KR20170042367A

KR20170042367A - 간엽계 줄기 세포용 배지

Info

Publication number: KR20170042367A
Application number: KR1020177007657A
Authority: KR
Inventors: 용휘 진; 이쿠에 하라타; 쇼 센다; 히로키 오자와; 츠요시 고바야시; 준야 도쿠치다; 마코토 이케야
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤; 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
Priority date: 2014-08-21
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2017-04-18
Also published as: KR102415441B1; CA2958533C; JPWO2016027850A1; US10947508B2; CA2958533A1; CN106715683A; WO2016027850A1; JP6940837B2; JP2020124218A; US20170198258A1; EP3184627A4; JP6944165B2; EP3184627B1; EP3184627A1

Abstract

본 발명은, 특별한 장치, 기재 등을 사용하지 않고, 종래 곤란했던 간엽계 줄기 세포의 장기간의 증식 배양을 가능하게 하는 수단을 제공하는 것을 과제로 한다. 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 아스파라긴산 및 글루탐산의 7종의 비필수 아미노산이 저감된 간엽계 줄기 세포용 배지를 제공함으로써 상기 과제를 해결한다.

Description

간엽계 줄기 세포용 배지{CULTURE MEDIUM FOR MESENCHYMAL STEM CELLS}

본 발명은 간엽계 줄기 세포용 배지 및 간엽계 줄기 세포의 배양 방법 등에 관한 것이다.

간엽계 줄기 세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 성체의 골수 등에 존재하는 체성 줄기 세포의 일종이며, 골, 연골, 지방 세포로의 분화능을 갖는 접착성의 세포라고 정의된다. 배아성 줄기(embryonic stem; ES) 세포나 인공 다능성 줄기(induced pluripotent stem; iPS) 세포 등의 배아성의 줄기 세포와 달리 암화의 위험성이 매우 적은 것으로 생각되고 있으며, 재생 의료에 사용되는 세포 재료로서 크게 유망시되고 있다. 일본에서도, 관절 질환을 중심으로 이미 복수의 임상 연구가 진행되고 있다.

간엽계 줄기 세포는 일반적으로「노화」되는 세포로서 알려져 있으며, 배양 기간이 길어지면(분열 횟수가 많아지면), 증식 속도의 저하, 나아가서는 정지를 초래하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1). 비특허문헌 1에는, 저산소 분압 하에서의 배양에 의해, 인간 간엽계 줄기 세포(hMSC)의 노화를 억제할 수 있다는 보고가 이루어지고 있지만, 배지의 아미노산 조성이 인간 간엽계 줄기 세포의 노화나 증식에 어떠한 영향을 주는지는 전혀 알려져 있지 않다.

특허문헌 1 및 특허문헌 2에는 배지로부터의 특정한 아미노산의 제거에 의한 줄기 세포 배양 기술의 예가 개시되어 있다. 이들은, ES 세포나 iPS 세포와 같은 다능성 줄기 세포에 관한 기술이며, 분화 유도시에 잔존하는 미분화 상태의 세포를 선택적으로 사멸·제거시켜, 세포 조성물 중에서 분화된 것의 순도를 높이는 기술이다. 오늘날까지, 체성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포를 불문하고 어떠한 줄기 세포에 있어서도, 배지 중으로부터의 특정한 아미노산 제거가 세포의 노화를 억제하거나, 증식을 촉진시키는 예는 알려져 있지 않다.

일본 공개특허공보 제2009-100702호 WO2012/056997A1

Jin, Y., et al., Biochem Biophys Res Commun., Vol. 391, p. 1471-1476.

간엽계 줄기 세포는 노화되는 세포이며, 배양 기간이 길어지면(분열 횟수가 많아지면), 증식 속도의 저하, 나아가서는 정지를 초래하는 것이 알려져 있다. 따라서, 충분한 세포수를 확보하는 것이 용이하지 않으며, 이것이 인간 간엽계 줄기 세포의 기초 연구, 임상 응용을 행하는데 있어서 하나의 장해가 되고 있다. 그래서, 본 발명은 간엽계 줄기 세포, 특히, 인간 간엽계 줄기 세포를 특별한 장치, 기재 등을 사용하지 않고, 종래보다도 장기간 증식시키기 위한 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 아스파라긴산 및 글루탐산의 7종의 비필수 아미노산의 양이 저감된 배양액 중에서 인간 간엽계 줄기 세포를 배양하면, 당해 비필수 아미노산의 양이 저감되어 있지 않은 통상의 배양액 중에서 배양한 경우보다도 장기간의 증식 배양이 가능해지고, 보다 많은 간엽계 줄기 세포가 얻어지는 것을 밝혀내었다.

이상의 지견에 기초하여 본 발명이 완성되었다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 적어도 1종의 아미노산의 농도가, 글리신 5μM 미만, 알라닌 5μM 미만, 세린 3μM 미만, 프롤린 5μM 미만, 아스파라긴 1μM 미만, 아스파라긴산 2μM 미만 및/또는 글루탐산 3μM 미만인, 간엽계 줄기 세포용 배지.

[2] 글리신이 5μM 미만인, 상기 [1]에 기재된 배지.

[3] 글리신이 1μM 미만인, 상기 [1]에 기재된 배지.

[4] 알라닌이 5μM 미만인, 상기 [1] 내지 [3] 중의 어느 하나에 기재된 배지.

[5] 알라닌이 1μM 미만인, 상기 [1] 내지 [3] 중의 어느 하나에 기재된 배지.

