CN107429234A - 含人血清白蛋白的神经干细胞增殖培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在维持神经干细胞和/或神经前体细胞的未分化性及多潜能性的状态下促进细胞增殖的含人血清白蛋白的神经干细胞和/或神经前体细胞增殖培养基、以及使用所述培养基的神经干细胞和/或神经前体细胞增殖方法等。

Description

含人血清白蛋白的神经干细胞增殖培养基
【技术领域】
本发明涉及含人血清白蛋白的神经干细胞和/或神经前体细胞增殖培养基、及使用所述培养基的神经干细胞和/或神经前体细胞增殖方法等。
【背景技术】
神经干细胞是有自身复制能,有多潜能性(multipotency)的未分化的细胞,有产生出神经系的多样的细胞(神经细胞及神经前体细胞(neural progenitor)、以及神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞等)及神经胶质前体细胞等)的能力的细胞。神经干细胞及神经前体细胞因为可供给神经细胞等的通常在成体中难增殖的细胞,作为再生医疗中的生物体材料的提供源聚集了关注,被期待对于肌萎缩性侧索固化症、阿尔茨海默病、帕金森病等的难治性神经疾病或向神经损伤的治疗应用。在使用这样的神经干细胞和/或神经前体细胞的对于难治性神经疾病或神经损伤的治疗、以及这些治疗法的开发研究等中,由于以大量的神经干细胞和/或神经前体细胞作为必要,在体外的神经干细胞和/或神经前体细胞的培养方法的开发及改良是重要的课题之一。
作为神经干细胞和/或神经前体细胞的培养方法,至今报告了几种方法。
在非专利文献1中,作为神经干细胞的在体外的培养方法,记载了神经球(neurosphere)培养。在该文献中显示,通过在含上皮细胞生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基中对神经干细胞进行悬浮培养,能维持神经干细胞的未分化状态而保持多潜能性地使增殖。
另外,作为对神经干细胞和/或神经前体细胞进行粘附单层培养的方法,可举出在用层粘连蛋白、聚L鸟氨酸、纤连蛋白等的基质包被的培养器上,使用含EGF和/或bFGF的培养基而培养神经干细胞和/或神经前体细胞的方法等(非专利文献2)。
在上述的粘附单层培养中,报告了神经干细胞进行对称分裂,自身复制,有与神经球培养比较能提供均一的细胞集团的益处。
这些培养方法有可在体外培养神经干细胞及神经前体细胞的大的益处,有细胞的增殖慢、培养耗时间的缺点。从而,期望开发出用于维持神经干细胞或神经前体细胞的未分化性及多潜能性地促进增殖的改良的培养基及培养条件。
即便如此,对于含血清白蛋白的培养基至今有几处记载。在专利文献1中,作为将干细胞分化为内胚层前体细胞的培养基,公开了调节渗透压的培养基,记载了在添加人血清白蛋白的培养基中培养人工多能性干(iPS)细胞株,则促进内胚层分化诱导的效率。另外,在非专利文献3中,为了探讨糖化反应(Maillard反应)的最终糖化生成物(AGE)对于神经干细胞的分化的效果,使用含AGE修饰的牛血清白蛋白质的培养基而进行神经干细胞的培养。报告了在所述培养基中进行神经球培养,则促进向神经胶质细胞的一种星形胶质细胞的分化。再者,在非专利文献4中,为了渗透压维持以及生长因子及脂肪酸保持而对添加牛血清白蛋白的初代脑肿瘤细胞培养用培养基进行了记载。除了这些之外,由于牛血清白蛋白廉价且易得到,为了调制培养基中的渗透压,或为了使脂肪酸等的难溶性的化合物增溶,也添加到培养基中。
但是,对于人血清白蛋白对神经干细胞和/或神经前体细胞的未分化性及多潜能性的维持或增殖促进的影响则完全不知。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:美国专利申请公开第20130224857号说明书
【非专利文献】
非专利文献1:Science,1992,255(5052),1707-10。
非专利文献2:PLoS Biology,2005,3(9),e283
非专利文献3:International Journal of Molecular Sciences,2014,15(1),159-170
非专利文献4:BioTechniques,2013,55(2),83,85-86,88
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明的目的是提供维持神经干细胞和/或神经前体细胞的未分化性及多潜能性的状态下促进细胞增殖的培养基,另外,提供维持神经干细胞和/或神经前体细胞的未分化性及多潜能性的状态下促进细胞增殖的方法。
【解决课题的技术方案】
