KR20160002490A

KR20160002490A - 줄기세포 증식 향상 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법

Info

Publication number: KR20160002490A
Application number: KR1020140080831A
Authority: KR
Inventors: 장재덕; 서선희
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2016-01-08
Also published as: KR101753557B1

Abstract

본 발명은 줄기세포 배양용 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 머캅토에탄올을 함유하는 항산화제 첨가물을 줄기세포 배양 시 첨가하여 고가의 성장인자 없이도 줄기세포의 증식을 촉진하고, 고가의 저산소분압배양기 없이도 산화 스트레스를 극복하여 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있다.

Description

줄기세포 증식 향상 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법{Culture medium composition for promoting stem cell proliferation and methods for culturing stem cell}

본 발명은 미분화 중간엽 줄기세포 증식능을 향상시키기 위한 머캅토에탄올을 함유하는 항산화제 혼합물이 첨가된 배지 조성물 및 상기 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.

세포치료제(Cell Therapy Product)는 세포의 조직과 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 환자 자신(autologus)이나 타인(allogenic) 또는 다른 동물(xenogenic)의 체세포를 채취하여 증식시키거나 줄기세포를 증식시킨 후 원하는 세포로 분화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미하며, 적용범위가 넓고, 화상이나 암, 치매 등 각종 난치성 질환의 치료에 무한한 가능성을 가진 새로운 치료방법으로 최근 집중적으로 조명을 받아 왔다.

줄기세포는 아직 분화가 덜 되어 다른 세포로 될 수 있는 세포를 말하며 미분화 상태에서 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 자가재생산 능력과 적절한 조건에서 배양되면 특정한 세포로 분화하는 능력이 있다. 세포치료제로 연구개발중인 세포는 매우 다양한 종류가 있으며 그 세포의 분화적 위치에 따라 전분화능 줄기세포(배아줄기세포, 유도만능줄기세포 등), 다분화능 줄기세포 혹은 성체줄기세포(골수/지방 유래 줄기세포, 제대혈/탯줄 줄기세포, 태아 줄기세포 등), 그리고 체세포 등으로 구분될 수 있다. 사람 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점이 있으며 그 외에도 전분화능 줄기세포의 분화조절기술이 아직 완전하지 못하여 세포치료제로 개발되기까지에는 많은 시간이 더 소요될 것으로 알려져 있다. 체세포를 이용한 세포치료제의 연구개발이 많은 결실을 보여주긴 하였으나 체세포가 태생적으로 가지고 있는 낮은 증식성과 원료조직 확보의 어려움 등이 있어 이를 극복하기 위한 대안으로 성체 줄기세포의 연구 및 세포치료제로의 연구개발에 많은 관심이 집중되어 왔다.

성체 줄기세포 중에서도 중간엽 줄기세포는 체세포에 비해 증식능이 우수하며 뼈, 연골, 지방 등으로 분화할 수 있는 다분화성 줄기세포로서 배아줄기세포 등의 만능줄기세포에 비해 훨씬 유전적으로 안정화되어 있어 발암성의 가능성이 매우 낮다는 장점을 바탕으로 연골재생, 심근경색 치료, 이식편대숙주질환의 치료 등을 위한 세포치료제로 개발되어 왔다. 중간엽 줄기세포가 체세포에 비해 높은 자가재생산 능력을 보이는 것은 사실이나 신체 내에 있을 때와는 달리 체외배양조건에서는 세포의 증식성을 유지하기 위한 최선의 조건을 구비하여야 하며 생체의 조건에 가까운 영양분, pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 맞추어 주어야 한다. 또한 체외배양에서 세포의 대사과정에 의해 자연적으로 발생하는 활성산소 등과 같은 유해물질은 세포에 산화 스트레스를 부과하여 세포의 수명을 단축하고 증식능을 떨어뜨리므로 활성산소와 같은 유해 라디칼을 감소시키는 노력이 필요하다.

