是在30℃至40℃的溫度下培養4小時以下，優選地，培養1小時至3小時，更優選地，培養1小時30分鐘至2小時30分鐘後，在30℃至40℃的溫度下培養12至36小時，優選地，將18小時至30小時的培養重複兩次至三次，接著，在30℃至40℃的溫度下培養24小時至72小時，優選地，培養36小時至60小時，每次將上清液移到新的培養容器中。

本發明的實施例中分離的方法簡要說明如下。

所培養的細胞形成單克隆細胞群體，在分離該單克隆細胞群體後可進行傳代培養，本發明的特徵在於，除了現有的層分離培養方法以外，還包括步驟5）的傳代培養步驟。

在本發明中，“層分離培養”是指根據比重分離幹細胞的方法，是指如下工序，即，首先，提取人骨髓並培養於細胞培養液後，獲得上清液並將其移到處理或未處理塗敷劑的培養容器中進行培養後，多次重複相同過程。這種層分離培養的特徵在於，重複進行通過重複獲得上清液來進行培養的工序，而無需離心過程，並且其優點在於，最終可獲得單克隆幹細胞，優選地可獲得單克隆間充質幹細胞，而不會污染其他細胞。

本發明的上述步驟1）至步驟5）中步驟1）至步驟4）可以以與KR 10-2006-0075676號、US 12/982738或KR10-2013-7020033號中記載的層分離培養方法相同或等同的方式進行，可以將KR 10-2006-0075676號的所有內容作為參照。

並且，現有KR10-2013-7020033及US12/982738號中公開了一種與胰腺炎的治療有關的獲得細胞的方法，包括：步驟（i），獲得骨髓、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品或細胞因數啟動的外周血的生物學樣本；步驟（ii），將上述骨髓、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品或細胞因數啟動的外周血的生物學樣本浸漬於容器中；步驟（iii），將含有比其他細胞密度較小的細胞的上清液以連續方式兩次以上從上述容器輸送到另一個容器；步驟（iv），從上述上清液中分離密度較小的細胞；步驟（v），向患有胰腺炎對象給藥在步驟（iv）中獲得的細胞，其中上述骨髓、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品或細胞因數啟動的外周血未經步驟（i）至步驟（iii）中大於1000rpm的離心。上述方法為僅通過密度差而無需離心即可獲得單克隆幹細胞的方法，使用KR 10-2006-0075676號的現有層分離培養方法。

然而，上述US 12/982738、10-2006-0075676號及KR10-2013-7020033號的層分離培養方法未公開在低傳代時有效獲得單克隆幹細胞並由此治療胰腺炎治療效果得到顯著改善的用於獲得改良的單克隆幹細胞的方法。

如圖1所示，現有層分離培養方法如下進行，即，從單菌落中獲得的所有細胞移到6孔中，並增殖至80～90％匯合（confluency）後，以增殖狀態的第一代（P1）細胞為種子細胞（seed cell），在對密度調節不了解的情況下，為了獲得大量細胞，可以以4000細胞/cm² 進行高密度培養。

與此相反，本發明涉及一種“改良的層分離培養方法”，其基於可通過調節細胞密度來有效地獲得預防、治療、改善胰腺炎的效果優秀的幹細胞，其特徵在於，改變現有的層分離培養方法和種子細胞之後的培養步驟。例如，具體地，包括“步驟5），將步驟4）的上述單克隆幹細胞以50細胞/cm² 至1000細胞/cm² 的細胞密度接種於培養基中進行培養”。與現有的層分離培養方法相比，改良的層分離培養方法可誘導單克隆幹細胞的快速增殖，因此可快速獲得最終產物，優選地，僅培養至小於第十代如P2至P8來製備主細胞庫（Master Cell Bank，MCB），並可獲得預防或治療胰腺炎效果優秀的單克隆幹細胞。

如現有的工序所示，在以4000細胞/cm² 的高密度培養本發明的單克隆幹細胞的情況下，細胞增殖能力顯著減少且間充質幹細胞的標記物發生變化，並且幹細胞的分化能力可能喪失。因此，通過改良的層分離培養法獲得的單克隆幹細胞意味著以低密度程度至中密度程度、小於4000細胞/cm² 的細胞密度進行培養，例如，3000細胞/cm² 以下，優選地，2000細胞/cm² 以下，更優選地，50細胞/cm² 至1000細胞/cm² （cells/cm² ）的細胞密度培養。

與以4000細胞/cm² 之類的高密度培養的間充質幹細胞相比，在以1000細胞/cm² 以下的細胞密度培養單克隆間充質幹細胞的情況下，細胞的增殖能力在長期的培養時間內都保持很高，因此，具有無需重複多次傳代也可快速獲得大量所需的單克隆細胞的優點。因此，本發明的改良的層分離培養方法的特徵在於，將種子細胞之後的傳代培養步驟僅進行至小於第十代，優選地，僅進行至第八代以下，與為確保足夠數量的細胞而培養至最高第二十五代的現有的層分離培養方法相比，其具有僅用較少的傳代培養也可生產大量單克隆幹細胞的優點。

並且，在用上述細胞密度培養單克隆間充質幹細胞的情況下，該細胞的去氧核糖核酸的損傷較少，由於抑制老化，因此具有可有效地保持幹細胞的分化能力的優點，進而可快速獲得具有優秀的幹細胞特性的單克隆間充質幹細胞。

並且，與以4000細胞/cm² 之類的高密度培養的單克隆幹細胞相比，根據本發明的方法獲得的單克隆幹細胞的預防、改善或治療胰腺炎的效果優秀。

使用於本發明中的培養基均可包括不含抗氧化劑的培養基、上述培養基中添加有抗氧化劑的培養基或含抗氧化劑的培養基。

不含抗氧化劑的培養基並不限定於此，可使用DMEM培養基，根據需要在上述培養基中進一步添加抗氧化劑來進行培養。並且，根據需要，可通過使用含抗氧化劑的α-MEM培養基來進行培養。

本發明的抗氧化劑可以不受限制地包含可用於細胞培養的抗氧化劑，其可以為選自由穀胱甘肽（Glutathione）、半胱氨酸（Cysteine）、半胱胺（Cysteamine）、泛醇（Ubiquinol）、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）及抗壞血酸（Ascorbic acid；AA）組成的組中的一種以上。在培養基中添加抗氧化劑的情況下，能夠以10μg/ml至50μg/ml的濃度，優選地，以10μg/ml至30μg/ml的濃度，更優選地，以25μg/ml的濃度添加上述抗氧化劑。

在本發明的一例中，作為不含抗氧化劑的培養基使用DMEM，更優選地，使用LG-DMEM培養基，作為含抗壞血酸作為抗氧化劑的培養基使用α-MEM培養基。

另一方面，根據本發明的方法，可以非常有效地增殖單克隆幹細胞，因此可省略通過使用主細胞庫來製備工作細胞庫的工序。與現有的層分離培養法相比，該方法簡化了在製備主細胞庫後需要伴隨製備工作細胞庫的工序。

在使用含抗氧化劑的培養基作為本發明的培養基的情況下，在上述培養基中還可添加慶大黴素作為抗生素。

優選地，通過本發明的方法獲得的間充質幹細胞最終可以是小於P2至P10的間充質幹細胞，更優選地，可以是P2至P8的間充質幹細胞，進一步優選地，可以是P2至P6的間充質幹細胞。這表明，與以最終產物獲得至少培養至P10至P12的間充質幹細胞的現有的工序相比，是在更低的傳代時獲得的幹細胞，並且，可通過調節細胞接種密度來以在低傳代時輕鬆獲得大量快速增殖的間充質幹細胞。

在本發明中，與通過現有的層分離培養法獲得的單克隆幹細胞（以下標記為‘cMSC2’）相比，通過如上改良的層分離培養法，優選地，在2000細胞/cm² 以下，更優選地，在1000細胞/cm² 以下的低密度及抗氧化條件下改良的層分離培養法獲得的單克隆幹細胞（以下，標記為‘cMSC1’）的細胞大小更小並可以均勻地形成，在輕度及重症急性胰腺炎的存活率高，減輕由水腫引起的胰腺的增重，並可以有效地減少由於急性胰腺炎引起的消化酶的增加和與炎症有關的酶的增加。

在本發明中，“胰腺炎”是指由胰腺酶引起的胰腺分泌腺的破壞以及整個胰腺發炎，均包括慢性胰腺炎及急性胰腺炎，但可以是急性胰腺炎，可以不受限制地包括輕度及重症急性胰腺炎。

