JP6634822B2 - 幹細胞の培養用培地 - Google Patents
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Description
[1]脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを含有してなる幹細胞の培養用培地。
[2]脂肪酸担持量の低減が脱脂肪酸処理によるものである、[1]記載の培地。
[3]脱脂肪酸処理が活性炭処理である、[2]記載の培地。
[4]アルブミンの脂肪酸担持量が10mg/g以下である、[1]〜[3]のいずれかに記載の培地。
[5]アルブミンの脂肪酸担持量が6mg/g以下である、[1]〜[3]のいずれかに記載の培地。
[6]アルブミンの脂肪酸担持量が0.1mg/g〜0.65mg/gである、[1]〜[3]のいずれかに記載の培地。
[7]培地中の脂肪酸含有量が60μM以下である、[1]〜[6]のいずれかに記載の培地。
[8]アルブミン1g当たりの脂肪酸担持量が0.1mg〜0.65mgである、幹細胞の培養用培地。
[9]培地中の脂肪酸含有量が60μM以下である、[8]に記載の培地。
[10]脂肪酸が長鎖脂肪酸である、[1]〜[9]のいずれかに記載の培地。
[11]脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも1種である、[1]〜[9]のいずれかに記載の培地。
[12]アルブミンがヒト血清由来アルブミンである、[1]〜[11]のいずれかに記載の培地。
[13]幹細胞が多能性幹細胞である、[1]〜[12]のいずれかに記載の培地。
[14]多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、[13]記載の培地。
[15][1]〜[12]のいずれかに記載の培地で培養する工程を含む、幹細胞の培養方法。
[16]幹細胞が多能性幹細胞である、[15]記載の方法。
[17]多能性幹細胞が、胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、[16]記載の方法。
[18]脂肪酸担持量を測定し、脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを選抜する工程を含む、培地への添加に適したアルブミンを選択する方法。
[19]アルブミンを脱脂肪酸処理して脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを調製し、該調製されたアルブミンを培地に添加することを特徴とする、幹細胞の培養用培地の製造方法。
[20]脱脂肪酸処理が活性炭処理である、[19]記載の方法。
[21]活性炭処理がアルブミン重量当り30〜60重量%の活性炭量を用いて行われる、[20]記載の方法。
[22]活性炭処理がpH6.7〜7.3で行われる、[20]または[21]記載の方法。
[23]活性炭処理がpH3.7〜4.3で行われる、[20]または[21]記載の方法。
[24]調製されたアルブミンの脂肪酸担持量が10mg/g以下である、[19]〜[23]のいずれかに記載の方法。
[25]調製されたアルブミンの脂肪酸担持量が6mg/g以下である、[19]〜[23]のいずれかに記載の方法。
[26]調製されたアルブミンの脂肪酸担持量が0.1mg/g〜0.65mg/gである、[19]〜[23]のいずれかに記載の方法。
[27]培地中の脂肪酸含有量が60μM以下である、[19]〜[26]のいずれかに記載の方法。
[28]脂肪酸が長鎖脂肪酸である、[19]〜[27]のいずれかに記載の方法。
[29]脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも1種である、[19]〜[27]のいずれかに記載の方法。
[30]アルブミンがヒト血清由来アルブミンである、[19]〜[29]のいずれかに記載の方法。
[31]幹細胞が多能性幹細胞である、[19]〜[30]のいずれかに記載の方法。
[32]多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、[31]記載の方法。
[33]脂肪酸担持量が0.1mg/g〜0.65mg/gであるアルブミンを含有してなる幹細胞培養用の培地添加剤。
[34]脂肪酸が長鎖脂肪酸である、[33]に記載の培地添加剤。
[35]脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも1種である、[33]に記載の培地添加剤。
[36]アルブミンがヒト血清由来アルブミンである、[33]〜[35]のいずれかに記載の培地添加剤。
[37]幹細胞が多能性幹細胞である、[33]〜[36]のいずれかに記載の培地添加剤。
[38]多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、[37]に記載の培地添加剤。