중간엽 줄기세포의 체외증식향상을 위한 종래기술로는 미분화 중간엽 줄기세포의 증식능을 향상시키기 위하여 배지 내 아미노산, 무기염류, 비타민류 등 일부 영양물질 농도를 조절하는 기술(대한민국 등록특허 제1138091호), 천연약제 추출물을 사용하는 기술(대한민국 등록특허 제1168994호), 인슐린, 하이드로코르티존, EGF 및 LIF 등의 성장인자를 사용하는 기술(대한민국 등록특허 제0908481호)등이 개발되었으며 어느 정도 중간엽 줄기세포의 체외 증식향상에 기여할 수 있으나 세포의 증식과정에서 수반되는 활성산소와 같은 산화물질을 효과적으로 차단하는 성분에 대한 기술은 아니므로 활성산소 축적에 의한 세포의 조기노화를 방지하기 어려워 여러 번의 계대 배양에 걸친 대량 배양이 어려울 수 있다는 단점이 여전히 존재한다. 또한 최종적으로 인체에 적용될 세포치료제의 주성분으로 사용될 중간엽 줄기세포를 제조하기 위한 공정에 사용되므로 증식용 배지에 포함되는 물질들은 일관적인 품질의 물질이어야 하고 충분한 안전성과 수급용이성이 보장되어야 한다. 따라서 천연약제추출물은 순수물질이 아니어서 품질의 일관성이나 수급이 보장되기 어렵고 EGF나 LIF와 같은 성장인자는 매우 고가이므로 세포의 대량생산에 지속적으로 사용하기는 현 기술 수준으로는 어렵다고 할 수 있다.

또한, 중간엽 줄기세포의 증식과정에서 발생하는 산화 스트레스 해소를 지향하는 종래기술로 폴리에틸렌글리콜-부착된 카탈라제(PEG-catalase) 또는 N-아세틸 시스테인(acetyl cysteine)를 이용하는 기술(대한민국 공개특허 제2013-0057682호), 항산화제인 셀레늄을 이용하는 기술(대한민국 공개특허 제2013-0003159호), 그리고 저산소분압을 이용하는 기술(대한민국 공개특허 제2012-0109671호) 등이 개발되어 있다. 그러나, 대한민국 공개특허 제2013-0057682호의 경우는 특별히 제조된 물질을 사용해야 하는 부담과 세포에 미치는 불확실한 영향 등이 우려되며, 대한민국 공개특허 제2013-0003159호에 개시된 셀레늄은 이미 기존 상용배지에서 사용하는 배지첨가물인 ITS(인슐린/트랜스페린/셀레늄)에서 알려진 물질이며 저혈청배지 혹은 무혈청배지에서 많이 사용하는 것으로 알려져 있다. 대한민국 공개특허 제2012-010967호에 개시된 저산소분압을 이용한 배양기술은 저산소분압을 유지할 수 있는 부가적인 장치를 장착한 고가의 세포배양기를 사용해야 하고 배양기의 문을 개폐할 때마다 변화되는 산소분압까지 조절하기 위해서는 높은 비용의 시설 및 설비 부담이 있다고 할 수 있다.

따라서, 산화 스트레스를 최소화하면서도 중간엽 줄기세포의 증식능을 높일 수 있는 새로운 기술이 요구된다.

대한민국 공개특허 제2014-0000945호 (2014.01.06) 미국 등록특허 제7,109,032호 (2006.09.19)

본 발명의 목적은 저산소분압 배양기와 같은 고가 장비를 사용하지 않으면서 체외배양 시 중간엽 줄기세포가 겪게 되는 산화 스트레스 등에 의한 증식저해현상을 해소하고, 고가의 성장인자를 사용하지 않으면서 중간엽 줄기세포로서의 특성을 그대로 유지한 채로 중간엽 줄기세포 증식 배양을 도모할 수 있는 최적의 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 기본배지에 대하여, 10 내지 50μM의 머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol); 4.5 내지 6.5μM의 아스코르브산, 4 내지 6μM의 아스코르브산 2-인산, 0.8 내지 1.2mM의 피루브산 나트륨 및 8 내지 12μM의 알파-키토글루타르산의 제1혼합물; 및 8 내지 12㎍/mL의 인슐린, 4.5 내지 6.5㎍/mL의 트랜스페린, 4 내지 6㎍/mL의 셀레늄, 3.76 내지 5.64㎍/mL의 리놀레산 및 0.4 내지 0.6㎍/mL의 우혈청 알부민의 제2혼합물이 포함된 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 줄기세포 배양용 배지 조성물은 기본배지에 대하여, 20μM의 머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol); 5.5μM의 아스코르브산, 5μM의 아스코르브산 2-인산, 1mM의 피루브산 나트륨 및 10μM의 알파-키토글루타르산의 제1혼합물; 및 10㎍/mL의 인슐린, 5.5㎍/mL의 트랜스페린, 5㎍/mL의 셀레늄, 4.7㎍/mL의 리놀레산 및 0.5㎍/mL의 우혈청 알부민의 제2혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명은 고효율 세포증식을 위하여 세포분열촉진을 위한 섬유아세포성장인자, 상피세포성장인자 등의 고가의 성장인자들을 사용하지 않고, 저산소분압 배양기와 같은 고가의 장비를 사용하지 않으면서도 머캅토에탄올 등 획득이 용이한 성분들을 배지에 첨가하여 중간엽 줄기세포의 증식율을 개선할 수 있다. 이로써, 단기간 내에 세포치료제 연구 및 제조에 필요한 충분한 수의 줄기세포를 얻을 수 있다.