可通過本發明的改良的層分離培養方法獲得的單克隆幹細胞不僅有效地預防、治療或改善胰腺炎，還可有效地預防、治療或改善胰腺炎引起的疾病，例如，選自由肺損傷、敗血症、腎衰竭、胸腔積液、多器官衰竭及多器官損傷組成的組中的一種以上疾病。

通過本發明的方法獲得的單克隆幹細胞的特徵在於，可增進胰腺細胞的存活率，並具有選自由α-澱粉酶或脂肪酶活性降低、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase；MPO）活性降低、中性粒細胞浸潤及炎症改善、炎性細胞因數分泌降低以及抗炎性細胞因數分泌增加組成的組中等一種以上活性。

並且，通過本發明的方法獲得的單克隆幹細胞可改善選自由水腫、壞死、出血及炎性浸潤組成的組中的一種以上的胰腺炎病理狀態。

並且，通過本發明的方法獲得的單克隆幹細胞可以是選自由轉化生長因數-β1（TGF-β1）分泌能力、可溶性腫瘤壞死因數-受體1（Soluble tumor necrosis factor receptor 1，sTNF-R1）分泌能力、吲哚胺2,3-二氧化酶表達能力、誘導性T細胞共刺激分子配體表達能力組成的組中的一種以上能力得以增強的單克隆幹細胞。

因此，與通過現有的層分離培養法獲得的cMSC2相比，通過本發明的改良的層分離方法獲得作為單克隆幹細胞的cMSC1的胰腺細胞的存活率增進、α-澱粉酶或脂肪酶活性的降低、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase；MPO）活性降低、中性粒細胞浸潤及炎症改善、炎性細胞因數分泌降低、抗炎性細胞因數分泌增加活性均顯著優秀，改善由水腫、壞死、出血及炎性浸潤組成的組中的一種以上的胰腺炎病理狀態的效果優秀。這種胰腺炎治療效果的差異是通過改良的層分離培養法獲得的本發明的單克隆幹細胞僅有的顯著效果，與通過現有的方法獲得的cMSC2相比，可起因於選自由轉化生長因數-β1分泌能力、可溶性腫瘤壞死因數-受體1分泌能力、吲哚胺2,3-二氧化酶表達能力、誘導性T細胞共刺激分子配體表達能力組成的組中的一種以上的能力得以增強。

本發明的藥學組合物可通過進一步包含除上述有效成分之外的一種以上藥學上可接受的載體來製備，以用於給藥。包含在本發明的藥學組合物中的藥學上可接受的載體是製劑時通常所使用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但並不限定於此。除了上述成分以外，本發明的藥學組合物還可包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、調味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。

本發明的藥學組合物的劑量可根據上述藥學組合物的製劑化方法、給藥方式、給藥時間和/或給藥途徑等而有所不同，並且可根據通過上述藥學組合物的給藥來所要實現的反應的類型和程度、成為給藥對象的個體的種類、年齡、體重、常規健康狀態、疾病的症狀程度、性別、飲食、排泄、包括與該個體同時使用或與之結合使用的藥物成分或其他成分在內的醫學領域眾所周知的幾種因素和類似因素而有所不同，本技術領域的普通技術人員可以容易地確定並開出對於所需治療有效的劑量。

例如，本發明的藥學組合物的劑量可以為每天1mg/kg至1000mg/kg，但是，上述劑量在任何方面均不限制本發明的範圍。

本發明的藥學組合物的給藥途徑及給藥方式可以彼此獨立，對其方式並沒有特別的限制，並且任何給藥途徑和給藥方式均可以，只要上述藥學組合物以達到所需的目的部位即可。

可通過口服給藥或非口服給藥方式給藥上述藥學組合物。例如，上述非口服給藥方式可利用靜脈內給藥、腹腔內給藥、肌肉內給藥、經皮給藥或皮下給藥等，並且還可利用將上述藥學組合物塗敷、噴霧或吸附在疾病部位的方法，但並不限定於此。

並且，本發明提供一種預防或治療胰腺炎的方法，包括：步驟1），在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2），僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3），培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4），將步驟3）的上述上清液作為步驟2）的第一容器的上清液，通過重複步驟2）和步驟3）一次以上來獲得單克隆幹細胞；步驟5），以50細胞/cm² 至1000細胞/cm² 的細胞密度將步驟4）的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養；以及步驟6），向個體給藥上述單克隆幹細胞。

在本發明中，上述“個體”包括需要預防或治療胰腺炎的個體，可以是哺乳類或除人類以外的哺乳類。

並且，本發明提供一種用於預防、改善或治療胰腺炎的組合物的製備方法，包括：步驟1），在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2），僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3），培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4），將步驟3）的上述上清液作為步驟2）的第一容器的上清液，通過重複步驟2）和步驟3）一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5），以50細胞/cm² 至1000細胞/cm² 的細胞密度將步驟4）的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。

根據本發明，與通過現有的層分離培養法獲得的單克隆幹細胞相比，無需製備工作細胞庫即可快速、輕鬆地獲得優異的具有預防、改善或治療胰腺炎效果的單克隆幹細胞，上述組合物可包括但不限於藥學、食品、准藥物及化妝品組合物。

在本發明的製備方法中，其特徵在於，在上述步驟5）的培養中，以1000細胞/cm² 的細胞密度接種於培養基中進行培養。

並且，在本發明的製備方法中，其特徵在於，上述步驟5）的培養基為添加抗氧化劑的培養基。

在本發明的治療方法及製備方法中，可以以相同的方法應用於在上述的組合物中描述的內容，為避免描述的複雜性，省略重複的內容。

以下，通過實施例詳細說明本發明。

下述實施例僅用於示例本發明，本發明的內容並不限定於下述實施例。

實施例1、建立改良的層分離培養法

為了製備對胰腺炎具有更優秀的效果的單克隆間充質幹細胞，利用了改良的間充質幹細胞層分離培養法及增殖方法。改良的間充質幹細胞層分離培養法及增殖方法的特徵在於，改變記載於韓國國內專利申請10-2006-0075676號中的層分離培養法的培養條件中的細胞密度及培養基。在以下實驗中，將通過層分離培養法獲得的單克隆間充質幹細胞（cMSC）的細胞培養密度分別改為50細胞/cm² （低密度）、1000細胞/cm² （中密度）、4000細胞/cm² （高密度），並分析相應的細胞特性。

1.1、確認根據細胞密度的間充質幹細胞的形態變化

首先，進行了用於確認長期培養中根據細胞密度的間充質幹細胞的形態變化。為了改變培養條件，使用了第五代（P5）、第十代（P10）、第十五代（P15）的間充質幹細胞，分別在低密度、中密度、高密度的條件下接種於LG-DMEM培養基中。隨後，通過顯微鏡觀察細胞的形態變化來判斷幹細胞是否老化，其結果示出在圖2中。

如圖2所示，在第五代（P5）及第十代（P10）中，根據細胞密度細胞大小和形態模式具有差異，尤其，在P15的情況下，在高密度培養條件下觀察到偏平且變大的形態的間充質幹細胞。這種形態代表典型的間充質幹細胞老化，可確認在長期培養中細胞的密度調節可調節間充質幹細胞的老化。

1.2、確認根據細胞密度的間充質幹細胞大小及粒度

為了進一步確認根據細胞密度的幹細胞的變化，通過流式細胞儀對已知在老化的細胞中會增加的細胞大小及細胞的粒度（granularity）進行定量分析，其結果示出在圖3中。

如圖3所示，確認在P5中細胞的大小沒有顯著差異，但在P10及P15的情況下，根據細胞密度具有顯著差異。尤其，可以確認到，在P10及P15中，在高細胞密度的培養條件下細胞的大小顯著增加以進一步促進細胞老化。同樣，細胞的粒度也顯示隨著所有傳代中細胞密度的增加而顯著增加的結果。因此，在間充質幹細胞的長期培養中，可以確認到，細胞密度的調節可成為調節細胞老化的因素，確認到可通過降低細胞培養密度來改善以後傳代中所出現的形態變化。

1.3、確認根據培養細胞密度的間充質幹細胞的老化

為了確認在實施例1.1及實施例1.2中確認的形態變化是否實際上是間充質幹細胞的老化依賴性（age-dependent）現象，進行了使用可對老化細胞選擇性地染色的β半乳糖苷酶的染色分析法，並通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）比較作為老化相關基因的p15、p16及作為增殖標記物的增殖細胞核抗原基因的表達。其結果分別示出在圖4及圖5中。

