WO2015182140A1 - 足場依存性細胞の培地及び培養方法、並びに幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物及びその製造方法 - Google Patents

足場依存性細胞の培地及び培養方法、並びに幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物及びその製造方法 Download PDF

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stem cells
medium
cell
anchorage
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義基 中島
健史 大政
正義 塚原
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協和発酵キリン株式会社
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    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a medium and a culture method for anchorage-dependent cells, a cell composition containing stem cells and / or differentiated cells derived from stem cells, and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a medium for culturing anchorage-dependent cells without using a scaffold, and a method for producing stem cells and the like using the medium.
  • scaffolds The same applies to the culture of stem cells such as ES cells (embryonic stem cells) and iPS cells (induced pluripotent stem cells), and it is known that it is difficult to grow cells in the absence of scaffolds or feeder cells. Yes.
  • stem cells such as ES cells (embryonic stem cells) and iPS cells (induced pluripotent stem cells), and it is known that it is difficult to grow cells in the absence of scaffolds or feeder cells. Yes.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Non-patent Document 1 Matrigel and recombinant protein
  • Non-patent Document 2 and 3 scaffolds using polymers such as polymers have been developed (Non-Patent Documents 2 and 3), but they are still very expensive and may not be suitable depending on the cell line.
  • Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) is a racodherin homolog in humans and is a membrane-bound glycoprotein found in breast milk and breast epithelial cells (see Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Document 4 describes that administration of MFG-E8 can be effective in the treatment of sepsis and ischemia-reperfusion injury.
  • Non-Patent Document 5 describes that MFG-E8 secreted from activated macrophages binds to apoptotic cells and induces phagocytic phagocytosis. So far, it has not been known to add MFG-E8 to a medium for animal cells or to culture anchorage-dependent cells or iPS cells in the presence of MFG-E8.
  • the main object of the present invention is to provide a technique capable of culturing scaffold-dependent cells without using a scaffold.
  • MFG-E8 promotes adhesion of anchorage-dependent cells in the absence of the scaffold, cell survival and proliferation (colony formation), and further when the anchorage-dependent cells are stem cells. We have found that differentiation is possible.
  • the present invention provides the following [1] to [25].
  • An adhesion promoter for anchorage-dependent cells comprising MFG-E8 or a fragment of the protein.
  • a method for culturing an anchorage-dependent cell comprising a step of culturing an anchorage-dependent cell in the absence of the anchorage in a medium containing MFG-E8 or a fragment of the protein.
  • the culture method according to [7], wherein the anchorage-dependent cells are stem cells.
  • the stem cells are embryonic stem cells, inducible pluripotent stem cells, or mesenchymal stem cells.
  • the culture method according to any one of [7] to [9], wherein the anchorage-dependent cells are derived from a human.
  • the medium is a serum-free medium.
  • a method for producing a cell composition containing stem cells comprising culturing stem cells in the absence of a scaffold in a medium containing MFG-E8 or a fragment of the protein.
  • stem cells are embryonic stem cells, inducible pluripotent stem cells, or mesenchymal stem cells.
  • the stem cell is derived from a human.
  • [17] A method for producing a cell composition containing differentiated cells from stem cells, comprising a step of inducing stem cell differentiation in the absence of a scaffold in a medium containing MFG-E8 or a fragment of the protein.
  • the production method of [17], wherein the stem cells are embryonic stem cells, inducible pluripotent stem cells, or mesenchymal stem cells.
  • a cell composition comprising stem cells and / or differentiated cells derived from stem cells cultured in a medium containing MFG-E8 or a fragment of the protein in the absence of a scaffold.
  • the present invention provides a technique capable of culturing anchorage-dependent cells without using a scaffold.
  • Example 1 which is a figure which shows the result of having evaluated the effect of MFG-E8 when a scaffold dependence cell was cultured in the absence of a scaffold using a human iPS cell.
  • the plate with no scaffold coated was cultured for 4 days in the presence or absence of MFG-E8, and the area of the grown colonies was measured. It is a figure which shows the result of having evaluated the effect of MFG-E8 by changing the addition density
  • the scaffold-dependent cell culture medium according to the present invention is characterized in that it contains MFG-E8 (Milk fat globule-EGF factor 8) or a fragment of the protein.
  • the amino acid sequence of human MFG-E8 is shown in SEQ ID NO: 1 (GenBank Accession No. Q08431-1 http://www.uniprot.org/uniprot/Q08431).
  • the amino acid sequence of human MFG-E8 may be GenBank Accession No. Q08431-2 or No Q08431-3 (http://www.uniprot.org/uniprot/Q08431).
  • SEQ ID NO: 1 the first to 23rd amino acid sequences are secretory signal sequences.
  • MFG-E8 is also referred to as lactadherin, medin, secreted EGF repeat and discoidin domains-containing protein 1 (SED1).
  • the MFG-E8 used in the medium according to the present invention is not limited to the human MFG-E8 represented by SEQ ID NO: 1 and may have a non-human MFG-E8 (MFG) as long as it has an activity of promoting anchorage-dependent cell adhesion.
  • MFG-E8 homologue may be from any animal, for example, rodents such as rats, mice, hamsters and guinea pigs, rabbit eyes such as rabbits, and ungulates such as pigs, cows, goats and sheep.
  • mouse-derived MFG-E8 is described in PLoS ONE, 2012, 7, e36368 and PLoS ONE, 2011, 6, e27685.
  • the MFG-E8 homolog used for the culture medium according to the present invention can be appropriately selected according to the origin of the anchorage-dependent cells to be cultured, and preferably MFG-E8 derived from the same animal as that of the anchorage-dependent cells to be cultured. A homolog is used. For example, when culturing human-derived cells, it is preferable to use human-derived MFG-E8.
  • MFG-E8 used in the medium according to the present invention can be generated from the amino acid sequences of human MFG-E8 and MFG-E8 homologues as long as it has an activity of promoting adhesion of anchorage-dependent cells.
  • Polypeptides fragments of MFG-E8 are also included.
  • the length of the polypeptide is, for example, 21 to 100, preferably 101 to 200, more preferably 201 to 364 in terms of the number of amino acid residues.
  • a specific example of a preferred fragment is a polypeptide (364 amino acid residues) consisting of the amino acid sequence from 24th to 387th of SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide is used interchangeably with “peptide” or “protein”.
  • “MFG-E8 and fragments thereof” are also simply referred to as “MFG-E8”.
  • MFG-E8 used in the medium according to the present invention has one or several amino acids in the amino acid sequences of human MFG-E8 and MFG-E8 homologues as long as it has an activity of promoting anchorage-dependent cell adhesion.
  • an amino acid sequence obtained by adding a His tag sequence to an amino acid sequence (24th to 387th amino acid sequence) from which the signal sequence is deleted in SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted or added can be deleted, substituted, inserted or added by a known mutant polypeptide production method such as site-directed mutagenesis. It means an amino acid sequence in which a certain number (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and still more preferably 5 or less) of amino acids are deleted, substituted, inserted or added. It is well known in the art that some amino acids in the amino acid sequence of a protein can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the protein.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added is not limited to a sequence in which mutation is artificially introduced by a known mutant polypeptide production method. It may also be the amino acid sequence of a variant present in
  • the MFG-E8 used in the medium according to the present invention may be a protein isolated or purified from nature, a recombinant protein or a synthetic protein, or may be chemically modified. Isolation of natural proteins, expression of recombinant proteins, protein synthesis, or purification of these proteins can be performed by a conventionally known technique.
  • the composition of the medium according to the present invention may be the same as that conventionally used for culturing anchorage-dependent cells, except that it contains MFG-E8.
  • Examples of such a medium include a medium used for culturing cells derived from animal tissues. Specifically, the following culture media can be mentioned.