도 1은 항산화 배지 첨가물 조성에 따른 세포증식효과를 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 항산화 배지 첨가물이 부가된 F06 배지에서 초대배양(P0) 시 골수 유래 중간엽 줄기세포의 증식비를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 항산화 배지 첨가물이 부가된 F06 배지에서 골수 유래 중간엽 줄기세포 증식 배수를 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 항산화 배지 첨가물이 부가된 F06 배지에서 증식 배양된 세포의 중간엽 줄기세포 다분화능을 검사한 결과이다.
도 5는 본 발명의 항산화 배지 첨가물이 부가된 F06 배지에서 증식 배양된 세포의 중간엽 줄기세포 표면항원검사 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 항산화 배지 첨가물이 부가된 F06 배지에서 배지 내 머캅토에탄올 함량에 따른 중간엽 줄기세포의 세포증식효과를 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 기본배지에 대하여, 10 내지 50μM의 머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol); 4.5 내지 6.5μM의 아스코르브산, 4 내지 6μM의 아스코르브산 2-인산, 0.8 내지 1.2mM의 피루브산 나트륨 및 8 내지 12μM의 알파-키토글루타르산의 제1혼합물; 및 8 내지 12㎍/mL의 인슐린, 4.5 내지 6.5㎍/mL의 트랜스페린, 4 내지 6㎍/mL의 셀레늄, 3.76 내지 5.64㎍/mL의 리놀레산 및 0.4 내지 0.6㎍/mL의 우혈청 알부민의 제2혼합물이 포함된 줄기세포 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 줄기세포 배양용 배지 조성물은 세포분열촉진을 위한 섬유아세포성장인자, 상피세포성장인자 등의 고가의 성장인자들을 사용하지 않고 저산소분압 배양기와 같은 고가의 장비를 사용하지 않으면서도 머캅토에탄올을 함유하는 항산화제 혼합물을 포함하고 있어 여러 번의 계대 배양 기간 동안 세포의 증식을 최적화시켜 중간엽 줄기세포가 보유한 고유의 자기 재생산 능력을 최대한 발휘할 수 있도록 하는 한편, 중간엽 줄기세포로서의 특성을 그대로 유지하게 하는 특성이 있다.

상기 머캅토에탄올은 배지 조성물을 기준으로 10 내지 50μM의 농도로 사용할 수 있다. 더 구체적으로 15 내지 50μM, 보다 구체적으로, 20 내지 50μM, 가장 구체적으로 세포증식효과와 생산 단가를 고려하여 20 μM이 좋다. 상기 범위를 벗어날 경우, 세포증식효과가 없거나, 고 농도에서는 머캅토에탄올의 강한 환원력이 증식을 저해할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 제1혼합물 또는 제2혼합물 또는 머캅토에탄올의 첨가 여부, 머캅토에탄올의 농도를 제어한 배지조성에서의 골수 유래 중간엽 줄기세포의 증식 여부를 확인한 결과, 기본배지에 대하여, 20μM의 머캅토에탄올; 5.5μM의 아스코르브산, 5μM의 아스코르브산 2-인산, 1mM의 피루브산 나트륨 및 10μM의 알파-키토글루타르산의 제1혼합물; 및 10㎍/mL의 인슐린, 5.5㎍/mL의 트랜스페린, 5㎍/mL의 셀레늄, 4.7㎍/mL의 리놀레산 및 0.5㎍/mL의 우혈청 알부민의 제2혼합물이 첨가된 배지 조성에서 제5계대 배양 시 대조군 대비 2배 이상의 증식향상능력을 나타냄을 확인하였다.

