KR20170132281A - 사람 혈청 알부민을 포함하는 신경 줄기세포 증식 배지 - Google Patents

사람 혈청 알부민을 포함하는 신경 줄기세포 증식 배지 Download PDF

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Abstract

신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의, 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진시키는, 사람 혈청 알부민을 포함하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 증식 배지, 및 당해 배지를 사용한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 증식 방법 등을 제공한다.

Description

사람 혈청 알부민을 포함하는 신경 줄기세포 증식 배지
본 발명은, 사람 혈청 알부민을 포함하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 증식 배지, 및 당해 배지를 사용한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 증식 방법 등에 관한 것이다.
신경 줄기세포는, 자기 복제능을 갖고, 다분화능(multipotency)을 갖는 미분화한 세포이고, 신경계의 다양한 세포(신경세포 및 신경 전구세포(neural progenitor), 및 글리아(glia) 세포(아스트로사이트(astrocyte), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 등) 및 글리아 전구세포 등)을 산출하는 능력을 가진 세포이다. 신경 줄기세포 및 신경 전구세포는, 신경세포 등의 통상 성체에서 증식하기 어려운 세포를 공급할 수 있기 때문에, 재생 의료에서의 생체 재료의 제공원으로서 주목을 모으고 있으며, 근위축성 측색 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 난치성 신경 질환이나 신경 손상에 대한 치료 응용에 대한 기대가 모아지고 있다. 이러한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 사용한 난치성 신경 질환이나 신경 손상에 대한 치료, 및 이들 치료법의 개발 연구 등에는, 다량의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 필요로 하기 때문에, 시험관내(in vitro)에서의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양 방법의 개발 및 개량은 중요한 과제 중 하나이다.
신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양 방법으로서는, 지금까지 몇 가지 방법이 보고되어 있다.
비특허문헌 1에는, 신경 줄기세포의 시험관내에서의 배양 방법으로서, 뉴로스피어(neurosphere) 배양이 기재되어 있다. 당해 문헌에서는, 상피세포 성장 인자(EGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함하는 무혈청 배지 중에서 신경 줄기세포를 부유 배양함으로써, 신경 줄기세포의 미분화 상태를 유지하고 다분화능을 유지한 채로 증식시키는 것이 가능한 것이 나타나 있다.
또한, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 접착 단층 배양하는 방법으로서는, 라미닌, 폴리-L-오르니틴, 피브로넥틴 등의 기질로 코팅된 배양기 위에서, EGF 및/또는 bFGF를 포함하는 배지를 사용하여 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 방법 등이 열거된다(비특허문헌 2).
상기의 접착 단층 배양에 있어서는, 신경 줄기세포는 대칭 분열을 행하여, 자기 복제하는 것이 보고되어 있고, 뉴로스피어 배양과 비교하여 균일한 세포 집단을 제공 가능하다는 이점을 갖는다.
이들 배양 방법은 신경 줄기세포 및 신경 전구세포를 시험관내에서 배양할 수 있다는 큰 이점을 갖지만, 세포의 증식이 늦어 배양에 시간이 걸린다는 결점이 있다. 따라서, 신경 줄기세포나 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 증식을 촉진시키기 위한, 개량된 배지 및 배양 조건의 개발이 요망된다.
그런데, 혈청 알부민을 포함하는 배지에 대해서는, 지금까지 몇 가지 기재가 이루어지고 있다. 특허문헌 1에는, 줄기세포를 내배엽 전구세포로 분화시키는 배지로서 침투압을 조절한 배지를 개시하고 있고, 사람 혈청 알부민을 첨가한 배지 중에서 사람 인공 다능성 줄기(iPS) 세포주를 배양하면, 내배엽 분화 유도의 효율이 촉진되는 것이 기재되어 있다. 또한 비특허문헌 3에는, 당화 반응(메일라드 반응)의 최종 당화 생성물(AGE)이 신경 줄기세포의 분화에 미치는 효과를 검토하기 위해, AGE 수식된 소 혈청 알부민 단백질을 포함하는 배지를 사용하여 신경 줄기세포의 배양을 행하고 있다. 당해 배지 중에서 뉴로스피어 배양을 행하면 글리아 세포의 일종인 아스트로사이트로의 분화가 촉진되는 것이 보고되어 있다. 또한, 비특허문헌 4에는, 침투압 유지 및 성장 인자 및 지방산 유지를 위해 소 혈청 알부민을 첨가한 원발성 뇌종양 세포 배양용 배지에 대해 기재되어 있다. 이에 더해, 소 혈청 알부민은 저렴하고 입수하기 쉬우므로, 배지 중의 침투압을 조정하기 위해, 또는 지방산 등의 난용성의 화합물을 가용화하기 때문에, 배지 중에 첨가하는 것도 있다.
하지만, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능의 유지나 증식 촉진에 사람 혈청 알부민이 미치는 영향에 대해서는 전혀 밝혀져 있지 않다.
특허문헌 1: 미국 특허출원 공개 제20130224857호 명세서
비특허문헌 1: Science, 1992, 255(5052), 1707-10. 비특허문헌 2: PLoS Biology, 2005, 3(9), e283 비특허문헌 3: International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(1), 159-170 비특허문헌 4: BioTechniques, 2013, 55(2), 83, 85-86, 88
본 발명의 목적은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진시키는 배지를 제공하는 것이고, 또한, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 사람 혈청 알부민이, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능의 유지 및 증식 촉진에 작용하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같은 것이다.
[1] 사람 혈청 알부민을 포함하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 용 배지.
[2] 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지용인, 상기 [1]에 기재된 배지.
[3] 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진용인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 배지.
[4] 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지 및 증식 촉진용인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[5] 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 다능성 줄기세포 유래인, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[6] 사람 혈청 알부민이 재조합체(recombinant)의 사람 혈청 알부민인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[7] 사람 혈청 알부민이 사람 혈장 유래인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[8] 배지 중에 지방산을 포함하는, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[9] 배지 중의 지방산량이 50μM 이하인, 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[10] 배지 중의 지방산량이 20μM 이하인, 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[11] 배지 중의 사람 혈청 알부민량이 0.2㎎/mL 이상 20㎎/mL 이하인, 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[12] 배지 중의 사람 혈청 알부민량이 0.5㎎/mL 이상 10㎎/mL 이하인, 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[13] 부유 배양용인, 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[14] 무혈청 배지인, 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[15] 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)를 포함하는, 상기 [1] 내지 [14] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[16] 배지 중의 bFGF량이 1ng/mL 이상 200ng/mL 이하인, 상기 [15]에 기재된 배지.
[17] 사람 혈청 알부민을 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 증식시키는 방법.
[18] 사람 혈청 알부민을 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지 방법.
[19] 사람 혈청 알부민을 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 미분화 유지하면서 증식 촉진시키는 방법.
[20] 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 다능성 줄기세포 유래인, 상기 [17] 내지 [19] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[21] 사람 혈청 알부민이 재조합체의 사람 혈청 알부민인, 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[22] 사람 혈청 알부민이 사람 혈장 유래인, 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[23] 배지에 지방산이 포함되는 것을 특징으로 하는, 상기 [17] 내지 [22] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[24] 배지 중의 지방산량이 50μM 이하인, 상기 [17] 내지 [23] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[25] 배지 중의 지방산량이 20μM 이하인, 상기 [17] 내지 [24] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[26] 배지 중의 사람 혈청 알부민량이 0.2㎎/mL 이상 20㎎/mL 이하인, 상기 [17] 내지 [25] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[27] 배지 중의 사람 혈청 알부민량이 0.5㎎/mL 이상 10㎎/mL 이하인, 상기 [17] 내지 [26] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[28] 당해 배지 중에서 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 부유 배양하는 것을 특징으로 하는, 상기 [17] 내지 [27] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[29] 상기 [1] 내지 [16] 중 어느 한 항에 기재된 배지 및 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함하여 이루어진 배양 조성물.
본 발명에 의하면, 미분화성, 다분화능을 유지한 채로 장기간에 효율적으로 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양을 행하는 것이 가능해진다. 그 결과, 배양에 의해 다량의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 얻는 것이 가능해진다. 또한, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에 드는 비용을 삭감하는 것이 가능해진다. 본 발명에 의하면, 특히 치료용의 사람의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양 시에, 이종 유래의 성분의 혼입을 피하는 것이 가능해진다.