  • RPMI-1640 medium Eagle's MEM medium, Dulbecco's modified MEM medium, GMEM (Glasgow's MEM), ⁇ -MEM, 199 medium, IMDM medium, DMEM medium Hybridoma Serum free medium (Invitrogen Corporation), Chemically DefriedHybridFed medium (Invitrogen), Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz ' s L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, CTC109, NCTC135, Wayout's MB752 / 1, CMRL-1066, Williams' medium E, Brinster's BMOC-3 Medium, Essential8 Medium (Life Technologies), mTeSR1 (medium SR Technologies 8) ), StemS
  • the medium according to the present invention can be prepared by adding MFG-E8 to these media in advance or during cell culture.
  • concentration of MFG-E8 added to the medium is not particularly limited as long as it has an activity of promoting the adhesion of anchorage-dependent cells, and can be, for example, 1 ⁇ g / ml to 5 ⁇ g / ml.
  • physiologically active substances and nutrient factors necessary for cell survival or proliferation can be added to the medium as needed. These additives may be added in advance to the medium, or may be added during cell culture.
  • Nutritional factors include sugars, amino acids, vitamins, hydrolysates or lipids.
  • examples of the sugar include neutral sugars such as glucose, mannose, or fructose; acidic sugars such as sialic acid; amino sugars; sugar alcohols, and the like.
  • vitamins examples include d-biotin, D-pantothenic acid, choline, folic acid, myo-inositol, niacinamide, pyrodoxal, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin or DL- ⁇ -tocopherol, and one or a combination of two or more Used.
  • hydrolyzate examples include hydrolyzed soybeans, wheat, rice, peas, corn, cottonseed, yeast extract and the like.
  • lipids include cholesterol, linoleic acid, and linolenic acid.
  • an antibiotic such as kanamycin, streptomycin, penicillin or hygromycin may be added to the medium as necessary.
  • an acidic substance such as sialic acid is added to the medium, it is desirable to adjust the pH of the medium to pH 5 to 9, preferably 6 to 8, which is a neutral range suitable for cell growth.
  • the culture medium according to the present invention may be a serum-free medium, that is, a serum-free medium.
  • the culture medium according to the present invention can contain serum, it is preferable not to contain serum from the viewpoint of preventing mixing of components derived from different animals.
  • the serum-free medium means a medium containing no unadjusted or unpurified serum.
  • the serum-free medium may contain a purified blood-derived component or animal tissue-derived component (for example, a growth factor).
  • the medium according to the present invention may or may not contain a serum substitute as well as serum.
  • Serum substitutes include, for example, albumin substitutes such as albumin, lipid-rich albumin and recombinant albumin, plant starch, dextran, protein hydrolysates, transferrin or other iron transporters, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace amounts An element, 2-mercaptoethanol, 3′-thioglycerol, or an equivalent thereof may be used.
  • Specific examples of serum substitutes include, for example, those prepared by the method described in WO 98/30679, commercially available Knockout Serum Replacement (KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (Life Technologies max) and Gluta Life Technologies).
  • “anchor-dependent cells” need to be attached for survival and / or proliferation, and are not viable and / or proliferatively inhibited in a non-adherent or floating state.
  • the “scaffold-dependent cell” is not particularly limited as long as it is a cell derived from animal tissue that can adhere to and grow on a substrate of an incubator without a scaffold in the presence of MFG-E8.
  • the “scaffold” widely includes proteins constituting the extracellular matrix in vivo and recombinant proteins or synthetic proteins thereof, modified products or partial polypeptides of these proteins, cell adhesion synthetic molecules, and the like.
  • the Specific examples of scaffolds include collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, partial structures of laminin, fibronectin and mixtures thereof (eg, Matrigel) and lysed cell membrane preparations (Lancet, 2005, 365, p1636-1641). The following are listed as conventionally known scaffolds.
  • Organic materials selected from the group of biopolymers consisting of collagen, gelatin, hyaluronic acid, proteoglycan, chitin, chitosan, chitosan derivatives, fibrin, dextran, agarose, calcium alginate, silk or combinations thereof, or aliphatic polyester, poly (Amino acid), poly (propylene fumarate), copoly (ether-ester), polyorthoester, polyalkylene oxalate, polyamide, polycarbonate, polycaprolactone, poly (iminocarbonate), polyorthoester, polyoxaester, polyamide ester , Polyoxaesters containing amine groups, polyanhydrides, polyphosphazenes, polyurethanes, hydroxybutyrate, dioxanone, or hydrogels such as polyacrylates Synthetic polymeric material selected from the group consisting of rate, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol or polyethyleneimine, or any copolymer, blend or
  • the species of anchorage-dependent cells to which the medium according to the present invention can be applied are not particularly limited, for example, rodents such as rats, mice, hamsters, guinea pigs, rabbits such as rabbits, pigs, cows, goats.
  • the cells may be ungulates such as sheep, cats such as dogs and cats, primates such as humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans and chimpanzees.
  • anchorage-dependent cells to which the medium according to the present invention can be applied include CHO cells derived from Chinese hamster ovary, CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO / dhfr- (ATCC CRL-9096), Pro5 strain (ATCC CRL-1781), CHO-S (Invitrogen Cat # 11619); Baby hamster kidney-derived BHK cells; Human cervical cancer-derived HeLa cells; Mouse breast cancer-derived C-127 cells; Mouse fibroblasts NIH / 3T3, BALB3T3; VerotosS3 from African green monkey kidney; mouse cell line NS0 (ATCC CRL-1827), SP2 / 0 (ATCC CRL-1581); mouse myeloma cell line SP2 / 0-Ag14; rat myeloma cell line Y3 Ag1.2.3.
  • CHO-K1 ATCC CCL-61
  • CHO / dhfr- ATCC CRL-9096
  • Pro5 strain ATCC
  • anchorage-dependent cells that are stem cells include mesenchymal stem cells that differentiate into myoblasts, vascular endothelial cells, osteoblasts, adipocytes, myocytes, cardiomyocytes, chondrocytes, etc .; to neurons and glial cells Differentiating neural stem cells; hematopoietic stem cells or bone marrow stem cells that differentiate into leukocytes, erythrocytes, platelets, mast cells, dendritic cells, etc .; various tissues through the formation of pseudo-embryos (EB bodies) from the spheroid state Embryonic stem cells (embryonic stem cells: ES cells), inducible pluripotent stem cells (iPS cells), and embryonic embryos derived from primordial germ cells, which are known to proceed to differentiation / induction steps into cells Multipotent germlins isolated in the process of establishing GS cells from testicular tissue, germ (EG) cells em (mGS) cells, multipotent adult progenit
  • anchorage-dependent cells that are stem cells
  • C2C12 strain known to differentiate into myotubes
  • 3T3-L1 strain known to differentiate into adipocytes
  • Examples include striatum-derived mouse neural stem cells (MNSC); rat fetal midbrain-derived rat neural stem cells (RNSC); rat liver-derived cell line 3′-mRLh-2.
  • the “stem cell” targeted by the present invention is not limited to the above, and refers to an immature cell having self-replication ability and differentiation / proliferation ability, and depending on the differentiation ability, a pluripotent stem cell (pluripotent stem cell). ), Multipotent stem cells, unipotent stem cells, and the like.
  • a “stem cell” is generally defined as an undifferentiated cell having “self-renewal ability” capable of proliferating while maintaining an undifferentiated state and “differentiated pluripotency” capable of differentiating into all three germ layers.
  • a pluripotent stem cell means a cell having an ability to differentiate into all tissues and cells constituting a living body.
  • a multipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, although not all types.
  • a unipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
  • pluripotent stem cells examples include the aforementioned ES cells or iPS cells.