本发明人为达成上述目的而重复锐意研究的结果,发现人血清白蛋白发挥神经干细胞和/或神经前体细胞的未分化性及多潜能性的维持以及增殖促进的作用,从而完成本发明。
即,本发明如下。
[1]神经干细胞和/或神经前体细胞用培养基,其含人血清白蛋白。
[2]上述[1]所述的培养基,其用于维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化。
[3]上述[1]或[2]所述的培养基,其用于促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖。
[4]上述[1]~[3]之任一项所述的培养基,其用于维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化,且促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖。
[5]上述[1]~[4]之任一项所述的培养基,其中所述神经干细胞和/或神经前体细胞源于多能性干细胞。
[6]上述[1]~[5]之任一项所述的培养基,其中人血清白蛋白是重组的人血清白蛋白。
[7]上述[1]~[5]之任一项所述的培养基,其中所述人血清白蛋白源于人血浆。
[8]上述[1]~[7]之任一项所述的培养基,其中所述培养基中含脂肪酸。
[9]上述[1]~[8]之任一项所述的培养基,其中所述培养基中的脂肪酸量是50μM以下。
[10]上述[1]~[9]之任一项所述的培养基,其中所述培养基中的脂肪酸量是20μM以下。
[11]上述[1]~[10]之任一项所述的培养基,其中所述培养基中的人血清白蛋白量是0.2mg/mL以上20mg/mL以下。
[12]上述[1]~[11]之任一项所述的培养基,其中所述培养基中的人血清白蛋白量是0.5mg/mL以上10mg/mL以下。
[13]上述[1]~[12]之任一项所述的培养基,其用于悬浮培养。
[14]上述[1]~[13]之任一项所述的培养基,其为无血清培养基。
[15]上述[1]~[14]之任一项所述的培养基,其含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
[16]上述[15]所述的培养基,其中所述培养基中的bFGF量是1ng/mL以上200ng/mL以下。
[17]使神经干细胞和/或神经前体细胞增殖的方法,其特征在于,向培养基添加人血清白蛋白。
[18]维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化的方法,其特征在于,向培养基添加人血清白蛋白。
[19]维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化地促进所述神经干细胞和/或神经前体细胞增殖的方法,其特征在于,向培养基添加人血清白蛋白。
[20]上述[17]~[19]之任一项所述的方法,其中所述神经干细胞和/或神经前体细胞源于多能性干细胞。
[21]上述[17]~[20]之任一项所述的方法,其中所述人血清白蛋白是重组的人血清白蛋白。
[22]上述[17]~[20]之任一项所述的方法,其中所述人血清白蛋白源于人血浆。
[23]上述[17]~[22]之任一项所述的方法,其特征在于,所述培养基中含脂肪酸。
[24]上述[17]~[23]之任一项所述的方法,其中所述培养基中的脂肪酸量是50μM以下。
[25]上述[17]~[24]之任一项所述的方法,其中所述培养基中的脂肪酸量是20μM以下。
[26]上述[17]~[25]之任一项所述的方法,其中所述培养基中的人血清白蛋白量是0.2mg/mL以上20mg/mL以下。
[27]上述[17]~[26]之任一项所述的方法,其中所述培养基中的人血清白蛋白量是0.5mg/mL以上10mg/mL以下。
[28]上述[17]~[27]之任一项所述的方法,其特征在于,在该培养基中对神经干细胞和/或神经前体细胞进行悬浮培养。
[29]培养组合物,其含上述[1]~[16]之任一项所述的培养基、及神经干细胞和/或神经前体细胞。
【发明效果】
由本发明使维持未分化性、多潜能性地进行长期有效神经干细胞和/或神经前体细胞的培养变得可能。结果,通过培养得到大量的神经干细胞和/或神经前体细胞变得可能。另外,削减神经干细胞和/或神经前体细胞的培养中所耗的成本变得可能。由本发明,特别是在培养治疗用的人的人神经干细胞和/或神经前体细胞时,避免异种来源的成分的混入变得可能。
【附图说明】