도 1은, 사람 혈청 알부민 농도 의존적인 뉴로스피어의 분화 억제 경향을 나타낸다. 각각 최종 농도 0.2㎎/mL, 1㎎/mL, 2.1㎎/mL가 되도록 사람 혈청 알부민을 첨가한 배지 중에서 14일간 배양 후의 뉴로스피어를 나타낸다. 1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지에서 배양한 뉴로스피어(왼쪽 아래) 및 2.1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지에서 배양한 뉴로스피어(오른쪽 아래)는, 14일간 배양 후에도 양호한 뉴로스피어 형태를 유지하였다. 사람 혈청 알부민을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 뉴로스피어(왼쪽 위)는, 14일간 배양 후, 뉴로스피어와 같은 형태를 잃고, 다수의 돌기를 갖는 세포가 관찰되었다. 0.2㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지에서 배양한 뉴로스피어(오른쪽 위)는, 14일간 배양 후, 뉴로스피어와 같은 형태를 일부 잃었지만, 사람 혈청 알부민을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 뉴로스피어(왼쪽 위)와 비교하여, 분화는 억제 경향에 있었다.
도 2는, 2.1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지 중에서 배양한 뉴로스피어에서의, 면역 염색의 결과를 나타낸다. βⅢ 튜뷸린(녹색) 양성의 신경세포가 다수 관찰되었다.
도 3은, 사람 혈청 알부민을 첨가한 지방산(올레산)을 포함하는 배지 중에서 배양한 뉴로스피어의 형태를 나타낸다. 60μM에서 검은색의 이형 스피어상이 다수 확인되었다.
도 4는, 사람 혈청 알부민의 Long-term self-renewing neuro epithelial-like stem cells(LtNES 세포)의 분화 억제 경향을 나타낸다. 각각 최종 농도 0.21㎎/mL, 1㎎/mL, 2.1㎎/mL가 되도록 사람 혈청 알부민을 첨가한 배지 중에서 4 내지 5일간 배양 후의 LtNES 세포를 나타낸다. 1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지에서 세포 수가 가장 증가하고, 0.21, 2.1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지에서도 세포는 양호한 증식을 나타냈다.
본 발명은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진시키는 배지(이하, 이것을 본 발명의 배지라고도 함), 및, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성, 다분화능을 유지한 채로 장기간에 효율적으로 배양하는 방법(이하, 이것을 본 발명의 방법이라고도 함)을 제공한다.
(1) 사람 혈청 알부민
알부민이란, 난백, 혈청, 유즙 등에 포함되는 응고하기 쉬운 단백질의 총칭이다. 알부민은, 약산성부터 약알칼리성 용액(희산(希酸), 물, 희(希)알칼리)에 가용이지만, 50%의 황산 암모늄으로 염석되지 않고, 고농도의 황산 암모늄으로 침전한다. 분자량 수만 이하(45,000 정도)에서 많은 것은 등전점 pI4.5 내지 6의 구상 단백질인 것이 알려져 있다. 대표적인 것으로서는, 오브알부민, 락트알부민, 혈청 알부민, 파르브알부민 등을 들 수 있다.
혈청 알부민 단백질은, 혈청에 많이 존재하는 단백질의 하나이고, 분자량 약 66,000의 가용성의 구상 단백질이다. 프레프로알부민으로부터 프로알부민을 거쳐 생성된다. 혈장 단백질 중의 50%에서 60%를 차지하는 것이 알려져 있고, 혈청 알부민의 농도는 혈장이나 간질액의 침투압 조절에 큰 역할을 다한다. 또한, 혈중의 난용성 물질(지방산이나 약제 등)과 결합하여 운반하는 역할을 하는 것도 알려져 있다.
본 발명에 사용되는 사람 혈청 알부민은, 천연의 사람 혈청 알부민이라도 좋고, 비천연이라도 좋다. 사람 혈청 알부민은, 혈장 성분으로부터 단리 정제한 혈장 유래의 사람 혈청 알부민이라도 좋고, 유전자 재조합 기술에 의해 미생물, 세포 또는 식물에 의해 생산시킨 것으로부터 단리 정제하거나 재조합체의 사람 혈청 알부민이라도 좋다. 치료 등의 목적을 위해 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 경우, 이물의 혼입을 피한다는 관점에서, 본 발명에 사용되는 사람 혈청 알부민은, 바람직하게는, 재조합체의 사람 혈청 알부민인 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 사람 혈청 알부민은, 구리 이온, 아연 이온 등의 금속 이온, 글루타티온, 피리독살, 빌리루빈 또는 지방산 등과 결합된 것이라도 좋고, 금속 이온, 글루타티온, 피리독살, 빌리루빈 및 지방산의 어느 것과도 결합되어 있지 않은 것이라도 좋다. 지방산과 결합된 사람 혈청 알부민을 사용하여 본 발명의 배지를 제작하는 경우, 사람 혈청 알부민의 지방산 담지량은, 바람직하게는 10㎎/g 이하, 보다 바람직하게는 6㎎/g 이하이고, 사람 혈청 알부민의 지방산 담지량은 0㎎/g이라도 상관없다.
사람 혈청 알부민 지방산 담지량의 측정은, 당 분야에서 통상 실시되고 있는 방법 또는 그에 준한 방법을 사용하여 실시할 수 있고, 예를 들어, 유리 지방산을 메틸에스테르화 후 GC-MS에 의한 검출이나, 적외 분광에 의한 정량에 더하여 Duncombe의 추출법, 아실-CoA 합성 효소(ACS)와 아실-CoA 산화 효소(ACOD)를 사용한 ACS-ACOD법 등을 들 수 있다. 모두 측정 키트로서 시판되고 있는 것을 이용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 사람 혈청 알부민은, 지방산 담지량이 높은 HSA를, 예를 들어 WO2014/192938 등에 기재된 방법에 의해, 결합하는 지방산량을 상기 범위로 저감시킨 것이라도 좋고, 시판의 지방산 프리-사람 혈청 알부민(예, Essentially fatty acid free(~ 0.005%), Sigma Aldrich 등)을 사용해도 좋다. 조성이 불명확한 지방산의 배지로의 혼입을 피한다는 관점에서, 지방산과 결합된 사람 혈청 알부민을 사용하는 경우, 사람 혈청 알부민은, (1) 지방산 담지량이 낮은(통상 0.02% 이하, 바람직하게는 0.005% 이하) 사람 혈청 알부민, (2) (1)의 사람 혈청 알부민에 조성이 명확한 지방산(예를 들어 리놀레산)을 담지시킨 사람 혈청 알부민 중 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 지방산 담지량이 낮은 사람 혈청 알부민을 사용한 경우라도, 사람 혈청 알부민은 배지 중의 지방산과 결합할 수 있기 때문에, 배지 중의 사람 혈청 알부민의 지방산 담지량은 상기의 값으로부터 변화할 수 있다.
당화 반응(메일라드 반응)에 의해 형성되는 최종 당화 생성물이 다양한 독성이 있는 것이 알려져 있기 때문에, 사람 혈청 알부민은, 최종 당화 생성물이 아닌 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 사람 혈청 알부민은, 단량체라도 좋고, 다량체를 형성하고 있어도 좋다. 바람직하게는, 사람 혈청 알부민은 단량체이다.