  • Stem cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei are also preferred as pluripotent stem cells (Nature, 1997, 385, 810; Science, 1998, 280, 1256; Nature). (Biotechnology, 1999, 17, 456; Nature, 1998, 394, 369; Nature Genetics, 1999, 22, 127; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 14984; Nature Genetics, 2000, 24, 109) .
  • Human ES cell lines are obtained from, for example, WA01 (H1) and WA09 (H9) from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University (Kyoto, Japan). Is possible.
  • iPS cells include cells that have acquired multipotency similar to ES cells obtained by introducing a plurality of genes (reprogramming factors) into somatic cells such as skin cells.
  • iPS cells obtained by introducing Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, C-Myc gene and Sox2 gene iPS cells obtained by introducing Oct3 / 4 gene, Klf4 gene and Sox2 gene (Nature Biotechnology, 2008) , 26, 101-106).
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • iPS cells can be obtained from predetermined institutions (RIKEN BioResource Center, Kyoto University, etc.).
  • multipotent stem cells examples include somatic stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, bone marrow stem cells, and reproductive stem cells.
  • the multipotent stem cell is preferably a mesenchymal stem cell, more preferably a bone marrow mesenchymal stem cell.
  • the mesenchymal stem cell broadly means a group of stem cells or progenitor cells that can differentiate into all or some mesenchymal cells such as osteoblasts, chondroblasts, and lipoblasts.
  • the medium according to the present invention can be suitably used for the proliferation of any stem cell, but preferably for culturing mesenchymal stem cells, ES cells or iPS cells, more preferably for culturing iPS cells.
  • it can be used for culturing human iPS cells.
  • human iPS cells include 253G1 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0002), 201B7 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0063), 409B2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0076), 454E2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0077), HiPS. -RIKEN-1A strain (RIKEN Cell Bank No.
  • HPS0003 HiPS-RIKEN-2A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0009), HiPS-RIKEN-12A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0029), Nips-B2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0223).
  • Anchorage-dependent cell culture method The method for culturing anchorage-dependent cells according to the present invention is characterized by including a procedure for culturing anchorage-dependent cells in the absence of the scaffold in a medium containing MFG-E8. According to the culture medium of the present invention, it is possible to allow the anchorage-dependent cells to adhere to the substrate of the incubator and to grow (colony formation) even in the absence of the scaffold by the action of MFG-E8. That is, in the present invention, MFG-E8 can function as an adhesion promoter for anchorage-dependent cells.
  • the incubator used in the culture method according to the present invention is not particularly limited, but a culture tank such as a flask, dish, petri dish, microwell plate, microslide, chamber slide, tube, tray, culture bag or tank, etc. Can be mentioned.
  • the substrate of these incubators is not particularly limited, and examples thereof include glass, various plastics such as polypropylene and polystyrene, metals such as stainless steel, or combinations thereof.
  • the substrate surface has been coated with a scaffold.
  • Such scaffolds include collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, partial structures of laminin, fibronectin and mixtures thereof (eg, Matrigel) and lysed cell membrane preparations (Lancet, 2005, 365, p1636-1641).
  • the culture method according to the present invention does not require coating of the substrate surface with such a scaffold, and can be applied to large-scale industrial culture.
  • the anchorage-dependent cells may be dispersed cells at the start of culture.
  • Dispersed cells include cells forming a small cell mass composed of several cells (typically about 2-50, 2-20, or 2-10).
  • the culture density of the anchorage-dependent cells is not particularly limited as long as the density can achieve a desired effect such as an improvement in cell survival rate.
  • Culture conditions such as temperature, CO 2 concentration, dissolved oxygen concentration, and pH can be appropriately set based on conventional techniques.
  • the culture temperature is not particularly limited, but may be 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C.
  • the CO 2 concentration can be 1-10%, preferably 2-5%.
  • the oxygen partial pressure can be 1-10%.
  • the culture method according to the present invention can be applied to a method for producing a cell composition containing stem cells or a method for producing a cell composition containing differentiated cells from stem cells, particularly using stem cells as anchorage-dependent cells.
  • the culture method of the present invention it is possible to grow stem cells by adhering stem cells to the base material of the incubator even in the absence of a scaffold. Therefore, by applying the culture method according to the present invention to a method for producing a cell composition containing stem cells or differentiated cells, it is not necessary to coat the surface of the base material with a scaffold, and heterogeneous animal-derived components or immunogenicity used as the scaffold. It is possible to prevent components and the like from being mixed into stem cells and differentiated cells.
  • Specific steps of the method for producing a cell composition containing stem cells according to the present invention are as follows, for example.
  • a step of culturing stem cells on feeder cells (B) A step of dissociating the stem cells from the feeder cells.
  • Step (a) is a step of growing and maintaining stem cells in an undifferentiated state on feeder cells.
  • Step (a) may be performed by applying a conventional method for culturing stem cells, and may be culturing in the presence of a scaffold and / or serum (or serum extract or the like).
  • stromal cells such as fetal fibroblasts can be used (for example, Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory, Second Edition, 1999, Cold Spring HarbourLaboratory Partnership; Press at Oxford University Press; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, 7634; Nature, 1981, 292, 154; J. Virol., 1969, 4, 549; Science, 1996, 272, 722; C . Ll Physiol, 1982,112,89;. See Nos. No. 2005/080554); International Publication No. 01/088100 issue.
  • Step (b) is a step of dissociating stem cells from feeder cells
  • step (c) is a method in which dissociated stem cells are allowed to adhere and proliferate in the absence of feeder cells and scaffolds by the culture method according to the present invention.
  • Examples of the method for dissociating stem cells from the feeder cells in the step (b) include a chemical method using a reagent or an enzyme, a physical method using a membrane or a bead, or a combination thereof.
  • the stem cells dissociated in the step (b) may be subjected to the step (a) again for passage.
  • step (b) you may perform the process of culturing the cell obtained by the process (b) for a short period of time in the absence of a scaffold between the process (b) and the process (c).
  • This additional step allows only the feeder cells to adhere to the substrate of the incubator and removes the feeder cells that are contaminated in the stem cells.
  • serum when serum is used in step (a), the cells obtained in step (b) are washed with a serum-free medium or buffer between step (b) and step (c). You may perform a process.
  • step (c) differentiation of the proliferated stem cells is induced.
  • Stem cell differentiation can be induced by a method known per se. For example, by adding a differentiation inducer such as retinoic acid to the medium, it becomes possible to differentiate stem cells into nervous system cells and the like in the absence of a scaffold. Further, differentiation induction may be performed as a separate step after step (c), in which case the cell is treated with a differentiation-inducing agent in the presence or absence of MFG-E8, preferably in the presence in that step. do it.
  • BMP inhibitors As the differentiation inducer, BMP inhibitors, Wnt inhibitors, Nodal inhibitors, retinoic acid and the like can be used.
  • differentiation induction is performed by culturing mesenchymal stem cells in a differentiation induction medium (90% ⁇ MEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.1 ⁇ M dexamethasone). be able to.
  • a differentiation induction medium for example, STEMdiff APEL Medium, STEMCELL
  • the medium was added to 10 ng / ml BMP-4, 10 ng / ml Activin.
  • the medium was replaced with 10 ng / ml VEGF, 150 ng / ml Dkk1, and after 8 days, the medium was replaced with 10 ng / ml VEGF, Cardiomyocytes with autonomous pulsation can be confirmed by exchanging them with those added with 150 ng / ml Dkk1, 10 ng / ml bFGF.
  • Cell composition The cell composition containing stem cells and / or differentiated cells cultured in a medium containing MFG-E8 or a fragment of the protein in the absence of a scaffold according to the present invention is used for further stem cell culture or for regenerative medicine. Can be utilized for cell sources.
  • the cell composition according to the present invention is obtained by the above-described production method, and may be a composition containing dispersed stem cells such as small cell clusters.
