JP2020124218A - 間葉系幹細胞用培地 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]少なくとも1種のアミノ酸の濃度が、グリシン5μM未満、アラニン5μM未満、セリン3μM未満、プロリン5μM未満、アスパラギン1μM未満、アスパラギン酸2μM未満、および/またはグルタミン酸3μM未満である、間葉系幹細胞用培地。
[2]グリシンが5μM未満である、上記[1]に記載の培地。
[3]グリシンが1μM未満である、上記[1]に記載の培地。
[4]アラニンが5μM未満である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の培地。
[5]アラニンが1μM未満である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の培地。
[6]セリンが3μM未満である、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の培地。
[7]セリンが0.7μM未満である、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の培地。
[8]プロリンが5μM未満である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の培地。
[9]プロリンが1μM未満である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の培地。
[10]アスパラギンが1μM未満である、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の培地。
[11]アスパラギンが0.1μM未満である、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の培地。
[12]アスパラギン酸が2μM未満である、上記[1]〜[11]のいずれかに記載の培地。
[13]アスパラギン酸が0.5μM未満である、上記[1]〜[11]のいずれかに記載の培地。
[14]グルタミン酸が3μM未満である、上記[1]〜[13]のいずれかに記載の培地。
[15]グルタミン酸が0.7μM未満である、上記[1]〜[13]のいずれかに記載の培地。
[16]グリシンが5μM未満、アラニンが5μM未満、セリンが3μM未満、プロリンが5μM未満、アスパラギンが1μM未満、アスパラギン酸が2μM未満、およびグルタミン酸が3μM未満である、上記[1]に記載の培地。
[17]グリシンが1μM未満、アラニンが1μM未満、セリンが0.7μM未満、プロリンが1μM未満、アスパラギンが0.1μM未満、アスパラギン酸が0.5μM未満、およびグルタミン酸が0.7μM未満である、上記[1]に記載の培地。
[18]低分子除去処理が施された血清または血清代替物を含有する、上記[1]〜[17]のいずれかに記載の培地。
[19]前記低分子除去処理が透析により行われる、上記[18]に記載の培地。
[20]血清がヒト血清である、上記[18]または[19]に記載の培地。
[21]非ヒト動物由来の成分を含まない、上記[1]〜[20]のいずれかに記載の培地。
[22]間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である上記[1]〜[21]のいずれかに記載の培地。
[23]間葉系幹細胞が、骨髄より採取されたものである上記[22]に記載の培地。
[24]上記[1]〜[23]のいずれかに記載の培地で間葉系幹細胞を培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法。
[25]間葉系幹細胞を培養する工程が、間葉系幹細胞を70日以上に亘り増殖させる工程である、上記[24]に記載の培養方法。
[26]上記[24]または[25]に記載の培養方法により得られる、細胞組成物。
[27]CD73、CD90およびCD105からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーに陽性である、上記[26]に記載の細胞組成物。
[28]CD73、CD90およびCD105からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーに陽性であり、かつ、CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79、CD19およびHLA−DR陰性である、上記[26]に記載の細胞組成物。
[29]上記[24]または[25]に記載の培養方法により得られる、細胞医療用の細胞。
[30]グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を添加せず、低分子除去処理が施された血清または血清代替物を含有する間葉系幹細胞用培地。
[31]ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、およびバリンを添加する、上記[30]に記載の培地。