본 발명의 방법에 있어서, 배지에 사람 혈청 알부민을 첨가하는 경우, 사람 혈청 알부민을 첨가하는 타이밍은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 사람 혈청 알부민은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 배양 개시 시 또는 배양 도중의 임의의 타이밍에서 첨가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 배지 중의 사람 혈청 알부민의 양은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 하한치로서는 0.2㎎/mL 이상, 바람직하게는 0.5㎎/mL 이상, 더욱 바람직하게는 약 1㎎/mL 이상이고, 가장 바람직하게는 1㎎/mL 이상이고, 상한치로서는 20㎎/mL 이하, 바람직하게는 10㎎/mL 이하, 더욱 바람직하게는 약 5㎎/mL 이하이고, 가장 바람직하게는 5㎎/mL 이하이다. 여기서, 「약」이란, ±10%를 허용하는 의미로 사용한다. 본 발명에 있어서, 배지 중의 사람 혈청 알부민의 양은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 0.2㎎/mL 내지 20㎎/mL, 바람직하게는 0.5㎎/mL 내지 10㎎/mL, 보다 바람직하게는 1㎎/mL 내지 5㎎/mL, 더욱 바람직하게는 약 1㎎/mL 내지 약 2.1㎎/mL, 가장 바람직하게는 1㎎/mL 내지 2.1㎎/mL이다. 여기서, 「약」이란, ±10%를 허용하는 의미로 사용한다. 배지에 포함되는 사람 혈청 알부민의 양이 0.2㎎/mL 미만의 경우, 신경세포로 분화하는 세포의 비율이 증가하는 점에서 바람직하지 않다. 한편, 배지에 포함되는 사람 혈청 알부민의 양은 많아도 문제는 없으나, 통상, 배지에 포함되는 양으로서는 20㎎/mL 이하가 적당하다.
혈장 유래의 사람 혈청 알부민은, 자체 공지의 방법에 의해 입수 가능하다. 예를 들어, 사람 혈청 알부민은, 혈장 성분 중으로부터 단리함으로써 입수할 수 있다. 사람 혈장 성분 중으로부터 사람 혈청 알부민을 단리하는 방법의 일례로서는, 한정되는 것은 아니지만, 저온 에탄올 분획법(Cohn Method)을 들 수 있다. 저온 에탄올 분획법이란, 저온 하에서 에탄올 농도, pH 등을 조정함으로써 혈장 단백질을 분리하는 방법이고, 저온 에탄올 분획법에 의해 얻어진 사람 혈청 알부민 분획(사람 혈청 알부민은 분획 V로 분획됨)으로부터 천연의 사람 혈청 알부민을 입수할 수 있다. 또한, Kistler 등에 의한 방법(Graham, J.M., Rickwood, D.Subcellular Fractionation, a Practical Approach.Oxford University Press.1997), Tanaka K 등에 의한 방법(Braz J Med Biol Res.1998 Nov; 31(11):1383-8) 등의 Cohn Method를 개량한 방법에 의해서도, 혈장 성분으로부터 사람 혈청 알부민을 분리하는 것이 가능하다.
재조합체의 사람 혈청 알부민의 입수 방법으로서는, 효모균 등의 미생물, 동물 세포 또는 식물 등에 사람 혈청 알부민을 생산시키고, 배양물로부터 사람 혈청 알부민을 단리 정제하는 방법을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 미생물에 사람 혈청 알부민을 생산시키는 방법으로서는, 효모를 사용하는 방법(Quirk AV 등, Biotechnol Appl Biochem.1989 Jun; 11(3):273-87, Okabayashi K 등, J Biochem.1991 Jul; 110(1):103-10, 일본 공개특허공보 특개소60-41487호, 일본 공개특허공보 특개소63-39576호, 일본 공개특허공보 특개소63-74493호), 대장균을 사용하는 방법(Lawn RM 등, Nucleic Acids Res.1981 Nov 25; 9(22):6103-114), 고초균(bacillus subtilis)을 사용하는 방법(Saunders CW 등, J Bacteriol.1987 Jul; 169(7):2917-25, 일본 공개특허공보 특개소62-25133호) 등을 들 수 있다. 식물에 사람 혈청 알부민을 생산시키는 방법으로서는, 벼(Oryza sativa)의 배유(endosperm) 중에서 사람 혈청 알부민을 생산시키는 방법(He 등, Proc Natl Acad Sci USA.2011 Nov 22; 108 (47):19078-83) 등을 들 수 있다. 또한, CHO 세포 등의 동물 세포에 생산시킨 사람 혈청 알부민을 사용할 수도 있다. 이들 사람 혈청 알부민 생산 숙주로부터의 사람 혈청 알부민의 단리 정제는, 상기의 문헌에 준한 방법, 일본 공개특허공보 특개평5-317079호, 일본 공개특허공보 특개평6-56883호, 일본 공개특허공보 특개평6-245789호, 일본 공개특허공보 특개평7-170993호, 일본 공개특허공보 특개평7-170994호, 일본 공표특허공보 특표평6-500050호, 일본 공개특허공보 특개2005-348745호, 일본 공개특허공보 특개2007-130025호 등에 기재된 정제 방법에 준한 방법, 또는 친화(affinity) 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 등 자체 공지의 방법, 및 이들의 조합 등을 적절히 선택하여 행하여진다.
사람 혈청 알부민의 cDNA 배열로서는, NCBI Accession No.로서 AF542069, DQ986150, AY960291, NM_000477 등이 예시되지만, 이들에 한정되지 않는다. 사람 혈청 알부민의 아미노산 배열로서는, NCBI Accession No.로서 NP_000468, AAA98797, CAA00844, CAA02034 등이 예시되지만, 이들에 한정되지 않는다.
사람 혈청 알부민으로서는,
1) 상기 사람 혈청 알부민의 아미노 배열에 있어서, 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 증식 촉진시키는 단백질,
2) 상기 사람 혈청 알부민의 아미노 배열에 있어서, 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지 효과를 갖는 단백질,
등이 포함된다.
상기 단백질이 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 효과를 갖는지 여부는, 예를 들어, 당해 단백질을 첨가한 배지 중 또는 단백질을 첨가하고 있지 않은 배지 중에서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 파종하고, 당해 배지 중에서 14일간 배양 후의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 수를 측정하여 비교함으로써 판정할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 배양 기간은 13일 이하, 15일 이상 등 적절히 선택 가능하다. 또한, 단백질이 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지 효과를 갖는지 여부는, 예를 들어, 당해 단백질을 첨가한 배지 중 또는 단백질을 첨가하고 있지 않은 배지 중에서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 파종하고, 당해 배지 중에서 14일간 배양 후의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 후술의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 마커로 염색하고, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 마커로 염색되는 세포 수를 측정하여 비교함으로써 판정할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 상기 단백질에는 사람 혈청 알부민이 포함된다.
사람 혈청 알부민은, 상업적으로 입수 가능한 것을 사용할 수도 있다. 상업적으로 입수 가능한 재조합체의 사람 혈청 알부민으로서는, 시그마 알드리치사 A9731(형번), 사이언셀 리서치 래버러토리즈사 OsrHSA-10(형번), 우한 헬스젠 바이오테크놀로지즈사 HY01E-10g(형번), 이엔자임사 HSA-1r(형번), 바이오베르데사 IBK-A1-10(형번) 등의 재조합체 벼 유래의 제품이나 시그마 알드리치사 A7223(형번), A6608(형번), A7736(형번), 노보자임사의 Albucult(등록상표)(제품명), Recombumin alpha(등록상표)(제품명), AlbIX(등록상표)(제품명) 등의 재조합체 효모 유래의 제품을 들 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 사람 혈장 유래 사람 혈청 알부민으로서는, 시그마 알드리치사 A1887(형번), A1653(형번), A9511(형번), A3782(형번), A8763(형번), A4327(형번), 바이올로지컬 인더스트리즈사 Bio-Pure HSA 10% Solution(제품명) 등의 제품을 들 수 있다.
(2) 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포
본 명세서 중, 신경 줄기세포란, 신경계 세포(신경세포 및 글리아 세포(아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등), 및 이들의 전구세포)로의 다분화능(multipotency)을 유지하고, 자기 복제능을 갖는 미분화된 세포를 의미한다. 구체적으로는, 신경 줄기세포란, 신경세포 및 글리아 세포(아스트로사이트, 올리고 덴드로사이트 등)를 최종적으로 산출하는 능력을 가지며, 또한, 초기화 등의 특별한 조작을 가하지 않는 한에서, 표피계 세포, 혈구계 세포, 근육 세포 등의 신경계 이외의 세포를 실질적으로 산출하지 않는 세포이다. 실질적으로 산출하지 않는다란, 신경 줄기세포가 산출하는 세포 중, 90% 이상이, 신경세포 및 글리아 세포(아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등), 및 이들의 전구세포(신경 줄기세포를 포함함) 중 어느 하나인 상태를 가리킨다.