  • the cell composition according to the present invention may contain MFG-E8 or a fragment of the protein derived from a medium containing MFG-E8 or a fragment of the protein used in step (c) of the production method described above, Other medium components may be included. Further, the cell composition may include feeder cells.
  • the cell composition according to the present invention can be used, for example, for preservation, transportation, and passage of stem cells by cryopreservation.
  • the cell composition according to the present invention further contains a medium component as described above, serum or an alternative thereof, or an organic solvent such as DMSO in addition to a known cell preservation solution. May be included.
  • the concentration of serum or its substitute is not particularly limited, but may be 1 to 50% (v / v), preferably 5 to 20% (v / v).
  • the concentration of the organic solvent is not particularly limited, but may be 0 to 50% (v / v), preferably 5 to 20% (v / v).
  • the cell composition according to the present invention can be used as a medicine.
  • known forms and compositions suitable for pharmaceuticals can be applied.
  • a cell composition containing cardiomyocytes can be formed into a sheet and can be suitably transplanted into the heart for the treatment of heart disease.
  • the cell composition according to the present invention can be applied to a patient by means such as transplantation, intravenous injection, subcutaneous injection, intra-articular injection, and intramuscular injection. It is preferable that the cell composition as a medicine does not contain serum from the viewpoint of preventing contamination with components derived from different animals.
  • Example 1 Culture of human iPS cells in medium containing MFG-E8
  • the effect of MFG-E8 when the anchorage-dependent cells were cultured in the absence of the scaffold was evaluated using human iPS cells.
  • Human iPS cells (201B7, RIKEN Cell Bank No. HPS0063) were cultured (37 ° C, 5% CO 2 ) on feeder cells (mitomycin-treated mouse fetal fibroblasts). Passaging was performed every 3-4 days. Passage was performed by dissociating iPS cells from feeder cells using a dissociation solution, then dispersing them into small cell clusters (about 50 to 100 cells), and seeding on the feeder cells. The following were used for the culture solution and the dissociation solution.
  • the small cell mass was seeded on a plate not coated with a scaffold (cell density: 1 ⁇ 10 5 cells / 0.65 cm 2 in a medium volume of 0.5 ml), and MFG-E8 (Recombinant Human MFG-E8, R & D
  • the cells were cultured for 4 days in a maintenance culture solution (MFG-E8 2 ⁇ g / ml) containing Systems, Catalog # 2767-MF-050) or a maintenance culture solution containing no MFG-E8. After culture, the area of the formed colonies was measured.
  • the MFG-E8 used here consists of an amino acid sequence obtained by adding a His tag sequence to the amino acid sequence (24th to 387th amino acid sequence) from which the signal sequence is deleted in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 2 shows the results of the test conducted by changing the MFG-E8 addition concentration to 0, 0.5, 1, 2, 5 ⁇ g. At a concentration of 1 ⁇ g / ml or higher, cell engraftment and proliferation were significantly promoted.
  • Example 2 Differentiation induction of human iPS cells by medium containing MFG-E8
  • the differentiation ability of human iPS cells cultured in the absence of a scaffold using a medium containing MFG-E8 was evaluated.
  • a small cell mass of iPS cells is seeded on a plate not coated with a scaffold, and does not contain a differentiation-inducing culture medium containing MFG-E8 (MFG-E8 1 ⁇ g / ml) or MFG-E8.
  • the cells were cultured in a differentiation-inducing medium.
  • a commercially available kit PSdif-Cardio Cardiomyocyte Differentiation Kit, Stem RD was used for the differentiation induction culture medium. This differentiation-inducing culture medium is serum-free. After 10 days of culture, the presence or absence of cardiomyocyte differentiation induction was confirmed with a microscope.
  • MFG-E8 has the effect of promoting the adhesion of iPS cells in the absence of a scaffold and enabling cell survival and proliferation (colony formation), and further differentiation. .

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Abstract

　足場依存性細胞を、足場を用いることなく培養可能な技術として、ＭＦＧ－Ｅ８（Ｍｉｌｋ　ｆａｔ　ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ　ｆａｃｔｏｒ　８）又は該タンパク質の断片を含む、足場依存性細胞の培地を提供する。この培地によれば、足場非存在下において、足場依存性細胞の接着を促進し、細胞の生存と増殖（コロニー形成）を可能とでき、さらには足場依存性細胞が幹細胞である場合においてその後の分化も可能とすることができる。

Description

足場依存性細胞の培地及び培養方法、並びに幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物及びその製造方法
　本発明は、足場依存性細胞の培地及び培養方法、並びに幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物及びその製造方法に関する。より詳しくは、足場を用いずに足場依存性細胞を培養するための培地、及び該培地を用いた幹細胞等の製造方法などに関する。
　ＣＨＯ細胞などの足場依存性細胞が増殖するためには、細胞が培養器の基材の表面に接着する必要があり、基材表面への細胞の接着を可能とするため、ラミニンやコラーゲン、ポリリジンなどの足場と呼ばれる接着分子を基材表面にコートすることが行われている。ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）やｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などの幹細胞の培養においても同様であり、足場やフィーダー細胞の非存在下では細胞を増殖させるのが困難であることが知られている。特に、ヒトｉＰＳ細胞の場合、接着が不十分であると分化を誘導できないという問題がある。
　従来用いられている足場としては、マトリゲルや組換えタンパク質（非特許文献１）も挙げられるが、これらの材料はコストが高く、ロット間による品質の差が大きいなど安定性に欠けている。また、ポリマーなどの高分子を用いた足場も開発されているが（非特許文献２、３）、やはり非常に高価であり、細胞株によっては適さない場合もある。
　Ｍｉｌｋ　ｆａｔ　ｇｌｏｂｕｌｅ-ＥＧＦ　ｆａｃｔｏｒ　８（ＭＦＧ-Ｅ８）は、ヒトにおけるラクドアドヘリンホモログであり、母乳及び乳房上皮細胞で見つかった膜結合型糖タンパク質である（非特許文献１参照）。非特許文献４には、敗血症や虚血再灌流障害の治療にＭＦＧ-Ｅ８の投与が有効となり得ることが記載されている。また、非特許文献５には、活性化マクロファージから分泌されるＭＦＧ-Ｅ８が、アポトーシス細胞に結合し、ファゴサイトによる貪食を誘導することが記載されている。これまでに、動物細胞用の培地にＭＦＧ－Ｅ８を添加することや、ＭＦＧ－Ｅ８存在下で足場依存性細胞またはｉＰＳ細胞を培養することは知られていない。
Ｎａｔａｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,２０１０,２８（６）:６１１－６１５ Ｎａｔａｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,２０１０,２８（６）:６０６－６１０ Ｎａｔａｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,２０１０,２８（６）:５８１－５８３ Ｍｏｌ. Ｍｅｄ.,２０１１,１７（Ｉ－２）:１２６－３３ Ｎａｔｕｒｅ,２００２,４１７（６８８５）:１８２‐７
　本発明は、足場依存性細胞を、足場を用いることなく培養可能な技術を提供することを主な目的とする。
　本発明者らは、ＭＦＧ-Ｅ８が、足場非存在下における足場依存性細胞の接着を促進し、細胞の生存と増殖（コロニー形成）、さらには足場依存性細胞が幹細胞である場合においてその後の分化を可能とすることを見い出した。
　すなわち、上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］～［２５］を提供する。
［１］ＭＦＧ－Ｅ８（Ｍｉｌｋ　ｆａｔ　ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ　ｆａｃｔｏｒ　８）又は該タンパク質の断片を含む、足場依存性細胞の培地。
［２］前記足場依存性細胞が幹細胞である、［１］の培地。
［３］前記幹細胞が胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［２］の培地。
［４］前記足場依存性細胞がヒト由来である、［１］～［３］のいずれかの培地。
［５］無血清の培地である、［１］～［４］のいずれかの培地。
［６］ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む、足場依存性細胞の接着促進剤。
［７］ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で、足場非存在下、足場依存性細胞を培養する手順を含む、足場依存性細胞の培養方法。
［８］前記足場依存性細胞が幹細胞である、［７］の培養方法。
［９］前記幹細胞が胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［８］の培養方法。
［１０］前記足場依存性細胞がヒト由来である、［７］～［９］のいずれかの培養方法。
［１１］前記培地が無血清の培地である、［７］～［１０］のいずれかの培養方法。
［１２］ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で、足場非存在下、幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［１３］（ａ）幹細胞をフィーダー細胞上で培養する工程と、
（ｂ）前記フィーダー細胞から前記幹細胞を解離する工程と、
（ｃ）ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で、フィーダー細胞非存在下、前記幹細胞を培養する工程と、を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［１４］前記工程（ｃ）で用いる前記培地が無血清の培地である、［１３］の製造方法。
［１５］前記幹細胞が胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１２］～［１４］のいずれかの製造方法。
［１６］前記幹細胞がヒト由来である、［１２］～［１５］のいずれかの製造方法。
［１７］ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で、足場非存在下、幹細胞の分化を誘導する工程を含む、幹細胞からの分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［１８］前記幹細胞が胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１７］の製造方法。
［１９］前記幹細胞がヒト由来である、［１７］又は［１８］の製造方法。
［２０］前記培地が無血清の培地である、［１７］～［１９］のいずれかの製造方法。
［２１］足場非存在下、ＭＦＧ-Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で培養された、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物。
［２２］前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［２１］の細胞組成物。
［２３］前記幹細胞が、ヒト由来である、［２１］又は［２２］の細胞組成物。
［２４］前記培地が無血清の培地である、［２１］～［２３］のいずれかの細胞組成物。
［２５］ＭＦＧ-Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む、［２１］～［２４］のいずれかの細胞組成物。
　本発明により、足場依存性細胞を、足場を用いることなく培養可能な技術が提供される。
足場依存性細胞を足場非存在下で培養した場合におけるＭＦＧ－Ｅ８の効果を、ヒトｉＰＳ細胞を用いて評価した結果を示す図である（実施例１）。足場がコートされていないプレートで、ＭＦＧ-Ｅ８存在下又は非存在下で４日間培養を行い、生育したコロニーの面積を計測した。 ＭＦＧ－Ｅ８の効果を添加濃度を変化させて評価した結果を示す図である（実施例１）。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
１．足場依存性細胞の培地
［ＭＦＧ－Ｅ８］
　本発明に係る足場依存性細胞の培地は、ＭＦＧ－Ｅ８（Ｍｉｌｋ　ｆａｔ　ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ　ｆａｃｔｏｒ　８）又は該タンパク質の断片を含むことを特徴とする。
　ヒトＭＦＧ－Ｅ８のアミノ酸配列を配列番号１（GenBank Accession No. Q08431-1 http://www.uniprot.org/uniprot/Q08431）に示す。ヒトＭＦＧ－Ｅ８のアミノ酸配列は、GenBank Accession No. Q08431-2又はNo. Q08431-3（http://www.uniprot.org/uniprot/Q08431）であってもよい。配列番号１において１番目～２３番目のアミノ酸配列は、分泌シグナル配列である。ＭＦＧ－Ｅ８は、ラクドアドヘリン（ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ）、ｍｅｄｉｎ、ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ＥＧＦ　ｒｅｐｅａｔ　ａｎｄ　ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ　ｄｏｍａｉｎｓ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＳＥＤ１）とも称される。
　本発明に係る培地に用いられるＭＦＧ－Ｅ８は、配列番号１に示されるヒトＭＦＧ－Ｅ８に限られず、足場依存性細胞の接着を促進する活性を有する限りにおいて、ヒト以外のＭＦＧ－Ｅ８（ＭＦＧ－Ｅ８ホモログ）であってもよい。ＭＦＧ-Ｅ８ホモログは、いずれの動物のものであってもよく、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などのホモログであってよい。一例として、マウス由来のＭＦＧ－Ｅ８は、ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，２０１２，７，ｅ３６３６８及びＰＬｏＳ　ＯＮＥ，２０１１，６，ｅ２７６８５に記載されている。本発明に係る培地に用いるＭＦＧ-Ｅ８ホモログは、培養する足場依存性細胞の由来に応じて適宜選択することができ、好ましくは培養する足場依存性細胞の由来動物と同じ動物由来のＭＦＧ-Ｅ８ホモログが用いられる。例えば、ヒト由来の細胞を培養する場合は、ヒト由来のＭＦＧ-Ｅ８を用いるのが好ましい。
　また、本発明に係る培地に用いられるＭＦＧ－Ｅ８は、足場依存性細胞の接着を促進する活性を有する限りにおいて、ヒトＭＦＧ－Ｅ８及びＭＦＧ－Ｅ８ホモログのアミノ酸配列から生成し得る、任意長のポリペプチド（ＭＦＧ－Ｅ８の断片）も含まれるものとする。ポリペプチドの長さとしては、アミノ酸残基数で、例えば２１～１００、好ましくは１０１～２００、より好ましくは２０１～３６４とされる。好ましい断片の具体例としては、配列番号１の２４番目～３８７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（３６４アミノ酸残基）が挙げられる。なお、本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用されるものとする。以下、「ＭＦＧ－Ｅ８及びその断片」を単に「ＭＦＧ－Ｅ８」とも称する。
　さらに、本発明に係る培地に用いられるＭＦＧ－Ｅ８は、足場依存性細胞の接着を促進する活性を有する限りにおいて、ヒトＭＦＧ－Ｅ８及びＭＦＧ－Ｅ８ホモログのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質であってもよい。例えば、配列番号１においてシグナル配列を欠失させたアミノ酸配列（２４番目から３８７番目のアミノ酸配列）にＨｉｓタグ配列を付加したアミノ酸配列が挙げられる。
　「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、挿入もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を意味する。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。
　さらに、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。従って、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に変異を導入した配列に限定されるものではなく、天然に存在する変異体のアミノ酸配列でもあり得る。
　本発明に係る培地に用いられるＭＦＧ－Ｅ８は、天然から単離・精製されたタンパク質、組換えタンパク質又は合成タンパク質であってよく、化学修飾されたものであってもよい。天然タンパク質の単離、組換えタンパク質の発現、タンパク質の合成あるいはこれらのタンパク質の精製は、従来公知の手法によって行うことができる。
［基礎培地］
　本発明に係る培地の組成は、ＭＦＧ－Ｅ８を含む点を除いて、足場依存性細胞の培養のために従来用いられている培地と同様であってよい。このような培地としては、例えば、動物組織に由来する細胞の培養に用いられている培地が挙げられる。具体的には以下の培地を挙げることができる。