[6] 세린이 3μM 미만인, 상기 [1] 내지 [5] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[7] 세린이 0.7μM 미만인, 상기 [1] 내지 [5] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[8] 프롤린이 5μM 미만인, 상기 [1] 내지 [7] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[9] 프롤린이 1μM 미만인, 상기 [1] 내지 [7] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[10] 아스파라긴이 1μM 미만인, 상기 [1] 내지 [9] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[11] 아스파라긴이 0.1μM 미만인, 상기 [1] 내지 [9] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[12] 아스파라긴산이 2μM 미만인, 상기 [1] 내지 [11] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[13] 아스파라긴산이 0.5μM 미만인, 상기 [1] 내지 [11] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[14] 글루탐산이 3μM 미만인, 상기 [1] 내지 [13] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[15] 글루탐산이 0.7μM 미만인, 상기 [1] 내지 [13] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[16] 글리신이 5μM 미만, 알라닌이 5μM 미만, 세린이 3μM 미만, 프롤린이 5μM 미만, 아스파라긴이 1μM 미만, 아스파라긴산이 2μM 미만 및 글루탐산이 3μM 미만인, 상기 [1]에 기재된 배지.

[17] 글리신이 1μM 미만, 알라닌이 1μM 미만, 세린이 0.7μM 미만, 프롤린이 1μM 미만, 아스파라긴이 0.1μM 미만, 아스파라긴산이 0.5μM 미만 및 글루탐산이 0.7μM 미만인, 상기 [1]에 기재된 배지.

[18] 저분자 제거 처리가 가해진 혈청 또는 혈청 대체물을 함유하는, 상기 [1] 내지 [17] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[19] 상기 저분자 제거 처리가 투석에 의해 행해지는, 상기 [18]에 기재된 배지.

[20] 혈청이 인간 혈청인, 상기 [18] 또는 [19]에 기재된 배지.

[21] 비인간 동물 유래의 성분을 함유하지 않는, 상기 [1] 내지 [20] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[22] 간엽계 줄기 세포가 인간 간엽계 줄기 세포인 상기 [1] 내지 [21] 중의 어느 한 항에 기재된 배지.

[23] 간엽계 줄기 세포가 골수로부터 채취된 것인 상기 [22]에 기재된 배지.

[24] 상기 [1] 내지 [23] 중의 어느 한 항에 기재된 배지에서 간엽계 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 간엽계 줄기 세포의 배양 방법.

[25] 간엽계 줄기 세포를 배양하는 공정이 간엽계 줄기 세포를 70일 이상에 걸쳐 증식시키는 공정인, 상기 [24]에 기재된 배양 방법.

[26] 상기 [24] 또는 [25]에 기재된 배양 방법에 의해 얻어지는, 세포 조성물.

[27] CD73, CD90 및 CD105로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 마커에 양성인, 상기 [26]에 기재된 세포 조성물.

[28] CD73, CD90 및 CD105로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 마커에 양성이고, 또한, CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79, CD19 및 HLA-DR 음성인, 상기 [26]에 기재된 세포 조성물.

[29] 상기 [24] 또는 [25]에 기재된 배양 방법에 의해 얻어지는, 세포 의료용의 세포.

[30] 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 아스파라긴산 및 글루탐산을 첨가하지 않고, 저분자 제거 처리가 가해진 혈청 또는 혈청 대체물을 함유하는 간엽계 줄기 세포용 배지.

[31] 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린을 첨가하는, 상기 [30]에 기재된 배지.

[32] 아르기닌, 시스테인, 글루타민 및 티로신을 추가로 첨가하는, 상기 [31]에 기재된 배지.

본 발명에 의하면, 지금까지 곤란했던 간엽계 줄기 세포의 장기간에 걸친 증식 배양이 가능해진다. 따라서, 보다 많은 간엽계 줄기 세포를 간편하게 얻을 수 있어, 연구나 의료 등에 사용하기 위해 간엽계 줄기 세포를 대량으로 공급하는 것이 가능해진다.

도 1은 본 발명의 배지에 의한 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: OF3825)의 7일간의 배양에 있어서의 세포 증식 촉진 효과를 도시하는 도면이다.
도 2는 본 발명의 배지에 의한 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: OF3825)의 약 70일간의 배양에 있어서의 세포 증식 촉진 효과를 도시하는 도면이다.
도 3은 본 발명의 배지에 의한 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: OF3853 및 OF4266)의 약 30일간에 있어서의 세포 증식 촉진 효과를 도시하는 도면이다.
도 4는 본 발명의 배지에 의한 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: BM103)의 제1 계대로부터 109일간에 있어서의 세포 증식 촉진 효과를 도시하는 도면이다. 가로축의 괄호 안의 숫자는 배양 개시로부터의 일수를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 배지에 의해 배양한 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: BM103PN2(도 5A) 및 BM105PN2(도 5B)의 지방 세포로의 분화 촉진 효과를 도시하는 도면이다.

본 발명은, 글리신, 아닐린, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 아스파라긴산 및 글루탐산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 적어도 1종의 아미노산의 양이 저감된, 간엽계 줄기 세포용 배지(이하,「본 발명의 배지」라고 약기하는 경우가 있다)를 제공한다. 보다 구체적으로는, 적어도 1종의 아미노산의 농도가, 글리신 5μM 미만, 알라닌 5μM 미만, 세린 3μM 미만, 프롤린 5μM 미만, 아스파라긴 1μM 미만, 아스파라긴산 2μM 미만, 및/또는 글루탐산 3μM 미만인, 간엽계 줄기 세포용 배지를 제공한다.