또한, 상기 배지조성이 골수에서 분리한 부착성 세포의 초대배양에서도 증식향상효과가 있는지 확인한 결과, 대조군 대비 5배 이상의 증식향상효과를 나타내었다.

또한, 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하기 위해서는 GMP 설비 및 품질관리 조건 하에서 대량배양을 통한 충분한 세포수 증식이 여러 번에 걸친 계대 배양 기간 동안 확보되어야 한다. 따라서, GMP 조건의 대량 배양에서 상기 배지조성이 서로 다른 여러 기증자의 골수 로트에 대한 중간엽 줄기세포의 분리와 계대증식배양에서도 증식향상효과를 나타내는지 확인한 결과, 계대수가 늘어남에 따라 세포증식능이 감소하는 경향성은 나타나나 대조군 대비 계대별 세포증식배수는 유의하게 높았다.

또한, 상기 배지조성에의 의해 4계대 배양된 중간엽 줄기세포가 다분화 특성을 모두 지니고 있는지 확인하기 위해, 연골분화능검사, 뼈분화능검사, 지방분화능검사를 수행한 결과, 상기 배지조성에서 배양된 골수 유래 부착성 세포는 중간엽 줄기세포가 가지는 전형적인 다분화능을 보였다.

아울러, 상기 배지조성에의 의해 4계대 배양된 중간엽 줄기세포가 중간엽 줄기세포로서의 표면항원 특성을 보유하고 있는지 유세포 분석기를 사용하여 확인한 결과, 상기 배지조성에서 배양된 골수 유래 부착성 세포는 중간엽 줄기세포가 가지는 표면항원인 CD73, CD90에 대해 양성을 나타냈고, 조혈모세포 및 내피세포의 대표 항원인 CD34나 임파구의 대표 항원인 CD45에 대해서는 음성을 나타내었다.

상기 결과로부터 본 발명의 배지조성은 중간엽 줄기세포의 증식향상효과를 나타낼 수 있고, 이러한 배지조성에서 배양된 중간엽 줄기세포는 줄기세포로서의 특성을 보유하고 있음을 알 수 있었다.

상기 줄기세포는 종류를 특정하지 않으나, 한 구체예에서 상기 줄기세포는 골수, 제대혈 또는 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 포유동물, 예컨대 인간, 마우스, 랫트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 또는 고양이 등에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 인간일 수 있다. 이러한, 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에서 잘 알려져 있다.

상기 기본배지는 세포배양용으로 통상적으로 사용되는 공지의 기본배지로서, 예컨대, M199/F12 혼합물, MEM-알파(alpha Minimal essential Medium) 배지, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지, MCDB 131 배지, IMEM 배지, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham? F-12) 배지, PCM 배지 또는 MSC 확장 배지 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

이들 기본배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하며, 줄기세포의 배양 시 동물 유래 혈청을 약 10% 내지 30% 정도 포함하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다.

줄기세포 배양에 사용되는 혈청은 태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청일 수 있고, 바람직하게는, 우태아혈청(FBS)일 수 있다. 또한, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.

또한, 줄기세포 배양 시, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다.

항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 펀지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.

필요에 따라 L-글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 70 내지 90％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대 배양을 한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 항산화 배지조성에 따른 12-웰 플레이트에서의 중간엽 줄기세포 증식성 비교

최적의 배지첨가물 조성을 선별하기 위하여 세포 생존능, 항산화 기능, 그리고 세포 증식능과 관련된다고 알려진 여러 종류의 배지 첨가물을 확보하고 이들을 이용하여 여러 가지 첨가물 조합을 준비하였다. 표 1에서와 같이 우혈청 20%가 함유된 저포도당 DMEM를 대조군으로 하고 제1첨가물 및 제2첨가물이 배열된 조성에 5 내지 20μM의 베타-머캅토에탄올을 첨가한 실험군을 준비하였다.

이때 항산화배지조성에 사용되는 제1첨가물은 5.5μM 아스코르브산, 5 μM 아스코르브산 2-인산, 1 mM 피루브산 나트륨, 그리고 10 μM 알파-키토글루타르산으로 이루어진다.

또한 제2첨가물은 10㎍/mL의 인슐린, 5.5㎍/mL 트랜스페린, 5㎍/mL의 셀레늄, 4.7㎍/mL의 리놀레산, 그리고 0.5㎍/mL의 우혈청 알부민으로 이루어진다.