[39]脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを含有してなる培地で培養する工程を含む、幹細胞の培養システムであって、該脂肪酸担持量が、幹細胞を未分化状態で維持することができるように選択される培養システム。
[40]脂肪酸担持量の低減が脱脂肪酸処理によるものである、[39]記載の培養システム。
[41]脱脂肪酸処理が活性炭処理である、[40]記載の培養システム。
[42]アルブミンの脂肪酸担持量が10mg/g以下である、[39]〜[41]のいずれかに記載の培養システム。
[43]アルブミンの脂肪酸担持量が6mg/g以下である、[39]〜[41]のいずれかに記載の培養システム。
[44]アルブミンの脂肪酸担持量が0.1mg/g〜0.65mg/gである、[39]〜[41]のいずれかに記載の培養システム。
[45]培地中の脂肪酸含有量が60μM以下である、[39]〜[44]のいずれかに記載の培養システム。
[46]脂肪酸が長鎖脂肪酸である、[39]〜[45]のいずれかに記載の培養システム。
[47]脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも1種である、[39]〜[45]のいずれかに記載の培養システム。
[48]アルブミンがヒト血清由来アルブミンである、[39]〜[47]のいずれかに記載の培養システム。
[49]幹細胞が多能性幹細胞である、[39]〜[48]のいずれかに記載の培養システム。
[50]多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、[49]記載の培養システム。
1.本発明の培地
本明細書中、「長鎖脂肪酸」は、炭素数12以上の脂肪酸を意味する。幹細胞の増殖阻害作用を有する長鎖脂肪酸であれば、本発明の培地において低減される長鎖脂肪酸は特に限定されないが、低減されるべき長鎖脂肪酸の具体例としては、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸およびアラキドン酸が挙げられ、好ましい低減されるべき長鎖脂肪酸の例として、ステアリン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸およびアラキドン酸が挙げられる。
2種以上の脂肪酸がアルブミンに結合している場合は、その合計量が上記範囲となるように低減されることが好ましい。
また、アルブミンの脂肪酸担持量を0.1mg/g未満にした場合でも所望の効果は得られるが、脂肪酸担持量を0.1mg/g未満にするには、例えば、イオン交換クロマトグラフィー等の方法により更に脱脂肪酸処理を行う必要があり、活性炭処理等の簡便な方法と比べ、時間、労力、費用等を要する。従って、アルブミンの脂肪酸担持量を0.1mg/g未満にした場合には産業レベルで本発明の培地を大量生産するのには不利である。
2種以上の脂肪酸がアルブミンに結合している場合は、その合計量が上記範囲となるように低減されることが好ましい。
2種以上の脂肪酸が培地中に含まれている場合には、その合計量が上記範囲となるように低減されることが好ましい。
2.本発明の製造方法
一実施態様として、本発明の製造方法は、アルブミンを脱脂肪酸処理して脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを調製し(工程1)、該調製されたアルブミンを培地に添加する(工程2)方法である。
(工程1) アルブミンを脱脂肪酸処理して脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを調製する工程
上記、「本発明の培地」の項に準じて実施することができる。要すれば、ヒト由来の血清アルブミンやrHSAを活性炭処理、イオン交換処理、加熱処理等の脱脂肪酸処理(好ましくは活性炭処理)に付し、脂肪酸担持量が低減された(好ましくは脂肪酸担持量10mg/g以下、より好ましくは6mg/g以下となるよう、いっそう好ましくは実質的に脂肪酸を担持しない)アルブミンを調製する。脂肪酸担持量が低減されたことの確認は、当分野で通常実施されている方法またはそれに準じた方法を用いてアルブミンに結合している脂肪酸の量を測定することによって実施することができ、測定キットとして市販されているものを利用することができる。
一態様において、アルブミンの脂肪酸担持量は、10mg/g以下、より好ましくは6mg/g以下であって、かつ、0.1mg/g以上であり得る。具体的には、脂肪酸担持量は、0.1mg/g〜0.8mg/gであり得、好ましくは0.1mg/g〜0.65mg/g、または、0.2mg/g〜0.8mg/g、より好ましくは0.2mg/g〜0.65mg/g、最も好ましくは0.29mg/g〜0.65mg/gであり得る。