본 명세서 중에 기재되는 아미노산은 L-체, D-체, DL-체 중 어느 것을 의미하고, 또한 각각의 아미노산의 유리체뿐만 아니라 염의 형태도 의미한다.

염의 형태에는 산 부가염이나 염기와의 염 등을 들 수 있고, 세포 독성을 나타내지 않고, 의약품으로서 허용되는 염인 것이 바람직하다. 이러한 염을 형성하는 산으로서는 예를 들면, 염화 수소, 브롬화 수소, 황산, 인산 등의 무기산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 말레산, 푸말산 또는 모노메틸황산 등의 유기산이 열거되고, 또한 이러한 염을 형성하는 염기로서는 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 칼슘 등의 금속의 수산화물 또는 탄산화물이나, 암모니아 등의 무기 염기, 에틸렌디아민, 프로필렌디아민, 에탄올아민, 모노알킬에탄올아민, 디알킬에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 등의 유기 염기가 열거된다. 상기 염은 수화물(함수염)이라도 좋다.

본 발명의 배지 중에 있어서는, 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 아스파라긴산 및 글루탐산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 적어도 1종의 아미노산(이하, 이들 7종의 아미노산을 정리하여,「본 발명의 저감되는 아미노산」이라고 기재하는 경우가 있다)의 양이 저감되어 있다. 본 명세서 중,「저감되어 있다」란, 일반적인 배지에 사용되고 있는 양에 비해 적은 것을 의미하고, 또한 간엽계 줄기 세포의 장기간의 증식 배양을 가능하게 할 정도로 그 함유량이 낮게 억제되어 있는 것을 의미한다. 일반적인 배지에 사용되고 있는 양으로서는, 예를 들면, 글리신이면 133 내지 667μM, 알라닌이면 50 내지 400μM, 세린이면 238 내지 400μM, 프롤린이면 150 내지 400μM, 아스파라긴이면 50 내지 400μM, 아스파라긴산이면 50 내지 400μM, 글루탐산이면 50 내지 510μM이 열거된다. 아미노산의 양의 저감을 실현하기 위해, 본 발명의 배지를 제작할 때에 사용하는 기초 배지 및 이것에 첨가되는 첨가물은 본 발명의 저감되는 아미노산을 함유하지 않거나 또는 본 발명의 저감되는 아미노산 등의 저분자를 제거하는 조작이 가해진 것인 것이 바람직하다. 또한, 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 배지는 본 발명의 저감되는 아미노산의 적어도 1종, 보다 바람직하게는 7종 전부를 실질적으로 함유하지 않는다. 「실질적으로 함유하지 않는다」란, 본 발명의 저감되는 아미노산을 함유하지 않거나 또는 본 발명의 저감되는 아미노산 등의 저분자를 제거하는 조작이 가해진, 기초 배지 및 이의 첨가물을 사용함으로써, 본 발명의 배지 중에 있어서의 본 발명의 저감되는 아미노산의 배양 시의 최종 농도가 가능한 한 낮게 억제되어 있는 것을 의미하고, 바람직하게는 본 발명의 배지 중의 농도가 검출 한계 이하인 농도이다. 아미노산의 검출은 닌하이드린법(ninhydrin method)에 의한 아미노산 분석 방법(예를 들면, Clinical Chemistry (1997), Vol. 43, No.8, p1421-1428을 참조) 등에 의해 행할 수 있다. 아미노산의 검출법으로서 닌하이드린법을 사용한 경우,「검출 한계 이하의 농도」란, 닌하이드린법에 의한 아미노산 분석 방법에 의해 검출할 수 없을 정도의 농도를 의미한다. 본 발명의 저감되는 아미노산에 있어서의 각 아미노산의 농도의 구체적인 예로서는 글리신이 5μM 미만, 바람직하게는 1μM 미만, 보다 바람직하게는 0.8μM 미만, 알라닌이 5μM 미만, 바람직하게는 1μM 미만, 보다 바람직하게는 0.8μM 미만, 세린이 3μM 미만, 바람직하게는 0.7μM 미만, 보다 바람직하게는 0.4μM 미만, 프롤린이 5μM 미만, 바람직하게는 1μM 미만, 보다 바람직하게는 0.7μM 미만, 아스파라긴이 1μM 미만, 바람직하게는 0.1μM 미만, 보다 바람직하게는 0.06μM 미만, 아스파라긴산이 2μM 미만, 바람직하게는 0.5μM 미만, 보다 바람직하게는 0.15μM 미만, 글루탐산이 3μM 미만, 바람직하게는 0.7μM 미만, 보다 바람직하게는 0.5μM 미만이 열거된다.

본 발명의 배지 중에 있어서는 본 발명의 저감되는 아미노산 7종 중의 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종에 관해서 이의(이들의) 양이 저감되어 있고, 복수종의 아미노산의 양이 저감되어 있는 경우에는 어느 아미노산의 조합이라도 좋다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 배지 중에 있어서는, 7종 전체 아미노산의 양이 저감되어 있다.

본 발명의 저감되는 아미노산 이외의 아미노산의 본 발명의 배지에 있어서의 함유량에 관해서는 간엽계 줄기 세포의 증식을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않으며, 통상의 세포 배양에 사용되는 농도를 적절히 채용할 수 있다.