【图1】显示人血清白蛋白浓度依赖性的神经球的分化抑制倾向。显示在添加人血清白蛋白至各自成为最终浓度0.2mg/mL、1mg/mL、2.1mg/mL的培养基中培养14天后的神经球。用1mg/mL人血清白蛋白添加培养基培养的神经球(左下)及用2.1mg/mL人血清白蛋白添加培养基培养的神经球(右下)即使培养14天后也维持良好的神经球形态。用未添加人血清白蛋白的培养基培养的神经球(左上)在培养14天后,失去神经球样的形态,观察到有多个突起的细胞。用0.2mg/mL人血清白蛋白添加培养基培养的神经球(右上)在培养14天后,失去一部分神经球样的形态,与用未添加人血清白蛋白的培养基培养的神经球(左上)比较,分化处于抑制倾向。
【图2】显示在2.1mg/mL人血清白蛋白添加培养基中培养的神经球中的免疫染色的结果。观察到多数βIII微管蛋白(绿)阳性的神经细胞。
【图3】显示在含添加人血清白蛋白的脂肪酸(油酸)的培养基中培养的神经球的形态。以60μM确认到多数黑色的异形球像。
【图4】显示人血清白蛋白的长期自我再生神经上皮样干细胞(Long-term self-renewing neuro epithelial-like stem cells,LtNES细胞)的分化抑制倾向。显示在添加人血清白蛋白至各自成为最终浓度0.21mg/mL、1mg/mL、2.1mg/mL的培养基中培养4~5天后的LtNES细胞。显示在1mg/mL人血清白蛋白添加培养基中细胞数最增加,在0.21、2.1mg/mL人血清白蛋白添加培养基中细胞也良好的增殖。
【实施方式】
本发明提供维持神经干细胞和/或神经前体细胞的未分化性及多潜能性的状态下促进细胞增殖的培养基(以下,也将其称为本发明的培养基)、及,维持神经干细胞和/或神经前体细胞的未分化性、多潜能性的状态下长期有效培养的方法(以下,也将其称为本发明的方法)。
(1)人血清白蛋白
白蛋白是指卵清、血清、乳汁等中所含的易凝固的蛋白质的总称。白蛋白可溶于弱酸性至弱碱性溶液(稀酸、水、稀碱),用50%的硫酸铵不被盐析,而用高浓度的硫酸铵沉淀。已知分子量数万以下(45,000程度)且多数是等电点pI4.5~6的球状蛋白质。作为代表性的,可举出卵清蛋白、乳白蛋白、血清白蛋白、小清蛋白等。
血清白蛋白质是在血清中多量存在的蛋白质之一,是分子量约66,000的可溶性的球状蛋白质。从前原白蛋白经原白蛋白生成。已知占血浆蛋白质中的50%~60%,血清白蛋白的浓度对于血浆或间质液的渗透压调节发挥大的作用。另外,也已知与血中的难溶性物质(脂肪酸或药剂等)结合而发挥搬运的任务。
在本发明中使用的人血清白蛋白可为天然的人血清白蛋白,也可为非天然的。人血清白蛋白可为从血浆成分单离纯化的血浆来源的人血清白蛋白,也可为从由基因重组技术由微生物、细胞或植物等产生的单离纯化的重组的人血清白蛋白。为了治疗等的目的,培养神经干细胞和/或神经前体细胞时,从避免异物的混入的观点来看,在本发明中使用的人血清白蛋白优选为重组的人血清白蛋白。
在本发明中使用的人血清白蛋白可为与铜离子、锌离子等的金属离子、谷胱甘肽、吡哆醛、胆红素或脂肪酸等结合,也可为不与金属离子、谷胱甘肽、吡哆醛、胆红素及脂肪酸之任一者结合。当使用与脂肪酸结合的人血清白蛋白而制作本发明的培养基时,人血清白蛋白的脂肪酸负载量优选为10mg/g以下,更优选为6mg/g以下,人血清白蛋白的脂肪酸负载量是0mg/g也无妨。
人血清白蛋白的脂肪酸负载量的测定可使用本领域通常实施的方法或基于其的方法实施,例如,除了将游离脂肪酸甲基酯化后由GC-MS的检测,或由红外分光的定量之外,可举出Duncombe的提取法、使用酰基-CoA合成酶(ACS)和酰基-CoA氧化酶(ACOD)的ACS-ACOD法等。均可利用作为测定试剂盒市售的。在本发明中使用的人血清白蛋白可为例如由WO2014/192938等中记载的方法,使结合了脂肪酸负载量高的HSA的脂肪酸量降低到上述范围,也可为使用市售的脂肪酸游离人血清白蛋白(例、基本上无脂肪酸(~0.005%)、SigmaAldrich等)。从避免组成不明确的脂肪酸混入培养基的观点来看,使用与脂肪酸结合的人血清白蛋白时,人血清白蛋白优选使用(1)脂肪酸负载量低的(通常0.02%以下,优选为0.005%以下)人血清白蛋白、(2)向(1)的人血清白蛋白负载组成明确的脂肪酸(例如亚油酸)的人血清白蛋白的任一者。
即使是在使用上述脂肪酸负载量低的人血清白蛋白时,由于人血清白蛋白可与培养基中的脂肪酸结合,培养基中的人血清白蛋白的脂肪酸负载量可从上述的值变化。
由于由糖化反应(Maillard反应)形成的最终糖化生成物已知有各种毒性,人血清白蛋白优选不是最终糖化生成物。
在本发明中使用的人血清白蛋白可为单体,也可为形成多聚体。优选为,人血清白蛋白是单体。