上記、「本発明の培地」の項に準じて実施することができる。脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを培地(基礎培地)に、終濃度が0〜50mg/mL、好ましくは0.01〜30mg/mL、より好ましくは0.05〜10mg/mL、さらに好ましくは0.5〜5mg/mLとなるように添加する。基礎培地としては、上記、「本発明の培地」の項で例示したものが同様に用いられる。
かくして幹細胞の培養用培地を製造することができる。
3.本発明の選択方法
一実施態様として、本発明の選択方法は、培地への添加候補となるアルブミンの脂肪酸担持量を測定し(工程1)、脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを選抜する(工程2)方法である。
(工程1)アルブミンの脂肪酸担持量を測定する工程
上記、「本発明の培地」の項に準じて実施することができる。要すれば、当分野で通常実施されている方法またはそれに準じた方法を用いて実施することができ、例えば、Duncombeの抽出法、アシル−CoAシンセターゼ(ACS)とアシル−CoAオキシダーゼ(ACOD)を使用したACS−ACOD法などが挙げられる。いずれも測定キットとして市販されているものを利用することができる。
上記工程1で得られた測定結果に基づいて脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを選抜する工程である。「脂肪酸担持量が低減されたアルブミン」としては、好ましくは脂肪酸担持量10mg/g以下、より好ましくは6mg/g以下、いっそう好ましくは実質的に脂肪酸を担持しないアルブミンが挙げられる。
一態様において、アルブミンの脂肪酸担持量は、10mg/g以下、より好ましくは6mg/g以下であって、かつ、0.1mg/g以上であり得る。具体的には、脂肪酸担持量は、0.1mg/g〜0.8mg/gであり得、好ましくは0.1mg/g〜0.65mg/g、または、0.2mg/g〜0.8mg/g、より好ましくは0.2mg/g〜0.65mg/g、最も好ましくは0.29mg/g〜0.65mg/gであり得る。
かくして選抜された「脂肪酸担持量が低減されたアルブミン」は幹細胞培養用の培地に好適に添加される。
4.本発明の培養方法
本発明の培養方法は、幹細胞を本発明の培地で培養する工程を含む。
幹細胞の培養に用いられる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。
5.本発明の添加剤
6.本発明の培養システム
1.アルブミンの精製(活性炭処理)
ヒト血清アルブミンの生理食塩水溶液(40ml、25%)にリン酸緩衝液(pH7.2)を40ml加え、予め200℃で30分間加熱した活性炭(5g、和光純薬社製)にリン酸緩衝液20mlで懸濁した液に加えた。4℃で3時間撹拌した後、4℃にて11,900rpmで20分間遠心分離した。沈降した活性炭をデカンテーションで除き、反応液を0.22μmのシリンジフィルターでろ過した。ろ過した液を100倍希釈し、島津製作所製UV吸収測定装置UV1800を用いて波長260nm、280nm、320nmで吸光度を測定して計算式(A280-A320)/0.55×100にて濃度を算出した。
各種被験化合物による人工多能性幹細胞(iPS細胞)の増殖効果を評価した。iPS細胞は、iPSアカデミアジャパン社より購入した201B7株を用いた。細胞培養は、基底膜マトリックスをコートした培養容器(日本ベクトンディッキンソン社、Falcon培養シャーレもしくはFalcon培養プレート)を用い、5%CO2/37℃の条件で行った。
各種被験化合物は、現在のところ、ヒト多能性幹細胞を培養するための最小組成と考えられる「E8」組成(Nature Methods, 2011, 8, 424-429にて開示される)の培地に、所定の濃度にて添加し、培養に用いることにより、その効果を検討した。
アルブミン10mgに相当する溶液または粉末を、1%食塩水を用いて200μlに調製し、メタノール400μlとクロロホルム200μlを加えて10分間振とうした。クロロホルム200μlと1%食塩水200μlを加え10分間振とうした後、10,000rpmで2分間遠心分離して下層を分取した。得られたクロロホルム層の溶媒を乾固しアッセイ用サンプルとした。サンプルを2−プロパノールに溶解し、脂肪酸量測定キット(ラボアッセイTMNEFA、和光純薬社製)を用いて検量線法により脂肪酸量をオレイン酸換算にて定量した。吸光度の測定には、コロナエレクトリック社のSH900を用いた。
ヒト血清由来アルブミンを最終濃度2.6g/Lで培地に添加し、各アルブミンの培養成績を比較した。数種のアルブミンについて、脂質除去を目的とした精製処理(脱脂肪酸処理)を施した。培養期間は1週間であった。6ウェルプレートの1ウェルあたり、13,000個の生細胞をシングルセル播種した。基底膜マトリックスとして大阪大学より購入した、ラミニン511の活性ドメインを含む断片を1ウェル当たり5μgコートした。播種時に使用する培地にはY−27632を添加(最終濃度10μM、ナカライテスク社:08945−84)した。翌日以降はY−27632を添加していない培地で培養した。