본 발명의 배지에는 자체 공지된 기초 배지를 사용할 수 있고, 간엽계 줄기 세포의 증식을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, DMEM, EMEM, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM(Glasgow's MEM), RPMI-1640, α-MEM, Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, Medium 199, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz's L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, Waymouth's MB752/1, CMRL-1066, Williams' medium E, Brinster's BMOC-3 Medium, E8 medium(Nature Methods, 2011, 8, 424-429), ReproFF2 배지(리프로셀사), 및 이들의 혼합 배지 등이 열거된다. 또한, 간엽계 줄기 세포 배양용으로 개변된 배지나, 상기 기초 배지와 다른 배지의 혼합물 등을 사용해도 좋다. 원하는 바에 따라, 이들 배지에 대해 본 발명의 저감된 아미노산 등의 저분자를 제거하는 조작을 가해도 좋다.

본 발명의 배지에는 자체 공지된 첨가물을 함유할 수 있다. 첨가물로서는 간엽계 줄기 세포의 증식을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 성장 인자(예를 들면, 인슐린 등), 철원(예를 들면, 트랜스페린 등), 폴리아민류(예를 들면, 프토레신 등), 미네랄(예를 들면, 세렌산나트륨 등), 당류(예를 들면, 글루코스 등), 유기산(예를 들면, 피루브산, 락트산 등), 본 발명의 저감되는 아미노산 이외의 아미노산(예를 들면, L-글루타민 등), 환원제(예를 들면, 2-머캅토에탄올 등), 비타민류(예를 들면, 아스코르브산, d-비오틴 등), 스테로이드(예를 들면, β-에스트라디올, 프로게스테론 등), 항생 물질(예를 들면, 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예를 들면, HEPES 등) 등, 지질류(예를 들면, 리놀산 등), 핵산류(예를 들면, 티미딘 등)가 열거된다. 또한, 종래로부터 간엽계 줄기 세포의 배양에 사용되어 온 자체 공지된 첨가물도 적절히 함유할 수 있다. 첨가물은 각각 자체 공지된 농도 범위 내에서 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명의 배지에는 혈청이 함유되어 있어도 좋다. 혈청으로서는 동물 유래의 혈청이면, 간엽계 줄기 세포의 증식을 저해하지 않는 것인 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 포유 동물 유래의 혈청(예를 들면, 소 태아 혈청, 인간 혈청 등)이며, 보다 바람직하게는 인간 혈청이다. 혈청의 농도는, 자체 공지된 농도 범위 내이면 좋다. 또한, 배양 후의 간엽계 줄기 세포를 의료 목적으로 사용하는 경우, 다른 동물 유래 성분은 혈액 매개 병원균의 감염원이나 이종 항원이 될 가능성이 있기 때문에, 혈청을 함유하지 않는 배지도 적합하게 사용할 수 있다. 혈청을 함유하지 않는 경우, 혈청의 대체 첨가물(예를 들면, Knockout Serum Replacement(KSR)(Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco) 등)을 사용해도 좋다. 상기 혈청 및 혈청 대체 첨가물은 본 발명의 저감되는 아미노산을 함유하지 않는 것, 또는 본 발명의 저감되는 아미노산 등의 저분자를 제거하는 조작이 가해진 것인 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 배지의 일례로서, 「본 발명의 저감되는 아미노산을 첨가하지 않고, 저분자 제거 처리가 가해진 혈청 또는 혈청 대체물을 함유하는 간엽계 줄기 세포용 배지」가 열거된다. 당해 배지에는, 본 발명의 저감되는 아미노산 이외의 아미노산, 구체적으로는 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린이 원하는 바에 따라 첨가되어 있어도 좋고, 또한 첨가되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 원하는 바에 따라 아르기닌, 시스테인, 글루타민 및 티로신이 첨가되어 있어도 좋고, 또한 첨가되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 배지에 의해 배양된 간엽계 줄기 세포를 세포 의료 등의 의료 목적으로 사용하는 경우, 병원균의 감염을 일으키거나, 이종 항원이 될 가능성이 있기 때문에, 본 발명의 배지에는 비인간 동물 유래 성분이 함유되지 않는 것이 보다 바람직하다.

상기의「본 발명의 저감되는 아미노산 등의 저분자를 제거하는 조작」은, 당해 조작에 제공되는 시료의 원하는 효과를 유지하면서 본 발명의 저감되는 아미노산을 제거할 수 있는 것이면 어떻게 행해도 좋지만, 투석이나 겔 여과 등의 조작이 열거된다. 구체예로서, 배지 제작에 사용하는 시약으로서, 아미노산 이외의 배지 성분(염류, 비타민 등)을 함유하는 시약에, 본 발명의 저감되는 아미노산 이외의 아미노산을 간엽계 줄기 세포의 증식에 필요한 농도로 첨가하고, 또한, 투석, 겔 여과 등의 조작에 의해, 본 발명의 저감되는 아미노산 및 기타 저분자를 제거한 혈청 등을 첨가하는 방법이 열거된다.

「줄기 세포」란, 자기 복제능 및 분화/증식능을 갖는 미숙한 세포를 의미한다. 줄기 세포에는, 분화 능력에 따라 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell), 복능성 줄기 세포(multipotent stem cell), 단능성 줄기 세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 줄기 세포란, 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 복능성 줄기 세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수종의 조직이나 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단능성 줄기 세포란, 특정한 조직이나 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다.

