JP2022513222A - クローナル幹細胞を含む膵炎治療用薬学的組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、改善された幹細胞の層分離培養により収得されるモノクローナル幹細胞を含む膵炎の予防、治療又は改善用組成物並びにその製造方法に関するものである。本発明の改善された幹細胞の層分離培養及び増殖方法によれば、モノクローナル幹細胞の迅速な増殖を通じて短時間で所望のモノクローナル幹細胞の大量収得が可能であり、これにより収得されるモノクローナル間葉系幹細胞は、膵炎の治療効果が増大された幹細胞であるところ、膵炎の治療剤として有用に用いられることができる。
Description
本発明は、改善された幹細胞の層分離培養により収得されるモノクローナル幹細胞を含む膵炎の予防、治療又は改善用組成物、並びにその製造方法に関する。
膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）は、膵臓（ｐａｎｃｒｅａｓ）に炎症を起こして生じる病気であって、急性膵炎（ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）及び慢性膵炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）がある。膵炎は、飲みすぎ（ａｌｃｏｈｏｌ ａｂｕｓｅ）、胆石（ｇａｌｌｓｔｏｎｅｓ）などが原因で膵液がスムーズに流れなくなり、膵液に含まれている酵素が膵臓の自己消化を誘発して発生する。膵炎は、大きく二つの類型に分けられるが、間質性浮腫（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｅｄｅｍａ）と膵臓周囲の脂肪壊死症（ｐｅｒｉｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｆａｔ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）が発見される軽症（ｍｉｌｄ ｔｙｐｅ）の膵炎と、膵臓周囲（ｐｅｒｉｐａｎｃｒｅａｔｉｃ）及び膵内（ｉｎｔｒａｐａｎｃｒｅａｔｉｃ）の広汎な脂肪壊死症、膵実質壊死（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）、出血を伴う重症（ｓｅｖｅｒｅ ｔｙｐｅ）の膵炎がある。
膵炎は、未だ正確な病態生理機序が知られていないが、代表的な症状として見られるのが、タンパク質分解酵素の前駆物質が膵内で早期活性化されることで起こる自己消化の過程である。すなわち、膵腺房細胞（ｐａｎｃｒｅａｓ ａｃｉｎａｒ ｃｅｌｌ）内で消化酵素が異常に早期活性化されると、膵臓の細葉を自己消化し、続いて炎症が発生し、組織の脱落、壊死が発生する。最近は、膵腺房細胞の損傷後、膵内に流入される活性化されたマクロファージが組織損傷に対する反応として、炎症性サイトカインインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－１βを分泌し、炎症細胞の循環、膵臓の浮腫及び膵実質の破壊に重要な役割をすることが明らかになっている。
膵炎の重症度を軽減させ、数々の臓器の合併症の発生を抑制することができる様々な実験的治療法が提示されているが、実験的治療法をいざヒトに適用した場合、非常に微弱な効果を示し、膵炎の予防及び治療に関連して効果的に広く用いられている治療剤は、未だにないのが実情である。
最近、様々な炎症性疾患の治療に幹細胞を利用しようとする試みが進められている。我々の体の２１０個余りのすべての機関の組織として成長しうる潜在的能力を有しており、無限に分裂され、適切な操作を通して所望の臓器に分化することができる。このような幹細胞の特性により幹細胞は、新しい治療剤として脚光を浴びており、幹細胞を用いた難病治療の可能性は非常に高いもので、白血病、骨粗しょう症、肝炎、パーキンソン病、老人性認知症、火傷など、数多くの疾病の治療が可能なものとして期待されている。
しかし、幹細胞の場合、これを大量に収得することが難しいという点では、まだまだ多くの制約事項がある。幹細胞を収得する方法として、凍結胚細胞から得る方法が効率的であるといえるが、倫理的な面ではいまもなお多くの論争がある。このような問題点を解消すべく体細胞核移植方法や成体幹細胞を用いて幹細胞を収得する方法もやはり多くの研究が進められてきた。胚性幹細胞に対する研究よりも活発に行われている分野としては、成体幹細胞の研究である。成体幹細胞は、中枢神経系や骨髄など各種の臓器に残り、成長期の臓器発達と損傷時の再生に関与する細胞として各種臓器に存在するため、骨髄、脾臓、脂肪細胞などを含むいろんな部位から得ることができるが、骨髄から得る方法が最も一般的に行われている。しかし、数多くの骨髄細胞の中から間葉系幹細胞を分離し、培養することにおいて、常に均一な形態の細胞を得ることが難しいので、このような問題点を補完するための研究が行われている。
本発明者は、新規な層分離培養法と命名された幹細胞の分離方法を発明しており、韓国特許出願第ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号として特許出願をし、登録を受けた。前記層分離培養法は、他の方法に比べて低コストで行うことができるだけでなく、汚染の問題がなく、他の幹細胞が混入する心配なしにクローナル間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ）を効果的に得ることができるという点で、他の幹細胞収得方法に比べて卓越した優秀性を有する。しかし、前記方法の優秀性にもかかわらず、層分離培養法は、間葉系幹細胞を大量産生し、最終産物として用いるためには、ワーキング細胞バンクを製造し、これを介して最終的な産物を収得する工程を経なければ十分な量の中間葉茎細胞を収得することができず、少なくとも１０回継代（Ｐａｓｓａｇｅ）以上の培養が必要という点で、迅速なモノクローナル間葉系幹細胞集団の収得が難しいという限界があった。
一方、炎症性疾患、特に膵炎を治療するために幹細胞を用いることは、まだ数々の限界があり、効果的に膵炎を治療するための幹細胞の製造法及びこれを用いた膵炎の治療方法については、まだ知られていない。
本発明者等は、前記のような層分離培養法の改善により幹細胞の迅速な増殖を誘導するための研究をしていた中、培養細胞密度を低く調節し、抗酸化剤を添加して培養する改善された層分離培養法を利用する場合、少ない継代培養だけで効果的な細胞増殖率の増加を誘導することができ、これにより収得されるモノクローナル間葉系幹細胞が従来の層分離培養法の幹細胞に比べて極めて顕著な膵炎の治療効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、従来の層分離培養法を改善した幹細胞の層分離培養及び増殖方法により収得されるモノクローナル幹細胞を含む膵炎の予防、治療、及び改善用組成物、並びにその製造方法を提供するものである。
前記目的を達成するために本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を、２）段階の第１容器の上澄み液とし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階；を通して収得されるモノクローナル幹細胞を含む、膵炎の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を、２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階を通してモノクローナル幹細胞を収得する段階；とを含む、膵炎の予防、改善又は治療用組成物の製造方法を提供する。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液とし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階；を通して収得される膵炎の予防、改善又は治療用幹細胞を提供する。
本発明の改善された幹細胞の層分離培養及び増殖方法によれば、モノクローナル幹細胞の迅速な増殖により短時間で所望のモノクローナル幹細胞の大量収得が可能であり、これを通じて収得されるモノクローナル間葉系幹細胞は、膵炎の治療効果が増大された幹細胞であるところ、膵炎の治療剤として有用に用いられることができる。
本発明は、間葉系幹細胞の改善された層分離培養及び増殖方法を通じて収得されるモノクローナル幹細胞を含む膵炎の予防、治療用薬学的組成物、又は前記モノクローナル幹細胞をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、膵炎の予防又は治療方法に関する。
また、本発明は、間葉系幹細胞の改善された層分離培養及び増殖方法を通じてモノクローナル幹細胞を得る段階を含む、膵炎の予防、改善又は治療用組成物の製造方法に関する。
本発明の有効成分であるモノクローナル幹細胞は、幹細胞を迅速かつ汚染なく収得することができる層分離培養法の利点に加えて、モノクローナル幹細胞、好ましくはモノクローナル間葉系幹細胞の迅速な増殖をを通じてＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）の製造段階なしでも短時間で所望のモノクローナル幹細胞を大量に収得することができる改善された層分離培養法を通じて収得される幹細胞である。前記の方法を通じて収得されるモノクローナル幹細胞は、従来の層分離培養法を通じて収得される幹細胞と比較して膵炎の治療効果が増大された幹細胞である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階；を通じて収得されるモノクローナル幹細胞を含む、膵炎の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階；を通じて収得されるモノクローナル幹細胞を含む、膵炎の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
前記２）及び３）段階の培養は、３０～４０℃で４時間以下、好ましくは１時間～３時間、より好ましくは１時間３０分～２時間３０分培養し、繰り返し培養は３０～４０℃で４時間以下、好ましくは１時間～３時間、より好ましくは１時間３０分～２時間３０分培養した後、３０～４０℃で１２～３６時間、好ましくは１８時間～３０時間培養を２～３回繰り返し、次いで３０～４０℃で２４～７２時間、３６時間～６０時間、好ましくは３６時間～６０時間で培養し、毎回上澄み液を新しい培養容器に移し替えて行うことができる。
本発明の実施例にて分離した方法を簡略に要約すると、次の通りである。
［図１］
［図１］
培養した細胞は、モノクローナル細胞群を形成するが、このモノクローナル細胞群を分離した後、継代培養を行うことができ、本発明は、従来の層分離培養方法に加え、５）段階の培養段階を含むことを特徴とする。
本発明において、「層分離培養」は、幹細胞を比重によって分離する方法を意味し、最初にヒト骨髄を抽出し、細胞培養液に培養した後、上澄み液のみを収得し、これをコーティング剤が施された又は施されていない培養容器に移し替えて培養した後、同一過程を数回繰り返す工程をいう。このような層分離培養は、遠心分離過程なしに上澄み液を繰り返し収得して培養する工程を繰り返すことを特徴とし、最終的に他の細胞を汚染させることなくモノクローナル幹細胞、好ましくは、モノクローナル間葉系幹細胞を収得することができる利点がある。
本発明の前記１）～５）の段階のうち、１）～４）の段階は、ＫＲ第１０－２００６－００７５６７６号、ＵＳ１２／９８２７３８、又はＫＲ第１０－２０１３－７０２００３３号に記載された層分離培養法と同一又は同等に行われることができ、ＫＲ第１０－２００６－００７５６７６号は、本発明において全体的に参考にすることができる。