各々の培地毎に実験を3連にて行った結果を表1に示す。
1週間の培養後、アルカリフォスファターゼ(ALP)染色を行い、未分化能維持の確認を行った。染色には、アルカリフォスファターゼ染色キット(シグマアルドリッジ社:86−R)を用いた。培養成績の欄において、+または−と表記した場合の培養後の様子を、図1に示す。Nova Biologics、Sigma、Biocell Laboratoriesの各社から入手したアルブミンを培地に添加した場合、一部を除いて細胞は増殖しなかった。しかし、アルブミンを精製処理に供した後で培地に添加した場合、細胞は増殖した。また、これら全てのアルブミンについて、脂肪酸担持量(脂肪酸含有量)を測定したところ、表1に示す結果となった。以上の結果から、アルブミンに結合した脂肪酸が、細胞の正常な増殖を阻害することがわかった。
脂肪酸担持量(mg/g)
(脂肪酸添加)
オレイン酸12.6μlを15mlのファルコンチューブに入れ、精製したヒト血清アルブミンBの溶液(5.9ml、8.8%)を加えた。溶液を37℃で3時間振とうし、放冷した後0.22μmのシリンジフィルターでろ過した。
かくしてオレイン酸を吸着させたアルブミンを得た。得られたオレイン酸を吸着させたアルブミンを、最終濃度2.6g/Lにて添加した培地を用いて実験を行った(培地中オレイン酸濃度196μM)。
パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸についても、表2に記載の用量の脂肪酸と精製したヒト血清アルブミンを用いて同様の処理を行い、各種の脂肪酸を吸着させたアルブミンを得、各種の脂肪酸を吸着させたアルブミンが添加された培地を調製した。
尚、上記吸着操作後のアルブミンの脂肪酸担持量の測定は行っていない。
アルブミン10mgに相当する溶液または粉末を、1%食塩水を用いて200μlに調製し、メタノール400μlとクロロホルム200μlを加えて10分間振とうした。クロロホルム200μlと1%食塩水200μlを加え10分間振とうした後、10,000rpmで2分間遠心分離して下層を分取した。得られたクロロホルム層の溶媒を乾固しアッセイ用サンプルとした。サンプルを2−プロパノールに溶解し、脂肪酸量測定キット(ラボアッセイTMNEFA、和光純薬社製)を用いて検量線法により脂肪酸量をオレイン酸換算にて定量した。吸光度の測定には、コロナエレクトリック社のSH900を用いた。
培地中の添加脂肪酸及び脂肪酸の添加濃度、アルブミン1gあたりの脂肪酸含有量(脂肪酸担持量)を表2に示す。
脂肪酸を吸着させたアルブミンを表2に記載の濃度で添加された培地を用い、幹細胞を培養した。培養期間は1週間であった。6ウェルプレートの1ウェルあたり、13,000個の生細胞をシングルセル播種した。基底膜マトリックスとして大阪大学より購入した、ラミニン511の活性ドメインを含む断片を1ウェル当たり5μgコートした。播種時に使用する培地にはY−27632を添加(最終濃度10μM)した。翌日以降はY−27632を添加していない培地で培養した。
各ウェルから、トリプルセレクト(ライフテクノロジーズ社:12563−011)で細胞を剥離し、ウェル内の生細胞数を測定した。その結果を図2に示す。オレイン酸、パルミチン酸、ともに、添加によって、細胞増殖を抑制することがわかった。その抑制効果は、脂肪酸添加濃度に比例し、高濃度の脂肪酸を添加するほど、強く細胞増殖を抑制した。以上の結果から、アルブミンに吸着した脂肪酸の濃度依存的に、細胞培養効率が低下することがわかった。
以下の5通りの精製度のヒト血清アルブミンを調製した。
(I)群:脂肪酸除去処理が施されたヒト血清アルブミン(Sigma社)を使用した。脂肪酸担持量は0.07mg/g以下であると考えられる。
(II)群:ヒト血清由来アルブミン(Nova Biologics社)をpH4の条件下、アルブミン重量に対して50重量%の活性炭を使用して精製した後に使用した。脂肪酸担持量の測定結果は、0.29mg/gであった。
(III)群:ヒト血清由来アルブミン(Nova Biologics社)をpH7の条件下、アルブミン重量に対して50重量%の活性炭を使用して精製した後に使用した。脂肪酸担持量の測定結果は、0.65mg/gであった。
(IV)群:ヒト血清由来アルブミン(Nova Biologics社)をpH7の条件下、アルブミン重量に対して25重量%の活性炭を使用して精製した後に使用した。脂肪酸担持量の測定結果は、0.92mg/gであった。
(V)群:ヒト血清由来アルブミン(Nova Biologics社)をpH7の条件下、アルブミン重量に対して13重量%の活性炭を使用して精製した後に使用した。脂肪酸担持量の測定結果は、1.86mg/gであった。
上記各群のヒト血清アルブミンを最終濃度2.6g/Lで培地に添加し、iPS細胞の培養を行った。基底膜マトリックスとしてラミニン511の活性ドメインを含む断片(iMatrix−511(株式会社ニッピ社))を5μg/wellでコートした6ウェルプレートを使用し、1ウェル当り13,000個のiPS細胞をシングルセル播種し、1週間培養した。播種時に使用する培地にのみ、最終濃度10μMでY−27632(ナカライテスク社:08945−84)を添加した。
