JP6744084B2 - 幹細胞由来の分化細胞用培地、幹細胞からの分化細胞の製造及び該分化細胞を含む細胞医薬組成物の製造のための方法 - Google Patents
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Description
[2]前記幹細胞が誘導性多能性幹細胞である[1]の培地。
[3]前記分化細胞が心筋細胞である[1]又は[2]の培地。
[4]前記幹細胞がヒト由来である[1]〜[3]のいずれかの培地。
[5]アトルバスタチンを濃度1〜20μMで含む[1]〜[4]のいずれかの培地。
[6]前記培地が無血清培地である、[1]〜[5]のいずれかの培地。
[8]前記幹細胞が誘導性多能性幹細胞である[7]の幹細胞生存抑制剤。
[9]前記幹細胞がヒト由来である[7]又は[8]の幹細胞生存抑制剤。
[10]幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物の生体内での腫瘍化を抑制するため医薬組成物であり、[7]〜[9]のいずれかの幹細胞生存抑制剤を含む医薬組成物。
[12]前記幹細胞が誘導性多能性幹細胞である[11]の方法。
[13]前記分化細胞が心筋細胞である[11]又は[12]の方法
[14]前記幹細胞がヒト由来である[11]〜[13]のいずれかの方法。
[15]幹細胞を培養する工程と、幹細胞を分化誘導する工程と、をさらに含む[11]〜[14]のいずれかの方法。
[17]前記幹細胞が誘導性多能性幹細胞である[16]の方法。
[18]前記分化細胞が心筋細胞である[16]又は[17]の方法
[19]前記幹細胞がヒト由来である[16]〜[18]のいずれかの方法。
[20]幹細胞を培養する工程、をさらに含む[16]〜[19]のいずれかの方法。
前記細胞混合物をアトルバスタチンにより処理する手順を含む方法。
[22]前記幹細胞が誘導性多能性幹細胞である[21]の方法。
[23]前記分化細胞が心筋細胞である[21]又は[22]の方法
[24]前記幹細胞及び前記分化細胞がヒト由来である[21]〜[23]のいずれかの方法。
[25]幹細胞を培養する工程と、幹細胞を分化誘導する工程と、をさらに含む[21]〜[24]のいずれかの方法。
[27]幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物の製造のためのアトルバスタチンの使用。
[28]幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物の生体内での腫瘍化を抑制するためのアトルバスタチンの使用。
本発明に係る分化細胞用培地は、幹細胞から分化細胞を誘導するために用いられるものであり、アトルバスタチンを含むことを特徴とする。本発明において、アトルバスタチンは、未分化な幹細胞に特異的な生存抑制活性を有し、分化細胞(特に心筋細胞)の細胞死を誘発することなく、未分化幹細胞の生存を抑制することが明らかとなった。
RPMI-1640培地、EagleのMEM培地、ダルベッコ改変MEM培地、Glasgow’s MEM培地、α-MEM培地、199培地、IMDM培地、DMEM培地Hybridoma Serum free培地、Chemically Defined Hybridoma Serum Free培地、Ham’s Medium F-12、Ham’s Medium F-10、Ham’s Medium F12K、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy’s 5A、Leibovitz’s L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth’s MB752/1、CMRL-1066、Williams’ medium E、Brinster’s BMOC-3 Medium、E8 Medium、E8 medium(以上サーモフィッシャーサイエンティフィック)、ReproFF2(リプロセル社)、EX-CELL 302培地(SAFC社)またはEX-CELL-CD-CHO(SAFC社)及びこれらの混合物。
栄養因子としては、糖、アミノ酸、ビタミン、加水分解物または脂質などが挙げられる。
糖としては、グルコース、マンノースまたはフルクトースなどが挙げられ、1種または2種以上を組み合わせて用いられる。
アミノ酸としては、L−アラニン、L−アルギニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−システイン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシンまたはL−バリンなどが挙げられ、1種または2種以上を組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、d−ビオチン、D−パントテン酸、コリン、葉酸、myo−イノシトール、ナイアシンアミド、ピロドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはDL−α―トコフェロールなどが挙げられ、1種または2種以上を組み合わせて用いられる。
加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、とうもろこし、綿実、酵母抽出物などを加水分解したものが挙げられる。
脂質としては、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸などが挙げられる。
本発明が対象とする「幹細胞」は、自己複成能及び分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等が含まれる。「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。