従来、ＫＲ第１０－２０１３－７０２００３３号及び ＵＳ１２／９８２７３８では、膵炎の治療に関連して、細胞を得る方法として（ｉ）骨骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織サンプル又はサイトカイン－活性化された末梢血の生体サンプルを得する段階と、（ｉｉ）前記骨骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織サンプル又はサイトカイン－活性化された末梢血の生体サンプルを、容器内に沈殿させる段階；（ｉｉｉ）前記容器から他の細胞に比べて比較的少なく密集された細胞を含有する上澄み液を２回以上連続的な方法で、他の容器に伝達する段階と、（ｉｖ）前記上澄み液から少なく密集された細胞を隔離する段階；（ｖ）段階（ｉｖ）で収得された細胞を膵炎を患う対象に投与するが、ここで前記骨骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織サンプル又はサイトカイン－活性化された末梢血は、段階（ｉ）～（ｉｉｉ）において、１，０００ｒｐｍを超える遠心分離を介さない段階が開示されている。前記の方法は、遠心分離せずに密度の差異だけで、モノクローナル幹細胞を収得する方法であるという点で、ＫＲ第１０－２００６－００７５６７６号の従来の層分離培養方法を用いる。
しかし、前記ＵＳ１２／９８２７３８、ＫＲ第１０－２００６－００７５６７６号及びＫＲ第１０－２０１３－７０２００３３号の層分離培養方法は、モノクローナル幹細胞を、低継代で効果的に収得し、これにより膵炎治療効果が顕著に改善さされたモノクローナル幹細胞を得るための方法が開示されていない。
従来の層分離培養法は、図１で確認されるように、単一コロニーから得られたすべての細胞を６ウェルに移し、８０～９０％コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に増殖させた後、増殖された状態の１回継代（Ｐ１）細胞をｓｅｅｄ ｃｅｌｌにして密度の調節に対する認識がなく、多くの細胞を収得するために４０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）で高密度培養を行う。
その反面、本発明は、２回継代後の培養で細胞密度を調節することにより、膵炎の予防、治療、改善効果に優れた幹細胞を効率的に収得することができることを基礎とした「改善された層分離培養法」に関するものであり、従来の層分離培養法とｓｅｅｄ ｃｅｌｌ以後の培養段階を異にすることを特徴とする。例えば、具体的に「５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階」を含む。改善された層分離培養法は、従来の層分離培養法に比べて迅速なモノクローナル幹細胞の増殖を誘導することができるので、最終的な産物を迅速に収得することができ、好ましくは、Ｐ２ないしＰ８のような継代が１０回未満の培養だけで ＭＣＢ（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を製造し、優れた膵炎の予防又は治療効果を示すモノクローナル幹細胞を収得することができる。
本発明のモノクローナル幹細胞は、従来の工程のように４０００細胞／ｃｍ２の高密度で培養される場合、細胞増殖能が著しく減少し、間葉系幹細胞のマーカーが変化し、幹細胞の分化能が失われ得る。したがって、改善された層分離培養法を通じて収得されたモノクローナル幹細胞は、低密度ないし中程度の密度、４０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）未満の低細胞密度、例えば、３０００細胞／ｃｍ２以下、好ましくは２０００細胞／ｃｍ２以下、より好ましくは５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培養されたことを意味することができる。
１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）以下の細胞密度でモノクローナル間葉系幹細胞を培養する場合、細胞の増殖能は、４０００細胞／ｃｍ２のように高密度に培養された間葉系幹細胞と比較して、長期間の培養期間の間ずっと著しく高く維持されるので、多くの継代を繰り返さなくても、所望量の大量のモノクローナル細胞を迅速に収得することができるという利点がある。したがって、本発明の改善された層分離培養方法は、ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ以後の継代培養段階を１０回継代未満、好ましくは８回継代以下のみで行われることを特徴とすることができ、従来の層分離培養方法は、十分な数の細胞を確保するために、最大２５回継代まで培養しなければならなかったものと比較して少ない継代培養だけでモノクローナル幹細胞の大量生産が可能な長所がある。
また、前記細胞密度でモノクローナル間葉系幹細胞を培養する場合、当該細胞は、ＤＮＡ損傷が少なく、老化が抑制され、幹細胞の分化能を効果的に維持することができるという利点があり、素早く、且つ迅速に優れた幹細胞特性を有するモノクローナル間葉系幹細胞を収得することができる。
また、本発明の方法に従って収得されるモノクローナル幹細胞は、４０００細胞／ｃｍ２のように高密度に培養されたモノクローナル幹細胞と比較して、優れた膵炎の予防、改善又は治療効果を示す。
本発明にて用いられる培地は、抗酸化剤を含まない培地であって、前記培地に抗酸化剤が追加された培地又は抗酸化剤を含む培地をいずれも含むことができる。
抗酸化剤を含まない培地としては、これに限定されるものではないが、ＤＭＥＭ培地を用いることができ、必要に応じて前記培地に、抗酸化剤をさらに追加して培養を行うことができる。また、必要に応じて抗酸化剤が含まれたα－ＭＥＭ培地を用いて培養を行うことができる。
本発明の抗酸化剤は、細胞培養に用いられることができる抗酸化剤を制限なく含むことができ、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、システアミン（Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）、ユビキノール（Ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ）、ベータ－マーカプトエタノール（ｂ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）及びアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ；ＡＡ）からなる群から選択された１種以上であることができる。抗酸化剤が培地に追加された場合、前記抗酸化剤は１０～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは２５μｇ／ｍｌの濃度で追加されることができる。
本発明の一例として、抗酸化剤を含まない培地としてＤＭＥＭ、より好ましくはＬＧ－ＤＭＥＭ培地を用い、抗酸化剤としてアスコルビン酸を含む培地としてα－ＭＥＭ培地を用いる。
一方、本発明の方法によれば、モノクローナル幹細胞を非常に効果的に増殖させることができるので、ＭＣＢを用いてＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を製造する工程が省略されることができる。これは、従来の層分離培養法がＭＣＢ製造後、ＷＣＢを製造する工程を伴う必要があるものに比べ、工程を単純化したものである。
本発明の培養培地として抗酸化剤を含む培地を用いる場合、前記培養培地には、抗生物質としてゲンタマイシンが追加されることができる。
本発明の方法により収得された中間葉幹細胞は、最終的に、好ましくはＰ２ないしＰ１０未満の中間葉幹細胞であることができ、より好ましくはＰ２ないしＰ８の中間葉幹細胞、さらに好ましくはＰ２ないしＰ６の中間葉幹細胞であることができる。これは最低Ｐ１０ないしＰ１２の中間葉幹細胞は、最終的産物として収得される従来の工程に比べ、より低い継代から収得される幹細胞であり、細胞接種密度調節を通じて低継代で急速に増殖された中間葉幹細胞を容易に大量に収得することができることを示す。
本発明において、前記のような改善された層分離培養法、好ましくは２０００細胞／ｃｍ２以下、さらに好ましくは１０００細胞／ｃｍ２以下の低密度及び抗酸化条件の改善された層分離培養法の方法で収得されたモノクローナル幹細胞（以下、「ｃＭＳＣ１」と表記）は、従来の層分離培養法で収得されるモノクローナル幹細胞（以下、「ｃＭＳＣ２」と表記）と比較して、細胞の大きさがより小さく、均質に形成されることができ、軽症だけでなく、重症急性膵炎の生存率を高め、浮腫による膵臓の重量増加を緩和させ、急性膵炎のために増加される消化酵素の増加と炎症関連酵素の増加を効果的に減少させることができる。
本発明において、「膵炎」とは、膵臓の酵素によって膵臓の分泌腺の破壊及び膵臓全体に炎症が発生することをいい、慢性膵炎及び急性膵炎の両方を含むが、急性膵炎であることができ、軽症及び重症急性膵炎を制限なく含むことができる。
本発明の改善された層分離培養方法により収得されたモノクローナル幹細胞は、膵炎だけでなく、膵炎から起因した疾患、例えば、肺損傷、敗血症、腎不全、胸膜滲出液、多臓器不全及び多発性臓器損傷からなる群から選択されたいずれか一つ以上の疾患もやはり効果的に予防、治療又は改善することができる。
本発明の方法を用いて収得されるモノクローナル幹細胞は、膵臓細胞の生存率を増進させることができ、アルファ－アミラーゼ又はリパーゼ活性の減少、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＭＰＯ）活性の減少、好中球浸潤及び炎症の改善、炎症性サイトカインの分泌の減少、及び抗炎症サイトカインの分泌の増大からなる群から選択された１種以上の活性を示すことを特徴とすることができる。
また、本発明の方法により収得されるモノクローナル幹細胞は、浮腫、壊死、出血、及び炎症浸潤からなる群から選択された１種以上の膵炎の病理学的状態を改善させることができる。
また、本発明の方法を通じて収得されるモノクローナル幹細胞は、幹細胞は、ＴＧＦ－β１分泌能、ｓＴＮＦ－Ｒ１（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）分泌能、ＩＤＯ発現能、ＩＣＯＳＬ発現能からなる群から選択された１種以上の能力が増大されたモノクローナル幹細胞であることができる。
したがって、本発明の改善された層分離方法を通じて収得されるモノクローナル幹細胞であるｃＭＳＣ１は、従来の層分離培養法によって収得されるｃＭＳＣ２と比較して、膵臓細胞の生存率の増進、アルファ－アミラーゼ又はリパーゼ活性の減少、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＭＰＯ）活性の減少、好中球浸潤及び炎症の改善、炎症性サイトカインの分泌の減少、抗炎症サイトカインの分泌の増大活性がすべて著しく優れており、浮腫、壊死、出血、及び炎症浸潤からなる群から選択された１種以上の膵炎病理学的状態を改善する効果に優れている。このような膵炎治療効果の差は、改善された層分離培養法によって収得される本発明のモノクローナル幹細胞ならではの顕著な効果であり、従来の方法で収得されたｃＭＳＣ２に比べてＴＧＦ－β１分泌能、ｓＴＮＦ－Ｒ１分泌能、ＩＤＯ発現能、ＩＣＯＳＬ発現能からなる群から選択された１種以上の能力が増大されたことに起因することができる。
本発明の薬学的組成物は、投与のために前記有効成分に加えて、追加で薬学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤の際に通常に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分に加えて潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