중간엽 줄기세포 증식향상배지를 제조하기 위해, 상기 베타-머캅토에탄올은 원액을 증류수로 희석하고 제균 여과하여 10mM 베타-머캅토에탄올을 포함하는 500배 농축액을 준비하였다.

다음으로, 1.375mM 아스코르브산 농축액, 1.25mM 아스코르브산 2-인산 농축액, 250mM 피루브산 나트륨, 그리고 2.5mM 알파-키토글루타르산을 포함하는 제1첨가물 250배 농축액을 준비하였다.

마지막으로, 1mg/mL의 인슐린, 550㎍/mL의 트랜스페린, 500㎍/mL의 셀레늄, 4.7mg/mL의 리놀레산, 그리고 50㎍/mL의 우혈청 알부민을 포함하는 제2첨가물 100배 농축액을 준비하였다.

DMEM 배지에 최종 농도가 20%가 되도록 우혈청을 첨가하고 베타-머캅토에탄올을 포함하는 500배 농축액을 부피비로 1:500, 제1첨가물 250배 농축액을 부피비로 1:250, 제2첨가물 100배 농축액을 부피비로 1:100이 되도록 첨가하고 혼합하여 중간엽 줄기세포 증식향상배지를 준비하였다.

실험에 사용된 세포는 우혈청 20%를 포함하는 저포도당 DMEM 배지에서 4계대까지 증식배양된 사람 골수 유래의 부착성세포를 사용하였고 12-웰 플레이트 배양용기에서 증식성을 비교하였다. 배양용기의 단위면적당 5×10³개 세포를 접종하고 37℃에서 5% CO₂ 배양기에서 7일간 배양한 후 세포수를 측정하고 실험군과 대조군의 세포수를 비교하였다. 이때 대조군의 최종 세포수를 100%로 하고 이에 대한 실험군의 최종 세포수의 비율을 계산하여 세포증식비를 도출하였다.

배지첨가물 조성표

	대조군	F01	F02	F03	F04	F05	F06
FBS(%)	20	20	20	20	20	20	20
제1첨가물	-	첨가	첨가	-	첨가	첨가	첨가
제2첨가물	-	-	첨가	-	첨가	첨가	첨가
5μM BME	-	-	-	첨가	첨가	-	-
10μM BME	-	-	-	-	-	첨가	-
20μM BME	-	-	-	-	-	-	첨가

표 1의 배지조성에서의 세포배양결과 도 1에 나타난 바와 같이, 제1첨가물 단독(F01) 혹은 제1첨가물 및 제2첨가물의 동시 사용(F02)은 대조군(Control)에 비해 유의한 증식 차이를 보이지 않았다. 대조군의 배지조성에 5 μM의 머캅토에탄올을 추가한 경우(F03) 다소 증식성이 향상되었으나 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다. 제1첨가물 및 제2첨가물의 동시 사용과 함께 5 μM의 머캅토에탄올을 추가한 경우(F04) 또는 10 μM의 머캅토에탄올을 추가한 경우(F05) 모두 대조군에 비해 유의한 증식성 향상을 보이지 않았다. 반면에 제1첨가물, 제2첨가물 그리고 20 μM의 머캅토에탄올이 포함된 배지조성의 경우(F06)에서는 대조군에 비해 200% 이상의 세포증식을 보여주었다. 이는 제1첨가물 및 제2첨가물에 포함된 세포생존향상 물질 및 항산화 물질조성만으로는 증식성를 향상시키기에 불충분하였고 여기에 20 μM의 머캅토에탄올이 추가되었을 경우에서만 유의한 세포증식의 차이를 보인 것을 확인할 수 있었다. 따라서 골수 유래 중간엽 줄기세포의 제5계대(P5)배양에 있어서 'F06' 배지조성은 대조군에 비해 2배 이상의 증식향상 능력이 있음을 확인하였다.