如圖4所示，在第五代（P5）及第十代（P10）中，不能在所有細胞密度下都確認到老化的細胞的染色，但在第十五代（P15）中，確認到老化的細胞的染色隨著細胞密度增加而顯著增加。並且，如圖5所示，在第十五代（P15）中，作為與老化相關的基因的細胞週期依賴性蛋白激酶（CDK）抑制劑p15及p16的基因表達隨著細胞培養密度的增加而增加，而作為增殖標記物的增殖細胞核抗原減少。

這結果表明，間充質幹細胞的形態變化與間充質幹細胞的老化有關，傳代培養時細胞培養密度的調節可以調節間充質幹細胞的老化。

1.4、確認根據培養細胞密度的間充質幹細胞的增殖能力的變化

已知間充質幹細胞的增殖能力隨著傳代和細胞的老化而逐漸降低。因此，增殖能力可作為確認間充質幹細胞的老化的標準，並比較了長期細胞培養時根據細胞培養密度的間充質幹細胞的增殖能力。通過根據初始接種細胞數量和培養結束後獲得的細胞的數量來計算根據每個傳代的增殖率，由此確認每個細胞的增殖能力，其結果如表1及圖6所示。

表1

增加倍數（Fold Increase）
（細胞/cm² （cell/cm² ））	P5	P10	P15
50	88.4±6.5	34.3±5.0	16.4±1.3
1000	8.5±0.3	4.9±0.5	3.1±0.4
4000	3.0±0.1	1.9±0.1	1.1±0.1

如表1所示，確認到，在低密度下培養的間充質幹細胞（MSC）的情況下，在第五代（P5）、第十代（P10）、第十五代（P15）中增加倍數（fold increase）為88.4、34.3、16.4，相反，在中密度下培養的間充質幹細胞的增加倍數為8.5、4.9、3.1，在高密度下培養的間充質幹細胞的增加倍數為3.0、1.9、1.1。並且，如圖6所示，確認到，群體倍增時間及群體倍增水準也與增加的倍數處於相同模式。這些結果表明，可通過在長期間充質幹細胞培養中降低細胞密度來保持間充質幹細胞的增殖能力，即使進行相同的傳代培養，也可以抑制間充質幹細胞的老化並延長其壽命。

1.5、確認根據培養細胞密度的間充質幹細胞（MSC）的分化能力的變化

為了確認細胞培養密度是否影響幹細胞能力，比較了根據P5至P15培養的分化能力。作為幹細胞能力確認了脂肪細胞分化能力及骨細胞分化能力，在各個傳代及密度下進行了正常、定量分析。具體地，脂肪細胞分化培養液使用在高糖DMEM培養液中添加新生牛血清（Newborn Calf Serum，NCS）（Gibco）、10-7mol的地塞米松（dexamethasone）（Sigma）、0.5mM的IBMX（Sigma）、10μg/ml的胰島素（insulin）（Sigma）、100μM的吲哚美辛（indomethacin）（Sigma）來製備的培養基並進行了實驗，在分化7天後，通過油紅O組織染色進行確認。並且，在油紅O組織染色後，利用異丙醇洗脫，並在500nm下測量後，通過定量分析確認。

骨細胞分選培養液使用了在α-MEM培養液中添加胎牛血清（FBS）（Gibco）、50μg/ml的抗壞血酸2磷酸酯（ascorbic acid 2 phosphate）（sigma），10-8mol的地塞米松（Sigma）、10mM的β-甘油磷酸酯（β-glycerophosphate）（sigma）的培養基，在分化21天後，通過茜素紅S組織化學染色確認。並且，在茜素紅S組織化學染色後，利用10％的乙酸洗脫，在405nm下測定並通過定量分析來確認。通過如上所述的方法確認脂肪分化能力及骨細胞分化能力的結果如圖7所示。

如圖7所示，脂肪細胞分化能力總體上隨著傳代而降低，但密度差不明顯，相反，在骨細胞分化能力的情況下，確認到在高密度條件下的第十五代（P15）培養組中顯著減少。通過這些結果確認到，當以低細胞密度培養時，可以更好地保持間充質幹細胞的骨細胞分化能力。

1.6、根據培養細胞密度的間充質幹細胞的抗原圖譜分析

進行了用於確認細胞培養密度是否還影響幹細胞的抗原表達的實驗，利用流式細胞儀確認根據每個傳代及培養密度的陽性及陰性抗原表達的變化，其結果如表2所示。

表2

傳代	P5	P10	P15
密度（Density）	LD	MD	HD	LD	MD	HD	LD	MD	HD
陽性標記物 (Positive marker)	CD29	100	99.9	99.7	90	99.6	99.5	87.3	97.8	48.5
CD44	99.9	99.9	100	99.4	99.7	99.6	93.8	80.6	31.4
CD73	100	100	99.8	98.7	99.6	99.6	60.3	20.9	3.8
CD90	99.9	100	100	99.5	99.9	99.8	94.9	98.5	65
CD105	100	100	99.8	99.3	99.7	99.8	15.7	3.65	4.4
陰性標記物 (Negative marker)	CD31	2.73	3.76	4.04	1.63	3.8	3.93	1.57	2.69	3.19
CD104	2.19	3.55	4.08	1.52	4.57	4.22	2.63	3.82	2.12
HLA-DR	2.82	3.04	3.62	2.42	4.47	3.97	2.1	3.44	2.76
CD14	3.19	3.95	4.04	3.26	5.81	4.24	2.38	3.07	2.93

如表2所示，陰性標記物表達的變化尚未明確，但是，在部分陽性標記物的情況下，確認到表達量也根據相同傳代的細胞培養密度而發生變化。

尤其，在第十五代（P15）中，在高密度下培養細胞的情況下，不僅大多數陽性標記物的表達量顯著減少，而且CD73、CD105顯示陰性表達，確認到可通過保持低細胞密度來進行細胞培養將成為非常重要的因素。

1.7、比較根據培養細胞密度的活性氧種（ROS）的產生及去氧核糖核酸損傷

已知間充質幹細胞的功能下降與去氧核糖核酸損傷有關，尤其，已知由活性氧種引起的去氧核糖核酸損傷促進間充質幹細胞（MSC）的老化。因此，為了確認總活性氧種的產生及由此產生的去氧核糖核酸損傷是否根據培養密度而不同，通過螢光強度分析比較了根據傳代及細胞培養密度的總細胞活性氧種量，並通過彗星（comet）分析確認去氧核糖核酸損傷程度，其結果如圖8所示。

如圖8所示，確認到在所有傳代中總活性氧種的產生趨於隨著細胞培養密度的增加而增加，尤其，確認到在第十代（P10）和第十五代（P15）中活性氧種的產生顯著增加（A）。在彗星分析中，從去氧核糖核酸損傷最少的CC1分為損傷最多的CC5並分析數據，在損傷最嚴重的CC5的情況下，確認到隨著細胞培養密度的增加而顯著增加。相反，CC1趨於隨著細胞密度的增加而顯著降低（B）。

進而，為了確認去氧核糖核酸損傷是否由活性氧種引起，進行了用於確認由活性氧種引起的去氧核糖核酸損傷的確認8-羥基-去氧鳥苷（8-OHdG）的濃度的實驗。8-羥基-去氧鳥苷分析方法如下：將從各個細胞中獲得的50μl的去氧核糖核酸試樣加入8-羥基-去氧鳥苷偶聯板（8-OHdG conjugate coated plate）後，在常溫下培養10分鐘。隨後，再加入抗-8-羥基-去氧鳥苷抗體（anti-8-OHdG antibody）並在常溫下培養1小時，清洗3次後，將二抗酶偶聯物（secondary antibody enzyme conjugate）分別加入各個孔（well）後，在常溫下再培養1小時。然後，再清洗3次後，加入底物溶液（substrate solution）並在常溫下培養30分鐘。最後，添加終止溶液（Stop solution）後，在450nm下測定吸光度並進行確認，將其結果示出在圖9中。

如圖9所示，在去氧核糖核酸損傷最嚴重的第十五代（P15）組中，確認到8-羥基-去氧鳥苷的濃度隨著細胞培養密度增加而顯著增加。這些結果表明，去氧核糖核酸損傷因在高密度培養條件下產生的活性氧種而增加，由此促進間充質幹細胞的老化。