各ウェルからトリプルセレクト(ライフテクノロジーズ社:12563−011)で細胞を剥離し、生細胞数を計測した。図3には、各群についての3回の独立した実験の平均値を示す。培地性能に問題がない場合、本培養法で1週間の培養を行った場合のiPS細胞の生細胞数は3.0×105細胞程度以上になる。図3に示すように、(I)〜(III)群においては、良好な細胞増殖が認められ、いずれも3.0×105を超える細胞数が得られた。一方で、(IV)および(V)群では、明らかな増殖阻害作用が認められた。このことから、少なくともアルブミンの脂肪酸担持量が0.65mg/g以下であれば、iPS細胞は良好に増殖できることが明らかとなった。
(I)〜(III)群については、上記培養後さらに1週間の培養を行い、アルカリホスファターゼ(ALP)染色により分化率を調べた。分化率(%)は、各ウェル中における、ALP陰性コロニー数/全コロニー数×100にて算出した。(I)、(II)および(III)群の分化率は、それぞれ0.4%、1.5%および2.6%であった。これらの数値は十分に低い値といえ、いずれの条件もiPS細胞の未分化状態を維持したまま増殖させるのに適していることが明らかとなった。同様の結果は、顕微鏡によるコロニーの観察においても得られ、アルブミンの精製度が高いほど、iPS細胞の未分化状態がより高い割合で維持できることが確認された。
オクタン酸18.3μLを50mLのファルコンチューブに入れ、脱脂肪酸処理したヒト血清アルブミンB溶液(15mL、10%、Sigma社)を加えた。該溶液を37℃で7時間振とうし、4℃で終夜静置後、0.22μmのシリンジフィルターでろ過した。かくしてオクタン酸を再吸着させたアルブミンを得た。該オクタン酸を再吸着させたアルブミンの脂肪酸担持量を測定し、該オクタン酸再吸着後のアルブミンと再吸着前の脱脂肪酸処理後の精製アルブミンを、培地中の最終オクタン酸濃度が28μMまたは57μMとなるように比率を調製しながら適宜混合させた。培地にはアルブミンの最終濃度が2.6g/Lとなるように添加した。
オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸およびアラキドン酸についても同様の手技にて脂肪酸の再吸着を行った。培地中の最終濃度および添加量についても同様である。
上記のようにして作製した培地を使用し、各脂肪酸のiPS細胞の増殖に対する影響を検討した。基底膜マトリックスとしてラミニン511の活性ドメインを含む断片(iMatrix−511(株式会社ニッピ社))を5μg/wellでコートした6ウェルプレートを使用し、1ウェル当り13,000個のiPS細胞をシングルセル播種し、1週間培養した。播種時に使用する培地にのみ、最終濃度10μMでY−27632(ナカライテスク社:08945−84)を添加した。尚、陽性対照には、脂肪酸を再吸着させていないアルブミン、即ち、脱脂肪酸処理を施したアルブミンを使用してiPS細胞の培養を行った。
各ウェルからトリプルセレクト(ライフテクノロジーズ社:12563−011)で細胞を剥離し、生細胞数を計測した。図4には、各群についての3回の独立した実験の平均値を示す。
ステアリン酸、パルミチン酸、およびアラキドン酸を再吸着させた場合は、28μMと57μMの双方で細胞が死滅し、生細胞を得られなかった。リノール酸およびリノレン酸も、iPS細胞の増殖阻害作用が強く、57μMの再吸着の場合は細胞が死滅し、28μMの再吸着でも陽性対照と比べiPS細胞の増殖が顕著に抑制された。オレイン酸を再吸着させた場合でも、濃度依存的な細胞増殖阻害作用が認められ、28μMおよび57μMのいずれの場合でも陽性対照よりも少ない生細胞数であった。一方で、オクタン酸の場合は、57μMの再吸着においては、一定の細胞増殖阻害作用が認められたが、28μMの再吸着では陽性対照と同等の生細胞数であった。これらの検討から、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸またはアラキドン酸をアルブミンへ再吸着させた場合は、いずれの濃度で添加された場合でもiPS細胞の増殖に対して阻害作用を示すことが明らかとなった。オクタン酸の再吸着の場合は、再吸着の濃度によっては陽性対照と同等の生細胞数が得られ、その阻害作用は低いことが明らかとなった。
以上より、オレイン酸等の長鎖脂肪酸の方が、オクタン酸等の中鎖脂肪酸に比べiPS細胞への毒性が強く増殖阻害作用が高いことが示された。
Claims (34)
- 脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを含有してなる多能性幹細胞の培養用培地であって、アルブミンの脂肪酸担持量が0.1mg/g〜0.65mg/gであり、且つ培地中のアルブミンの添加量が終濃度0.5〜5mg/mLである、培地。