本発明の薬学的組成物の投与量は、前記薬学的組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間及び／又は投与経路などにより多様化することができ、前記薬学的組成物の投与により達成しようとする反応の種類と程度、投与対象となる個体の種類、年齢、体重、一般的な健康状態、疾病の症状や程度、性別、食餌、排泄、当該個体に同時又は移植に共に用いられる薬物その他の組成物の成分などをはじめとする種々の因子及び医薬分野でよく知られた類似因子に応じて多様化することができ、当該技術分野における通常の知識を有する者は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定し、処方することができる。
本発明の薬学的組成物の投与量は、例えば、１日に１ｍｇ／ｋｇないし１，０００ｍｇ／ｋｇであることができるが、前記投与量はいかなる面であれ、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の薬学的組成物の投与経路及び投与方法は、それぞれ独立的であることができ、その方法において特に制限されず、目的とする当該部位に前記薬学的組成物が到達することができる任意の投与経路及び投与方法に従うことができる。
前記薬学的組成物は、経口投与又は非経口投与の方法で投与することができる。前記非経口投与方法としては、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与又は皮下投与などが含まれ、前記薬学的組成物を疾患部位に塗布したり噴霧、吸入する方法もまた利用することができるが、これらに限定されるものでない。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階を経て、モノクローナル幹細胞を収得する段階；及び６）前記モノクローナル幹細胞を個体に投与する段階；を含む膵炎の予防又は治療方法を提供する。
本発明において、前記「個体」は、膵炎の予防又は治療が必要な個体を含み、哺乳類又はヒトを除く哺乳類であることができる。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階を通じて収得される膵炎の予防、改善又は治療用幹細胞を提供する。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階を通じてモノクローナル幹細胞を収得する段階；を含む膵炎の予防、改善又は治療用組成物の製造方法を提供する。
本発明によれば、従来の層分離培養法で収得されるモノクローナル幹細胞と比較して優れた膵炎の予防、改善又は治療効果を示すモノクローナル幹細胞をＷＣＢを製造することなく、迅速且つ容易に収得することができ、前記組成物は、薬学、食品、医薬外品、及び化粧料組成物に制限なく含まれることができる。
本発明の製造方法において、前記５）段階の培養は、１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して行われることを特徴とすることができる。
また、本発明の製造方法において、前記５）段階の培地は、抗酸化剤が追加された培地であることを特徴とすることができる。
本発明の治療方法及び製造方法において、前記の組成物にて記述された内容が同一に適用されることができ、重複する内容は、明細書の記載の複雑さを避けるために省略する。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
次の実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されない。
次の実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されない。
＜実施例１＞改善された層分離培養法の確立
膵炎により優れた効果を示すモノクローナル間葉系幹細胞を製造するために改善された間葉系幹細胞の層分離培養法及び増殖方法を用いた。改善された間葉系幹細胞の層分離培養法及び増殖方法は、韓国特許出願第１０－２００６－００７５６７６号に記載された層分離培養法の培養条件のうち、細胞密度及び培養培地を変更したことを特徴とする。以下の実験では、層分離培養法により収得されたモノクローナル間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ）の細胞培養密度をそれぞれ５０細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）（低密度）、１０００細胞／ｃｍ２（中密度）、４，０００細胞／ｃｍ２（高密度）と異にしてそれに応じた細胞の特性を分析した。
膵炎により優れた効果を示すモノクローナル間葉系幹細胞を製造するために改善された間葉系幹細胞の層分離培養法及び増殖方法を用いた。改善された間葉系幹細胞の層分離培養法及び増殖方法は、韓国特許出願第１０－２００６－００７５６７６号に記載された層分離培養法の培養条件のうち、細胞密度及び培養培地を変更したことを特徴とする。以下の実験では、層分離培養法により収得されたモノクローナル間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ）の細胞培養密度をそれぞれ５０細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）（低密度）、１０００細胞／ｃｍ２（中密度）、４，０００細胞／ｃｍ２（高密度）と異にしてそれに応じた細胞の特性を分析した。
１．１ 細胞密度による間葉系幹細胞の形態学的変化の確認
まず、長期間培養で細胞密度による間葉系幹細胞の形態学的変化を確認するための実験を行った。培養条件の変化を与えるために５回継代（Ｐ５）、１０回継代（Ｐ１０）、１５回継代（Ｐ１５）の間葉系幹細胞を用いており、それぞれ低密度、中密度、高密度の条件でＬＧ－ＤＭＥＭ培地に接種した。それから、細胞の形態学的変化を顕微鏡で観察し、幹細胞が老化するか否かを判断し、その結果を図２に示した。
まず、長期間培養で細胞密度による間葉系幹細胞の形態学的変化を確認するための実験を行った。培養条件の変化を与えるために５回継代（Ｐ５）、１０回継代（Ｐ１０）、１５回継代（Ｐ１５）の間葉系幹細胞を用いており、それぞれ低密度、中密度、高密度の条件でＬＧ－ＤＭＥＭ培地に接種した。それから、細胞の形態学的変化を顕微鏡で観察し、幹細胞が老化するか否かを判断し、その結果を図２に示した。
図２に示すように、５回継代（Ｐ５）及び１０回継代（Ｐ１０）では、細胞密度により細胞の大きさと形態学的パターンにおいて差を示しており、特にＰ１５の場合、高密度培養条件で平らで大きくなった形態の間葉系幹細胞が観察された。このような形態は、典型的な間葉系幹細胞の老化を示すものであり、長期間培養で細胞の密度調節が間葉系幹細胞の老化を調節することができることを確認した。
１．２ 細胞密度によるＭＳＣ細胞の大きさ及び粒度の確認
細胞密度による幹細胞の変化をさらに確認するために、老化した細胞から増加したとして知られている細胞の大きさ及び細胞の粒度（ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）をフローサイトメトリー分析を通じて定量分析し、その結果を図３に示した。
細胞密度による幹細胞の変化をさらに確認するために、老化した細胞から増加したとして知られている細胞の大きさ及び細胞の粒度（ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）をフローサイトメトリー分析を通じて定量分析し、その結果を図３に示した。
図３に示すように、細胞の大きさは、Ｐ５では有意な差を示さなかったが、Ｐ１０及びＰ１５の場合、細胞密度により有意な差を示すことを確認した。特にＰ１０及びＰ１５では、高細胞密度の培養条件で細胞の大きさが有意に増加し、細胞の老化がさらに促進されることが確認された。これと同様に細胞の粒度もやはりすべての継代（Ｐａｓｓａｇｅ）で細胞の密度が高くなるほど有意に増加する結果が表れた。したがって、間葉系幹細胞の長期培養において、細胞の密度調節が細胞の老化を調節する因子となり得ることを確認しており、細胞培養密度を下げることで後期継代で表される形態学的変化が改善され得ることが確認された。
１．３ 培養細胞密度による間葉系幹細胞の老化の確認
実施例１．１及び１．２から確認された形態学的変化が、実際に間葉系幹細胞における老化依存（ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）現象であることを確認するために、老化細胞を選択的に染色することができるベータガラクトシダーゼを用いた染色分析法を行い、老化関連遺伝子であるｐ１５、ｐ１６、及び増殖マーカーであるＰＣＮＡ遺伝子の発現をＲＴ－ＰＣＲを用いて比較した。その結果をそれぞれ図４及び図５に示した。
実施例１．１及び１．２から確認された形態学的変化が、実際に間葉系幹細胞における老化依存（ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）現象であることを確認するために、老化細胞を選択的に染色することができるベータガラクトシダーゼを用いた染色分析法を行い、老化関連遺伝子であるｐ１５、ｐ１６、及び増殖マーカーであるＰＣＮＡ遺伝子の発現をＲＴ－ＰＣＲを用いて比較した。その結果をそれぞれ図４及び図５に示した。
図４に示すように、５回継代（Ｐ５）及び１０回継代（Ｐ１０）では、すべての細胞密度で老化した細胞の染色を確認することはできなかったが、１５回継代（Ｐ１５）では、細胞密度が高くなるほど、老化した細胞の染色が明らかに増加することを確認した。また、図５に示すように、１５回継代（Ｐ１５）では、細胞の培養密度が増加するほど、老化に関連する遺伝子であるＣＤＫ阻害剤ｐ１５及びｐ１６の遺伝子発現が増加し、増殖マーカーであるＰＣＮＡは、減少した。
こうした結果は、間葉系幹細胞の形態学的変化が、間葉系幹細胞の老化と関連があることを示す結果であり、継代培養時、細胞培養密度の調節が間葉系幹細胞の老化を調節することができることを示す結果である。
１．４ 培養細胞密度による間葉系幹細胞の増殖能変化の確認
間葉系幹細胞の増殖能力は継代が進み、細胞の老化が進むにつれて徐々に減少するとして知られている。したがって、増殖能は、間葉系幹細胞の老化を確認できる基準として用いることができ、長期間の細胞培養時、細胞培養密度による間葉系幹細胞の増殖能の比較を行った。各細胞の増殖能は、初期接種細胞数と培養が終わった後、得られる細胞の数を通じて各継代による増殖率を計算して確認し、その結果を表１及び図６に示した。
間葉系幹細胞の増殖能力は継代が進み、細胞の老化が進むにつれて徐々に減少するとして知られている。したがって、増殖能は、間葉系幹細胞の老化を確認できる基準として用いることができ、長期間の細胞培養時、細胞培養密度による間葉系幹細胞の増殖能の比較を行った。各細胞の増殖能は、初期接種細胞数と培養が終わった後、得られる細胞の数を通じて各継代による増殖率を計算して確認し、その結果を表１及び図６に示した。
表１に示すように、低密度で培養された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の場合、５回継代（Ｐ５）、１０回継代（Ｐ１０）、１５回継代（Ｐ１５）で増加倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）が、８８．４、３４．３、１６．４であるのに対し、中密度で培養された間葉系幹細胞は、８．５、４．９、３．１であり、高密度で培養された間葉系幹細胞は、３．０、１．９、１．１であることが確認された。また、図６に示すように、集団倍加時間（ＰＤＴ）及び集団倍加数（ＰＤＬ）も増加倍数と同じパターンで表れることを確認した。このような結果は、長期間の間葉系幹細胞培養で細胞密度を下げることで、間葉系幹細胞の増殖能を維持させることができることを示す結果であり、同じ継代培養を行っても、間葉系幹細胞の老化を抑制し、寿命を延長させることができることを示す。