在本发明的方法中,向培养基添加人血清白蛋白时,添加人血清白蛋白的时机只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果,就不特别限制。人血清白蛋白只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果,就不特别限定,可在培养开始时或培养途中的任意的时机添加。
在本发明中,培养基中的人血清白蛋白的量只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果,就不特别限定,例如,作为下限值,可为0.2mg/mL以上、优选为0.5mg/mL以上、再优选为约1mg/mL以上,最优选为1mg/mL以上,作为上限值,可为20mg/mL以下,优选为10mg/mL以下,再优选为约5mg/mL以下,最优选为5mg/mL以下。其中,“约”以容许±10%的含意使用。在本发明中,培养基中的人血清白蛋白的量只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果,就不特别限定,可为0.2mg/mL~20mg/mL、优选为0.5mg/mL~10mg/mL、更优选为1mg/mL~5mg/mL、再优选为约1mg/mL~约2.1mg/mL、最优选为1mg/mL~2.1mg/mL。其中,“约”以容许±10%的含意使用。当培养基中所含的人血清白蛋白的量不足0.2mg/mL时,向神经细胞分化的细胞的比例增加的点是不期望的。一方面,培养基中所含的人血清白蛋白的量多也无问题,但通常,作为培养基中所含的量,适当为20mg/mL以下。
血浆来源的人血清白蛋白可由公知的方法得到。例如,人血清白蛋白可通过从血浆成分中单离而得到。作为从人血浆成分中单离人血清白蛋白的方法的一例,不限定,可举出低温乙醇分级分离法(Cohn Method)。低温乙醇分级分离法是指通过在低温下调整乙醇浓度、pH等而对血浆蛋白进行分离的方法,可从由低温乙醇分级分离法得到的人血清白蛋白级分(人血清白蛋白被分级分离为级分V)得到天然的人血清白蛋白。另外,即使通过根据Kistler等的方法(Graham,J.M.,Rickwood,D.Subcellular Fractionation,a PracticalApproach.Oxford University Press.1997)、根据Tanaka K等的方法(Braz J Med BiolRes.1998Nov;31(11):1383-8)等的对Cohn方法进行改良的方法也能从血浆成分分离人血清白蛋白。
作为重组的人血清白蛋白的入手方法,可举出在酵母菌等的微生物、动物细胞或植物等中生产人血清白蛋白,从培养物单离纯化人血清白蛋白的方法,但不限于这些。作为使微生物生产人血清白蛋白的方法,可举出使用酵母的方法(Quirk AV等人,BiotechnolAppl Biochem.1989Jun;11(3):273-87、Okabayashi K等人,J Biochem.1991Jul;110(1):103-10、特开昭60-41487号公报、特开昭63-39576号公报、特开昭63-74493号公报)、使用大肠杆菌的方法(Lawn RM等人,Nucleic Acids Res.1981Nov 25;9(22):6103-114)、使用枯草芽孢杆菌的方法(Saunders CW等人,J Bacteriol.1987Jul;169(7):2917-25、特开昭62-25133号公报)等。作为使植物生产人血清白蛋白的方法,可举出在稻(Oryza sativa)的胚乳中生产人血清白蛋白的方法(He等人,Proc Natl Acad Sci USA.2011Nov 22;108(47):19078-83)等。另外,也可使用由CHO细胞等的动物细胞生产的人血清白蛋白。从这些人血清白蛋白产生宿主单离纯化人血清白蛋白适宜选择基于上述的文献的方法、基于特开平5-317079号公报、特开平6-56883号公报、特开平6-245789号公报、特开平7-170993号公报、特开平7-170994号公报、特表平6-500050号公报、特开2005-348745号公报、特开2007-130025号公报等中记载的纯化方法的方法、或者亲和性层析、阴离子交换层析等公知的方法、及它们的组合等而进行。
作为人血清白蛋白的cDNA序列,作为NCBI Accession No.,例示AF542069、DQ986150、AY960291、NM_000477等,但不限于这些。作为人血清白蛋白的氨基酸序列,作为NCBI Accession No.,例示NP_000468、AAA98797、CAA00844、CAA02034等,但不限于这些。
作为人血清白蛋白,含下列等:
(1)由在上述人血清白蛋白的氨基酸序列上缺失、取代或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成,并且促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖的蛋白质、
(2)由在上述人血清白蛋白的氨基酸序列上缺失、取代或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成,并且有维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化效果的蛋白质。
上述蛋白质有促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖效果与否,例如,可通过在添加该蛋白质的培养基中或未添加蛋白质的培养基中接种神经干细胞和/或神经前体细胞,对在该培养基中培养14天后的神经干细胞和/或神经前体细胞的数进行测定比较来判断,但不限于此。另外,培养期间是13天以下15天以上等,能适宜选择。另外,蛋白质有维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化效果与否,例如,可通过在添加该蛋白质的培养基中或未添加蛋白质的培养基中接种神经干细胞和/或神经前体细胞,将在该培养基中培养14天后的神经干细胞和/或神经前体细胞用后述的神经干细胞和/或神经前体细胞标志物染色,对用神经干细胞和/或神经前体细胞标志物染色的细胞数进行测定比较来判断,但不限于此。再者,在上述蛋白质中含人血清白蛋白。
人血清白蛋白也可使用商业上可得到的。作为商业上可得到的重组的人血清白蛋白,可举出Sigma-Aldrich公司A9731(型号)、ScienCell Research Laboratories公司OsrHSA-10(型号)、武汉禾元生物科技公司HY01E-10g(型号)、eEnzyme公司HSA-1r(型号)、BioVerde公司IBK-A1-10(型号)等的重组稻来源的制品或Sigma-Aldrich公司A7223(型号)、A6608(型号)、A7736(型号)、Novozyme公司的Albucult(注册商标)(制品名)、Recombuminα(注册商标)(制品名)、AlbIX(注册商标)(制品名)等的重组酵母来源的制品。作为商业上可得到的人血浆来源人血清白蛋白,可举出Sigma-Aldrich公司A1887(型号)、A1653(型号)、A9511(型号)、A3782(型号)、A8763(型号)、A4327(型号)、BiologicalIndustries公司Bio-Pure HSA 10%Solution(制品名)等的制品。
(2)神经干细胞和/或神经前体细胞
本说明书中,神经干细胞是指维持向神经系细胞(神经细胞及神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞等)、以及它们的前体细胞)的多潜能性(multipotency),有自身复制能力的未分化的细胞。具体而言,神经干细胞是指有最终产生出神经细胞及神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞等)的能力,并且,只要不加初始化等的特别的操作,则基本上不产生出表皮系细胞、血细胞系细胞、肌肉细胞等的神经系以外的细胞的细胞。基本上不产生出是指在神经干细胞产生出的细胞之中,90%以上是神经细胞及神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞等)、以及它们的前体细胞(含神经干细胞)之任一者的状态。
本说明书中,神经前体细胞(neural progenitor)是指是有分裂能力的未分化的细胞,且有最终分化为1种以上的神经细胞的能力的细胞。神经前体细胞是指命运被决定为最终产生出神经细胞,并且基本上不产生出神经细胞及其前体细胞以外的细胞。神经胶质前体细胞(glial progenitor)是指来源于神经干细胞,是有分裂能力的未分化的细胞,且有分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞、微神经胶质、上衣细胞、许旺细胞的任何或它们的前体细胞的能力,并且基本上不分化为神经细胞的细胞。
由于神经干细胞及神经前体细胞难以严格地区别,在本说明书中,有作为“神经干细胞和/或神经前体细胞”无区别地使用的情况。
在本发明中,通常使用哺乳动物来源的神经干细胞和/或神经前体细胞。作为哺乳动物,例如,可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等的啮齿类、兔等的兔目、猪、牛、山羊、马、绵羊等的有蹄目、狗、猫等的食肉目、人、猴、恒河猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等的灵长类等,但不限于这些。在本发明中使用的神经干细胞和/或神经前体细胞优选为小鼠等的啮齿类或人等的灵长类的神经干细胞和/或神经前体细胞,更优选为人神经干细胞和/或神经前体细胞。