- 脂肪酸担持量の低減が脱脂肪酸処理によるものである、請求項1記載の培地。
- 脱脂肪酸処理が活性炭処理である、請求項2記載の培地。
- 培地中の脂肪酸含有量が60μM以下である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の培地。
- 脂肪酸が長鎖脂肪酸である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の培地。
- 脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の培地。
- アルブミンがヒト血清由来アルブミンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の培地。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、請求
項1〜7のいずれか1項に記載の培地。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞の培養方法。
- 多能性幹細胞が、胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、請
求項9記載の方法。 - 脂肪酸担持量を測定し、脂肪酸担持量が0.1mg/g〜0.65mg/gに低減されたアルブミンを選抜する工程を含む、多能性幹細胞培養用の培地添加剤の製造方法。
- アルブミンを脱脂肪酸処理して脂肪酸担持量が0.1mg/g〜0.65mg/gに低減されたアルブミンを調製し、該調製されたアルブミンを終濃度0.5〜5mg/mLとなるように培地に添加することを特徴とする、多能性幹細胞の培養用培地の製造方法。
- 脱脂肪酸処理が活性炭処理である、請求項12記載の方法。
- 活性炭処理がアルブミン重量当り30〜60重量%の活性炭量を用いて行われる、請求項13記載の方法。
- 活性炭処理がpH6.7〜7.3で行われる、請求項13または14記載の方法。
- 活性炭処理がpH3.7〜4.3で行われる、請求項13または14記載の方法。
- 培地中の脂肪酸含有量が60μM以下である、請求項12〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 脂肪酸が長鎖脂肪酸である、請求項12〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項12〜17のいずれか1項に記載の方法。
- アルブミンがヒト血清由来アルブミンである、請求項12〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、請求
項12〜20のいずれか1項に記載の方法。 - 脂肪酸担持量が0.1mg/g〜0.65mg/gであるアルブミンを含有してなる多能性幹細胞培養用の培地添加剤。
- 脂肪酸が長鎖脂肪酸である、請求項22に記載の培地添加剤。
- 脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項22に記載の培地添加剤。
- アルブミンがヒト血清由来アルブミンである、請求項22〜24のいずれか1項に記載の培地添加剤。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、請求
項22〜25のいずれか1項に記載の培地添加剤。 - 脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを終濃度0.5〜5mg/mLで含有してなる培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞の培養システムであって、該脂肪酸担持量が、多能性幹細胞を未分化状態で維持することができるように選択される培養システムであって、アルブミンの脂肪酸担持量が0.1mg/g〜0.65mg/gであるシステム。
- 脂肪酸担持量の低減が脱脂肪酸処理によるものである、請求項27記載の培養システム。
- 脱脂肪酸処理が活性炭処理である、請求項28記載の培養システム。
- 培地中の脂肪酸含有量が60μM以下である、請求項27〜29のいずれか1項に記載の培養システム。
- 脂肪酸が長鎖脂肪酸である、請求項27〜30のいずれか1項に記載の培養システム。
- 脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項27〜30のいずれか1項に記載の培養システム。
- アルブミンがヒト血清由来アルブミンである、請求項27〜32のいずれか1項に記載の培養システム。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、請求
項27〜33のいずれか1項に記載の培養システム。
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