　ＲＰＭＩ-１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　ＭＥＭ）、α-ＭＥＭ、１９９培地、ＩＭＤＭ培地、ＤＭＥＭ培地Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｅｒｕｍ　ｆｒｅｅ培地（インビトロジェン社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｅｒｕｍ　Ｆｒｅｅ培地（インビトロジェン社）、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ-１２、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ-１０、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ１２Ｋ、ＡＴＣＣ-ＣＲＣＭ３０、ＤＭ-１６０、ＤＭ-２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ-１５、ＲＩＴＣ８０-７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ　ＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ-１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’　ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ-３　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８　Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ社）、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社）、ＴｅＳＲ－Ｅ８　ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（和光純薬社）、ｍＥＳＦ培地（和光純薬社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマ社）、ＲｅｐｒｏＸＦ（リプロセル社）、ＰＳＧｒｏ-ｆｒｅｅ　Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳＣ/ＥＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＲＤ社）、ｈＰＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ　３０２培地（ＳＡＦＣ社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ-ＣＤ-ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社）又はＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ　Ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）など及びこれらの混合物。
　本発明に係る培地は、これらの培地にＭＦＧ－Ｅ８を予め添加あるいは細胞培養中に添加することによって調製できる。培地へのＭＦＧ－Ｅ８の添加濃度は、足場依存性細胞の接着を促進する活性を有する限りにおいて、特に限定されないが、例えば１μｇ／ｍｌ～５μｇ／ｍｌとできる。
　また、培地には、必要に応じて細胞の生存又は増殖に必要な生理活性物質及び栄養因子などを添加できる。これらの添加物は、培地に予め添加されていてもよく、細胞培養中に添加されてもよい。
　生理活性物質としては、インシュリン、ＩＧＦ－１、トランスフェリン、アルブミンまたは補酵素Ｑ１０などが挙げられる。
　栄養因子としては、糖、アミノ酸、ビタミン、加水分解物または脂質などが挙げられる。
　糖としては、グルコース、マンノースまたはフルクトースなどの中性糖；シアル酸などの酸性糖；アミノ糖；糖アルコールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
　アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシンまたはＬ－バリンなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
　ビタミンとしては、ｄ－ビオチン、Ｄ－パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピロドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ－α―トコフェロールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
　加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、とうもろこし、綿実、酵母抽出物などを加水分解したものが挙げられる。
　脂質としては、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸などが挙げられる。
　さらに、培地には、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンまたはハイグロマイシンなどの抗生物質を必要に応じて添加してもよい。シアル酸等の酸性物質を培地に添加する場合には、培地のｐＨを細胞の成育に適した中性域であるｐＨ５～９、好ましくはｐＨ６～８に調整することが望ましい。
　本発明に係る培地によれば、血清を添加しなくとも、培養器の基材に足場依存性細胞を接着させることができる。従って、本発明に係る培地は、血清を含まない培地、即ち無血清培地であってよい。本発明に係る培地は、血清を含有することもできるが、異種動物由来成分の混入防止の観点からは血清を含有しないことが好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。無血清培地は、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を含有していてもよい。
　本発明に係る培地は、血清と同様に、血清代替物についてもこれを含んでいても含んでいなくともよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、脂質リッチアルブミン及び組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリン又は他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２-メルカプトエタノール、３’-チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられ得る。血清代替物の具体例として、例えば、国際公開第９８／３０６７９号記載の方法により調製されるものや、市販のＫｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ-ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。
［足場依存性細胞］
　本発明において、「足場依存性細胞」は、生存及び／又は増殖のために接着していることを必要とし、非接着状態あるいは浮遊状態では生存及び／又は増殖が不能であるか又は著しく阻害される細胞を広く包含する。「足場依存性細胞」は、ＭＦＧ-Ｅ８の存在下で足場なしで培養器の基材に接着して増殖可能である、動物組織に由来する細胞であれば特に制限されない。
　ここで、「足場」には、生体内において細胞外マトリクスを構成するタンパク質及びその組換えタンパク質あるいは合成タンパク質、これらのタンパク質の変性物や部分ポリペプチド、細胞接着性の合成分子などが広く包含される。足場の具体例としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリ-Ｄ-リジン、ラミニン、ラミニンの一部構造体、フィブロネクチン及びこれら混合物（例えばマトリゲル）並びに溶解細胞膜調製物（Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６５，ｐ１６３６-１６４１）などが挙げられる。従来公知の足場材として以下が列挙される。コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、キチン、キトサン、キトサン誘導体、フィブリン、デキストラン、アガロース、アルギン酸カルシウム、シルクもしくはそれらの組み合わせからなる生体高分子の群から選択される有機材料、または脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、ポリ（プロピレンフマレート）、コポリ（エーテル-エステル）、ポリオルトエステル、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリカプロラクトン、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基を含むポリオキサエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリウレタン、ヒドロキシブチレート、ジオキサノン、もしくはハイドロゲル、例えばポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールもしくはポリエチレンイミン、あるいはそれらの任意の共重合体、混和物または化学的誘導体からなる群から選択される合成高分子材料。脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸またはそれらの共重合体もしくは混和物であってよい。
　また、本発明に係る培地を適用可能な足場依存性細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってよい。
　本発明に係る培地を適用可能な足場依存性細胞の具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１(ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１)、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ－（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０９６）、Ｐｒｏ５株（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（インビトロジェン社製　Ｃａｔ＃１１６１９）；ベイビーハムスター腎臓由来のＢＨＫ細胞；ヒト子宮頸部癌由来のＨｅＬａ細胞；マウス乳癌由来のＣ－１２７細胞；マウス線維芽細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３、ＢＡＬＢ３Ｔ３；アフリカミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏｔｓＳ３；マウス細胞株ＮＳ０（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１８２７）、ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１５８１）；マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０－Ａｇ１４；ラットミエローマ細胞株Ｙ３　Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ：８５１１０５０１）、ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６６２）；シリアンハムスター腎臓組織由来細胞ＢＨＫ－２１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１０）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－３４）；ヒト細胞株ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ　９６０２２９４０）；ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞またはＮＭ－Ｆ９細胞；ハイブリドーマ細胞；受精卵細胞；幹細胞などが挙げられる。
　幹細胞である足場依存性細胞の具体例としては、筋芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、心筋細胞、軟骨細胞等へ分化する間葉系幹細胞；ニューロンやグリア細胞へ分化する神経幹細胞；白血球、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞等へ分化する造血幹細胞又は骨髄幹細胞；スフェロイド状態から胚様体（ＥＢ体）と呼ばれる擬似的な胚の形成を経て様々な組織への分化・誘導のステップに進むことが知られている胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）や誘導性多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（ＥＧ）細胞、精巣組織からのＧＳ細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ（ｍＧＳ）細胞、骨髄から単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ（ＭＡＰＣ）等の多能性幹細胞などが挙げられる。