這些結果表明，將細胞培養密度調低可能在保護間充質幹細胞免受由間充質幹細胞的活性氧種的產生增加引起的去氧核糖核酸損傷。

1.8、確認根據抗氧化劑處理的間充質幹細胞（MSC）增殖及活性氧種（活性氧種）的產生能力

為了確認間充質幹細胞的增殖是否受到在高密度培養條件下產生活性氧種的影響，進行了活性氧種清除實驗。在第十一代（P11）至第十五代（P15）中，通過在高密度培養條件及高密度培養條件中添加作為抗氧化劑的25μg/ml的抗壞血酸來培養後，比較兩組之間的增殖率的增加倍數（Fold），其結果如圖10所示。

如圖10所示，在P11至P15中高密度培養條件下的增加倍數分別為2.6、1.9、1.6，隨著傳代數量的增加增殖率減少且開始出現老化，但是，在處理抗氧化劑的情況下，確認到在所有傳代中增殖能力保持在50％左右。並且，在抗氧化劑處理組中，在P11至P15中生長增加倍數（growth fold increase）分別為3.8、2.9、2.5，甚至直到P15為止增殖能力仍保持很高。

確認在作為終點（Endpoint）的P15中在單獨的高密度培養條件及高密度培養條件+抗氧化劑處理下的兩組之間的活性氧種水準，並將其結果示出在圖11中。

如圖11所示，在通過處理作為抗氧化劑的抗壞血酸來增加增殖的條件中，確認到活性氧種水準仍下降。因此，優選地，間充質幹細胞培養在低細胞密度下進行，在用抗氧化劑清除在高密度細胞培養下誘導的活性氧種的產生的情況下，確認到可增加間充質幹細胞的增殖能力，即，高密度條件會抑制由活性氧種引起的間充質幹細胞的增殖能力，活性氧種隨著細胞密度的減少而減少，因此可促進間充質幹細胞增殖能力。

總結這些結果，為了保持通過層分離培養獲得的單克隆間充質幹細胞的增殖、培養及幹細胞能力，重要的是將培養條件中的細胞密度調至1000細胞/cm² 以下，在通過添加抗氧化劑來進行培養的情況下，確認到可通過抑制細胞培養中可誘導的氧化應激來有效地促進間充質幹細胞增殖。並且，比較相同的低細胞密度條件培養，與小於第十代如第五代的幹細胞相比，第十代以上如P15的幹細胞的細胞的形態變化顯著並確認到諸如促進幹細胞的老化、降低分化能力之類的結果，因此，確認到以1000細胞/cm² 以下的密度以少於第十代的低傳代數進行培養是最有效的。

實施例2、驗證改良的層分離培養法

通過上述實施例1，確認了在通過層分離培養法獲得的間充質幹細胞培養中細胞密度的調節、傳代調節及抗氧化劑的添加可成為重要的因素，因此，針對於通過韓國國內專利申請10-2006-0075676號中記載的層分離培養法的現有工序獲得的單克隆間充質幹細胞，通過改變細胞培養密度，並改變添加抗壞血酸作為抗氧化劑的培養基，比較了通過進行傳代培養來獲得的單克隆間充質幹細胞的增殖能力及根據其的細胞獲得效果。

在現有韓國國內專利申請10-2006-0075676號的實施例1中，公開了通過如圖1所示的層分離培養方法從骨髓中分離間充質幹細胞並進行培養的方法，並公開了將通過層分離步驟獲得的作為單一性細胞群體的菌落以每孔100至600的細胞數量轉移至培養容器的事實。

並且，在韓國國內專利申請10-2013-0106432及美國專利申請2012-0171168號中，公開了利用層分離培養法分離來源於骨髓的間充質幹細胞並進行培養的方法，並且公開了以50細胞/cm² 至100細胞/cm² 塗抹菌落的事實。

然而，在韓國國內專利申請10-2006-0075676號、10-2013-0106432號及美國專利申請US2012-0171168號中，僅公開了對通過層分離培養法獲得的單一性細胞群體菌落進行計數並轉移至6孔板中進行培養的構成，即，僅公開了對應於第一代的菌落培養條件，而完全沒有公開與第二代後的單個非菌落的重複培養密度調節有關的構成及根據其的效果。根據記載於上述申請的現有層分離培養法，為了獲得足夠數量的具有預防、治療、改善胰腺炎效果的單克隆幹細胞，應培養至至少第十代。相反，在本發明的改良的層分離培養方法中，可通過第二代後的低細胞密度條件、最多第八代以下的低傳代培養數量來有效地獲得大量所需的單克隆幹細胞。

具體地，在本改良方法中，在培養通過層分離培養方法獲得的第一代（P1）的菌落後，在第二代（P2）後的傳代培養中，以作為低密度的1000細胞/cm2以下的密度接種細胞，將其與4000細胞/cm² 細胞培養的效果進行比較。並且，將細胞培養基改為含抗氧化劑的α-MEM培養基和不含抗氧化劑的LG-DMEM培養基，比較根據其的細胞增殖效果。

在下述表3中示出用於確認改良的層分離培養法的效果的實驗組，並在圖12a及圖12b中示意性地示出相對於現有層分離培養法改良的層分離培養方法的工序改良部分。

如圖12a所示，直到獲得第一代的工序為止，現有的層分離培養法和改良的層分離培養法中以相同的方式進行此工序，但是，在改良的層分離培養法中，在使用擴增的第一代細胞作為種子細胞老培養的步驟之後的傳代培養工序與現有的層分離培養法不同。現有的層分離培養法以對密度條件不了解的情況下獲得大量細胞為目的，進行4000細胞/cm² 以上的高密度傳代培養，但是，改良的層分離培養法將傳代培養的密度調至作為低密度的1000細胞/cm² 以下，從而僅培養至第二代之後最高第八代以下的培養也可以獲得最終產物。在圖12b中詳細示出第二代之後的培養工序。

表3

組	培養密度	培養基條件	傳代	傳代培養（Subculturing）時間（天（day））	替換培養基
4000LG	4000細胞/cm²	LG-DMEM	P2-P5	3～4	X
4000alpha	4000細胞/cm²	Alpha-MEM	3～4	X
1000LG	1000細胞/cm²	LG-DMEM	7	O（每3～4天）
1000alpha	1000細胞/cm²	Alpha-MEM	7	O（每3～4天）

上述表3的細胞株為通過層分離培養方法分離的細胞，分別命名為SCM01至SCM08。

2.1、確認根據細胞株密度及培養基的增殖效果

利用上述SCM01至SCM08細胞株進行培養，通過細胞數量、群體倍增時間、群體倍增水準分別比較至少於第十代的第五代的傳代培養，並示出在圖13至圖20中。

在圖13至圖20中確認，與通過以每平方釐米4000個細胞密度接種的方式培養的實驗組相比，通過以每平方釐米1000個細胞密度接種的方式培養的所有實驗組的細胞增殖效果更好。並且，即使在相同的1000個細胞密度組中，確認到在含作為抗氧化劑的抗壞血酸的α-MEM培養基中培養的1000alpha實驗組的細胞增殖效果更顯著。

2.2、比較根據細胞株密度的增殖效果

為了進一步準確地比較根據培養細胞數量的增殖率，將培養基分別固定為LG DMEM或α-MEM培養基，並比較根據以每平方釐米1000個或4000個細胞接種密度的傳代培養的細胞增殖效果，將其結果示出在圖21至圖24中。

如圖21所示，確認到與以每平方釐米4000個細胞數量接種組相比，當以每平方釐米1000個細胞數量接種的方式培養時，在LG DMEM中培養的SCM01至SCM08細胞株的第二代（P2）至第五代（P5）中的增殖率顯著高，與在第五代（P5）中確認的每平方釐米4000個細胞接種相比，1000個細胞接種組的增殖率為最少3.08倍至最大48.50倍。

並且，如圖22所示，每平方釐米1000個細胞接種組的群體倍增時間值也低於所有細胞株中每平方釐米4000個細胞株接種或具有與其類似的水準，在所有細胞株中，群體倍增水準值高於每平方釐米4000個細胞接種值。

並且，如圖23所示，當以1000個細胞數接種在α-MEM中培養的SCM01至SCM08細胞株時，傾向於與DMEM實驗組相同，確認到與在第五代（P5）中確認的每平方釐米4000個細胞株接種相比，每平方釐米1000個細胞接種組的增殖率為最少6.32倍至最大85.63倍。並且，如圖24所示，每平方釐米1000個細胞接種組的群體倍增時間值也低於所有細胞株中每平方釐米4000個細胞接種量，或具有與其類似的水準，在所有細胞株中，群體倍增水準值高於每平方釐米4000個細胞接種值。