１．５ 培養細胞密度による間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の分化能変化の確認
細胞培養密度が幹細胞能に影響を与えるか否かを確認するために、Ｐ５ないしＰ１５培養による分化能を比較した。幹細胞能として脂肪細胞分化能及び骨細胞分化能を確認しており、それぞれの継代及び密度で、正常、定量分析を行った。具体的には、脂肪細胞の分化培養液は、Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｓｏｓｅ ＤＭＥＭ培養液にＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、１０－７ｍｏｌデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）、１００μＭインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した培地を作成して実験し、７日間にわたる分化後、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色を通じて確認した。また、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色後、イソプロピルアルコールで溶出させ、５００ｎｍで測定した後、定量分析して確認した。
細胞培養密度が幹細胞能に影響を与えるか否かを確認するために、Ｐ５ないしＰ１５培養による分化能を比較した。幹細胞能として脂肪細胞分化能及び骨細胞分化能を確認しており、それぞれの継代及び密度で、正常、定量分析を行った。具体的には、脂肪細胞の分化培養液は、Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｓｏｓｅ ＤＭＥＭ培養液にＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、１０－７ｍｏｌデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）、１００μＭインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した培地を作成して実験し、７日間にわたる分化後、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色を通じて確認した。また、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色後、イソプロピルアルコールで溶出させ、５００ｎｍで測定した後、定量分析して確認した。
骨細胞分化培養液は、α－ＭＥＭ培養液にＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、５０μｇ／ｍｌ ａｓｃｏｒｂｉｃ ２ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｓｉｇｍａ）、１０－８ｍｏｌデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのベータグリセロリン酸（β（ｓｉｇｍａ）を添加した培地を使用しており、２１日間にわたる分化後にＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ組織化学染色を通じて確認した。また、Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ組織化学染色後、１０％酢酸で溶出させ、４０５ｎｍで測定し、定量分析して確認した。前記のような方法で脂肪細胞分化能及び骨細胞分化能を確認した結果を図７に示した。
図７に示すように、脂肪細胞分化能は継代が進むにつれて、全体的に減少したが、密度による差が顕著に表れていないのに対し、骨細胞分化能の場合、高密度条件の１５回継代（Ｐ１５）培養群で有意に減少していることを確認した。このような結果から間葉系幹細胞の骨細胞分化能は、低い細胞密度で培養した場合、よりうまく維持されることを確認した。
１．６ 培養細胞密度による間葉系幹細胞の抗原プロファイル分析
細胞培養密度が幹細胞の抗原発現にも影響を及ぼすか否かを確認するための実験を行い、各継代及び培養密度による陽性及び陰性抗原発現の変化をフローサイトメトリーで確認し、その結果を表２に示した。
細胞培養密度が幹細胞の抗原発現にも影響を及ぼすか否かを確認するための実験を行い、各継代及び培養密度による陽性及び陰性抗原発現の変化をフローサイトメトリーで確認し、その結果を表２に示した。
表２に示すように、陰性マーカー発現の変化は、明らかに確認されなかったが、一部の陽性マーカーの場合のような継代でも細胞培養密度により発現量の変化が表れることを確認した。
特に１５回継代（Ｐ１５）では、高密度で細胞を培養した場合、ほとんどの陽性マーカーの発現量が顕著に減少しただけでなく、ＣＤ７３、ＣＤ１０５は、陰性発現を示し、細胞密度を低く維持し、細胞培養を行うことが非常に重要な因子であることを確認した。
１．７ 培養細胞密度による活性酸素種（ＲＯＳ）産生及びＤＮＡ損傷の比較
間葉系幹細胞の機能の減少とＤＮＡ損傷は、関連性があるとして知られており、特に、活性酸素種ＲＯＳによって誘導されるＤＮＡ損傷は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の老化を促進するとして知られている。したがって、培養密度により全活性酸素種（ＲＯＳ）産生及びそれに伴うＤＮＡ損傷が異なって示されるかどうかを確認するために、継代及び細胞培養密度による全細胞性活性酸素種（ＲＯＳ）の量を蛍光強度分析を通じて比較し、ｃｏｍｅｔ分析を通じてＤＮＡ損傷の程度を確認し、その結果を図８に示した。
間葉系幹細胞の機能の減少とＤＮＡ損傷は、関連性があるとして知られており、特に、活性酸素種ＲＯＳによって誘導されるＤＮＡ損傷は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の老化を促進するとして知られている。したがって、培養密度により全活性酸素種（ＲＯＳ）産生及びそれに伴うＤＮＡ損傷が異なって示されるかどうかを確認するために、継代及び細胞培養密度による全細胞性活性酸素種（ＲＯＳ）の量を蛍光強度分析を通じて比較し、ｃｏｍｅｔ分析を通じてＤＮＡ損傷の程度を確認し、その結果を図８に示した。
図８に示すように、全ＲＯＳ産生は、全継代で細胞培養密度が増加するほど増加する傾向を確認し、特に１０回継代（Ｐ１０）と１５回継代（Ｐ１５）では、有意にＲＯＳ産生が増加することを確認した（Ａ）。ｃｏｍｅｔ分析では、ＤＮＡの損傷が最も弱いＣＣ１から損傷が最も深刻なＣＣ５に分類してデータを分析し、損傷が最も深刻なＣＣ５の場合、細胞培養密度が高くなるほど有意に増加することを確認した。その反面、ＣＣ１は、細胞密度が高くなるほど有意に低くなる傾向を示した（Ｂ）。
さらにＤＮＡ損傷がＲＯＳによって誘発されたかどうかを確認するために、ＲＯＳによるＤＮＡ損傷を確認する８－ＯＨｄＧの濃度を確認する実験を行った。８－ＯＨｄＧ分析方法は、次のとおりである。それぞれの細胞から得られたＤＮＡ試料５０μｌを８－ＯＨｄＧが結合されたプレート（８－ＯＨｄＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）に入れた後、常温で１０分間培養した。その後、抗－８－ＯＨｄＧ抗体（ａｎｔｉ－８－ＯＨｄＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を追加で入れ、常温で一時間培養し、３回洗浄した後、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、再び１時間常温で培養した。この後、再び３回洗浄した後、基質溶液（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れ、常温で３０分間培養した。最後に静止溶液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れてから、４５０ｎｍでの吸光度を測定して確認し、その結果を図９に示した。
図９に示すように、ＤＮＡ損傷が最も深刻なものとして表れた１５回継代（Ｐ１５）群では、細胞培養密度が高くなるほど、８－ＯＨｄＧの濃度が有意に増加することを確認した。このような結果を通じて高密度培養条件で産生されるＲＯＳによってＤＮＡ損傷が増加するものであり、これにより、間葉系幹細胞の老化が促進されることを示す。
このような結果は、細胞培養密度を低く調節することが中葉幹細胞のＲＯＳ産生の増加によるＤＮＡ損傷から間葉系幹細胞を保護する役割をすることができることを示す結果である。
１．８ 抗酸化剤処理による間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖及び活性酸素種（ＲＯＳ）の産生能の確認
間葉系幹細胞の増殖が高密度培養条件で産生されるＲＯＳによって影響を受けるかどうかを確認するため、ＲＯＳ消去実験を行った。１１回継代（Ｐ１１）ないし１５回継代（Ｐ１５）で高密度培養条件及び高密度培養条件に抗酸化剤であるアスコルビン酸２５μｇ／ｍｌを培地に添加して培養した後、二つのグループ間の増殖率の増加倍数（Ｆｏｌｄ）を比較し、その結果を図１０に示した。
間葉系幹細胞の増殖が高密度培養条件で産生されるＲＯＳによって影響を受けるかどうかを確認するため、ＲＯＳ消去実験を行った。１１回継代（Ｐ１１）ないし１５回継代（Ｐ１５）で高密度培養条件及び高密度培養条件に抗酸化剤であるアスコルビン酸２５μｇ／ｍｌを培地に添加して培養した後、二つのグループ間の増殖率の増加倍数（Ｆｏｌｄ）を比較し、その結果を図１０に示した。
図１０に示すように、高密度培養条件で増加倍数がＰ１１ないしＰ１５でそれぞれ２．６、１．９、１．６であり、継代回数が増加するにつれて増殖能が低下するとともに老化が現れ始めたが、抗酸化剤を処理した場合、全継代で約５０％程度の増殖能が高く維持されることを確認した。また、抗酸化剤処理群で成長増加倍数（ｇｒｏｗｔｈ ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）は、Ｐ１１ないしＰ１５でそれぞれ３．８、２．９、２．５であり、Ｐ１５まで増殖能が高く維持された。
終点（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ）であるＰ１５で高密度培養条件単独及び高密度培養条件＋抗酸化剤処理の二つのグループ間のＲＯＳレベルを確認した結果を図１１に示した。
図１１に示すように、抗酸化剤であるアスコルビン酸を処理して増殖が増加した条件では、ＲＯＳレベルもはやり減少していることを確認した。したがって、ＭＳＣ培養は、高密度ではない低い細胞密度で行うことが好ましく、高密度細胞培養から誘導されるＲＯＳ産生を抗酸化剤で消去する場合、間葉系幹細胞の増殖能を増加させることができることを確認した。すなわち、高密度条件はＲＯＳにより間葉系幹細胞の増殖能が抑制され、細胞密度が低くなるほどＲＯＳが減少し、間葉系幹細胞増殖能が促進されることができる。