　幹細胞である足場依存性細胞のより具体的な例として、筋管に分化することが知られているＣ２Ｃ１２株；脂肪細胞に分化することが知られている３Ｔ３-Ｌ１株；マウス胎児の大脳線条体由来のマウス神経幹細胞（ＭＮＳＣ）；ラット胎児の中脳由来のラット神経幹細胞（ＲＮＳＣ）；ラットの肝臓由来細胞株の３’－ｍＲＬｈ－２などが挙げられる。
　ここで、本発明が対象とする「幹細胞」は、上記に限定されず、自己複成能及び分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ)、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ)、単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ)等が含まれる。「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。
　多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　多能性幹細胞としては、特に、上述のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を挙げることができる。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８５，８１０；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８０，１２５６；Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，４５６；Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４，３６９；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，２２，１２７；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，１４９８４；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，２４，１０９）。
　ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
　ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子（初期化因子）を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられる。例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ-Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２６，１０１-１０６）等が挙げられる。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。ｉＰＳ細胞は、所定の機関（理研バイオリソースセンター、京都大学など）より入手可能である。
　複能性幹細胞としては、特に、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞、より好ましくは骨髄間葉系幹細胞である。なお、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。
　本発明に係る培地は、いずれの幹細胞の増殖にも好適に使用することができるが、好ましくは、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養に、より好ましくはｉＰＳ細胞の培養に、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞の培養に使用することができる。ヒトｉＰＳ細胞としてより具体的には253G1株（理研セルバンクNo. HPS0002）、201B7株（理研セルバンクNo. HPS0063）、409B2株（理研セルバンクNo. HPS0076）、454E2株（理研セルバンクNo. HPS0077）、HiPS-RIKEN-1A株（理研セルバンクNo. HPS0003）、HiPS-RIKEN-2A株（理研セルバンク No. HPS0009）、HiPS-RIKEN-12A株（理研セルバンク No. HPS0029）、Nips-B2株（理研セルバンクNo. HPS0223）などを挙げることができる。
２．足場依存性細胞の培養方法
［培養方法］
　本発明に係る足場依存性細胞の培養方法は、ＭＦＧ－Ｅ８を含む培地で、足場非存在下、足場依存性細胞を培養する手順を含むことを特徴とする。本発明に係る培地によれば、ＭＦＧ－Ｅ８の作用によって、足場非存在下においても、足場依存性細胞を培養器の基材に接着させて増殖（コロニー形成）させることが可能である。すなわち、本発明において、ＭＦＧ－Ｅ８は、足場依存性細胞の接着促進剤として機能し得るものである。
　ここで、本発明に係る培養方法に用いられる培養器は、特に限定されないが、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック又はタンクなどの培養槽などが挙げられ得る。これらの培養器の基材も、特に限定されず、ガラスや、ポリプロピレイン及びポリスチレンなどの各種プラスチック、ステンレスなどの金属又はそれらの組み合わせが挙げられる。従来、培養器の基材表面への足場依存性細胞の接着を誘導するため、基材表面に足場をコーティングすることが行われていた。このような足場には、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリ-Ｄ-リジン、ラミニン、ラミニンの一部構造体、フィブロネクチン及びこれら混合物（例えばマトリゲル）並びに溶解細胞膜調製物（Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６５，ｐ１６３６-１６４１）などが用いられている。本発明に係る培養方法では、このような足場による基材表面のコートが不要となり、かつ大規模な工業用培養にも適用することができる。
　足場依存性細胞は、培養開始時において、分散された細胞であってよい。分散細胞としては、数個（典型的に約２～５０、２～２０、又は２～１０個）の細胞からなる小さな細胞塊を形成している細胞が挙げられる。
　培養開始後、足場依存性細胞はＭＦＧ－Ｅ８の作用によって基材表面に接着し、その後増殖する。足場依存性細胞の培養密度は、細胞の生存率の向上等の所望の効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。好ましくは約１．０×１０１～１．０×１０７細胞／ｍｌ、より好ましくは約１．０×１０２～１．０×１０７細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは約１．０×１０３～１．０×１０７細胞／ｍｌ、最も好ましくは約３．０×１０４～１．０×１０７細胞／ｍｌである。
　温度、ＣＯ２濃度、溶存酸素濃度及びｐＨなどの培養条件は、従来技術に基づいて適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが３０～４０℃、好ましくは３７℃であり得る。ＣＯ２濃度は、１～１０％、好ましくは２～５％であり得る。酸素分圧は、１～１０％であり得る。
［幹細胞を含む細胞組成物の製造方法］
　本発明に係る培養方法は、足場依存性細胞として特に幹細胞を用いることで、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法あるいは幹細胞からの分化細胞を含む細胞組成物の製造方法に応用できる。本発明に係る培養方法によれば、足場非存在下においても、幹細胞を培養器の基材に接着させて増殖（コロニー形成）させることが可能である。従って、本発明に係る培養方法を幹細胞又は分化細胞を含む細胞組成物の製造方法に適用することで、足場による基材表面のコートが不要となり、足場として用いられる異種動物由来成分や免疫原性成分などが幹細胞や分化細胞に混入するのを防止できる。
　本発明に係る幹細胞を含む細胞組成物の製造方法の具体的な工程は、例えば以下の通りである。
（ａ）幹細胞をフィーダー細胞上で培養する工程。
（ｂ）前記フィーダー細胞から前記幹細胞を解離する工程。
（ｃ）ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で、フィーダー細胞非存在下、前記幹細胞を培養する工程。
　工程（ａ）は、フィーダー細胞上で、幹細胞を未分化状態で増殖、維持する工程である。工程（ａ）は、幹細胞培養のための従来方法を適用して行えばよく、足場及び／又は血清（あるいは血清抽出物等）の存在下での培養であってよい。フィーダー細胞には、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞を用いることができる（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９９３，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，１９８１，７８，７６３４；Ｎａｔｕｒｅ，１９８１，２９２，１５４；Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，１９６９，４，５４９；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２，７２２；Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８２，１１２，８９；国際公開第０１／０８８１００号；同第２００５／０８０５５４号を参照）。
　工程（ｂ）は、フィーダー細胞から幹細胞を解離する工程であり、工程（ｃ）は、本発明に係る培養方法によって、解離された幹細胞を、フィーダー細胞及び足場の非存在下で、接着させ増殖（コロニー形成）させる工程である。工程（ｂ）のフィーダー細胞から幹細胞を解離する方法としては、例えば試薬もしくは酵素などを用いた化学的手法、膜やビーズなどを用いた物理的手法又はそれらの組み合わせが挙げられる。工程（ｂ）で解離された幹細胞は、再度工程（ａ）に付して継代を行ってもよい。また、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、工程（ｂ）で得られた細胞を足場の非存在下で短期間培養する工程を行ってもよい。この追加的工程によってフィーダー細胞のみを培養器の基材に接着させて、幹細胞中に混入するフィーダー細胞を取り除くことができる。さらに、工程（ａ）において、血清を用いている場合には、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、工程（ｂ）で得られた細胞を無血清培地や緩衝液で洗浄する工程を行ってもよい。
［分化細胞を含む細胞組成物の製造方法］
　本発明に係る幹細胞から分化細胞を含む細胞組成物を製造する方法では、上記工程（ｃ）において、増殖した幹細胞の分化を誘導する。幹細胞の分化誘導は自体公知の手法によって行うことができる。例えばレチノイン酸などの分化誘導剤を培地に添加することにより、足場非存在下で、幹細胞を神経系細胞などに分化させることが可能となる。また、分化誘導を工程（ｃ）の後に別途の工程として行ってもよく、その場合には当該工程においてＭＦＧ－Ｅ８の存在下又は非存在下、好ましくは存在下で細胞に分化誘導剤を処理すればよい。
　分化誘導剤には、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤、レチノイン酸などを用いることができる。分化誘導は、例えば、軟骨細胞の分化誘導プロセスでは、分化誘導培地（９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ-グルタミン、０．１μＭのデキサメタゾン）中で、間葉系幹細胞を培養することによって行うことができる。