這些結果表明，與每平方釐米4000個高密度細胞接種培養相比，可通過每平方釐米1000個以下的細胞接種來誘導單克隆間充質幹細胞的快速增殖。

2.3、根據培養基的增殖效果比較

在先通過實施例2.2確認，與4000細胞/cm₂ 培養相比，1000細胞/cm₂ 培養可具有優異的增殖效果，因此，將細胞數量固定在1000個，以培養基為變數通過改變培養基來比較細胞增殖效果，從而進一步驗證基於培養基條件的增殖效果，並將其結果示出在圖25及圖26中。

如圖25所示，用α-MEM及DMEM比較不同培養基的細胞增殖率，其結果確認，與LG-DMEM相比，在利用α-MEM培養基的實驗組中細胞增殖率至少高1.77倍至6.39倍。並且，如圖26所示，在所有α-MEM實驗組中群體倍增時間均較低，而群體倍增水準增加。

這些實驗的結果表明，除了將細胞接種密度調節至每平方釐米1000個以下的細胞來培養至小於第十代的傳代如第二代（P2）至第五代（P5）之外，在利用含有抗氧化劑的培養基時可以最大程度地提高細胞增殖效率。

實施例3、建立改良工序

通過上述實施例，確認細胞密度的調節及抗氧化劑的添加可成為間充質幹細胞培養中的重要因素，因此，除了在韓國國內專利申請10-2006-0075676號及10-2013-7020033中記載的層分離培養法的現有工序之外，傳代培養時細胞培養密度及培養基條件來在小於第十代的低傳代下可有效獲得單菌落的間充質幹細胞的改良的工序，在下述表4（利用DMEM培養基的培養條件）及表5（利用α-MEM培養基的培養條件）中一併示出。

表4

工序	物品（Items）	新鮮產品（Fresh Product）	冷凍產品（Frozen Product）


骨髓～主細胞庫	培養基	DMEM	DMEM
*種子細胞（除P1）	抗生素（濃度）	青黴素-	青黴素-
	鏈黴素	鏈黴素
	青黴素	青黴素
	（100units/mL）	（100units/mL）
	鏈黴素（100μg/mL）	鏈黴素（100μg/mL）
	細胞培養密度	50～1000 細胞/cm²	50～1000 細胞/cm²
	傳代培養時間	3～14天	3～14天
	傳代	P1～P8	P1～P8
主細胞庫～工作細胞庫	培養基	DMEM	DMEM
	抗生素（濃度）	青黴素-	青黴素-
	鏈黴素	鏈黴素
	青黴素	青黴素
	（100units/mL）	（100units/mL）
	鏈黴素（100μg/mL）	鏈黴素（100μg/mL）
	細胞培養密度	50～1000 細胞/cm²	50～1000 細胞/cm²
	傳代培養時間	3～14天	3～14天
	傳代	P3～P5	P3～P5
最終產物	培養基	DMEM	DMEM
	抗生素（濃度）	青黴素-	青黴素-
	鏈黴素	鏈黴素
	青黴素	青黴素
	（100units/mL）	（100units/mL）
	鏈黴素（100μg/mL）	鏈黴素（100μg/mL）
	細胞培養密度	50～1000 細胞/cm²	50～1000 細胞/cm²
	傳代培養時間	3～14天	3～14天
	傳代	P6～P8	P6～P8

表5

工序	物品	新鮮產品	冷凍產品


骨髓～主細胞庫	培養基	α-MEM	α-MEM
*種子細胞（除P1）	抗生素（濃度）	慶大黴素（20μg/mL）	慶大黴素（20μg/mL）




	細胞培養密度	50～1000 細胞/cm²	50～1000細胞/cm²
	傳代培養時間	3～14天	3～14天
	傳代	P1～P8	P1～P8
主細胞庫～工作細胞庫	培養基	α-MEM	α-MEM
	抗生素（濃度）	慶大黴素（20μg/mL）	慶大黴素（20μg/mL）




	細胞培養密度	50～1000 細胞/cm²	50～1000細胞/cm²
	傳代培養時間	3～14天	3～14天
	傳代	P3～P5	P3～P5
最終產物	培養基	α-MEM	α-MEM
	抗生素（濃度）	慶大黴素（20μg/mL）	慶大黴素（20μg/mL）




	細胞培養密度	50～1000 細胞/cm²	50～1000細胞/cm²
	傳代培養時間	3～14天	3～14天
	傳代	P6～P8	P6～P8

更具體地，來源於本發明的骨髓的間充質幹細胞的層分離培養工序及增殖培養可以如下進行。

在用局部麻醉劑麻醉骨髓供體的臀部後，通過將針插入臀骨中收集骨髓。100mm的培養容器中加入含20％的胎牛血清、1％的青黴素/鏈黴素的14ml的DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium，GIBCO-BRL，Life-technologies，MD，USA）、1ml的人骨髓，於37℃、5％的CO₂ 細胞培養器中培養2小時。培養後，將培養容器稍微向一側傾斜，在以使底部的細胞不脫落的條件下，盡可能僅將培養容器的上部培養基轉移到新的容器中。

將再次重複相同的過程後獲得的培養液轉移至底部塗敷有膠原質（collagen）的培養容器（Becton Dickinson）後，在37℃的溫度下培養2小時。將培養液轉移到塗敷有新的膠原質的容器，並在24小時後將其再次轉移到新容器，然後在24小時後將其再次轉移到新容器。最後，在48小時後，將其轉移到新容器中並通過肉眼觀察剩餘的細胞貼附生長在培養容器底部。可猜到可通過之前幾個層分離步驟達到此階段的細胞為細胞比重顯著小於其他細胞的細胞。

約10天至14天後，細胞形成單菌落（single colony），對此單菌落細胞組處理胰蛋白酶後轉移到6孔培養容器。並在37℃、5％的CO₂ 細胞培養器中培養4天至5天後，當生長至約80％時，通過用0.05％的胰蛋白酶/1mM的EDTA（GIBCO-BRL）處理獲得細胞後，轉移到T175培養容器中並以低細胞密度進行傳代培養。

像這樣，當以小於第十代，優選地，在第八代以下的第二代（P2）至第五代（P5）中將細胞密度降低到1000細胞/cm² 的水準來進行培養的情況下，確認到儘管將其他工序調至一樣，也很好地保持了間充質幹細胞的增殖能力及幹細胞特性，從而在相同的傳代中也有效地誘導了增殖。尤其，在通過降低細胞密度來進行培養的情況下，可省略現有過程中所需的由間充質幹細胞製備工作細胞庫的過程，因此可有效地縮短細胞製備時間。尤其，若降低傳代，則可獲得大量的老化程度相對較低的細胞，在將這些細胞用作治療劑的情況下，可以預期優異的治療效果。

並且，在將含抗氧化劑的α-MEM用作培養基的情況下，通過抗氧化劑處理可以有效地改善高密度細胞培養物中誘導的活性氧種應激，並且可以恢復間充質幹細胞的細胞增殖能力，與現有的工序相比，其特徵在於，可顯著縮短細胞的傳代，並且能夠快速且穩定地獲得保持間充質幹細胞的特性且沒有老化的單克隆間充質幹細胞。

綜上所述，低密度細胞培養可以在短時間內獲得大量細胞，因此，不僅簡化製備工序，而且在長期培養（long-term culture）中，也可以獲得保持完整的間充質幹細胞特性的未老化細胞，從而能夠生產高質量的幹細胞。

由此，在以下治療胰腺炎的實驗中，使用了通過上述實施例構建的改良的方法獲得的幹細胞。

實施例4、確認通過改良的層分離培養法獲得的幹細胞的胰腺炎治療效果

4.1、準備cMSC1、cMSC2

根據實施例3的改良的層分離培養法，傳代培養時細胞培養密度為1000細胞/cm² 以下，通過利用含抗氧化劑的α-MEM培養基傳代3次來獲得單克隆間充質幹細胞。添加慶大黴素作為抗生素，並用α-MEM培養液進行培養（參照表5）。以下，在1000細胞/cm² 以下的低密度及抗氧化條件下通過改良的層分離培養法獲得的幹細胞命名為“cMSC1”。並且，為了與通過改良的層分離培養法獲得的幹細胞比較效果，通過傳代培養時以4000細胞/cm² 以上的密度及未添加抗氧化劑的條件下的培養方法培養且通過現有層分離培養法獲得並培養至第三代的幹細胞命名為“cMSC2”。

4.2、確認根據cMSC1給藥的急性胰腺炎治療效果

4.2.1、急性胰腺炎動物模型構建及實驗方法

為了確認根據cMSC1給藥的急性胰腺炎治療效果，將急性胰腺炎動物模型示出在下表6中。使用於實驗的小鼠使用無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）大鼠（購自（株）KOATECH），以每組15只5周齡的雄性大鼠，共60只，用於以下實驗。