多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
上述の通り、アトルバスタチンは、未分化な幹細胞に特異的な生存抑制活性を有し、分化細胞(特に心筋細胞)の細胞死を誘発することなく、未分化幹細胞の生存を抑制する。このため、アトルバスタチンは、in vitroでの細胞培養において幹細胞生存抑制剤として利用でき、さらにin vivoにおいても幹細胞生存抑制剤として、幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物の生体内での腫瘍化を抑制するため利用できる可能性がある。
本発明に係る分化細胞の製造方法は、分化誘導後の細胞をアトルバスタチンにより処理する工程を含むことを特徴とする。より具体的には、本発明に係る分化細胞の製造方法は、上述の本発明に係る分化細胞用培地中で分化誘導後の細胞を培養する手順を含むことを特徴とする。ただし、本発明に係る分化細胞の製造方法は、分化誘導前の幹細胞がアトルバスタチンにより処理されることを排除する趣旨ではない。すなわち、本発明に係る分化細胞の製造方法では、少なくとも分化誘導後の細胞(分化細胞に加えて未分化状態を維持した幹細胞を含み得る)がアトルバスタチンにより処理されるものであり、加えて分化誘導前の幹細胞もがアトルバスタチンにより処理されてもよい。
本発明に係る、幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物の製造方法は、幹細胞を分化誘導する工程と、分化誘導後の細胞をアトルバスタチンにより処理する工程と、を含むことを特徴とする。この製造方法は、さらに、幹細胞を培養する工程を含むことができる。
培養ヒトiPS細胞に対するアトルバスタチンの生存抑制活性を評価した。
ヒトiPS細胞は、京都大学iPS細胞研究所山中伸弥教授が樹立したヒト人工多能性幹細胞(201B7)を、理化学研究所セルバンク(No.HPS0063)より入手し使用した。ヒト多能性幹細胞培養の実践プロトコール(第2版)(理化学研究所 発生・再生科学総合研究センター 幹細胞研究支援・開発室作成 http://www.cdb.riken.jp/hsct/protocol.html)に従い、細胞のフィーダー層としてマウス胎児線維芽細胞(マイトマイシン処理で不活化、MEF)を蒔いたプラスチック培養皿の上で未分化ヒトiPS細胞を培養した。
スタチン類を20.0μM含むアッセイ培地で48時間培養後、コロニー(ALP+)数を測定した。アトルバスタチン添加群は、コントロール群に比べて、コロニー数は有意に低下した。他のスタチン類(フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン)については、未分化幹細胞に対する明らかな生存抑制活性は認められなかった(図1)。
アトルバスタチン10.0μM含むアッセイ培地で24時間培養後、コロニー(ALP+)数を測定した。アトルバスタチン添加群では、コロニー数はコントロール群に比べ60%以下と有意に低下し、未分化幹細胞の生存抑制が認められた(図2)。
アトルバスタチン1μMもしくは10μMを含むアッセイ培地で96時間培養後、コロニー(ALP+)数を測定した。アトルバスタチン添加群では、コントロール群に比べ、コロニー数は有意に低下し、未分化幹細胞の生存抑制が認められた(図3)。
iPS細胞から分化させた分化心筋細胞に対するアトルバスタチンの生存抑制活性(細胞死誘導活性)を評価した。
ヒトiPS細胞をフィーダー細胞から小細胞塊として解離し、さらに混入するフィーダー細胞を除去するために細胞接着性の培養プレート(0.1% ゼラチンコート)の底に吸着させ、アッセイ培地で37℃、1時間培養した(iPS細胞塊はプレートに吸着しないが、混入するフィーダー細胞は強く吸着する)。iPS細胞塊をピペッティング操作により小細胞塊へ細かく砕いた後、48ウェル培養プレートを用いて、Growth Factor Reduced BD Matrigel(BD)上に、高密度(1×106個/0.65cm2/培地容量0.5ml)で播種した。
iPS細胞から分化誘導した心筋細胞に対して、フルバスタチンは、有意な細胞死誘導活性を示した(図4)。一方、アトルバスタチンでは死細胞の割合はコントロール群と同程度であり、分化細胞の生存抑制及び細胞死の誘導は認められなかった。
Claims (6)
- ヒト由来である誘導性多能性幹細胞から分化した心筋細胞を製造する方法であって、
ヒト由来である誘導性多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する工程と、
分化誘導後の心筋細胞及びヒト由来である誘導性多能性幹細胞を含む細胞混合物をアトルバスタチンにより処理する工程と、を含む方法。 - ヒト由来である誘導性多能性幹細胞を培養する工程、をさらに含む請求項1に記載の方法。
- ヒト由来である誘導性多能性幹細胞から分化した心筋細胞を含む細胞医薬組成物を製造する方法であって、
前記ヒト由来である誘導性多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する工程と、
分化誘導後の心筋細胞及びヒト由来である誘導性多能性幹細胞を含む細胞混合物をアトルバスタチンにより処理する工程と、を含む方法。 - ヒト由来である誘導性多能性幹細胞を培養する工程、をさらに含む請求項3に記載の方法。
- ヒト由来である誘導性多能性幹細胞及び該幹細胞から分化した心筋細胞を含む細胞混合物から該心筋細胞のみを分離する方法であって、前記細胞混合物をアトルバスタチンにより処理する手順を含む方法。
- ヒト由来である誘導性多能性幹細胞を培養する工程と、該幹細胞を心筋細胞に分化誘導する工程と、をさらに含む請求項5に記載の方法。
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