　また、心筋細胞の分化誘導プロセスでは、培地（例えば、ＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）に０．５ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ-４を添加し、１日後、培地を１０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ-４、１０ｎｇ／ｍｌ　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した物に交換し、４日目後、培地を１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ　Ｄｋｋ１を添加した物に交換し、８日目後、培地を１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ　Ｄｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した物に交換することで自律的な拍動を伴う心筋細胞を確認できる。
［細胞組成物］
　本発明に係る、足場非存在下、ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で培養された幹細胞及び／又は分化細胞を含む細胞組成物は、さらなる幹細胞の培養のため、あるいは再生医療用の細胞ソースのために利用され得る。
　ここで、本発明に係る細胞組成物は、前述の製造方法により得られ、小さな細胞塊のような分散した幹細胞を含む組成物であり得る。本発明に係る細胞組成物は、前述の製造方法の工程（ｃ）で用いられるＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地に由来するＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含んでいてもよく、その他の培地成分を含んでいてもよい。さらに、細胞組成物はフィーダー細胞を含んでも良い。
　本発明に係る細胞組成物は、例えば、凍結保存による幹細胞の保存、輸送、及び継代に用いられ得る。凍結保存等の保存に用いられる場合、本発明に係る細胞組成物には、公知の細胞保存液の他、上述したような培地の成分、血清あるいはその代替物、又はＤＭＳＯ等の有機溶剤をさらに含んでいてもよい。この場合、血清又はその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが、１～５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５～２０％（ｖ／ｖ）であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが、０～５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５～２０％（ｖ／ｖ）であり得る。
　また、本発明に係る細胞組成物は医薬として利用することができる。この場合、医薬に適した公知の形態及び組成を適用することができる。例えば、心筋細胞を含む細胞組成物としては、シート状に形成されて心疾患の治療のため好適に心臓へ移植され得るものである。本発明に係る細胞組成物は、移植、静脈注射、皮下注射、関節内注射および筋肉注射などの手段によって患者に適用することができる。医薬としての細胞組成物は、異種動物由来成分の混入防止の観点から血清を含有しないことが好ましい。
［実施例１：ＭＦＧ－Ｅ８含有培地によるヒトｉＰＳ細胞の培養］
　足場依存性細胞を足場非存在下で培養した場合におけるＭＦＧ－Ｅ８の効果を、ヒトｉＰＳ細胞を用いて評価した。
（１）ヒトｉＰＳ細胞の準備
　ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７、理研セルバンクNo.HPS0063）を、フィーダー細胞（マイトマイシン処理マウス胎児線維芽細胞）上で培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。継代は、３～４日毎に行った。継代は、解離液を用いてｉＰＳ細胞をフィーダー細胞から解離した後、小細胞塊（約５０～１００個）に分散し、フィーダー細胞上に播種することにより行った。培養液及び解離液には以下を用いた。
培養液：
　Ｄ-ＭＥＭＦ１２（ＳＩＧＭＡ社）
　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）　　　　　　　 ２０％
　ＭＥＭ　ＮＯＮ-ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ　ＡＭＩＮＯ　ＡＣＩＤ［×１００］（ＳＩＧＭＡ社　製品番号：Ｍ７１４５） １％
　Ｌ-グルタミン酸　　　　　２．０ｍＭ
　２-メルカプトエタノール　８０μＭ
解離液：
　ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＳＩＧＭＡ社、製品番号：Ｄ５６５２）
　トリプシン　　　　０．２５％
　コラゲナーゼＩＶ　１ｍｇ／ｍｌ
　ＣａＣｌ２　　　　１ｍＭ
（２）足場非存在下での培養
　ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞から小細胞塊として解離した。小細胞塊中に混入するフィーダー細胞を除去するために、小細胞塊を足場（ゼラチン）がコートされたプレートに移し、維持培養液（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－８，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で１時間培養してフィーダー細胞をプレートに吸着させた。なお、この維持培養液は、無血清である。その後、小細胞塊を足場がコートされていないプレートに播種し（細胞密度：１×１０５個／０．６５ｃｍ２、培地容量０．５ｍｌ中）、ＭＦＧ-Ｅ８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＭＦＧ－Ｅ８、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔａｌｏｇ　＃２７６７－ＭＦ－０５０）を含む維持培養液（ＭＦＧ－Ｅ８　２μｇ／ｍｌ）又はＭＦＧ-Ｅ８を含まない維持培養液で４日間培養した。培養後、形成されたコロニーの面積を計測した。なお、ここで用いたＭＦＧ-Ｅ８は、配列番号１においてシグナル配列を欠失させたアミノ酸配列（２４番目から３８７番目のアミノ酸配列）にＨｉｓタグ配列を付加したアミノ酸配列からなる。
（３）結果
　結果を図１に示す。ＭＦＧ-Ｅ８を含まない培地では、コロニーはほとんど認められなかったが、ＭＦＧ-Ｅ８を添加した培地では、多数のコロニーが認められた。ＭＦＧ-Ｅ８添加培地で生育したコロニーは、未分化胚性幹細胞のマーカーであるアルカリフォスファターゼを発現していた。これらの結果から、ＭＦＧ-Ｅ８が、足場非存在下におけるｉＰＳ細胞の接着を促進し、細胞の生存と増殖（コロニー形成）を可能とする効果を有することが明らかとなった。また、ＭＦＧ－Ｅ８添加濃度を０，０．５，１，２，５μｇに変更して試験を行った結果を図２に示す。１μｇ／ｍｌ以上の濃度では、細胞の生着と増殖が顕著に促進された。
［実施例２：ＭＦＧ－Ｅ８含有培地によるヒトｉＰＳ細胞の分化誘導］
　ＭＦＧ－Ｅ８含有培地を用いて足場非存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞の分化能を評価した。
　実施例１と同様にして、ｉＰＳ細胞の小細胞塊を足場がコートされていないプレートに播種し、ＭＦＧ-Ｅ８を含む分化誘導培養液（ＭＦＧ－Ｅ８　１μｇ／ｍｌ）又はＭＦＧ-Ｅ８を含まない分化誘導培養液で培養した。分化誘導培養液には市販のキット（ＰＳｄｉｆ-Ｃａｒｄｉｏ　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍ　ＲＤ社）を用いた。なお、この分化誘導培養液は、無血清である。１０日間培養後に顕微鏡にて心筋細胞の分化誘導の有無を確認した。
　ＭＦＧ-Ｅ８を含まない培地では、細胞の生着が認められず、心筋細胞の誘導は不能であったが、ＭＦＧ-Ｅ８を添加した培地では、自律性の拍動を示す心筋細胞が確認された。この結果から、ＭＦＧ-Ｅ８が、足場非存在下におけるｉＰＳ細胞の接着を促進し、細胞の生存と増殖（コロニー形成）、さらにはその後の分化を可能とする効果を有することが明らかとなった。
配列番号１：ヒトＭＦＧ－Ｅ８のアミノ酸配列

Claims (25)

  1. 　ＭＦＧ－Ｅ８（Ｍｉｌｋ　ｆａｔ　ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ　ｆａｃｔｏｒ　８）又は該タンパク質の断片を含む、足場依存性細胞の培地。
  2. 　前記足場依存性細胞が幹細胞である、請求項１記載の培地。
  3. 　前記幹細胞が胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項２記載の培地。
  4. 　前記足場依存性細胞がヒト由来である、請求項１～３のいずれか一項に記載の培地。
  5. 　無血清の培地である、請求項１～４のいずれか一項に記載の培地。
  6. 　ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む、足場依存性細胞の接着促進剤。
  7. 　ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で、足場非存在下、足場依存性細胞を培養する手順を含む、足場依存性細胞の培養方法。
  8. 　前記足場依存性細胞が幹細胞である、請求項７記載の培養方法。
  9. 前記幹細胞が胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項８記載の培養方法。
  10. 前記足場依存性細胞がヒト由来である、請求項７～９のいずれか一項に記載の培養方法。
  11. 前記培地が無血清の培地である、請求項７～１０のいずれか一項に記載の培養方法。
  12. ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で、足場非存在下、幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
  13. （ａ）幹細胞をフィーダー細胞上で培養する工程と、
    （ｂ）前記フィーダー細胞から前記幹細胞を解離する工程と、
    （ｃ）ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で、フィーダー細胞非存在下、前記幹細胞を培養する工程と、を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
  14. 前記工程（ｃ）で用いる前記培地が無血清の培地である、請求項１３記載の製造方法。
  15. 前記幹細胞が胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の製造方法。
  16. 前記幹細胞がヒト由来である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の製造方法。
  17. ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で、足場非存在下、幹細胞の分化を誘導する工程を含む、幹細胞からの分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
  18. 前記幹細胞が胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１７の製造方法。
  19. 前記幹細胞がヒト由来である、請求項１７又は請求項１８記載の製造方法。
  20. 前記培地が無血清の培地である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の製造方法。
  21. 足場非存在下、ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む培地で培養された、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物。
  22. 前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項２１記載の細胞組成物。
  23. 前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項２１又は請求項２２記載の細胞組成物。
  24. 前記培地が無血清の培地である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  25. ＭＦＧ－Ｅ８又は該タンパク質の断片を含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の細胞組成物。

     
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