表6

組	實驗組
1	正常對照組（Control）
2	空白（Vehicle）（SAP）
3	cMSC1（誘發急性胰腺炎＋cMSC1給藥組）
4	cMSC2（誘發急性胰腺炎＋cMSC2給藥組）

為了構建急性胰腺炎動物模型，在手術前用剪刀（clipper）對動物的腹部進行剃毛。使用舒泰50（Zoletil 50）（法國維克（VIRBAC，France））及甲苄噻嗪（xylazine）（德國拜耳公司Rompun^® （Rompun^® ，Bayer AG，Germany））進行麻醉，必要時再進行麻醉。使用聚維酮及70％的乙醇對要解剖的部分進行廣泛的消毒後，對腹部正中進行切開。暴露十二指腸後，以1ml/kg的劑量在胰管中給藥作為急性胰腺炎誘發物質的3％的牛磺膽酸鈉（sodium taurocholate），由此誘導急性胰腺炎。

在動物模型中，誘導胰腺炎4小時後，通過尾靜脈以2×106細胞一次給藥200ul的cMSC1及cMSC2，72小時後取出血液和器官進行分析。在圖27中示出根據本發明構建的急性胰腺炎動物模型的示意圖。

4.2.2、確認根據cMSC1及cMSC2處理的胰腺細胞存活率

在實施例4.2.1中製備的急性胰腺炎動物模型中注入的細胞存活率。通過尾靜脈以相同劑量與表7中所示的細胞穩定劑一起給藥cMSC1及cMSC2。

表7

試驗物質名稱	劑量（細胞/頭）	細胞存活率	給藥途徑	給藥用量（ml/頭）
cMSC1	2×10⁶	91％	尾靜脈給藥	200ul
cMSC2	2×10⁶	87.7％
試驗物質名稱	試劑名稱	組成	給藥途徑	給藥用量（ml/頭）
空白（Vehicle）	等離子溶液A（Plasma Solution A）	67.5％	尾靜脈給藥	200ul
人血清白蛋白（Human Serum Albumin）	22.5％
DMSO（臨床級（Clinical-grade））	10％

在上述表7中所確認，當注入作為試驗物質的cMSC1和cMSC2時，測定存活率分別為91％、87.7％，均具有85％以上的存活率，尤其，cMSC1給藥組具有90％以上的存活率，並確認其效果優於胰腺細胞。

4.2.3、根據cMSC1處理的血液生化效果

為了在誘導急性胰腺炎的實施例4.2.1的大鼠中確認根據cMSC處理的血液生化效果，確認胰腺炎標誌物水準。具體地，使用血液生化分析儀（日本日立7180（7180 Hitachi，Japan））測定作為試驗終點的cMSC1或cMSC2給藥72小時後α-澱粉酶（（-amylase）及脂肪酶（lipase）兩種酶，結果示出在圖28中。

如圖28所示，確認在cMSC1、cMSC2給藥後第72小時後的急性胰腺炎（SAP）模型中的α-澱粉酶及脂肪酶水準顯著高於對照組。與SAP模型相比，cMSC2給藥組在α-澱粉酶水準上沒有效果，但是抑制脂肪酶增加約13％。另一方面，與SAP對照組相比，通過改良的層分離培養法獲得的cMSC1給藥組中確認到澱粉酶水準減少51％，脂肪酶也顯著降低至64％。

即，若注入cMSC1，則作為胰腺炎標誌物的α-澱粉酶和脂肪酶均顯著降低約51％至64％，這些結果表明，cMSC1可顯著降低血清內α-澱粉酶和脂肪酶活性。

4.2.4、確認根據cMSC1處理的髓過氧化物酶（Myeloperoxidase；MPO）

髓過氧化物酶（Myeloperoxidase；MPO）是在嗜中性粒細胞（neutrophil granulocytes）中大量表達的酶，用作心肌梗塞（myocardial infarction）或急性骨髓性白血病（acute myeloid leukemia）的預測因數，它是炎症的標誌。為了確認胰腺組織內中性粒細胞的浸潤程度及炎症程度是否根據本發明的cMSC1處理而得到改善，使用髓過氧化物酶活性測定試劑盒（Myeloperoxidase activity assay kit）（STA-803，Cell biolabs）並根據製造商的方法測定髓過氧化物酶（150kDa）活性，其結果示出在圖29中。

如圖29所示，確認與對照組相比，在誘導急性胰腺炎的組中髓過氧化物酶活性增加約12倍，但是在通過改良的層分離培養法獲得的cMSC1處理組中顯著減少65％以上。這些結果表明，與現有工序的細胞株組cMSC2的8％減少效果相比，cMSC1在統計學上具有顯著的中性粒細胞減少效果。

4.2.5、根據cMSC1處理的炎性細胞因數及抗炎性細胞因數分析

為了確認在作為急性胰腺炎動物模型的實施例4.2.1的大鼠中根據cMSC處理是否誘導炎症性因數的變化，使用下表8的分析工具並根據製造商的方法測定作為炎性細胞因數的腫瘤壞死因數α、白細胞介素-6、Iγ-干擾素、白細胞介素-10的變化，其結果示出在圖30中。

表8

專案	Cat No.	製造商	用途
Rat 腫瘤壞死因數α ELISA Kit	SRTA00	R&D Systems	性狀分析
Rat 白細胞介素-6 ELISA Kit	SR6000B	R&D Systems
Rat γ-干擾素 ELISA Kit	SRIF00	R&D Systems
Rat 白細胞介素-10 ELISA Kit	SR1000	R&D Systems

如圖30所示，確認與對照組相比，在急性胰腺炎動物模型（SAP）中腫瘤壞死因數α、白細胞介素-6、γ-干擾素的水準顯著增加，但是，與對照組相比，在cMSC1及cMSC2處理組的表達水準顯著減少。尤其，與對照組相比，在cMSC1處理組中，腫瘤壞死因數α、白細胞介素-6、γ-干擾素相對於對照組分別降低49％、42％、61％，從而具有優異的炎性細胞因數抑制效果。並且，與對照組相比，在cMSC1及cMSC2處理組中作為抗炎性細胞因數的白細胞介素-10均增加，尤其，cMCS1的白細胞介素-10水準比對照組增加69％，從而確認cMSC處理可誘導抗炎性細胞因數表達的增加。

4.2.5、根據cMSC1處理的組織病理學分析

取出實施例4.2.1的急性胰腺炎動物模型的器官，並進行組織病理學分析以確認根據cMSC1處理的水腫病變的變化。具體地，在給藥試驗物質第72小時後收集血液並將動物安樂死，然後取出胰腺並用10％中性緩衝福馬林固定。使用固定的組織進行常規的組織處理過程，例如，修剪、脫水、石蠟包埋及切割，並製備用於檢查組織病理學的標本。進行蘇木和曙紅（Hematoxylin & Eosin，H&E）染色，利用光學顯微鏡（日本奧林巴斯BX53（Olympus BX53，Japan））觀察組織病理學變化。使用Schmidt評分（Schmidt’s score）（A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy，Schmidt J et al，1992）對組織病理學評估進行評分。其結果示出在圖31及圖32中。

如圖31所示，在顯微鏡下，與對照組相比，在SAP中確認到炎症，在cMSC1處理組中炎症程度得到最大改善。

如圖32所示，與對照組相比，急性胰腺炎動物模型中，組織病理學評分，水腫、壞死、出血、炎性浸潤評分均顯著增加，確認通過cMSC1和cMSC2處理可減輕這些快速增加。尤其，與對照組相比，cMSC1處理組的所有評估指標均降低了約27％至35％，與cMSC2處理組相比，具有約2倍的效果。

總之，在通過改良的層分離培養法獲得的cMSC1的情況下，在急性胰腺炎中增加胰腺細胞的存活率，並且均可以有效地改善血液生化、組織病理學病變，因此，可對急性胰腺炎的治療具有優秀的效果。並且，即使與通過現有的層分離培養法和高密度傳代培養獲得的cMSC2相比，也確認到這些cMSC1在治療急性胰腺炎方面的效果明顯優秀。

實施例5、比較通過改良的層分離培養法獲得的幹細胞特性

5.1、比較cMSC1及cMSC2細胞特性

在實施例4中確認，與通過現有的層分離培養法獲得的cMSC2相比，通過改良的層分離培養法獲得的幹細胞cMSC1具有顯著優秀的急性胰腺炎治療效果，因此進行了用於比較這些細胞的特性的實驗。