본 발명에 있어서 대상으로 하는 간엽계 줄기 세포는, 지방 세포, 골 세포, 연골 세포, 근 세포, 간 세포, 신경 세포 등으로 분화 가능한 복능성 줄기 세포의 1종이며, ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포와 달리, 생체에 이식했을 때에 종양을 형성할 가능성이 낮은 세포로서 알려져 있다. 본 발명에 있어서의 간엽계 줄기 세포는 골수로부터 채취된 간엽계 줄기 세포일 수 있고, 바람직하게는 1 이상의 간엽계 줄기 세포 마커(예를 들면, CD73, CD90, CD105 등) 양성일 수 있고, 보다 바람직하게는 당해 마커 양성이며, 또한, 간엽계 줄기 세포에서 발현이 확인되지 않는 분자의 발현이 음성일 수 있다. 간엽계 줄기 세포에서 발현이 확인되지 않는 분자의 예로서는 CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79, CD19, HLA-DR 등이 열거된다.

본 발명의 배지는 어느 동물 유래의 간엽계 줄기 세포의 증식에도 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 배지를 사용하여 배양될 수 있는 간엽계 줄기 세포는 예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 고양이목, 인간, 원숭이, 히말라야 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등 유래의 간엽계 줄기 세포이며, 바람직하게는 인간 유래의 간엽계 줄기 세포이다.

본 발명의 배지는 바람직하게는 간엽계 줄기 세포의 증식 배양용 배지이다. 「증식 배양용 배지」란, 간엽계 줄기 세포의 자기 복제능이나 분화 복능성을 유지한 상태로 당해 세포의 복제(즉, 증식)를 가능하게 하는 배지이다. 따라서, 본 발명의 배지에 의해 배양된 간엽계 줄기 세포는 증식능을 유지하고 있는 것을 특징으로 한다. 본 명세서 중「증식능」이란, 세포 노화 등에 의해 세포 분열을 행하는 능력이 상실되어 있지 않은 것을 의미하고, 예를 들면, 배양 중의 세포의 대부분(예를 들면, 세포 조성물 중의 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 100%의 세포)이 세포 노화 마커(예를 들면, 노화 관련 β-갈락토시다제 활성의 상승 등) 음성인 경우나, 배양 중의 세포의 대부분(예를 들면, 세포 조성물 중의 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 100%의 세포)이 세포 주기의 G1, S, G2 또는 M기 중 어느 하나에 속하는 경우, 당해 세포는 증식능을 유지하고 있다고 할 수 있다.

본 발명의 배지에 의하면, 증식능을 유지한 채 장기간에 효율적으로 간엽계 줄기 세포의 배양을 행하는 것이 가능해진다. 예를 들면, 본 발명의 배지에 의해, 50일 이상, 바람직하게는 70일 이상, 보다 바람직하게는 87일 이상, 더욱 바람직하게는 118일 이상 동안, 증식능을 유지한 채 간엽계 줄기 세포의 배양이 가능하다. 또한, 본 발명의 배지에 의하면, 간엽계 줄기 세포의 증식능이 손상되지 않기 때문에, 배양에 의해 다량의 간엽계 줄기 세포를 얻는 것이 가능해진다. 본 발명의 배지를 사용함으로써, 종래에 비해 대량의 간엽계 줄기 세포를 얻을 수 있고, 예를 들면, 배양 개시시의 1230배 이상의 세포수의 간엽계 줄기 세포를 얻을 수 있다.

본 발명의 배지에서 배양된 간엽계 줄기 세포는, 종래의 배지에서 배양된 간엽계 줄기 세포와 비교하여, 동 정도의 골 세포로의 분화능을 가진다. 골 세포로의 분화는, 예를 들면, 골 분화 유도 배지(예를 들면, 10(v/v)% FBS, 100nM 덱사메타존, 50μM L-아스코르브산-2인산, 10mM β-글리세롤린산을 첨가한 DMEM 배지)에서 간엽계 줄기 세포를 배양함으로써 행할 수 있다. 골 세포로 분화했는지 여부는 Arizalin Red 염색에 의해 골 조직 중의 칼슘 이온의 침착을 검출함으로써 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 배지에서 배양된 간엽계 줄기 세포는 종래의 배지에서 배양된 간엽계 줄기 세포와 비교하여, 동 정도의 연골 세포로의 분화능을 가진다. 연골 세포로의 분화는, 예를 들면, 연골 분화 키트(론자사: PT-3003)에 10ng/mL TGF-β3을 첨가하여 사용함으로써 행할 수 있다. 연골 세포로 분화했는지 여부는, 예를 들면, 시판 글루코사미노글리칸 측정 키트 등에 의해 글루코사미노글리칸의 생산을 검출함으로써 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 배지에서 배양된 간엽계 줄기 세포는, 종래의 배지에서 배양된 간엽계 줄기 세포와 비교하여, 지방 세포로의 분화능이 항진될 수 있다. 지방 세포로의 분화는, 예를 들면, 지방 분화 유도 배지(예를 들면, 10(v/v)% FBS, 0.01㎎/mL 인슐린, 1μM 덱사메타존, 0.2mM 인도메타신, 0.5mM 이소부틸메틸크산틴을 첨가한 고글루코스 함유 DMEM 배지)에서 간엽계 줄기 세포를 배양함으로써 이룰 수 있다. 지방 세포로 분화했는지 여부는, 예를 들면, 시판 트리글리세리드 측정 키트 등을 사용하여 트리글리세리드의 생산을 검출함으로써 확인할 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 발명은, 본 발명의 배지에서 간엽계 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 간엽계 줄기 세포의 배양 방법(이하,「본 발명의 배양 방법」이라고 기재하는 경우가 있다)을 제공한다.