このような結果を総合してみると、層分離培養を通じて得られたモノクローナル間葉系幹細胞の増殖、培養及び幹細胞能を維持するためには、培養条件のうち、細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２以下の密度で調節することが重要であり、抗酸化剤を添加して培養する場合、細胞培養で誘発され得る酸化ストレスを抑制し、間葉系幹細胞の増殖を効果的に促進することができることを確認した。また、同様に低い細胞密度条件の培養を比較してみると、Ｐ１５と同じ１０回継代以上の幹細胞は、５回継代と同じ１０回継代未満の幹細胞と比較したとき、細胞の形態学的変化が著しくなり、幹細胞の老化促進、分化能減少のような結果が確認されるので、１０００細胞／ｃｍ２以下の密度で、１０回継代未満の低い低継代数で培養するのが最も効果的であることが確認された。
＜実施例２＞改善された層分離培養法の検証
前記実施例１を通じて、層分離培養法で収得された間葉系幹細胞培養において、細胞密度の調節、継代調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子となりうることを確認したので、韓国特許出願第１０－２００６－００７５６７６号に記載された層分離培養法の既存の工程で収得されたモノクローナル間葉系幹細胞を細胞培養密度を異にして、抗酸化剤であるアスコルビン酸が添加された培地で培地を変えながら、継代培養を行い、単一コロニーＭＳＣの増殖能及びそれに伴う細胞収得効果を比較した。
前記実施例１を通じて、層分離培養法で収得された間葉系幹細胞培養において、細胞密度の調節、継代調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子となりうることを確認したので、韓国特許出願第１０－２００６－００７５６７６号に記載された層分離培養法の既存の工程で収得されたモノクローナル間葉系幹細胞を細胞培養密度を異にして、抗酸化剤であるアスコルビン酸が添加された培地で培地を変えながら、継代培養を行い、単一コロニーＭＳＣの増殖能及びそれに伴う細胞収得効果を比較した。
以前の韓国特許出願第１０－２００６－００７５６７６号の実施例１には、図１のような層分離培養方法を通じて骨髄から間葉系幹細胞を分離し、培養する方法が開示されており、層分離段階を経て収得される単一性細胞群であるコロニーをウェル当り１００～６００の細胞数で培養容器に移し替えるという事実が開示されている。
また、韓国内特許出願第１０－２０１３－０１０６４３２号及び米国特許出願第２０１２－０１７１１６８号には、層分離培養法を用いて、骨髄由来の間葉系幹細胞を分離し、培養する方法が開示されており、コロニーを５０～１００細胞／ｃｍ２で塗抹するという事実が開示されている。
しかし、韓国特許出願第１０－２００６－００７５６７６号、第１０－２０１３－０１０６４３２号及び米国特許出願ＵＳ２０１２－０１７１１６８号には、層分離培養法によって収得された単一性細胞群コロニーを計数し、６ウェルプレートに移動させて培養する構成、すなわち、１回継代に該当するコロニー培養の条件が開示されているだけで、２回継代以後のコロニーではない個々の細胞の繰り返し培養密度の調節に対する構成及びこれによる効果は、全く開示されていない。前記出願に記載された従来の層分離培養法によれば、十分な量の膵炎の予防、治療、改善効果があるモノクローナル幹細胞を得るために少なくとも１０回継代以上の培養を行わなければならない。その反面、本発明の改善された層分離培養方法では、２回継代以後、低細胞密度条件、最大８回継代以下の少ない継代培養数により効果的に目的とする膵炎の治療に効果がある、モノクローナル幹細胞を大量に収得することができる。
具体的には、本改善方法では、層分離培養法で収得された１回継代（Ｐ１）のコロニーを培養した後、２回継代（Ｐ２）以後の継代培養では、低密度である１０００細胞／ｃｍ２以下で細胞を分注し、これを４０００細胞／ｃｍ２の細胞培養の効果と比較した。また、細胞培養培地を抗酸化剤が含まれたα－ＭＥＭ培地と抗酸化剤が既に含まれたＬＧ－ＤＭＥＭ培地を異にして、これによる細胞増殖効果を比較した。
改善された層分離培養法の効果を確認するための実験群を、次の表３に従来の層分離培養法と比べて改善された層分離培養方法の工程改善部分を図１２に模式化して示した。
図１２に示すように、１回継代を収得する工程までは、従来の層分離培養法と改善された層分離培養法が工程を同様に進めたが、改善された層分離培養法は、拡張された１回継代細胞をｓｅｅｄ ｃｅｌｌとして用いて培養する段階以後の継代培養工程が従来の層分離培養法と異なる。既存の層分離培養法は、密度の条件について認識せずに多くの細胞を収得することを目的とし、４０００細胞／ｃｍ２以上の高密度継代培養を行うが、改善された層分離培養法は、継代培養の密度を低密度である１０００細胞／ｃｍ２以下に調節することにより、２回継代以後、８回継代以下の培養だけで最終的な産物を収得することができる。２回継代後の培養工程を図１２に詳細に示した。
前記表３の細胞株は、層分離培養方法によって分離された細胞株であり、ＳＣＭ０１ないＳＣＭ０８とそれぞれ命名した。
２．１ 細胞株密度及び培地による増殖効果の確認
前記ＳＣＭ０１ないし０８細胞株を用いて培養を行い、１０回継代培養未満である５回継代までの継代培養による細胞増殖効果を、細胞数、集団倍加時間（ＰＤＴ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ）、集団倍加数（ＰＤＬ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）とそれぞれ比較し、これを図１３～図２０に示した。
前記ＳＣＭ０１ないし０８細胞株を用いて培養を行い、１０回継代培養未満である５回継代までの継代培養による細胞増殖効果を、細胞数、集団倍加時間（ＰＤＴ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ）、集団倍加数（ＰＤＬ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）とそれぞれ比較し、これを図１３～図２０に示した。
図１３～図２０にて確認されるように、ｃｍ２当たり１０００個の細胞密度で接種して培養されたすべての実験群において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞密度で接種して培養した実験群よりも優れた細胞増殖効果を示した。また、同じ１０００個の細胞密度群であっても、抗酸化剤であるアスコルビン酸が含まれたα－ＭＥＭ培地で培養された１０００ａｌｐｈａ実験群において、より顕著な細胞増殖効果が確認された。
２．２ 細胞株密度による増殖効果の比較
培養細胞数による増殖率をより正確に比較するために、培養培地をそれぞれＬＧ ＤＭＥＭ又はα－ＭＥＭ培地に固定し、ｃｍ２当たり１０００又は４０００個の細胞接種密度の継代培養による細胞増殖効果を比較し、その結果を図２１～図２４に示した。
培養細胞数による増殖率をより正確に比較するために、培養培地をそれぞれＬＧ ＤＭＥＭ又はα－ＭＥＭ培地に固定し、ｃｍ２当たり１０００又は４０００個の細胞接種密度の継代培養による細胞増殖効果を比較し、その結果を図２１～図２４に示した。
図２１に示すように、ＬＧ ＤＭＥＭで培養されたＳＣＭ０１ないしＳＣＭ０８細胞株の２回継代（Ｐ２）ないし５回継代（Ｐ５）での増殖率がｃｍ２当たり４０００個の細胞数の接種群よりも１０００個の細胞数で接種して培養したとき、著しく高いことが確認されており、５回継代（Ｐ５）で確認されたｃｍ２当たり４０００個の細胞接種に比べて１０００個の細胞接種群の増殖率は、最低３．０８ないし最大４８．５０倍であることを確認した。
また、図２２に示すように、ｃｍ２当たり１０００個の細胞接種群のＰＤＴ値もすべての細胞株において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞接種よりも低いか、或いは同じようなレベルで示され、ＰＤＬ値は、すべての細胞株において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞接種に比べて高い値が確認された。
また、図２３に示すように、α－ＭＥＭで培養されたＳＣＭ０１ないしＳＣＭ０８細胞株全部、１０００個の細胞数で接種して培養したとき、ＤＭＥＭ実験群と同じ傾向を示しており、５回継代（Ｐ５）で確認されたｃｍ２当たり４０００個の細胞株接種に比べてｃｍ２当たり１０００個の細胞接種群の増殖率は、最小６．３２ないし最大８５．６３倍であることが確認された。また、図２４に示すように、ｃｍ２当たり１０００個の細胞接種群のＰＤＴ値も全細胞株において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞接種よりも低いか、或いは同じようなレベルで示され、ＰＤＬ値は、すべての細胞株において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞接種に比べて高い値が確認された。
このような結果は、ｃｍ２当たり４０００個の高密度細胞接種培養に比べてｃｍ２当たり１０００個以下の細胞接種を通じて素早くモノクローナル間葉系幹細胞の増殖を誘導することができることを示す結果である。
２．３ 培養培地による増殖効果の比較
前で実施例２．２を通して１０００細胞／ｃｍ２培養が４０００細胞／ｃｍ２培養に比べ優れた増殖効果を示すことがあることを確認したので、細胞数を１０００個に固定し、培地を変数として変化させながら、細胞増殖効果を比較することにより、培養培地条件による増殖効果をさらに検証し、その結果を図２５及び図２６に示した。
前で実施例２．２を通して１０００細胞／ｃｍ２培養が４０００細胞／ｃｍ２培養に比べ優れた増殖効果を示すことがあることを確認したので、細胞数を１０００個に固定し、培地を変数として変化させながら、細胞増殖効果を比較することにより、培養培地条件による増殖効果をさらに検証し、その結果を図２５及び図２６に示した。
図２５に示すように、培養培地をα－ＭＥＭ及びＤＭＥＭに変えながら、細胞増殖率を比較した結果、ＬＧ－ＤＭＥＭに比べてα－ＭＥＭ培地を用いた実験群で最小１．７７倍～６．３９倍の高い細胞増殖率を確認した。また、図２６に示すように、ＰＤＴは、すべてのα－ＭＥＭ実験群で低く示され、ＰＤＬは増加したことが確認された。
このような実験結果は、細胞接種密度をｃｍ２当たり１０００個以下の細胞で調節し、２回継代（Ｐ２）ないし５回継代(５Ｐ)のような１０回継代未満の低継代で培養することに加え、抗酸化剤が添加された培地を用いて培養した場合、細胞の増殖効率を最大化とすることができることが示される。
＜実施例３＞ 改善工程の樹立
前記実施例を通して間葉系幹細胞培養において、細胞密度の調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子となり得ることを確認したので、韓国特許出願第１０－２００６－００７５６７６号及び同第１０－２００７－００５３２９８号に記載された層分離培養法の既存の工程に加えて、継代培養時、細胞培養密度及び培地条件を異にし、単一コロニーの間葉系幹細胞を、１０回継代未満の低い継代で効果的に収得することができる改善された過程を確立し、これを総合的に下記の表４（ＤＭＥＭ培地を用いた培養条件）及び表５（α－ＭＥＭ培地を用いた培養条件）に示した。
前記実施例を通して間葉系幹細胞培養において、細胞密度の調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子となり得ることを確認したので、韓国特許出願第１０－２００６－００７５６７６号及び同第１０－２００７－００５３２９８号に記載された層分離培養法の既存の工程に加えて、継代培養時、細胞培養密度及び培地条件を異にし、単一コロニーの間葉系幹細胞を、１０回継代未満の低い継代で効果的に収得することができる改善された過程を確立し、これを総合的に下記の表４（ＤＭＥＭ培地を用いた培養条件）及び表５（α－ＭＥＭ培地を用いた培養条件）に示した。
より具体的には、本発明の骨髄由来の間葉系幹細胞の層分離培養工程及び増殖培養を次のように行った。