以與實施例4.1的方法相同的方法獲得cMSC1及cMSC2，並通過培養這些來確認細胞大小。

實驗中使用的細胞及方法示出在下述表9中。

表9

細胞名稱	使用的培養基	按面積培養的細胞數量	培養時間	特殊事項
cMSC1	α-MEM	1000 細胞/cm²	7天	培養基中添加抗氧化劑1000a
cMSC2	DMEM	4000 細胞/cm²	3～4天	4000LG

為了驗證cMSC1和cMSC2的細胞大小差異，使用Nucleo Counter NC-250設備確認細胞大小，其結果示出在圖33及表10中。

表10

細胞名稱（Cell Name）	cMSC1	cMSC2
估計的細胞直徑（Estimated Cell Diameter）（μm）	18.0	18.9
細胞直徑標準偏差（Cell Diameter Standard Deviation）（μm）	10.5	12.6

如表10及圖33所示，確認兩種細胞的大小不同，通過設備確認細胞直徑的標準偏差，結果顯示，通過改良的層分離培養法獲得的cMSC1的偏差小於cMSC2。

進一步地，當使用流式細胞儀（FACS）制定相同的前向散射/側向散射光（FSC/SSC）值時，在流式細胞分析中也確認細胞大小是否具有差異，其結果示出在圖34中。

如圖34所示，由於cMSC2的細胞大小較大，因此細胞分佈廣泛，相反，確認到cMSC1的細胞大小較小，因此分佈在側向散射光（SSC）50K中。

如上所述，cMSC1的細胞大小更小，在隨著均質形成培養間充質幹細胞的同時分泌的細胞因數量發生變化，因此cMSC1進一步增強了治療急性胰腺炎的效果。

5.2、確認cMSC1及cMSC2的體外（in vitro）效果

在培養對急性胰腺炎具有不同效果的cMSC1及cMSC2後，進行了體外實驗以比較每個細胞的活性。首先，在混合淋巴細胞反應（Mixed lymphocyte reaction；MLR）條件下確認了活化T細胞的抑制率。實驗方法如下。通過將兩種不同供體（donor）的外周血單核細胞相互混合，在通過抗原誘導T細胞活性後（同種異體混合淋巴細胞反應（allogeneic MLR）），分別添加cMSC1或cMSC2以確認其是否抑制T細胞活性。在分別以4：1的比例共培養用各個Dye（CFSE和eFluor670）染色的人外周血單核細胞和cMSC1或cMSC2後，培養8天，分析通過使用FACS verse（BD Biosciences）設備的流式細胞分析法測定，其結果示出在圖35中。

如圖35所示，混合淋巴細胞反應條件下確認活化的T細胞的抑制率，結果顯示兩種細胞在T細胞：cMSC=1：4的條件下具有50％以上的抑制率，但是在改良的工序的細胞株（cMSC1）中抑制率為79％，而現有工序的細胞株（MSC2）的抑制率為53％，具有約26％的差異。

在體外培養cMSC1及cMSC2，並比較在各細胞株的培養液中的轉化生長因數-β1、可溶性腫瘤壞死因數-受體1、及免疫相關標記物吲哚胺2,3-二氧化酶、誘導性T細胞共刺激分子配體的表達量，其結果示出在圖36及圖37中。

如圖36所示，確認在培養兩種細胞株的培養液中轉化生長因數-β1和可溶性腫瘤壞死因數-受體1的分泌量，結果確認，轉化生長因數-β1在兩種細胞株之間沒有顯著差異，但是，可溶性腫瘤壞死因數-受體1在作為改良的工序的細胞株的cMSC1中分泌高達28pg/ml。

並且，如圖37所示，以無任何刺激狀態的WI38（Human Fibroblast）為標準，比較吲哚胺2,3-二氧化酶、誘導性T細胞共刺激分子配體的表達量，結果確認，在作為改良的工序的細胞株的cMSC1中兩個基因的表達量高約2倍。

進一步地，在植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）刺激條件下共培養後，通過培養液確認炎性細胞因數（γ-干擾素、白細胞介素-17）及抗炎性（IL-10）細胞因數的變化。為了確認γ-干擾素、白細胞介素-17、白細胞介素-10的分泌量，以1×10⁶ 細胞/孔的濃度將外周血單核細胞塗敷在24孔板（well plate）並用1ug/ml的植物血凝素誘導炎症反應。具體地，通過改變上述植物血凝素處理與否及cMSC處理與否來測定每個實驗組中的γ-干擾素、白細胞介素-17、白細胞介素-10的濃度，其結果示出在圖38中。

如圖38所示，與改良的工序的細胞株cMSC1共培養，結果確認與植物血凝素刺激條件相比，γ-干擾素被抑制74.3％、白細胞介素-17被抑制82.2％，在通過現有的工序獲得的細胞株cMSC2中γ-干擾素被抑制55.4％、白細胞介素-17被抑制65.8％。即，確認兩種細胞株之間炎性細胞因數的抑制率相差約20％，在相同條件下確認抗炎細胞因數白細胞介素-10的分泌量，結果顯示在改良的工序的細胞株cMSC1中白細胞介素-10的分泌量增加約25％，相反在現有工序的細胞株cMSC2中白細胞介素-10的分泌量增加7％，確認cMSC1比cMSC2增加3倍以上的抗炎性細胞因數分泌。

綜上所述，可確認若使用通過改良的工序獲得的cMSC1，則可有效地降低由急性胰腺炎引起的消化酶的增加和與炎症有關的酶的增加。並且，可確認到降低炎性細胞因數的分泌，更顯著地增加抗炎性細胞因數的分泌，還可通過胰腺的組織學分析來確認顯著的結果。尤其，可以確認，根據本發明的cMSC1因保持了優異的增殖和幹細胞特性而有效地保持了增殖效果，而且與以前的工序獲得的細胞株cMSC2相比，cMSC1在免疫組織調節能力、免疫相關基因的表達、炎症及抗炎性細胞因數的分泌方面更優秀。因此，可知與通過以前的工序獲得的細胞相比，通過改良的工序獲得的細胞在預防、治療胰腺炎上更優秀。