본 명세서 중, 신경 전구세포(neural progenitor)란, 분열능을 갖는 미분화된 세포로서, 1종 이상의 신경세포에 최종적으로 분화하는 능력을 갖는 세포를 가리킨다. 신경 전구세포는, 신경세포를 최종적으로 산출하도록 운명이 결정되고, 또한, 신경세포 및 이의 전구세포 이외를 실질적으로 산출하지 않는 세포를 가리킨다. 글리아 전구세포(glial progenitor)란, 신경 줄기세포에 유래하고, 분열능을 갖는 미분화 세포로서, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아(microglia), 상의 세포(ependymalcell), 슈반 세포(schwann cell) 중 어느 하나 또는 이들의 전구세포로 분화하는 능력을 갖고, 또한 신경세포에 실질적으로 분화하지 않는 세포를 가리킨다.
신경 줄기세포 및 신경 전구세포는 엄밀하게 구별하는 것이 곤란하기 때문에, 본 명세서 중 「신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포」로서 구별 없이 사용되는 경우가 있다.
본 발명에 있어서는, 통상, 포유 동물 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 사용된다. 포유 동물로서는, 예를 들어, 마우스(mouse), 래트(rat), 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 식육목(carnivora), 사람, 원숭이, 히말라야 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 바람직하게는 마우스 등의 설치류 또는 사람 등 영장류의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포이며, 보다 바람직하게는, 사람 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포이다.
본 발명에 사용되는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 다능성 줄기세포 유래의 것, 생체 조직으로부터 분리한 것, 섬유아세포 등으로부터 다능성 줄기세포를 경유하지 않고 직접 분화 유도한 것(Stem Cells.2012 Jun; 30(6):1109-19) 등을 들 수 있고, 상기에 기재된 미분화성을 유지하고 다분화능을 유지하는 세포로서 신경세포를 산출하는 능력을 유지하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서 중, 다능성 줄기세포란, 자기 복제능 및 분화/증식능을 갖는 미숙한 세포로서, 태반을 제외한 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 다능성 줄기세포의 예로서는, 배아성 줄기세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포)(Takahashi K 등, Cell.2007 Nov 30; 131(5):861-72), 정자 줄기세포(Kanatsu-Shinohara M 등, Biol Reprod.2007 Jan; 76(1):55-62), 배아성 생식 세포(Matsui Y 등, Cell.1992 Sep 4; 70(5):841-7), 핵 이식에 의해 얻어진 클론 배아 유래의 ES 세포(Wakayama T 등, Science.2001 Apr 27; 292(5517):740-3) 등이 열거된다.
다능성 줄기세포 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다. 다능성 줄기세포 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 작성 방법으로서는, 다능성 줄기세포의 부유 배양을 행하여 배엽체 형성을 경유하여 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 형성시키는 방법(Bain G 등, Dev Biol.1995 Apr; 168(2):342-57 등), 스트로마 세포(stromal cell) 등을 피더 세포(feeder cell)로서 사용하여 다능성 줄기세포를 배양하는 방법, bFGF를 포함하는 무혈청 배지 중에서 다능성 줄기세포를 부유 배양을 행하는 방법(Watanabe K 등, Nat Neurosci.2005 Mar; 8(3):288-96 등), SMAD 시그널 저해제 Noggin 및 SB431542의 존재 하에서 다능성 줄기세포(ES세포 등)를 접착 배양하는 방법(Chambers SM 등, Nat Biotechnol.2009 Mar; 27(3):275-80), 단층 배양된 다능성 줄기세포(ES 세포 등)를 글리코겐 합성 키나제 3(GSK3: glycogen synthase kinase 3) 저해제, transforming growth factor β(TGF-β) 저해제, Notch 시그널 억제제 존재 하에 배양하는 방법(Li 등, Proc Natl Acad Sci USA.2011 May 17; 108(20):8299-304) 등이 열거된다.
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 ES 세포 또는 인공 다능성 줄기세포 유래이고, 보다 바람직하게는 인공 다능성 줄기세포 유래이다.
세포가 신경 줄기세포인 것은, 예를 들어, 세포를 EGF 및 bFGF를 포함하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 배양된 세포괴를 분산 처리 후에, 접착 배양을 행함으로써, 신경세포 및 글리아 세포로 분화 유도시킴으로써 확인할 수 있다.
또한, 신경 줄기세포는, 신경 줄기세포에서 발현하는 것이 알려져 있는 유전자, 이의 전사 산물, 단백질 등(신경 줄기세포 마커)에 의해 확인할 수도 있다.
신경 줄기세포 마커로서는, 세포 골격 단백질인 네스틴(Nestin; Science, 276, 66(1997)), SOX1(SRY(sex determining region Y)-box1), SOX2(SRY(sex determining region Y)-box2), Pax6(paired box 6), Ki67, 증식 세포핵 항원(PCNA), 지방산 결합 단백질 7(Fabp7, BLBP라고도 함) 등이 알려져 있고, 당업자는, 이들 마커를 적절히 조합하여 원하는 신경 줄기세포인 것을 확인할 수 있다. 본 발명에 적합한 신경 줄기세포로서는, 예를 들어, SOX2 양성 및 네스틴 양성인 세포가 열거되지만, 이에 한정되지 않는다.
세포가 신경 전구세포인 것은, 예를 들어, 세포를 배양하여, 신경세포로 분화 유도시킴으로써 확인할 수 있다.
신경 전구세포에서 발현되는 유전자로서는, Tbr2(T-box brain protein 2), MASH1(Mammalian achaete-scute homolog 1), 네스틴 등이 열거된다. 본 발명에 적합한 신경 전구세포로서는, SOX2 음성 및 네스틴 양성인 세포가 열거되지만, 이것에 한정되지 않는다.
분화된 신경세포의 마커의 예로서는, βⅢ 튜뷸린, MAP2(microtubule-associated protein) 등이 열거된다.
본 명세서 중, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 미분화 유지한다란, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 분열 후에 형성하는 세포 중 1개 이상의 세포가 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로서의 성질을 계속 유지하는 것, 또는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화가 억제되어 있는 것, 또는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 분열하지 않고 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로서의 성질을 계속 유지하는 것을 말한다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 분열 후에 형성하는 세포가, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로서의 성질을 유지하고 있는지 여부는, 예를 들어, 상술한 마커에 의해 확인할 수 있다.
본 명세서 중, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화가 억제된다란, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 산출하는 전 세포 중, 분화된 세포(예를 들어 신경세포)가 차지하는 비율이 감소하는 것을 말한다. 분화의 억제는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로부터 신경세포 등으로의 분화 억제라도 좋다. 분화 억제되고 있는지 여부는, 예를 들어, 상술한 분화 마커(예를 들어 βⅢ 튜뷸린 등의 신경세포 마커)에 의해 확인할 수 있다.
일 형태에서, 본 발명에서 사용되는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 단리되어 있다. 「단리」란, 목적으로 하는 성분이나 세포 이외의 요인을 제거하는 조작이 이루어져서, 천연(예, 생체 내)으로 존재하는 상태를 벗어나 있다는 것을 의미한다.
(3) 본 발명의 배지
본 발명의 일 실시형태로서, 본 발명은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양용의 배지를 제공한다. 본 발명의 배지는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지시켜, 증식을 촉진시키는 효과를 갖는다. 본 발명의 일 실시형태로서, 본 발명의 배지는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지용이고, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진용이며, 또는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지 및 증식 촉진용이다.
본 발명의 배지는, 사람 혈청 알부민을 포함한다. 첨가하는 사람 혈청 알부민에 대해서는 전술한 대로이다. 본 발명의 배지에 포함되는 사람 혈청 알부민 이외의 성분에 대해서는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 통상의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에 사용되는 조성을 적절히 채용할 수 있다.
본 발명의 배지는, 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제해도 좋다. 기초 배지로서는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수 있다. 본 발명의 배지는, 줄기세포 배양용으로서 통상 사용되는 배지를 기초 배지로 하여 조제해도 좋다. 시판의 줄기세포 배양용의 기초 배지로서는, RHB 배지(StemCells, Inc), TeSRTM-E6(STEMCELL Technologies), hESF-GRO 배지(니프로 가부시키가이샤), HESF-DIF 배지(니프로 가부시키가이샤), CSTI-7(가부시키가이샤 사이보 카가쿠 켄큐죠), Essential 6 배지(Life Technologies) 등이 열거된다.