[32]アルギニン、システイン、グルタミン、およびチロシンをさらに添加する、上記[31]に記載の培地。
1.細胞
LONZA社より購入した、正常ヒトドナーから採取、調製されたヒト間葉系幹細胞(カタログ番号:PT−2501)、および本発明者らが自主採取したヒト間葉系幹細胞(ロット番号:BM103〜104)を使用した。
間葉系幹細胞の培養においては、アミノ酸以外のDMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium、GIBCO)を構成する成分(塩類、ビタミンなど)からなる培地(以下、「Zero培地」と表記される場合がある)、これに20種類のアミノ酸を添加した培地(以下、「Full培地」と表記される場合がある)、もしくは、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を除いた13種類のアミノ酸を添加した培地(以下、「−7培地」と表記される場合がある)、それぞれの培地に、透析により低分子を除去したFBS(fetal bovine serum、ライフテクノロジーズ社:26400−044)を10(v/v)%となるように添加し、使用した。
表1には、培養に使用した血清中における透析後の、上記7種アミノ酸の濃度、これらアミノ酸の、−7培地に添加した際の使用時の最終濃度、一般的な培地におけるこれらアミノ酸の濃度を示す。
間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化は、脂肪分化誘導培地(10(v/v)% FBS(ライフテクノロジーズ社:26400−044)、0.01mg/mL インスリン(ナカライテスク社:19251−95)、1μM デキサメタゾン(シグマ社:D2915)、0.2mM インドメタシン(シグマ社:I7378)、0.5mM イソブチルメチルキサンチン(シグマ社:I7018)を添加した高グルコース含有DMEM培地(GIBCO))を使用して行った。脂肪細胞への分化後の培養は、脂肪維持培地(10(v/v)% FBS(ライフテクノロジーズ社:26400−044)、0.01mg/mL インスリン(ナカライテスク社:19251−95)を添加した高グルコース含有DMEM培地(GIBCO))を使用して行った。
間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化培養および分化後の維持培養は、37℃、5% CO2雰囲気下のインキュベーター内で行った。
間葉系幹細胞を、6ウェルプレートの1ウェルあたり2x105細胞を播種し、間葉系幹細胞用培地にて100%コンフルエントになるまで培養を行った。続いて脂肪分化誘導培地へ培地交換し、3日間培養した後に、脂肪維持培地へ培地交換し、更に3日間培養を行った。この脂肪分化誘導培地と脂肪維持培地による計6日間の培養を、3サイクル合計18日間実施した。
培養後の細胞を10% ホルマリンにて固定した後、オイルレッドO染色に供した。続いて細胞を0.1% Thesit(登録商標)(ラウロマクロゴール)に溶解し、血清トリグリセリド測定キット(シグマ社:TR0100−1KT)にてトリグリセリド量を定量した。BCA(ビシンコニン酸)試薬を用いてタンパク質を定量し、タンパク質量当たりのトリグリセリド量を比較することで、細胞ごとの分化効率を検討した。
実施例1:−7培地での短期間培養による、間葉系幹細胞の細胞増殖促進効果(図1)
Zero培地、Full培地または−7培地でヒト間葉系幹細胞(ロット番号:OF3825)を7日間培養し、細胞数を評価した。細胞数の計測はCCKアッセイにより行った。市販のキットであるCell counting kit-8 (Dojindo)を使用し、キット付属の使用説明書に順じて操作を行った。CCKアッセイでは、OD450nm(縦軸)に細胞数が比例する。各培地につき3ウェルで評価を行い、各ウェルの値を○で、3ウェルの平均値を●で表した。Full培地で培養した場合に比べ、−7培地では間葉系幹細胞の増殖が顕著に促進されていることを見出した。
−7培地またはFull培地でヒト間葉系幹細胞(ロット番号:OF3825)を70日間培養し、それぞれの培地で培養したときの累積細胞数を計測した。継代時に、細胞をトリプシン処理で培養容器から剥がし、トリパンブルーと混和した後、細胞懸濁液を血球計算盤に供し、細胞数を計測した。細胞数の計測は、以下の実施例においても同様の方法で行った。Full培地で培養した場合に比べ、−7培地で培養した場合は累積細胞数が顕著に増大した。従って、−7培地は、間葉系幹細胞の長期に渡る増殖培養に適した培地であることが示された。
ロット番号:OF3853およびロット番号:OF4266のヒト間葉系幹細胞を、−7培地またはFull培地において30日間培養し、累積細胞数を計測した。両ロットのヒト間葉系幹細胞について、−7培地による顕著な増殖促進効果が認められた。