<실시예 2> F06 배지 사용에 따른 골수로부터 중간엽 줄기세포 초대배양 효율 비교

실시예 1에서 확인된 F06 배지조성이 사람 골수로부터 부착성세포를 분리하고 세포를 증식시키는 초대배양을 실시하는 경우에도 증식향상효과가 있는지 우혈청 20%를 포함하는 저포도당 DMEM을 사용하는 대조군 배지조성과 비교하였다. 적혈구용혈법을 이용하여 사람 골수로부터 적혈구를 제거하고 세포를 원심분리하여 회수한 다음 회수된 세포를 이등분하여 대조군 배지 및 F06 배지에 동일 수의 세포를 각각 현탁시켜 접종하고 5% CO₂ 배양기에서 14일간 배양 후 세포수를 측정하고 실험군과 대조군의 세포수를 비교하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 골수 유래 중간엽 줄기세포의 초대배양에서 F06 배지조성은 대조군 배지조성에서보다 5배 이상의 증식 세포수를 보였다. 따라서 F06 배지조성은 중간엽 줄기세포의 증식향상뿐 아니라 골수 유래 부착성 세포의 초대 배양 시 세포의 생존성 및 부착성에도 대조군 배지조성에 비해 월등한 향상효과를 보이는 것으로 확인되었다.

<실시예 3> 대량증식배양에서 F06 배지조성에 따른 중간엽 줄기세포 증식성 비교

중간엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하기 위해서는 GMP 설비 및 품질관리 조건하에서 대량배양을 통한 충분한 세포수 증식이 여러 번에 걸친 계대 배양 기간 동안 확보되어야 한다. 본 실시예에서는 GMP 조건의 대량배양에서 F06 배지조성이 서로 다른 여러 기증자의 골수 로트에 대한 중간엽 줄기세포의 분리와 계대 증식 배양에서도 대조군 배지조성에 비해 유의성 있게 증식향상효과를 보여주는지를 비교하였다. 증식의 정도는 P1에서 P4까지의 각 계대 배양에서 초기 접종세포대비 배양 후 회수된 세포의 비율을 이용하여 계대별 세포증식배수를 계산하였다. P1 배양에서 P4 배양까지의 세포증식배수 자료들을 대조군 배지조성을 이용한 경우와 F06 배지조성을 이용한 경우를 분류하여 그림에 나타내고 각 경우에 대한 추세선을 작성하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 골수 로트 차이에 의한 세포의 증식능력 차이가 있었고 계대수가 늘어남에 따라 세포증식능이 감소하는 경향성은 대조군 및 실험군 모두에서 공통으로 보이고 있으나 전반적인 계대별 세포증식배수는 F06 배지조성이 대조군보다 유의하게 높음을 확인할 수 있었다. 따라서 F06 배지조성은 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리, 증식 배양하는데 있어서 향상된 증식능을 유발하는 것으로 판단할 수 있었다.

<실시예 4> F06 배지조성에서 증식배양된 세포의 중간엽 줄기세포 다분화 특성 확인

F06 배지조성에 의해 P4까지 증식 배양된 중간엽 줄기세포가 중간엽 줄기세포로서의 다분화 특성을 모두 지니고 있는지를 확인하기 위하여 연골분화능 검사, 뼈분화능 검사, 지방분화능 검사를 실시하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, F06 배지조성에 의해 배양된 골수 유래 부착성 세포는 중간엽 줄기세포가 가지는 전형적인 다분화능인 연골분화능, 지방분화능, 그리고 뼈분화능을 보였으며 따라서 F06 배지조성으로 중간엽 줄기세포를 배양하였을 경우 중간엽 줄기세포의 특성을 그대로 보존할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 5> F06 배지조성에서 증식배양된 세포의 중간엽 줄기세포 표면항원 특성 확인

실시예 2에서 확인된 F06 배지조성에 의해 P4까지 증식 배양된 중간엽 줄기세포가 중간엽 줄기세포로서의 표면항원 특성을 모두 지니고 있는지를 확인하기 위하여 중간엽 줄기세포의 대표적 표면항원 양성표지자인 CD73과 CD90, 중간엽 줄기세포의 대표적인 표면항원 음성표지자인 CD34 및 CD45에 대한 검사를 유세포 분석기를 이용하여 실시하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, F06 배지조성에 의해 배양된 골수 유래 부착성 세포는 중간엽 줄기세포가 가지는 전형적인 표면항원인 CD73, CD90에 대한 양성을 나타냈으며 조혈모세포 및 내피세포의 대표항원인 CD34나 임파구의 대표항원인 CD45의 표면항원에 대해서는 음성을 보였고 따라서 F06 배지조성으로 중간엽 줄기세포를 배양하였을 경우 중간엽 줄기세포의 표면항원 특성을 그대로 보존할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 6> F06 배지조성에서 베타-머캅토에탄올의 함량을 증감시킨 배지조성에 따른 중간엽 줄기세포 증식성 비교

실시예 1에서 확인된 중간엽 줄기세포 증식향상배지조성인 F06 조성에서 베타-머캅토에탄올의 함량을 증감시켰을 때 증식성이 변화하는 양상을 알아보기 위하여 아래와 같은 조성을 준비하였다.