간엽계 줄기 세포의 배양에 사용되는 배양기는 간엽계 줄기 세포의 배양이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 및 롤러 보틀을 들 수 있다.

배양기는 세포 배양성이라도 세포 비배양성이라도 좋고, 목적에 따라 적절히 선택된다. 세포 배양성의 배양기는 배양기 표면의 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 세포외 매트릭스(ECM) 등의 임의의 세포 지지용 기질로 코팅된 것일 수 있다. 세포 지지용 기질은 간엽계 줄기 세포의 접착을 목적으로 하는 임의의 물질일 수 있고, ECM을 사용한 매트리겔, 또는 콜라겐이나 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴 등이 열거된다.

기타 배양 조건은, 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃일 수 있다. CO₂ 농도는 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 2 내지 5%일 수 있다. 산소 농도는 1 내지 20%, 바람직하게는 1 내지 10%일 수 있다.

바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 배양 방법은 50일 이상, 바람직하게는 70일 이상, 보다 바람직하게는 87일 이상, 더욱 바람직하게는 118일 이상에 걸쳐 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 배양 방법에 의하면, 간엽계 줄기 세포의 증식능이 상실되지 않기 때문에, 상기 장기간의 배양을 행함으로써 다량의 간엽계 줄기 세포를 얻을 수 있고, 예를 들면, 배양 개시시의 세포수의 1230배 이상의 세포수의 간엽계 줄기 세포를 얻는 것이 가능하다.

본 발명은, 본 발명의 배양 방법에 의해 얻어지는 세포 조성물(이하,「본 발명의 세포 조성물」이라고도 기재한다)도 제공한다. 본 발명의 세포 조성물은, 이의 대부분(예를 들면, 세포 조성물 중의 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 100%의 세포)이 미분화된 간엽계 줄기 세포인 것이 바람직하다. 간엽계 줄기 세포의 공지의 마커의 예로서, CD73, CD90 및 CD105가 열거된다. 따라서, 본 발명의 세포 조성물은, 이의 대부분(예를 들면, 세포 조성물 중의 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 100%의 세포)이, CD73, CD90 및 CD105 중 어느 하나, 바람직하게는 어느 2개의 조합, 보다 바람직하게는 3개 전체 마커에 양성인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 세포 조성물은, 간엽계 줄기 세포이면 발현이 확인되지 않는 분자를 발현하고 있지 않는 것이 보다 바람직하다. 간엽계 줄기 세포에서 발현이 확인되지 않는 분자로서는, 예를 들면, CD45(조혈 줄기 세포에 있어서 발현됨), CD34(조혈 줄기 세포에 있어서 발현됨), CD14(단구, 마크로파지에 있어서 발현됨), CD11b(단구, 마크로파지, NK 세포, 과립구에 있어서 발현됨), CD79(B 세포에 있어서 발현됨), CD19(B 세포에 있어서 발현됨) 및 HLA-DR(수상 세포, B 세포, 단구, 마크로파지에 있어서 발현됨) 등이 열거된다. 따라서, 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 세포 조성물은, 이의 대부분(예를 들면, 세포 조성물 중의 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 100%의 세포)이 간엽계 줄기 세포에서 발현이 확인되지 않는 분자의 발현 음성이다.

본 발명의 배양 방법에 의해 얻어진 세포는, 세포 의료 등의 의료용에 적합하게 사용할 수 있다. 당해 세포는, 대상 질환 등에 따라서, 미분화 그대로, 또는 골 세포, 연골 세포 또는 지방 세포 등으로 분화시킨 후에 사용할 수 있다. 대상 질환으로서는 예를 들면, 월상(月狀) 골 무부성 괴사, 대퇴골 두 무부성 괴사(aseptic necrosis of the femoral head), 난단성 골 연골염, 요추 추간판 헤르니아, 허혈성 심질환, 표피 수포증 등이 열거된다. 또한, 당해 세포는 지방 세포로 분화시킨 후, 미용 정형용으로 사용하는 것도 가능하다.

당해 세포 의료의 대상이 되는 동물로서는 예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트 등의 설치류나 토끼 등의 실험 동물, 돼지, 소, 염소, 말, 양, 밍크 등의 가축, 개, 고양이 등의 펫(pet), 인간, 원숭이, 히말라야 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등이 열거되고, 바람직하게는 인간이다.

상기 세포 의료에 있어서의 세포의 투여량 및 투여 방법은, 원하는 효과를 얻을 수 있으면 특별히 제한되지 않으며, 치료 대상이 되는 질환이나 증상의 정도, 투여 대상이 되는 동물 등에 따라 적절히 설정할 수 있다.

이하에 실시예를 나타내어, 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예

(재료와 방법)

1. 세포

LONZA사로부터 구입한, 정상 인간 도너로부터 채취, 조제된 인간 간엽계 줄기 세포(카탈로그 번호: PT-2501), 및 본 발명자들이 자주 채취한 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: BM103~104)를 사용하였다.