본 발명에 사용되는 배지는, 화학적으로 미결정의 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 바람직하게는, 함유 성분이 화학적으로 결정된 배지(Chemically defined medium; CDM)이다.
혈청 중에는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화를 촉진시키는 성분이 포함되므로, 본 발명의 배지는, 무혈청 배지인 것이 바람직하다. 본 발명에서의 「무혈청 배지」란, 무조정 또는 미정제의 혈청이 포함되지 않은 배지를 의미한다. 본 발명에서는, 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예를 들어, EGF, bFGF 등의 증식 인자)가 혼입되어 있는 배지도, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는, 혈청 대체물을 함유하고 있어도 좋다. 혈청 대체물로서는, 예를 들어, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것을 들 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 혈청 대체물로서는 시판품을 이용해도 좋다. 이러한 시판의 혈청 대체물로서, 예를 들어, GlutamaxTM(Life Technologies사 제조), N2(Life Technologies사)가 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 배지를 사람 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포에 사용하는 경우, 이종 유래의 성분의 혼입을 피한다는 관점에서, 소 혈청 알부민 등의 사람 이외의 동물 유래의 혈청 알부민을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지가 사람 이외의 동물 유래의 알부민을 포함하는 경우라도, 이종 유래의 성분의 혼입을 피한다는 관점에서, 이의 양은 가능한 한 저감되고 있는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 본 발명의 배지 중의 사람 이외의 동물 유래의 알부민의 양은, 통상 1000ng/mL 이하, 바람직하게는 500ng/mL 이하, 보다 바람직하게는 100ng/mL 이하, 더욱 바람직하게는 10ng/mL 이하, 보다 더 바람직하게는 0ng/mL이다.
본 발명의 배지는, 추가로 배지 첨가물을 함유해도 좋다. 배지 첨가물로서는, 비타민류, 글루타민 등의 비필수 아미노산, 사이토카인 및 성장 인자 등의 단백질, L-아스코르브산, 인산L-아스코르빌마그네슘, 피루브산나트륨, 2-아미노에탄올, 글루코오스, 탄산수소나트륨, HEPES, 인슐린, 프로게스테론, 셀렌산나트륨, 푸트레신 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 첨가물은 자체 공지의 농도 범위 내에서 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지는, 필수 아미노산(L-라이신, L-류신, L-이소류신, L-트레오닌, L-발린, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-트립토판)을 포함한다. 본 발명의 배지는 바람직하게는 L-세린, L-시스틴, 글리신, L-시스테인, L-프롤린, L-메티오닌, L-글루타민산, L-아스파라긴, L-아스파라긴산 및 L-알라닌, L-글루타민, L-아르기닌, L-티로신을 포함한다.
본 발명의 배지는, 이노시톨, 염화콜린, 엽산, D-판토텐산칼슘, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 나이아신아미드, 비타민 B12, 리보플라빈(비타민 B2), D-비오틴, D-글루코오스, 피루브산나트륨, 히포크산틴, 티미딘, 리포산, 푸트레신염산염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 배지 첨가물을 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상 포함한다.
본 발명의 배지는, 바람직하게는, 상피세포 성장 인자(EGF) 및/또는 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)를 포함하고, 보다 바람직하게는 bFGF를 포함한다.
본 발명에 있어서 배지 중의 bFGF의 양의 상한치는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 제한되지 않지만, 바람직하게는 1000ng/mL 이하, 보다 바람직하게는 500ng/mL 이하, 더욱 바람직하게는 200ng/mL 이하이다.
본 발명에 있어서 배지 중의 bFGF의 양의 하한치는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.1ng/mL 이상, 보다 바람직하게는 1ng/mL 이상, 더욱 바람직하게는 10ng/mL 이상이다.
본 발명에 있어서 배지 중의 bFGF의 양은, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.1ng/mL 내지 1000ng/mL, 보다 바람직하게는 1ng/mL 내지 200ng/mL, 더욱 바람직하게는 10ng/mL 내지 200ng/mL이다.
일 형태로서, 본 발명의 배지는, bFGF(최종 농도 10ng/mL 내지 200ng/mL)를 포함한다.
또한, 본 발명의 배지는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화를 촉진시키는 효과를 갖는 물질(본 명세서 중, 신경 분화 촉진 물질이라고도 함)을 실질적으로 포함하지 않는 것이 바람직하다.
신경 분화 촉진 물질의 예로서는, BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), GDNF(Glial cell line-derived neurotrophic factor), cAMP(Cyclic adenosine monophosphate), dbcAMP(dibutyryl cAMP), DAPT(tert-butyl(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(3,5-difluorophenyl)acetyl]amino]propanoyl]amino]-2-phenylacetate), compound E(N-[(1S)-2-[[(3S)-2,3-Dihydro-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl]amino]-1-methyl-2-oxoethyl]-3,5-difluorobenzeneacetamide), SU5402(2-[(1,2-Dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-4-methyl-1H-pyrrole-3-propanoic acid), SU6668(3-[2,4-dimethyl-5-[(E)-(2-oxo-1H-indol-3-ylidene)methyl]-1H-pyrrol-3-yl]propanoic acid; Orantinib; 3-[2,4-dimethyl-5-[(E)-(2-oxo-1H-indol-3-ylidene)methyl]-1H- pyrrol-3-yl] propanoic acid)가 열거된다.
신경 분화 촉진 물질을 실질적으로 함유하지 않는다란, 신경 분화 촉진 물질이 포함되어 있어도 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화를 촉진할 수 없는 양이고, 사용되는 신경 분화 촉진 물질의 종류에 따라 적절하게 설정된다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 배지에 포함되는 신경 분화 촉진 물질의 농도는 0μM이다.
본 발명의 배지는 지방산을 포함해도 좋다. 본 발명의 배지에 포함되는 지방산으로서는, 올레산, 리놀레산, α-리놀레산, γ-리놀레산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산, 이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 부티르산, 아세트산, 팔미톨레산, 길초산(발레르산), 카프로산, 에난트산(헵틸산), 카프릴산, 펠라르곤산, 카프린산, 라우르산, 미리스트산, 펜타데실산, 마르가르산, 쿠센산(khusenic acid), 에레오스테아르산, 아라키드산, 8,11-에이코사디엔산, 5,8,11-에이코사트리엔산, 베헨산, 리그로세르산, 네르본산, 세로트산, 몬탄산, 멜리신산 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 배지에 포함되는 지방산은, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 포화 지방산이라도 좋고, 불포화 지방산이라도 좋다.
원하는 효과를 달성할 수 있는 한 한정되는 것은 아니지만, 배지에는 통상 리놀레산이 사용되고 있다.
본 발명의 배지에는 통상 기초 배지에 유래하는 지방산이 포함되어 있다.
본 발명에서, 배지 중의 지방산의 양은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한, 또는 원하는 효과에 악영향을 미치지 않는 한 특별히 한정되지 않지만, 50μM 이하, 바람직하게는 25μM 이하, 보다 바람직하게는 22μM 이하, 더욱 바람직하게는 20μM 이하, 보다 더 바람직하게는 20μM 미만이다. 지방산의 농도가 60μM의 경우에서는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 중, 이의 다수가 통상보다도 증식능이 낮은 검은색의 이형 스피어를 형성하는 세포가 되는 점에서 바람직하지 않고, 배지 중의 지방산의 양은 50μM 이하가 바람직하며, 양이 적을수록 검은색의 이형 스피어가 형성되기 어려워지므로 바람직하다.
본 발명의 배지는, 통상의 기초 배지에 포함되는 정도의 양의 지방산을 포함하는 것이 바람직하고, 이의 양은, 바람직하게는 0.01μM 이상, 보다 바람직하게는 0.05μM 이상, 더욱 바람직하게는 0.1μM 이상이다.
본 발명에 있어서 배지 중의 지방산 농도는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.01μM 내지 50μM, 보다 바람직하게는 0.05μM 내지 25μM, 더욱 바람직하게는 0.05μM 내지 22μM, 보다 더 바람직하게는 0.1μM 내지 22μM, 가장 바람직하게는 0.1μM 내지 20μM이다.
본 발명의 배지가 지방산과 결합되어 있는 사람 혈청 알부민을 포함하는 경우, 상기 「배지 중의 지방산의 양」은, 배지 중의 유리 지방산의 양에 더해, 사람 혈청 알부민과 결합되어 있는 지방산의 양도 포함한다.