배지첨가물 조성표

	대조군	F05	F058	F06	F061	F062	F063	F064	F065
FBS(%)	20	20
제1첨가물	-	첨가
제2첨가물	-	첨가
BME (μM)	-	10	15	20	50	100	250	500	5000

실험에 사용된 세포는 우혈청 20%를 포함하는 저포도당 DMEM 배지에서 4계대까지 증식배양된 후 동결보관된 사람 골수 유래의 부착성세포를 해동하여 사용하였고 96-웰 플레이트 배양용기에서 증식성을 비교하였다. 배양용기의 단위면적당 5×10³개 세포를 접종하고 37℃에서 5% CO₂ 배양기에서 5일간 배양한 후 세포수를 측정하고 실험군과 대조군의 세포수를 비교하였다. 이때 대조군의 최종 세포수를 100%로 하고 이에 대한 실험군의 최종 세포수의 비율을 계산하여 세포증식비를 도출하였다.

표 2의 배지조성에서의 세포배양결과 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군(Control)에 비해 제1첨가물 및 제2첨가물의 동시 사용과 함께 머캅토에탄올이 추가된 경우 10μM ~ 500 μM의 머캅토에탄올을 함유한 배지에서 대조군보다 더 높은 세포증식비를 줄 수 있음을 확인하였다. 증식비의 향상정도는 50 μM의 머캅토에탄올 농도까지는 상대적으로 증가하다가 그 이상의 머캅토에탄올을 함유한 배지에서는 감소되기 시작하였다. 5000 μM의 머캅토에탄올이 함유된 배지에서는 대조군보다도 더 낮은 세포증식비를 보였다. 이는 50 μM 이상의 머캅토에탄올에서는 세포증식 향상효과가 감소한다는 것을 의미하며 이는 높은 농도에서는 머캅토에탄올의 강한 환원력이 증식을 저해할 수도 있음을 보여준 것이라고 할 수 있다.

이러한 결과로 볼 때 안전한 최적 머캅토에탄올의 배지내 함유 농도는 50μM 보다 낮아야 할 것으로 생각되며, 실시예 1에서 제시된 20μM 머캅토에탄올은 증식향상효과와 생산 단가를 고려하여 최적의 조성임을 알 수 있었다.

Claims

기본배지에 대하여,
10 내지 50μM의 머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol);
4.5 내지 6.5μM의 아스코르브산, 4 내지 6μM의 아스코르브산 2-인산, 0.8 내지 1.2mM의 피루브산 나트륨 및 8 내지 12μM의 알파-키토글루타르산의 제1혼합물; 및
8 내지 12㎍/mL의 인슐린, 4.5 내지 6.5㎍/mL의 트랜스페린, 4 내지 6㎍/mL의 셀레늄, 3.76 내지 5.64㎍/mL의 리놀레산 및 0.4 내지 0.6㎍/mL의 우혈청 알부민의 제2혼합물이 포함된 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 줄기세포 배양용 배지 조성물은 기본배지에 대하여,
20μM의 머캅토에탄올;
5.5μM의 아스코르브산, 5μM의 아스코르브산 2-인산, 1mM의 피루브산 나트륨 및 10μM의 알파-키토글루타르산의 제1혼합물; 및
10㎍/mL의 인슐린, 5.5㎍/mL의 트랜스페린, 5㎍/mL의 셀레늄, 4.7㎍/mL의 리놀레산 및 0.5㎍/mL의 우혈청 알부민의 제2혼합물을 포함하는 것인 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
줄기세포는 골수, 지방조직 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
기본배지는 M199/F12 혼합물, MEM-알파 배지, DMEM 배지, MCDB 131 배지, IMEM 배지, DMEM/F12 배지, PCM 배지 및 MSC 확장 배지로 이루어진 군에서 선택되는 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
줄기세포 배양용 배지 조성물은 태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청, L-글루타민, 항생제 및 항진균제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제1항의 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양방법.
제6항에 있어서,
줄기세포는 골수, 지방 조직 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 줄기세포의 배양방법.
제6항에 있어서,
줄기세포는 10% 내지 30%의 태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청 하에서 배양하는 줄기세포의 배양방법.