2. 간엽계 줄기 세포의 배양

간엽계 줄기 세포의 배양에 있어서는, 아미노산 이외의 DMEM(Dulbecco;s modified Eagle medium, GIBCO)을 구성하는 성분(염류, 비타민 등)으로 이루어지는 배지(이하,「Zero 배지」라고 표기되는 경우가 있다), 여기에 20종류의 아미노산을 첨가한 배지(이하,「Full 배지」라고 표기되는 경우가 있다), 또는 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 아스파라긴산 및 글루탐산을 제외한 13종류의 아미노산을 첨가한 배지(이하, 「-7 배지」라고 표기되는 경우가 있다), 각각의 배지에, 투석에 의해 저분자를 제거한 FBS(fetal bovine serum, 라이프테크놀로지즈사: 26400-044)를 10(v/v)%가 되도록 첨가하여, 사용하였다.

표 1에는, 배양에 사용한 혈청 중에 있어서의 투석 후의, 상기 7종 아미노산의 농도, 이들 아미노산의 -7 배지에 첨가했을 때의 사용시의 최종 농도, 일반적인 배지에 있어서의 이들 아미노산의 농도를 기재한다.

간엽계 줄기 세포의 배양은, 37℃, 5% CO₂ 분위기 하의 인큐베이터 내에서 행하였다.

3. 지방 세포로의 분화 배양 및 지방 세포의 유지 배양

간엽계 줄기 세포로부터 지방 세포로의 분화는, 지방 분화 유도 배지(10(v/v)% FBS(라이프테크놀로지즈사: 26400-044), 0.01㎎/mL 인슐린(나카라이테스크사: 19251-95), 1μM 덱사메타존(시그마사: D2915), 0.2mM 인도메타신(시그마사: I7378), 0.5mM 이소부틸메틸크산틴(시그마사: I7018)을 첨가한 고 글루코스 함유 DMEM 배지(GIBCO))를 사용하여 행하였다. 지방 세포로의 분화 후의 배양은, 지방 유지 배지(10(v/v)% FBS(라이프테크놀로지즈사: 26400-044), 0.01㎎/mL 인슐린(나카라이테스크사: 19251-95)를 첨가한 고 글루코스 함유 DMEM 배지(GIBCO)를 사용하여 행하였다.

간엽계 줄기 세포로부터 지방 세포로의 분화 배양 및 분화 후의 유지 배양은, 37℃, 5% CO₂ 분위기 하의 인큐베이터 내에서 행하였다.

4. 지방 세포 분화 유도와 분화 효율의 측정

간엽계 줄기 세포를, 6웰 플레이트의 1웰당 2×10⁵ 세포를 파종하고, 간엽계 줄기 세포용 배지에서 100% 컨플루언트(confluent)가 될 때까지 배양을 행하였다. 계속해서 지방 분화 유도 배지로 배지 교환하고, 3일간 배양한 후에, 지방 유지 배지로 배지 교환하고, 다시 3일간 배양을 행하였다. 이 지방 분화 유도 배지와 지방 유지 배지에 의한 계 6일간의 배양을 3사이클 합계 18일간 실시하였다.

배양 후의 세포를 10% 포르말린으로 고정시킨 후, 오일레드 O 염색에 제공하였다. 계속해서 세포를 0.1% Thesit(등록상표)(라우로마크로골)에 용해하고, 혈청 트리글리세리드 측정 키트(시그마사: TR0100-1KT)로 트리글리세리드량을 정량하였다. BCA(비신코닌산) 시약을 사용하여 단백질을 정량하고, 단백질량당 트리글리세리드량을 비교함으로써, 세포별 분화 효율을 검토하였다.

(결과)

실시예 1: -7 배지에서의 단기간 배양에 의한 간엽계 줄기 세포의 세포 증식 촉진 효과(도 1)

Zero 배지, Full 배지 또는 -7 배지에서 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: OF3825)를 7일간 배양하고, 세포수를 평가하였다. 세포수의 계측은 CCK 어세이에 의해 행하였다. 시판 키트인 Cell counting kit-8(Dojindo)를 사용하고, 키트 부속의 사용 설명서에 따라 조작을 행하였다. CCK 어세이에서는 OD450nm(세로축)에 세포수가 비례한다. 각 배지당 3웰에서 평가를 행하여, 각 웰의 값을 ○로, 3웰의 평균값을 ●로 나타내었다. Full 배지에서 배양한 경우에 비해, -7 배지에서는 간엽계 줄기 세포의 증식이 현저하게 촉진되고 있는 것을 밝혀내었다.

실시예 2: -7 배지에서의 장기간 배양에 의한 간엽계 줄기 세포의 세포 증식 촉진 효과(도 2)

-7 배지 또는 Full 배지에서 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: OF3825)를 70일간 배양하고, 각각의 배지에서 배양했을 때의 누적 세포수를 계측하였다. 계대시에, 세포를 트립신 처리로 배양 용기로부터 벗겨내고, 트리판블루와 혼화한 후, 세포 현탁액을 혈구 계산반에 제공하고, 세포수를 계측하였다. 세포수의 계측은, 이하의 실시예에 있어서도 같은 방법으로 행하였다. Full 배지에서 배양한 경우에 비해, -7 배지에서 배양한 경우에는 누적 세포수가 현저하게 증대되었다. 따라서, -7 배지는 간엽계 줄기 세포의 장기간에 걸친 증식 배양에 적합한 배지인 것이 나타났다.

실시예 3: 상이한 로트의 간엽계 줄기 세포의 -7 배지에서의 배양에 의한 세포 증식 촉진 효과(도 3)

로트 번호: OF3853 및 로트 번호: OF4266의 인간 간엽계 줄기 세포를 -7 배지 또는 Full 배지에 있어서 30일간 배양하고, 누적 세포수를 계측하였다. 양 로트의 인간 간엽계 줄기 세포에 관해서, -7 배지에 의한 현저한 증식 촉진 효과가 확인되었다.