骨髄ドナーの臀部に局所麻酔薬で麻酔した後、臀部の骨に注射針を刺し、骨髄を採取した。１００ｍｍ培養容器に２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む１４ｍｌ ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ｀ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ｀ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）、ヒトの骨髄１ｍｌを入れ、３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で２時間培養した。培養後、培養容器を片方に軽く傾け、底に張り付いている細胞がなるべく浮き上がらないように最大限に培養容器の上層培養液のみ新しい容器に移し替えた。
同様の過程をもう一度繰り返した後、収得した培養液を底に膠原質（ｃｏｌｌａｇｅｎ）がコーティングされた培養容器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し替えた後、３７℃で２時間培養した。培養液を再び新しい膠原質がコーティングされた容器に移し替え、２４時間後再び新しい容器に移し替え、２４時間後にまた新たな容器に移し替えた。最後に、４８時間後、新しい容器に移し替えた後、残存する細胞が培養容器の底に張り付いて育っていることを目視で確認した。前の数々の層分離段階を経て、この段階まで辿り着くことができる細胞は、細胞の割合が他の細胞よりもはるかに小さい細胞であることを推測することができる。
約１０～１４日間の時間が経過すると、細胞が単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ）を形成するが、このモノクローナル細胞群をトリプシンを処理して分離した後、６－ウェル培養容器に移し替えた。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で４～５日培養した後、約８０％育ったときに、細胞を０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ）を処理して収得した後、Ｔ１７５培養容器に移し替え、低細胞密度で継代培養した。
このように、１０回継代未満、好ましくは８回継代以下の２回継代（Ｐ２）ないし５回継代（Ｐ５）で細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２のレベルに下げて培養する場合、他の工程はすべて同じように調節したにもかかわらず、間葉系幹細胞の増殖能及び幹細胞の特性が優秀に維持され、同じ継代でも増殖を効果的に誘導されることを確認した。特に細胞密度を下げて培養する場合、既存の工程で必要とされていた間葉系幹細胞でＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）の製造過程を省略することができ、細胞の製造期間を効果的に短縮することができる。特に継代を少なくすると、老化が比較的ゆっくり進んだ細胞を大量に収得することができ、このような細胞を治療剤として用いる場合、治療効果に優れるものと期待することができる。
また、培養培地として抗酸化剤が添加されたα－ＭＥＭを用いる場合、高密度の細胞培養で誘導されるＲＯＳストレスが抗酸化剤処理によって効果的に改善され、間葉系幹細胞の細胞増殖能が回復することができ、従来の工程に比べて細胞の継代を大幅に短縮させ、間葉系幹細胞の特性を維持する老化が進んでいない新鮮な状態の単一コロニー間葉系幹細胞を迅速かつ安定的に収得することができるという特徴がある。
前記のような内容を総合してみると、低密度細胞培養は、短時間に多くの細胞を得ることができ、製造工程は簡素化するだけでなく、長期間培養（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ）でも、間葉系幹細胞の特性を完全に維持する老化していない状態の細胞を収得することができるので、良質の幹細胞の産生を可能にすることを確認した。
これにより、以下、膵炎の治療のための実験において、前記実施例を通じて構築した改善方法により収得される幹細胞を用いた。
＜実施例４＞改善された層分離培養法により収得された幹細胞の膵炎治療効果確認
４．１ ｃＭＳＣ１、ｃＭＳＣ２の用意
実施例３の改善された層分離培養法に従って継代培養時、細胞培養密度を１０００細胞／ｃｍ２以下とし、抗酸化剤を含むａ－ＭＥＭ培地を用いて３回継代し、モノクローナル中間葉系幹細胞を収得した。抗生物質としては、ゲンタマイシンが追加され、α－ＭＥＭ培養液で行った（表５参照）。以下、１０００細胞／ｃｍ２以下の低密度及び抗酸化条件の改善された層分離培養法により収得された幹細胞を「ｃＭＳＣ１」と命名した。また、改善された層分離培養法により収得された幹細胞と効果を比較するために継代培養時、４０００細胞／ｃｍ２以上の密度及び抗酸化剤未添加条件の培養方法で培養する従来の層分離培養法により収得し、３回継代培養された幹細胞を「ｃＭＳＣ２」と命名した。
４．１ ｃＭＳＣ１、ｃＭＳＣ２の用意
実施例３の改善された層分離培養法に従って継代培養時、細胞培養密度を１０００細胞／ｃｍ２以下とし、抗酸化剤を含むａ－ＭＥＭ培地を用いて３回継代し、モノクローナル中間葉系幹細胞を収得した。抗生物質としては、ゲンタマイシンが追加され、α－ＭＥＭ培養液で行った（表５参照）。以下、１０００細胞／ｃｍ２以下の低密度及び抗酸化条件の改善された層分離培養法により収得された幹細胞を「ｃＭＳＣ１」と命名した。また、改善された層分離培養法により収得された幹細胞と効果を比較するために継代培養時、４０００細胞／ｃｍ２以上の密度及び抗酸化剤未添加条件の培養方法で培養する従来の層分離培養法により収得し、３回継代培養された幹細胞を「ｃＭＳＣ２」と命名した。
４．２ ｃＭＳＣ１投与による急性膵炎の治療効果の確認
４．２．１ 急性膵炎の動物モデルの構築及び実験方法
ｃＭＳＣ１投与による急性膵炎の治療効果を確認するために、急性膵炎の動物モデルを下記の表６のように設定した。実験に用いられたマウスは、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）ラット（（株）コアテック）で購入して用いており、各グループ別に５週齢の雄ラット１５匹、計６０匹を以下の実験に用いた。
４．２．１ 急性膵炎の動物モデルの構築及び実験方法
ｃＭＳＣ１投与による急性膵炎の治療効果を確認するために、急性膵炎の動物モデルを下記の表６のように設定した。実験に用いられたマウスは、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）ラット（（株）コアテック）で購入して用いており、各グループ別に５週齢の雄ラット１５匹、計６０匹を以下の実験に用いた。
急性膵炎の動物モデルを構築するために、術前、ｃｌｉｐｐｅｒを利用して、動物腹部の剃毛を行った。Ｚｏｌｅｔｉｌ ５０（ＶＩＲＢＡＣ、Ｆｒａｎｃｅ）及びｘｙｌａｚｉｎｅ（Ｒｏｍｐｕｎ(R)ＢａｙｅｒＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて麻酔を行い、必要時、麻酔を追加で行った。ポビドン及び７０％のアルコールを用いて切開部位を広く消毒した後、腹部正中切開を行った。十二指腸を露出さた後、急性膵炎誘発物質である３％タウロコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ）を１ｍＬ／ｋｇの投与液量で膵臓管内に投与して急性膵炎を誘導した。
動物モデルにおいて膵炎を誘導してから４時間後、ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２を２ｘ１０６ｃｅｌｌｓを尾静脈を通じて単回２００ｕｌ投与し、７２時間後に血液及び臓器を摘出して分析を行った。図２７に本発明に係る急性膵炎の動物モデル構築の模式図を示した。
４．２．２ ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２処理による膵臓細胞の生存率の確認
実施例４．２．１にて作製した急性膵炎の動物モデルから注入した細胞の生存率を確認した。ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２を下記表７に示した細胞安定化剤と共に同じ投与量で尾静脈を通じて投与した。
実施例４．２．１にて作製した急性膵炎の動物モデルから注入した細胞の生存率を確認した。ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２を下記表７に示した細胞安定化剤と共に同じ投与量で尾静脈を通じて投与した。
前記表７にて確認されるように、試験物質であるｃＭＳＣ１とｃＭＳＣ２の注入時、生存率を測定した結果、それぞれ９１％、８７．７％であり、すべて８５％以上の生存率を確認し、特にｃＭＳＣ１投与群は、９０％以上の生存率を示し、膵臓細胞保護効果がより卓越していることを確認した。
４．２．３ ｃＭＳＣ１処理による血液生化学的効果
急性膵炎が誘導された実施例４．２．１のラットにおいて、ｃＭＳＣ処理による血液生化学的効果を確認するために、膵炎標識マーカーレベルを確認した。具体的には試験終了時点であるｃＭＳＣ１又はｃＭＳＣ２投与７２時間後、２つの酵素アルファ－アミラーゼ（ａ－ａｍｙｌａｓｅ）及びリパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）を血液生化学的分析（７１８０ Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｊａｐａｎ）を用いて測定し、結果を図２８に示した。
急性膵炎が誘導された実施例４．２．１のラットにおいて、ｃＭＳＣ処理による血液生化学的効果を確認するために、膵炎標識マーカーレベルを確認した。具体的には試験終了時点であるｃＭＳＣ１又はｃＭＳＣ２投与７２時間後、２つの酵素アルファ－アミラーゼ（ａ－ａｍｙｌａｓｅ）及びリパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）を血液生化学的分析（７１８０ Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｊａｐａｎ）を用いて測定し、結果を図２８に示した。
図２８に示すように、ｃＭＳＣ１、２投与後７２時間目に急性膵炎（ＳＡＰ）モデルでのアルファ－アミラーゼ及びリパーゼレベルは、対照群に比べて有意に高いことを確認した。ｃＭＳＣ２投与群は、ＳＡＰモデルに比べてアルファ－アミラーゼレベルでは効果を示さなかったが、リパーゼ増加は、約１３％抑制することを確認した。一方、改善された層分離培養法により収得されたｃＭＳＣ１群では、ＳＡＰ群に比べ５１％のアミラーゼレベルの減少を確認し、リパーゼもやはり６４％の有意なレベルの減少を示した。
すなわち、ｃＭＳＣ１を注入すれば、膵炎標識マーカーであるアルファ－アミラーゼとリパーゼがいずれも有意に約５１～６４％減少することが確認され、これらの結果は、ｃＭＳＣ１が血清中のアルファ－アミラーゼとリパーゼ活性を非常に顕著に減少させることができることを示している。
４．２．４ ｃＭＳＣ１処理によるミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＭＰＯ）の確認
ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＭＰＯ）は、好中性顆粒（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）に豊富に発現される酵素であり、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）又は急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）の予測因子として用いられ、炎症の程度を示す標識である。本発明のｃＭＳＣ１処理によって膵臓組織内の好中球浸潤の程度及び炎症の程度が改善されるか否かを確認するために、ミエロペルオキシダーゼ（１５０ｋＤａ）をＭｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＳＴＡ－８０３、Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、メーカーの方法に沿って測定し、その結果を図２９に示した。
ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＭＰＯ）は、好中性顆粒（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）に豊富に発現される酵素であり、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）又は急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）の予測因子として用いられ、炎症の程度を示す標識である。本発明のｃＭＳＣ１処理によって膵臓組織内の好中球浸潤の程度及び炎症の程度が改善されるか否かを確認するために、ミエロペルオキシダーゼ（１５０ｋＤａ）をＭｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＳＴＡ－８０３、Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、メーカーの方法に沿って測定し、その結果を図２９に示した。
図２９に示すように、急性膵炎を誘導したグループにおいて、対照群よりも約１２倍程、ミエロペルオキシダーゼ活性が増加されたが、改善された層分離培養法によって収得されたｃＭＳＣ１処理群では、有意に６５％以上減少することを確認した。このような結果は、ｃＭＳＣ１が従来工程における細胞株のグループｃＭＳＣ２が８％減少した効果と比較して統計学的に有意な著しい好中球が減少した効果を示すことを示す結果である。
４．２．５ ｃＭＳＣ１処理による炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインの分析
急性膵炎の動物モデルである実施例４．２．１のラットにおいて、ｃＭＳＣ処理によって炎症性因子の変化が誘導されるか否かを確認するために、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０の発現変化を下記表８の分析ツールを用いて、メーカーの方法に沿って測定しており、その結果を図３０に示した。
急性膵炎の動物モデルである実施例４．２．１のラットにおいて、ｃＭＳＣ処理によって炎症性因子の変化が誘導されるか否かを確認するために、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０の発現変化を下記表８の分析ツールを用いて、メーカーの方法に沿って測定しており、その結果を図３０に示した。
図３０に示すように、急性膵炎の動物モデル（ＳＡＰ）は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γのレベルが対照群に比べて著しくに増加したが、ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２処理群では、対照群に比べて発現レベルが画然と減少したことを確認した。特にｃＭＳＣ１処理群は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γでそれぞれ４９％、４２％、６１％の対照群に比べて減少効果を示し、著しく優れた炎症性サイトカインの抑制効果が確認された。また、抗炎症サイトカインであるＩＬ－１０は、対照群に比べてｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２処理群の両方で増加し、特にｃＭＣＳ１のＩＬ－１０レベルは、対照群に比べて６９％増加しており、ｃＭＳＣ処理によって抗炎症サイトカイン発現の増加が誘導されることを確認した。
４．２．５ ｃＭＳＣ１処理による組織病理学的分析
実施例４．２．１の急性膵炎の動物モデルの臓器を摘出し、ｃＭＳＣ１処理による浮腫病変の変化を確認するために、組織病理学的分析を行った。具体的には、試験物質投与後７２時間目に採血してから動物を安楽死させた後、膵臓を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。固定された組織を用いて、トリミング、脱水、パラフィン包埋及び薄切などの一般的な組織処理を施し、組織病理学的検査のための検体を作製した。Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３、Ｊａｐａｎ）を用いて、組織病理学的変化を観察した。組織病理学的評価は、Ｓｃｈｍｉｄｔ’ｓ ｓｃｏｒｅ（Ａ ｂｅｔｔｅｒ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｊ ｅｔ ａｌ、１９９２）を用いて点数化した。その結果を図３１及び図３２に示した。
実施例４．２．１の急性膵炎の動物モデルの臓器を摘出し、ｃＭＳＣ１処理による浮腫病変の変化を確認するために、組織病理学的分析を行った。具体的には、試験物質投与後７２時間目に採血してから動物を安楽死させた後、膵臓を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。固定された組織を用いて、トリミング、脱水、パラフィン包埋及び薄切などの一般的な組織処理を施し、組織病理学的検査のための検体を作製した。Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３、Ｊａｐａｎ）を用いて、組織病理学的変化を観察した。組織病理学的評価は、Ｓｃｈｍｉｄｔ’ｓ ｓｃｏｒｅ（Ａ ｂｅｔｔｅｒ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｊ ｅｔ ａｌ、１９９２）を用いて点数化した。その結果を図３１及び図３２に示した。
図３１に示すように、顕微鏡下で対照群に比べ、ＳＡＰで炎症所見が確認されており、ｃＭＳＣ１処理群で炎症の程度が最も改善されていることを確認した。
図３２に示すように、急性膵炎の動物モデルでは、組織病理学スコア、浮腫、壊死、出血、炎症浸潤スコアがすべて対照群に比べて急激に増加しており、このような急激な増加は、すべてｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２処理によって緩和される傾向を確認した。特にｃＭＳＣ１処理群は、対照群に比べてすべての評価指標において約２７～３５％の減少効果が示され、ｃＭＳＣ２処理群に比べて約２倍の効果を示すことを確認した。
総合的には、改善された層分離培養法によって収得されたｃＭＳＣ１の場合、急性膵炎において膵臓の細胞生存率を増加させ、血液生化学的、組織病理学的病変をいずれも効果的に改善させることができるので、急性膵炎の治療に優れた効果を示すことができることを確認した。また、このようｃＭＳＣ１の急性膵炎の治療に対する効果は、従来の層分離培養法によって収得され、高密度継代培養されたｃＭＳＣ２と比較しても大幅に優れていることを確認した。
＜実施例５＞改善された層分離培養法によって収得された幹細胞の特性比較
５．１ ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２細胞の特性比較
実施例４にて改善された層分離培養法によって収得された幹細胞ｃＭＳＣ１が従来の層分離培養法で収得されたｃＭＳＣ２と比較して著しく優れた急性膵炎の治療効果を示すことを確認したので、これらの細胞の特性を比較するための実験を行った。
５．１ ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２細胞の特性比較
実施例４にて改善された層分離培養法によって収得された幹細胞ｃＭＳＣ１が従来の層分離培養法で収得されたｃＭＳＣ２と比較して著しく優れた急性膵炎の治療効果を示すことを確認したので、これらの細胞の特性を比較するための実験を行った。
実施例４．１の方法と同じ方法でｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２を収得しており、これらを培養し、細胞の大きさを確認した。
実験に用いた細胞と方法を下記表９に示した。
ｃＭＳＣ１とｃＭＳＣ２の細胞の大きさの差異を検証するために、Ｎｕｃｌｅｏ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２５０機器を用いて、細胞の大きさを確認し、その結果を図３３及び表１０に示した。
表１０及び図３３に示すように、２つの細胞は大きさが異なることを確認しており、機器を介してセル径の標準偏差を確認した結果、改善された層分離培養法によって収得されたｃＭＳＣ１がｃＭＳＣ２より偏差が小さいことを確認した。
さらにフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて、前方散乱光／側方散乱光（ＦＳＣ／ＳＳＣ）値を同一に指定したとき、フローサイトメトリーでも、細胞の大きさに差異があるかどうかを確認し、その結果を図３４に示した。
図３４に示すように、ｃＭＳＣ２は、細胞の大きさが大きくなり、細胞が全体的に広く分布しているのに対し、ｃＭＳＣ１は、細胞の大きさが小さく、それにより側方散乱光（ＳＳＣ）５０Ｋ内に分布されることを確認した。
前記のように、ｃＭＳＣ１が細胞の大きさがより小さく、均質に形成されることにより間葉系幹細胞が培養されると同時に分泌されるサイトカインの量が変化され、ｃＭＳＣ１が急性膵炎の治療効果がさらに強化されることが確認された。
５．２ ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果確認
急性膵炎に対して異なる効果を示すｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２を培養した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験を行い、細胞別の活性を比較した。まず、活性化されたＴ細胞の抑制率を混合リンパ球反応（Ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＭＬＲ）条件で確認した。実験方法は、次の通りである。二人の異なるｄｏｎｏｒのＰＢＭＣを、互いに混ぜ合わせることで、抗原によるＴ細胞の活性を誘導した後（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＭＬＲ）、ｃＭＳＣ１又はｃＭＳＣ２をそれぞれ入れてあげ、Ｔ細胞の活性が抑制されるか否かを確認した。それぞれのＤｙｅ（ＣＦＳＥとｅＦｌｕｏｒ６７０）で染色された者のＰＢＭＣとｃＭＳＣ１又はｃＭＳＣ２を４：１の割合でそれぞれ共培養した後、８日間培養し、分析はＦＡＣＳ ｖｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器を用いるフローサイトメトリー法で測定した。その結果を図３５に示した。