지방산과 결합된 사람 혈청 알부민을 첨가하여 본 발명의 배지를 제작하는 경우, 원하는 배지 지방산량을 달성할 수 있도록, 지방산 담지량이 적절한 사람 혈청 알부민을 사용하여 본 발명의 배지를 제작하는 것이 바람직하다.
2종 이상의 지방산이 본 발명의 배지 중에 포함되어 있는 경우에는, 이의 합계량이 상기 범위가 되도록 설정되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 배지는, bFGF(10ng/mL 내지 200ng/mL) 및 사람 혈청 알부민(0.5㎎/mL 내지 10㎎/mL)을 포함하고, 배지 중의 지방산양이 0.05μM 내지 50μM인 무혈청 배지이다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 배지는, bFGF(10ng/mL 내지 200ng/mL), 사람 혈청 알부민(약 1㎎/mL 내지 약 2.1㎎/mL)을 포함하고, 사람 이외의 동물 유래의 혈청 알부민의 농도가 500ng/mL 이하로서, 배지 중의 지방산량이 약 0.1μM 내지 약 20μM인 무혈청 배지이다. 여기서, 「약」이란 ±10%를 허용하는 의미로 사용한다.
바람직한 일 형태로서, 본 발명의 배지는, 사람 혈청 알부민에 더해, 트랜스페린, 인슐린, NaHCO3, 셀레늄, 에탄올아민, bFGF를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 배지는, 사람 혈청 알부민에 더해, 트랜스페린, 인슐린, NaHCO3, 셀레늄, 에탄올아민, bFGF, 이노시톨, 염화콜린, 엽산, D-판토텐산칼슘, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 나이아신아미드, 비타민 B12, 리보플라빈(비타민 B2), D-비오틴, D-글루코오스, 피루브산나트륨, 히포크산틴, 티미딘, 리포산, 푸트레신, 리놀레산, L-라이신, L-류신, L-이소류신, L-트레오닌, L-발린, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-트립토판 및 L-아스파라긴을 포함하는 무혈청 배지이다.
일 형태로서, 본 발명의 배지는, DMEM/F-12 배지를 기초 배지로 하여, 사람 혈청 알부민(0.5㎎/mL 내지 10㎎/mL)에 더해, 트랜스페린(0.5μg/mL 내지 100μg/mL), 인슐린(5μg/mL 내지 1㎎/mL), NaHCO3(100μg/mL 내지 5㎎/mL), 셀렌산나트륨(2ng/mL 내지 1μg/mL), 에탄올아민(100ng/mL 내지 100μg/mL), bFGF(10ng/mL 내지 200ng/mL)를 포함한다.
다른 바람직한 형태로서, 본 발명의 배지는, 사람 혈청 알부민에 더해, bFGF, hLIF, 글루코오스, 글루타민, NaHCO3, HEPES, 인슐린, 트랜스페린, 프로게스테론, 셀렌산나트륨, 푸트레신을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 배지는, 사람 혈청 알부민에 더해, 글루코오스, 글루타민, NaHCO3, HEPES, 인슐린, 트랜스페린, 프로게스테론, 셀렌산나트륨, 푸트레신, 이노시톨, 염화콜린, 엽산, D-판토텐산칼슘, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 나이아신아미드, 아미드, 비타민 B12, 리보플라빈(비타민 B2), D-비오틴, D-글루코오스, 피루브산나트륨, 히포크산틴, 티미딘, 리포산, 푸트레신, 리놀레산, L-라이신, L-류신, L-이소류신, L-트레오닌, L-발린, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-트립토판, L-아스파라긴을 포함하는 무혈청 배지이다.
일 형태로서, 본 발명의 배지는, DMEM/F-12 배지를 기초 배지로 하여, 사람 혈청 알부민(0.5㎎/mL 내지 10㎎/mL)에 더해, bFGF(10ng/mL 내지 200ng/mL), hLIF(1ng/mL 내지 100ng/mL), 글루코오스(1㎎/mL 내지 10㎎/mL), 글루타민(100μg/mL 내지 1㎎/mL), NaHCO3(100μg/mL 내지 5㎎/mL), HEPES(100μg/mL 내지 5㎎/mL), 인슐린(5μg/mL 내지 1㎎/mL), 트랜스페린(0.5μg/mL 내지 100μg/mL), 프로게스테론(2ng/mL 내지 1μg/mL), 셀렌산나트륨(2ng/mL 내지 1μg/mL), 푸트레신(100μg/mL 내지 10㎎/mL)을 포함한다.
본 발명의 배지는, 접착 배양, 부유 배양, 포매 배양, 조직 배양 등 중 어느 배양 방법에도 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 배지는 부유 배양용이다.
본 발명의 배지는, 어느 동물 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에도 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 배지를 사용하여 배양될 수 있는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 식육목, 사람, 원숭이, 히말라야 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포이고, 바람직하게는, 사람 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포이다.
(4) 본 발명의 방법
본 발명의 일 실시형태로서, 본 발명은, 사람 혈청 알부민을 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양 방법을 제공한다. 당해 방법은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 증식시키고, 미분화를 유지하는 방법이기도 하다.
본 발명의 일 실시형태로서, 본 발명의 방법은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 본 발명의 배지에서 배양하는 공정을 포함한다. 또한 다른 본 발명의 실시형태로서는, 본 발명의 방법은, 사람 혈청 알부민을 포함하지 않는 배지에 사람 혈청 알부민을 첨가하여, 사람 혈청 알부민 존재 하에서서 일정 기간 배양하는 공정을 포함한다.
신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에서의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 기간은, 통상 2일간 이상, 바람직하게는 4일간 이상, 더욱 바람직하게는 8일 이상이다.
신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 4일 이상 계속해서 배양하는 경우, 3일에 1회, 바람직하게는 2일에 1회 배지를 교환하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서 배지에 사람 혈청 알부민을 첨가하는 시간은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 길이의 시간인 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 배양 기간 중의 전 기간에 있어서 사람 혈청 알부민을 포함하는 배지에서 배양한다. 배지의 조성은 전술한 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 사용되는 배지에 사람 혈청 알부민이 포함되어 있는 것을 제외하고는, 접착 배양, 부유 배양, 조직 배양 등의 자체 공지의 방법에 의해 배양 가능하다. 배양 방법은 목적에 따라 적절하게 선택 가능하다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 접착 배양 방법의 예로서는, Flanagan LA 등, J Neurosci Res. 2006 Apr; 83(5):845-56, Conti L 등, PLoS Biology., 2005 Sep; 3(9):e283 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 부유 배양이란, 배지 중에 있어서, 배양기 또는 피더 세포(사용되는 경우)에 대해 비접착성의 조건 하에서 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 것을 말한다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 부유 배양 방법의 예로서는, 뉴로스피어법(Reynolds BA and Weiss S., Science, USA 1992 Mar 27; 255(5052):1707-10), 무혈청 응집 부유 배양법(SFEB법, SFEBq법; Watanabe 등, Nature Neuroscience 8,288-296(2005)) 등을 들 수 있다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 조직 배양이란, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함하는 조직을, 슬라이스 등 조직편 또는 조직 전체로서 배양하는 방법이다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 조직 배양으로서는, O'Rourke NA 등, Science. 1992 Oct 9; 258(5080):299-302., Komuro H 등, Science.1992 Aug 7; 257(5071):806-9에 기재된 슬라이스 배양법 등을 들 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 사람 혈청 알부민을 포함하는 배지 중에서 부유 배양되는 것이 바람직하다.
부유 배양에 의해 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 구상의 괴, 이른바 뉴로스피어를 형성한다. 부유 배양을 행하는 경우, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식의 유무, 정도는 형성되는 뉴로스피어의 크기, 또는 뉴로스피어를 구성하는 세포의 수를 측정함으로써 평가할 수 있다. 또한, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식의 유무나, 그 정도는, 트립판 블루(trypan blue) 등의 세포 염색 시약을 사용하여 생세포수를 계측함으로써도 평가할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에 사용되는 배양기는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬(dish), 페트리 디쉬(petri dish), 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬(multi dish), 마이크로 플레이트(microplate), 마이크로웰 플레이트(microwell plate), 멀티플레이트(multiplate), 멀티웰 플레이트(multiwell plate), 마이크로슬라이드(microslide), 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 및 롤러 보틀이 열거된다.