실시예 4: Full 배지에 의한 간엽계 줄기 세포의 배양에 있어서의 증식 배양 가능 기간의 검토(도 4)

-7 배지 또는 Full 배지를 사용하여, 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: BM103)을 109일간 배양하고, 각각 누적 세포수를 계측하였다. -7 배지에서의 배양에서는 누적 세포수가 한계에 도달하지 않고, 계속 증식한 것에 대해, Full 배지에서 배양한 경우에는 배양 개시로부터 70일째 이후에는 누적 세포수가 거의 한계가 되었다. Full 배지에서의 배양에 있어서, 한계가 될 때까지의 배양에 의해, 최종적인 누적 세포수는 배양 개시시의 세포수의 1230배이었다. 따라서, Full 배지에 의한 간엽계 줄기 세포의 증식 배양 가능한 기간은 약 70일간이고, 이 경우의 누적 세포수는 배양 개시시의 세포수의 1230배 정도인 것이 밝혀졌다.

참고예 1: -7 배지에서 배양한 간엽계 줄기 세포의 지방 세포로의 분화 촉진(도 5)

-7 배지 또는 Full 배지에서 20 내지 24일간 배양한 인간 간엽계 줄기 세포(로트 번호: BM103PN2(도 5A) 및 BM105PN2(도 5B))를 사용하여, 지방 세포, 골 세포 또는 연골 세포로의 분화 유도를 행하였다. 골 세포 및 연골 세포로의 분화에 관해서는, -7 배지에서 배양한 간엽계 줄기 세포는, Full 배지에서 배양한 것과 비교하여, 동 정도의 분화 효율을 나타내었다. 지방 세포로의 분화에 관해서는, -7 배지에서 배양한 간엽계 줄기 세포는 Full 배지에서 배양한 것과 비교하여 분화 효율이 현저하게 높았다(도 5). 따라서, -7 배지는 간엽계 줄기 세포의 골 세포 및 연골 세포로의 분화에 관해서는 종래의 배지와 동 정도의 분화능을 유지하면서, 종래보다도 효율이 양호한 지방 세포로의 분화를 가능하게 하는 배지인 것이 나타났다.

본 발명에 의하면, 간엽계 줄기 세포를 노화시키지 않고 장기간 증식 배양을 행하는 것이 가능하며, 다량의 간엽계 줄기 세포가 필요해지는 경우에 특히 유용하다. 본 발명에 의해 배양된 간엽계 줄기 세포는, 세포 의료 등의 용도에 적합하게 사용할 수 있다.

본 출원은, 일본에서 출원된 특원2014-168580(출원일 2014년 8월 21일)을 기초로 하고 있으며 이의 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims

적어도 1종의 아미노산의 농도가, 글리신 5μM 미만, 알라닌 5μM 미만, 세린 3μM 미만, 프롤린 5μM 미만, 아스파라긴 1μM 미만, 아스파라긴산 2μM 미만 및/또는 글루탐산 3μM 미만인, 간엽계 줄기 세포용 배지.
제1항에 있어서, 글리신이 5μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 글리신이 1μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 알라닌이 5μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 알라닌이 1μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 세린이 3μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 세린이 0.7μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 프롤린이 5μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 프롤린이 1μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 아스파라긴이 1μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 아스파라긴이 0.1μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 아스파라긴산이 2μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 아스파라긴산이 0.5μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 글루탐산이 3μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 글루탐산이 0.7μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 글리신이 5μM 미만, 알라닌이 5μM 미만, 세린이 3μM 미만, 프롤린이 5μM 미만, 아스파라긴이 1μM 미만, 아스파라긴산이 2μM 미만, 및 글루탐산이 3μM 미만인, 배지.
제1항에 있어서, 글리신이 1μM 미만, 알라닌이 1μM 미만, 세린이 0.7μM 미만, 프롤린이 1μM 미만, 아스파라긴이 0.1μM 미만, 아스파라긴산이 0.5μM 미만 및 글루탐산이 0.7μM 미만인, 배지.
제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 저분자 제거 처리가 가해진 혈청 또는 혈청 대체물을 함유하는, 배지.
제18항에 있어서, 상기 저분자 제거 처리가 투석에 의해 행해지는, 배지.
제18항 또는 제19항에 있어서, 혈청이 인간 혈청인, 배지.
제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 유래의 성분을 함유하지 않는, 배지.
제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 간엽계 줄기 세포가 인간 간엽계 줄기 세포인, 배지.
제22항에 있어서, 간엽계 줄기 세포가 골수로부터 채취된 것인 배지.
제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 기재된 배지에서 간엽계 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 간엽계 줄기 세포의 배양 방법.
제24항에 있어서, 간엽계 줄기 세포를 배양하는 공정이 간엽계 줄기 세포를 70일 이상에 걸쳐 증식시키는 공정인, 배양 방법.
제24항 또는 제25항에 기재된 배양 방법에 의해 얻어지는, 세포 조성물.
제26항에 있어서, CD73, CD90 및 CD105로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 마커에 양성인, 세포 조성물.
제26항에 있어서, CD73, CD90 및 CD105로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 마커에 양성이며, 또한, CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79, CD19 및 HLA-DR 음성인, 세포 조성물.
제24항 또는 제25항에 기재된 배양 방법에 의해 얻어지는, 세포 의료용 세포.