急性膵炎に対して異なる効果を示すｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２を培養した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験を行い、細胞別の活性を比較した。まず、活性化されたＴ細胞の抑制率を混合リンパ球反応（Ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＭＬＲ）条件で確認した。実験方法は、次の通りである。二人の異なるｄｏｎｏｒのＰＢＭＣを、互いに混ぜ合わせることで、抗原によるＴ細胞の活性を誘導した後（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＭＬＲ）、ｃＭＳＣ１又はｃＭＳＣ２をそれぞれ入れてあげ、Ｔ細胞の活性が抑制されるか否かを確認した。それぞれのＤｙｅ（ＣＦＳＥとｅＦｌｕｏｒ６７０）で染色された者のＰＢＭＣとｃＭＳＣ１又はｃＭＳＣ２を４：１の割合でそれぞれ共培養した後、８日間培養し、分析はＦＡＣＳ ｖｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器を用いるフローサイトメトリー法で測定した。その結果を図３５に示した。
図３５に示すように、活性化されたＴ細胞の抑制率を混合リンパ球反応条件で確認した結果、２つの細胞共にＴ ｃｅｌｌ：ｃＭＳＣ＝１：４の条件で５０％以上の抑制率を示したが、改善された工程の細胞株（ｃＭＳＣ１）は、７９％、前工程の細胞株（ＭＳＣ２）は、５３％抑制率で約２６％の差異が確認された。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２を培養し、各細胞株の培養液において、ＴＧＦ－β１、ｓＴＮＦ－Ｒ１（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、及び免疫関連マーカーＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）の発現量を比較し、その結果を図３６及び図３７に示した。
図３６に示すように、二つの細胞株を培養した培養液において、ＴＧＦ－β１とｓＴＮＦ－Ｒ１の分泌量を確認した結果、ＴＧＦ－β１は、２つの細胞株間大きな差異が表れなかったが、ｓＴＮＦ－Ｒ１は、改善された工程の細胞株であるｃＭＳＣ１において、２８ｐｇ／ｍｌ高く分泌されることが確認された。
また、図３７に示すように、何ら刺激を与えていない状態のＷＩ３８（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を基準に、ＩＤＯ、ＩＣＯＳＬの発現量を比較した結果、改善された工程の細胞株であるｃＭＳＣ１で二つの遺伝子発現量が約２倍高いことを確認した。
さらにＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激条件で共培養した後、培養液に炎症性サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７）及び抗炎症性（ＩＬ－１０）サイトカインの変化を確認した。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、ＩＬ－１０の分泌量を確認するために、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度のＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ）を２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに塗抹し、１ｕｇ／ｍｌ ＰＨＡで炎症反応を誘導した。具体的には、前記ＰＨＡ処理の有無及びｃＭＳＣ処理の有無を異にして、各実験群にてＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、ＩＬ－１０の濃度を測定し、その結果を図３８に示した。
図３８に示すように、改善された工程の細胞株ｃＭＳＣ１と共培養した結果、ＰＨＡ刺激条件に比べてＩＦＮ－γは７４．３％、ＩＬ－１７は８２．２％抑制されることが確認され、既存の工程によって収得された細胞株ｃＭＳＣ２では、ＩＦＮ－γが５５．４％、ＩＬ－１７が６５．８％抑制されることが確認された。すなわち、２つの細胞株間の炎症性サイトカインの抑制率は、約２０％程度差があることを確認し、同一の条件で、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の分泌量を確認した結果、改善された工程の細胞株ｃＭＳＣ１ではＩＬ－１０が約２５％増加したのに対し、前工程の細胞株ｃＭＳＣ２では７％の増加が確認されており、ｃＭＳＣ１がｃＭＳＣ２よりも約３倍以上、抗炎症性サイトカインの分泌をさらに増加させることが確認された。
前記のような結果を総合してみると、改善された工程により収得したｃＭＳＣ１を用いれば、急性膵炎により増加される消化酵素の増加と炎症関連酵素の増加を効果的に減少させることができることを確認することができる。また、炎症性サイトカインの分泌を減少させ、抗炎症サイトカインの分泌をさらに著しく増加させることを確認することができ、膵臓の組織学的分析を通じても有意な結果を確認することができた。特に、本発明によるｃＭＳＣ１は、増殖能及び幹細胞の特性が優秀に維持され、増殖が効果的に維持されるのみならず、ｃＭＳＣ１は、前工程で獲得した細胞株ｃＭＳＣ２と比較したとき、免疫調節能力、免疫関連遺伝子の発現、炎症及び抗炎症性サイトカインの分泌において、より優れていることを確認することができた。したがって、改善された工程で獲得された細胞は、前工程で獲得された細胞に比べ、より優れた膵炎の予防、治療が可能であることを知ることができる。
Claims (15)
- １）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階と、
２）前記第１容器の上澄み液のみ新しい容器に移し替えて培養する段階と、
３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階と、
４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階と、
５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階と、を通じて収得されるモノクローナル幹細胞を含む、膵炎の予防又は治療用薬学的組成物。 - 前記５）段階の培養は、１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して行われることを特徴とする請求項１に記載の膵炎の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記５）段階の培養は、２回継代～８回継代で培養するものであることを特徴とする請求項１に記載の膵炎の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記５）段階の培地は、抗酸化剤が追加された培地であることを特徴とする請求項１に記載の膵炎の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記膵炎は、慢性膵炎又は急性膵炎であることを特徴とする請求項１に記載の膵炎の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記モノクローナル幹細胞は、膵臓細胞の生存率を増進させることを特徴とする請求項１に記載の膵炎の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記モノクローナル幹細胞は、アルファ－アミラーゼ又はリパーゼ活性の減少、ミエロペルオキシダーゼ活性の減少、好中球浸潤及び炎症の改善、炎症性サイトカイン分泌の減少及び抗炎症性サイトカイン分泌の増大からなる群から選択された１種以上の活性を示すことを特徴とする請求項１に記載の膵炎の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記モノクローナル幹細胞は、浮腫、壊死、出血、及び炎症浸潤からなる群から選択された１種以上の膵炎病理学的状態を改善させることを特徴とする請求項１に記載の膵炎の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記モノクローナル幹細胞は、ＴＧＦ－β１分泌能、ｓＴＮＦ－Ｒ１（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）分泌能、ＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）発現能及びＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ－ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）発現能からなる群から選択された１種以上の能力が増大されたモノクローナル幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の膵炎の予防又は治療用薬学的組成物。
- １）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階と、
２）前記第１容器の上澄み液のみ新しい容器に移し替えて培養する段階と、
３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階と、
４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返し、モノクローナル幹細胞を得る段階と、
５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階と、を通じてモノクロナール幹細胞を収得する段階を含む、膵炎の予防、改善又は治療用組成物の製造方法。 - 前記５）段階の培養は、１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して行われることを特徴とする請求項１０に記載の膵炎の予防、改善又は治療用組成物の製造方法。
- 前記５）段階の培養は、２回継代～８回継代で培養するものであることを特徴とする請求項１０に記載の膵炎の予防、改善又は治療用組成物の製造方法。
- 前記５）段階の培地は、抗酸化剤が追加された培地であることを特徴とする、請求項１０記載の膵炎の予防、改善又は治療用組成物の製造方法。
- １）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階と、
２）前記第１容器の上澄み液のみ新しい容器に移し替えて培養する段階と、
３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階と、
４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返し、モノクローナル幹細胞を得る段階と、
５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階と、を通じて収得される膵炎の予防、改善又は治療用幹細胞。 - １）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階と、
２）前記第１容器の上澄み液のみ新しい容器に移し替えて培養する段階と、
３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階と、
４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返し、モノクローナル幹細胞を得る段階と、
５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階と、を通じてモノクローナル幹細胞を収得する段階と、
６）前記モノクローナル幹細胞を個体に投与する段階とを含む、膵炎の予防又は治療方法。
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