신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에 사용되는 배양기는, 세포 접착성이라도 세포 비접착성이라도 좋고, 목적에 따라 적절하게 선택된다. 부유 배양에 의해 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 경우, 분화하기 쉬운 세포를 제거하기 위해, 접착성의 배양기를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 접착 배양에 의해 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 경우에 있어서도, 배양기는 세포 접착성인 것이 바람직하다. 세포 접착성의 배양기는, 배양기의 표면의 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로, 세포외 매트릭스(ECM) 등의 임의의 세포 지지용 기질 또는 이들의 기능을 모방(mimic)하는 인공물로 코팅된 것일 수 있다. 세포 지지용 기질은, 줄기세포 또는 피더 세포(사용되는 경우)의 접착을 목적으로 하는 임의의 물질일 수 있다.
그 밖의 배양 조건은, 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 2 내지 5%이다. 산소 농도는, 통상 1 내지 40%이지만, 배양 조건 등에 따라 적절히 선택된다.
(5) 사람 혈청 알부민을 포함하는 배지 및 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함하여 이루어진 배양 조성물
본 발명은 추가로 상기 본 발명의 배지 및 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함하여 이루어진, 배양 조성물(본 명세서 중, 본 발명의 배양 조성물이라고도 함)을 제공한다. 당해 배양 조성물은, 세포를 배양함으로써 수득되는 결과물을 포함한다. 본 발명의 배양 조성물에 관련된 각 용어의 정의 및 형태는, 상기에 기재한 것과 동일하다.
본 발명의 배양 조성물에서의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 생존하여, 증식하고 있는 세포이다.
본 발명의 배양 조성물에서의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 순도(전체 세포 수에서 차지하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 수의 백분율)는, 통상 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다.
본 발명의 배양 조성물에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 본 발명의 배지 중에 존재한다. 일 형태에 있어서, 본 발명의 배양 조성물은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의, 본 발명의 배지 중의 현탁액이다. 본 발명의 배양 조성물은, 적절한 용기 중에 봉입되어 있어도 좋다.
일 실시형태로서, 본 발명의 배양 조성물은 동결 보존시킨 상태로 제공될 수 있다. 본 발명의 배양 조성물은 동결 보존하는 것이 가능하며, 필요에 따라 융해·기면하여 사용할 수 있다. 동결 보존은, 자체 공지의 세포 동결 보존 방법을 사용할 수 있다. 동결 보존의 예로서는, 본 발명의 배양 조성물에 디메틸설폭사이드를 첨가하고, -80 내지 -200℃, 바람직하게는 -196℃(액체 질소 중)의 조건으로 본 발명의 배양 조성물을 보존하는 방법을 들 수 있다.
이하에 실시예를 나타내어, 본 발명을 보다 상세히 설명하겠지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 사람 혈청 알부민 기능 평가
(1) 사람 다능성 줄기세포로부터 뉴로스피어 로의 유도
B27 서플리멘트(1x; Life Technologies), bFGF(PeproTech inc.), hLIF(Millipore), Y27632(와코 쥰야쿠 코교)를 첨가한 Media hormone mix(MHM) 배지를 작성하고, iPS 세포를 TrypLETM Select에서 단일 세포로 분산한 것을 당해 배지 중에서 37℃, 5% CO2, 4% O2 환경 하에서 부유 배양을 행하였다. 배지의 교환은 7일에 1회 행하였다. 배양 후, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 구상의 세포괴인 뉴로스피어를 형성하였다.
(2) 뉴로스피어 의 배양법
B27 서플리멘트(1x; Life Technologies), bFGF(최종 농도 20ng/mL; PeproTech inc.), hLIF(최종 농도 10ng/mL; Millipore)를 첨가한 Media hormone mix(MHM) 배지(Life Technologies)를 작성하고, 사람 다능성 줄기세포로부터 유도된 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 당해 배지 중에서 37℃, 5% CO2, 4% O2 환경 하에서 부유 배양을 행하였다. 배지의 교환은 7일에 1회 행하였다. 배양 후, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 구상의 세포괴인 뉴로스피어를 형성하였다.
뉴로스피어의 계대(繼代)에는, TrypLE Select(Life Technologies)를 사용하였다. 뉴로스피어 배양 중인 배양 접시에서 배지를 제거하고, TrypLE Select로 바꾸었다. TrypLE Select 내에서 37℃, 10분간 인큐베이팅을 행하고, 그 후 피펫팅을 행하여 단일 세포로 하였다. 분산시킨 세포를, 상기 배지 중에 1.0×105cells/mL가 되도록 파종하고, 37℃, 5% CO2 환경 하에서 배양을 행하였다.
(3) 사람 혈청 알부민 기능 평가
(2)에서 배양한 뉴로스피어를 사용하여 배지의 기능 평가를 행하였다. bFGF(최종 농도 20ng/mL), hLIF(최종 농도 10ng/mL)를 첨가한 Media hormone mix(MHM) 배지(Life Technologies)를 작성하여 피검 기초 배지로 하였다. 이 피검 기초 배지에 사람 혈청 알부민(Essentially fatty acid free(내지 0.005%), Sigma Aldrich)을 각각 최종 농도 0.2, 1, 2.1㎎/mL가 되도록 첨가한 배지(사람 혈청 알부민 첨가 배지) 또는 미첨가인 배지(대조군 배지) 중에서 뉴로스피어 배양을 행하고, 사람 혈청 알부민의 기능 평가를 행하였다. 7일에 한 번 배지 교환을 행하고, 14일간 배양 후, 현미경 하에서 형성된 뉴로스피어의 형태의 관찰을 행하였다. 결과를 도 1에 나타낸다.(또한, (3)의 배양 개시 전에, (3)에 기재된 배양 전에 사용한 배지의 반입을 극력 억제할 수 있도록, 배양 전에 사용한 배지를 희석하여 충분히 제거하였다.)
대조군 배지에서 배양한 뉴로스피어는, 14일간의 배양 후에, 구상의 형태를 잃고, 분화한 신경세포에서 보이는 돌기가 늘어난 세포 형태를 나타냈다. 한편, 1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지, 2.1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지 중에서 배양한 뉴로스피어는, 14일간의 배양 후에도 구상의 형태를 유지하고, 배양 전과 비교하여 뉴로스피어가 커져 있었다. 이들 배지 중에서 배양한 뉴로스피어에서는 분화한 세포에서 보이는 돌기가 늘어난 세포 형태는 나타나지 않았다. 0.2㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지에서 배양한 뉴로스피어는, 일부에서 분화한 세포에서 보이는 돌기가 늘어난 세포 형태가 관찰되었지만, 대조군 배지와 비교하여 돌기의 수가 적고 구상 형태를 유지하고 있는 뉴로스피어도 다수 관찰되었다.
이 결과로부터, 사람 혈청 알부민 농도 의존적인 뉴로스피어의 분화 억제 경향이 나타났다. 사람 혈청 알부민의 양이 0.2㎎/mL 이상으로 구상 형태를 유지하고 있는 뉴로스피어가 다수 관찰되지만, 특히 사람 혈청 알부민 1㎎/mL 이상으로 양호한 뉴로스피어상의 형성이 확인되었다.
실시예 2: 신경세포로의 분화 유도
사람 혈청 알부민 첨가 배지 중에서 배양한 뉴로스피어가 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로서의 성질을 유지하고 있는 것을 실증한다.
실시예 1과 동일하게, 사람 다능성 줄기세포 유래의 뉴로스피어를 2.1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지 중에서 14일간 배양하고, 그 후 분화 유도 배양을 행하였다. 분화 유도 배양을 위해, 사람 혈청 알부민 첨가 배지 중에서 배양한 뉴로스피어의 분산 처리를 행하였다. 분산 처리에는, TrypLE Select(Life Technologies)를 사용하였다. 뉴로스피어 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, TrypLE Select로 바꾸었다. TrypLE Select 내에서 37℃, 10분간 인큐베이팅을 행하고, 그 후 피펫팅을 행하여, 단일 세포로 하였다. 세포수 측정은 혈구계산반을 사용하여 행하였다. 분산시킨 세포는, 1.5×105세포/웰이 되도록 폴리-L-오르니틴/피브로넥틴으로 코트한 48웰플레이트에 파종하고, B27 서플리멘트(1x; Life Technologies)를 첨가한 Media hormone mix(MHM)(Life Technologies) 배지 중에서 20일간 배양하였다. 37℃, 5% CO2 환경 하에서 배양을 행하고, 배지 교환은 2일에 한 번 행하였다.