圖1為示出從骨髓分離單克隆間充質幹細胞的現有層分離培養法的圖。圖2為示出通過顯微鏡觀察確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞的形態變化的結果的圖。圖3為示出通過流式細胞儀（Flow cytometry；FACS）分析並以前向散射（forward scatter；FSC）（A）及側向散射（side scatter；SSC）（B）光的平均值確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞的細胞大小及粒度（granularity）變化的結果的圖（*p>0.05，**p>0.01，***p>0.005）。圖4為示出在以不同的細胞培養密度及細胞傳代培養下培養單克隆間充質幹細胞中，通過β半乳糖苷酶（β-gal）活性染色確認細胞是否老化的結果的圖。圖5為示出在不同細胞培養密度下培養第十五代（Passage 15；P15）單克隆間充質幹細胞後，通過反轉錄聚合酶鏈式擴增反應（RT-PCR）確認作為老化相關基因的p15、p16及作為增殖標記物的增殖細胞核抗原（PCNA）的結果的圖。圖6為示出通過細胞群體倍增時間（Population Doubling Time；PDT）及細胞群體倍增水準（population Doubling Level；PDL）確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞的增殖能力的結果的圖（*p>0.05，**p>0.01，***p>0.005）。圖7為示出確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞的分化能力的結果的圖（*p>0.05，**p>0.01，***p>0.005）。圖7的A部分為通過油紅O（Oil red O）組織學染色確認根據細胞培養及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞分化成脂肪細胞的能力的結果，圖7的B部分為示出對A部分的組織學染色程度進行定量的圖。圖7的C部分為通過茜素紅S（Alizarin red S）組織學染色確認根據細胞培養及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞分化成破骨細胞的能力的結果，圖7的D部分為示出對C部分的組織學染色程度進行定量的圖。圖8為示出通過彗星試驗（comet assay）確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞中產生的總活性氧種（reactive oxygen species；ROS）的產生（A）以及基於此的去氧核糖核酸（DNA）損傷（B）的結果的圖（*p>0.05，**p>0.01，***p>0.005）。圖9為示出用於確認由根據細胞培養密度及細胞傳代培養產生的活性氧種引起的去氧核糖核酸損傷程度而測定8-羥基-去氧鳥苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine；8-OHdG）濃度的結果的圖。（*p>0.05，**p>0.01，***p>0.005）。圖10為示出通過單獨的高密度條件（HD）或高密度條件＋抗壞血酸（抗氧化劑的一種）（HD+AA）來培養第十一代（P11）至第十五代（P15）的單克隆間充質幹細胞後確認細胞增殖能力變化的結果的圖。圖11為示出通過單獨的高密度條件（HD）或高密度條件＋抗壞血酸（HD+AA）來培養第十五代（P15）的單克隆間充質幹細胞後，比較所產生的活性氧種水準的結果的圖（*p>0.05，**p>0.01，***p>0.005）。圖12a為示出現有的層分離培養法及改良的層分離培養法實驗方法的圖。圖12b為改良的層分離培養法的示意圖，與現有的層分離培養法不同的對應於第二代之後的低密度培養的示意圖。圖13至圖20為示出將通過層分離培養法獲得的SCM01至SCM08單克隆間充質幹細胞以1000細胞/cm² 或4000細胞/cm² 密度接種並利用添加或不添加抗氧化劑的Dulbecco改良的Eagle培養基，低葡萄糖（Dulbecco's Modified Eagle Medium，low glucose；LG-DMEM），最低基本培養基α（Minimum Essential Medium α，α-MEM）培養基培養的細胞的增殖率的結果的圖。各圖的A部分為示出根據各實驗組第一代（P1）至第五代（P5）的細胞數變化、各圖的B部分為各實驗組的群體倍增時間及群體倍增水準結果的圖。圖21為示出使用不添加抗氧化劑的LG-DMEM培養基，確認僅將細胞密度改為1000細胞/cm² 或4000細胞/cm² 密度的實驗組中的細胞增殖率的結果的圖。圖22為示出使用不添加抗氧化劑的LG-DMEM培養基，確認僅將細胞密度改為1000細胞/cm² 或4000細胞/cm² 密度的實驗組中的群體倍增時間及群體倍增水準的結果的圖。圖23為示出使用添加抗氧化劑的α-MEM培養基，確認僅將細胞密度改為1000細胞/cm² 或4000細胞/cm² 密度的實驗組中的細胞增殖率的結果的圖。圖24為示出使用添加抗氧化劑的α-MEM培養基，確認僅將細胞密度改為1000細胞/cm² 或4000細胞/cm² 密度的實驗組中的群體倍增時間及群體倍增水準的結果的圖。圖25為示出將細胞密度固定為1000細胞/cm² 密度，並確認將培養基改為LG-DMEM或α-MEM的實驗組中的細胞增殖率的結果的圖。圖26為示出將細胞密度固定為1000細胞/cm² 密度，並確認將培養基改為LG-DMEM或α-MEM的實驗組中的群體倍增時間及群體倍增水準的結果的圖。圖27為急性胰腺炎動物模型構建及本發明的cMSC1、cMSC2處理方案的示意圖。圖28為示出在急性胰腺炎動物模型中根據本發明的cMSC1、cMSC2處理方案的α-澱粉酶（-amylase）及脂肪酶（lipase）的活性變化的結果的圖（所有值均以均值（SEM）P值的標準誤差表示= *，>0.05；**，>0.01；***，>0.001與SAP（重症急性胰腺炎）組相比，以及###，>0.001與對照組相比）。圖29為示出確認在急性胰腺炎動物模型中根據cMSC1、cMSC2處理方案的髓過氧化物酶（myeloperoxidase；MPO）活性變化的結果的圖（所有值均以均值（SEM）P值的標準誤差表示= *，>0.05；**，>0.01；***，>0.001與SAP組相比，以及###，>0.001與對照組相比）。圖30為示出確認在急性胰腺炎動物模型中根據cMSC1、cMSC2處理方案的炎性細胞因數腫瘤壞死因數α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、γ-干擾素（IFN-γ）變化及抗炎性細胞因數白細胞介素-10（IL-10）變化的結果的圖（所有值均以均值（SEM）P值的標準誤差表示 = *，>0.05；**，>0.01；***，>0.001與SAP組相比，以及###，>0.001與對照組相比）。圖31為示出在急性胰腺炎動物模型中根據cMSC1、cMSC2處理的組織病理學分析結果的圖。圖32為示出確認急性胰腺炎動物模型中根據cMSC1、cMSC2處理的組織病理學評分（histopathologic score）、水腫、壞死、出血、炎性浸潤評分的結果的圖（所有值均以均值（SEM）P值的標準誤差表示= *，>0.05；**，>0.01；***，>0.001與SAP組相比，以及###，>0.001與對照組相比）。圖33為示出通過Nucleo Counter NC-250儀器確認以改良的方法培養的cMSC1以及以現有方法培養的cMSC2的細胞大小的結果的圖。圖34為示出利用流式細胞儀確認cMSC1及cMSC2的細胞大小分佈的結果的圖。圖35為通過混合淋巴細胞反應（mixed lymphocyte reaction，MLR）方法確認cMSC1及cMSC2的免疫細胞抑制能力的結果的圖（外周血單個核細胞（PBMC；peripheral blood mononuclear cell））。圖36為示出確認cMSC1及cMSC2的培養液的人轉化生長因數-β1（hTGF-β1）和人可溶性腫瘤壞死因數-受體1（Soluble tumor necrosis factor receptor 1，hsTNF-R1）的分泌量的結果的圖。圖37為示出以WI38細胞標準比較在cMSC1及cMSC2中表達的免疫相關標記物吲哚胺2,3-二氧化酶（Indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）、誘導性T細胞共刺激分子配體（Induced T cell co-stimulator ligand，ICOSL）的表達變化的結果的表。圖38為示出確認在共培養免疫細胞和cMSC1及cMSC2的培養液中分泌的γ-干擾素、白細胞介素-17（IL-17）、白細胞介素-10的結果的圖。

Claims

一種用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物，其中，包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；步驟5)，以50細胞/cm²至1000細胞/cm²的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養至第一代；以及步驟6)，以50細胞/cm²至1000細胞/cm²的細胞密度將步驟5)的上述傳代的單克隆幹細胞接種於培養基中，培養至第二代至第八代；其中，上述步驟5)或6)的培養基為添加有抗氧化劑的培養基。
如請求項1之用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物，其中，在上述步驟5)或6)的傳代培養中，以1000細胞/cm²的細胞密度接種於培養基中進行傳代培養。
如請求項1之用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物，其中，上述胰腺炎為慢性胰腺炎或急性胰腺炎。
如請求項1之用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物，其中，上述單克隆幹細胞增加胰腺細胞的存活率。
如請求項1之用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物，其中，上述單克隆幹細胞具有選自由α-澱粉酶或脂肪酶活性降低、髓過氧化物酶活性降低、中性粒細胞浸潤和炎症改善、炎性細胞因數分泌減少以及抗炎性細胞因數分泌增加組成的組中的一種以上的活性。
如請求項1之用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物，其中，上述單克隆幹細胞改善選自由水腫、壞死、出血及炎性浸潤組成的組中的一種以上的胰腺炎病理狀態。
如請求項1之用於預防或治療胰腺炎的藥學組合物，其中，上述單克隆幹細胞為選自由轉化生長因數-β1分泌能力、可溶性腫瘤壞死因數-受體1(sTNF-R1，Soluble tumor necrosis factor receptor 1)分泌能力、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO，Indoleamine 2,3-dioxygenase)表達能力及誘導性T細胞共刺激分子配體(ICOSL，Induced T cell co-stimulator ligand)表達能力組成的組中的一種以上能力增強的單克隆幹細胞。
一種用於預防、改善或治療胰腺炎的藥學組合物的製備方法，其中，包括：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；步驟5)，以50細胞/cm²至1000細胞/cm²的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養第一代；以及步驟6)，以50細胞/cm²至1000細胞/cm²的細胞密度將步驟5)的上述傳代的單克隆幹細胞接種於培養基中，培養至第二代至第八代；其中，上述步驟5)或6)的培養基為添加有抗氧化劑的培養基。
如請求項8之用於預防、改善或治療胰腺炎的藥學組合物的製備方法，其中，在上述步驟5)或6)的傳代培養中，以1000細胞/cm²的細胞密度接種於培養基中進行傳代培養。
一種用於預防、改善或治療胰腺炎的幹細胞，其中，通過如下步驟獲得：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm²至1000細胞/cm²的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養第一代；以及步驟6)，以50細胞/cm²至1000細胞/cm²的細胞密度將步驟5)的上述傳代的單克隆幹細胞接種於培養基中，培養至第二代至第八代；其中，上述步驟5)或6)的培養基為添加有抗氧化劑的培養基。