−7培地またはFull培地を用いて、ヒト間葉系幹細胞(ロット番号:BM103)を109日間培養し、それぞれ累積細胞数を計測した。−7培地での培養では、累積細胞数が頭打ちとはならずに、増殖し続けたのに対し、Full培地で培養した場合は、培養開始から70日目以降は累積細胞数がほぼ頭打ちとなった。Full培地での培養において、頭打ちとなるまでの培養により、最終的な累積細胞数は培養開始時の細胞数の1230倍であった。よって、Full培地による間葉系幹細胞の増殖培養可能な期間は、およそ70日間で、その場合の累積細胞数は培養開始時の細胞数の1230倍程度であることが明らかとなった。
−7培地またはFull培地で20日〜24日間培養したヒト間葉系幹細胞(ロット番号:BM103PN2(図5A)およびBM105PN2(図5B))を用いて、脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化誘導を行った。骨細胞および軟骨細胞への分化に関しては、−7培地で培養した間葉系幹細胞は、Full培地で培養したものと比べ、同程度の分化効率を示した。脂肪細胞への分化に関しては、−7培地で培養した間葉系幹細胞は、Full培地で培養したものと比べ、分化効率が顕著に高かった(図5)。よって、−7培地は、間葉系幹細胞の骨細胞および軟骨細胞への分化に関しては従来の培地と同程度の分化能を維持しつつ、従来よりも効率のよい脂肪細胞への分化を可能とする培地であることが示された。
Claims (29)
- 少なくとも1種のアミノ酸の濃度が、グリシン5μM未満、アラニン5μM未満、セリン3μM未満、プロリン5μM未満、アスパラギン1μM未満、アスパラギン酸2μM未満、および/またはグルタミン酸3μM未満である、間葉系幹細胞用培地。
- グリシンが5μM未満である、請求項1に記載の培地。
- グリシンが1μM未満である、請求項1に記載の培地。
- アラニンが5μM未満である、請求項1に記載の培地。
- アラニンが1μM未満である、請求項1に記載の培地。
- セリンが3μM未満である、請求項1に記載の培地。
- セリンが0.7μM未満である、請求項1に記載の培地。
- プロリンが5μM未満である、請求項1に記載の培地。
- プロリンが1μM未満である、請求項1に記載の培地。
- アスパラギンが1μM未満である、請求項1に記載の培地。
- アスパラギンが0.1μM未満である、請求項1に記載の培地。
- アスパラギン酸が2μM未満である、請求項1に記載の培地。
- アスパラギン酸が0.5μM未満である、請求項1に記載の培地。
- グルタミン酸が3μM未満である、請求項1に記載の培地。
- グルタミン酸が0.7μM未満である、請求項1に記載の培地。
- グリシンが5μM未満、アラニンが5μM未満、セリンが3μM未満、プロリンが5μM未満、アスパラギンが1μM未満、アスパラギン酸が2μM未満、およびグルタミン酸が3μM未満である、請求項1に記載の培地。
- グリシンが1μM未満、アラニンが1μM未満、セリンが0.7μM未満、プロリンが1μM未満、アスパラギンが0.1μM未満、アスパラギン酸が0.5μM未満、およびグルタミン酸が0.7μM未満である、請求項1に記載の培地。
- 低分子除去処理が施された血清または血清代替物を含有する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の培地。
- 前記低分子除去処理が透析により行われる、請求項18に記載の培地。
- 血清がヒト血清である、請求項18または19に記載の培地。
- 非ヒト動物由来の成分を含まない、請求項1〜20のいずれか1項に記載の培地。
- 間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である請求項1〜21のいずれか1項に記載の培地。
- 間葉系幹細胞が、骨髄より採取されたものである請求項22に記載の培地。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の培地で間葉系幹細胞を培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法。
- 間葉系幹細胞を培養する工程が、間葉系幹細胞を70日以上に亘り増殖させる工程である、請求項24に記載の培養方法。
- 請求項24または25に記載の培養方法により得られる、細胞組成物。
- CD73、CD90およびCD105からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーに陽性である、請求項26に記載の細胞組成物。
- CD73、CD90およびCD105からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーに陽性であり、かつ、CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79、CD19およびHLA−DR陰性である、請求項26に記載の細胞組成物。
- 請求項24または25に記載の培養方法により得られる、細胞医療用の細胞。
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