배양 후, 세포를 고정하고, 신경세포 마커인 βⅢ 튜뷸린에 대한 항체를 사용하여 면역 염색을 행하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.
분화 유도 배양한 세포는, βⅢ 튜뷸린 양성의 신경세포를 다수 포함하고 있었다. 사람 혈청 알부민 첨가 배지 중에서 배양한 뉴로스피어는 효율적으로 신경세포로 분화할 수 있는 것이 나타났다.
실시예 3: 지방산의 기능 평가
사람 혈청 알부민 첨가 배지에 추가로 지방산을 첨가하여 기능 평가를 행하였다. 실시예 3의 목적은, 지방산 담지량이 많은 사람 혈청 알부민의 작용을 확인하는 것이다.
실시예 1과 동일하게 2.1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지를 작성하였다. 이 배지에, 각각 최종 농도 20μM, 60μM가 되도록 올레산(도쿄 카세이 코교)을 첨가한 배지, 또는 올레산을 첨가하고 있지 않은 배지를 작성하고, 이들 배지 중에서 뉴로스피어 배양을 행하였다.(또한, 지방산 및 사람 혈청 알부민을 포함하는 배지는, 지방산을 미리 소정의 농도의 사람 혈청 알부민 용액과 혼합하고, 당해 혼합물을 배지에 첨가함으로써도 제작할 수 있다.) 배지 중의 올레산의 거의 100%가 HSA와 결합되어 있다고 추정된다. 7일에 한 번 배지 교환을 행하고, 14일간 배양 후, 현미경 하에서 형성된 뉴로스피어의 형태의 관찰을 행하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
20μM 올레산 첨가 배지 중에서 배양한 뉴로스피어는, 지방산을 첨가하고 있지 않은 배지 중에서 배양한 뉴로스피어와 동일한 양호한 뉴로스피어의 형태를 나타냈다. 한편, 60μM 올레산 첨가 배지 중에서 배양한 뉴로스피어에서는, 검은색의 이형 스피어의 형태를 나타내는 것이 다수 확인되었다.
실시예 4: 사람 혈청 알부민 기능 평가
(1) Long-term self-renewing neuro epithelial-like stem cells(이하 LtNES 세포) 유도법
iPS 세포로부터 EB를 형성하고, E6 배지(Life Technologies 또는 STEMCELL Technologies)에서 아스코르브산 및 트랜스페린을 제외한 조성에 상당하는 배지에 트랜스페린(최종 농도 0.5 내지 10μg/mL), 에탄올아민(최종 농도 5 내지 50μM)을 첨가한 배지 중에서, 4일간 배양하였다. 폴리-L-오르니틴(PO) 코트한 dish에 EB를 파종하고, 상기 배지 중에서 10일 정도 배양하여, Rosette와 같은 구조가 형성되는 것을 확인하였다. Rosette 부분을 도려내어, 뉴로스피어로서 상기 배지 중에서 부유 배양을 7일 정도 행하였다. 뉴로스피어를 트립신/EDTA로 분산하고, PO/라미닌 코트한 dish 위에서 상기 배지 중에서 배양하여, LtNES 세포를 작성하였다. LtNES 세포는 신경 줄기세포 및 신경 전구세포가 혼재한 것이다.
또한, 상기 E6 배지(Essential 6 배지)에 대해서는, Life Technologies사 홈페이지<URL:http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A1516401>에서, E8 배지를 베이스로 한 제법으로 만들어지고, bFGF와 TGFβ를 포함하지 않는 것이 기재되어 있다. 또한, E8 배지(Essential 8배지)에 대해서는, Nat Methods 2011 May; 8(5):424-429에 기재되어 있다.
또한, 상기 E6 배지의 성분은, Stem Cells. 2014 Apr; 32(4), 1032-42의 요약 중에도 기재되어 있다.
(2) 사람 혈청 알부민 기능 평가
E6 배지(Life Technologies 또는 STEMCELL Technologies)에서 아스코르브산 및 트랜스페린을 제외한 조성에 상당하는 배지에, 트랜스페린(최종 농도 0.5 내지 10μg/mL), 에탄올아민(최종 농도 5 내지 50μM), bFGF(최종 농도 5 내지 100ng/mL)를 첨가하여, 피검 기초 배지를 작성하였다.
피검 기초 배지에, 사람 혈청 유래 알부민(Sigma Aldrich)을 최종 농도 0, 0.21, 1, 2.1㎎/mL가 되도록 첨가한 피검 배지를 작성하였다.
각 피검 배지를 사용하여, 사람 다능성 줄기세포로부터 유도된 LtNES 세포(1.5×105 세포)를 배양하였다. 세포의 배양은, 37℃, 5% CO2 분위기 하의 인큐베이터 내에서 행하였다. 2일에 한 번 배지 교환을 행하고, 4 내지 5일간 배양하였다. 배양 후, 피검 배지 대신에 TrypLE Select를 첨가하여, 37℃, 1분간 인큐베이팅하여 세포 분산 처리를 행하였다. TrypLE Select를 배지로 희석 후, 피펫팅을 행하여, 단일의 세포로 하고, 세포수를 세어 평가하였다. 세포수 측정은, 트립판 블루(라이프 테크놀로지즈사)에 의한 사멸 세포 염색을 행한 다음, 혈구 계산반으로 행하였다.
결과를 도 4에 나타낸다. 1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지에서 세포수가 가장 증가하고, 0.21, 2.1㎎/mL 사람 혈청 알부민 첨가 배지에서도 세포는 양호한 증식을 나타냈다.
본 발명에 의하면, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진시키는 것이 가능해져, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 배양에 드는 인적 비용 및 금전적 비용을 삭감할 수 있다.
여기서 기술된 특허, 특허출원 명세서, 과학 문헌을 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 여기에 인용됨으로써, 이의 모두가 명시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 편입된 것이다.
본 출원은, 일본에서 출원된 특원2015-069979(출원일: 2015년 3월 30일)를 기초로 하고 있고, 이의 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.

Claims (29)

  1. 사람 혈청 알부민을 포함하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포용 배지.
  2. 제1항에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지용인, 배지.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진용인, 배지.
  4. 제1항에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지 및 증식 촉진용인, 배지.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 다능성 줄기세포 유래인, 배지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 혈청 알부민이 재조합체의 사람 혈청 알부민인, 배지.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 혈청 알부민이 사람 혈장 유래인, 배지.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중에 지방산을 포함하는, 배지.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 지방산량이 50μM 이하인, 배지.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 지방산량이 20μM 이하인, 배지.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 사람 혈청 알부민량이 0.2㎎/mL 이상 20㎎/mL 이하인, 배지.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 사람 혈청 알부민량이 0.5㎎/mL 이상 10㎎/mL 이하인, 배지.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 부유 배양용인, 배지.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배지인, 배지.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)를 포함하는, 배지.
  16. 제15항에 있어서, 배지 중의 bFGF량이 1ng/mL 이상 200ng/mL 이하인, 배지.
  17. 사람 혈청 알부민을 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 증식시키는 방법.
  18. 사람 혈청 알부민을 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지 방법.
  19. 사람 혈청 알부민을 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 미분화 유지하면서 증식 촉진시키는 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 다능성 줄기세포 유래인, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 혈청 알부민이 재조합체의 사람 혈청 알부민인, 방법.
  22. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 혈청 알부민이 사람 혈장 유래인, 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 배지에 지방산이 포함되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 지방산량이 50μM 이하인, 방법.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 지방산량이 20μM 이하인, 방법.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 사람 혈청 알부민량이 0.2㎎/mL 이상 20㎎/mL 이하인, 방법.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 사람 혈청 알부민량이 0.5㎎/mL 이상 10㎎/mL 이하인, 방법.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 당해 배지 중에서 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 부유 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 배지 및 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함하여 이루어진 배양 조성물.
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