在本发明中使用的神经干细胞和/或神经前体细胞可举出多能性干细胞来源的,从生物体组织分离的,从成纤维细胞等不经由多能性干细胞而直接分化诱导的(StemCells.2012Jun;30(6):1109-19)等,只要是维持上述记载的未分化性、维持多潜能性的细胞且维持产生出神经细胞的能力,就不特别限制。本说明书中,多能性干细胞是指是有自身复制能力及分化/增殖能力的未成熟的细胞,且有可向构成除胎盘外的生物体的全部组织或细胞分化的能力的细胞。作为多能性干细胞的例,可举出胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能性干细胞(iPS细胞)(Takahashi K等人,Cell.2007Nov 30;131(5):861-72)、精子干细胞(Kanatsu-Shinohara M等人,Biol Reprod.2007Jan;76(1):55-62)、胚胎生殖细胞(MatsuiY等人,Cell.1992Sep 4;70(5):841-7)、由核移植得到的克隆胚来源的ES细胞(Wakayama T等人,Science.2001Apr 27;292(5517):740-3)等。
多能性干细胞来源的神经干细胞和/或神经前体细胞可由公知的方法得到。作为多能性干细胞来源的神经干细胞和/或神经前体细胞的制成方法,可举出进行多能性干细胞的悬浮培养而经由胚层体形成而形成神经干细胞和/或神经前体细胞的方法(Bain G等人,Dev Biol.1995Apr;168(2):342-57等)、使用基质细胞等作为饲养细胞而培养多能性干细胞的方法、在含bFGF的无血清培养基中对多能性干细胞进行悬浮培养的方法(WatanabeK等人,Nat Neurosci.2005Mar;8(3):288-96等)、在SMAD信号抑制剂Noggin及SB431542的存在下对多能性干细胞(ES细胞等)进行粘附培养的方法(Chambers SM等人,NatBiotechnol.2009Mar;27(3):275-80)、将单层培养的多能性干细胞(ES细胞等)在glycogensynthase kinase3(GSK3)抑制剂、transforming growth factorβ(TGF-β)抑制剂、Notch信号抑制剂存在下培养的方法(Li W等人,Proc Natl Acad Sci USA.2011May 17;108(20):8299-304)等。
优选为,在本发明中使用的神经干细胞和/或神经前体细胞是ES细胞或人工多能性干细胞来源,更优选为人工多能性干细胞来源。
细胞是神经干细胞时,例如,通过将细胞在含EGF及bFGF的无血清培养基中进行悬浮培养,将培养的细胞块分散处理后,进行粘附培养,可通过分化诱导为神经细胞及神经胶质细胞来确认。
另外,神经干细胞也可由已知在神经干细胞中表达的基因、其转录产物、蛋白质等(神经干细胞标志物)确认。
作为神经干细胞标志物,已知作为细胞骨架蛋白质的巢蛋白(Nestin;Science,276,66(1997))、SOX1(SRY(性别决定区Y)-盒1)、SOX2(SRY(性别决定区Y)-盒2)、Pax6(成对盒6)、Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、脂肪酸结合蛋白质7(Fabp7、也称为BLBP)等,本领域技术人员可使这些标志物适宜组合而确认是期望的神经干细胞。作为适宜于本发明的神经干细胞,例如,可举出SOX2阳性并且巢蛋白阳性的细胞,但不限于此。
细胞是神经前体细胞时,例如,可通过培养细胞,分化诱导为神经细胞来确认。
作为在神经前体细胞中表达的基因,可举出Tbr2(T-盒脑蛋白2)、MASH1(哺乳动物achaete-scute同源体1)、巢蛋白等。作为适宜于本发明的神经前体细胞,可举出SOX2阴性并且巢蛋白阳性的细胞,但不限于此。
作为分化的神经细胞的标志物的例,可举出βIII微管蛋白、MAP2(微管相关蛋白)等。
本说明书中,神经干细胞和/或神经前体细胞未分化维持是指在神经干细胞和/或神经前体细胞分裂后形成的细胞之中1个以上的细胞维持持续作为神经干细胞和/或神经前体细胞的性质,神经干细胞和/或神经前体细胞的分化被抑制,或者神经干细胞和/或神经前体细胞不分裂维持持续作为神经干细胞和/或神经前体细胞的性质。神经干细胞和/或神经前体细胞分裂后形成的细胞维持作为神经干细胞和/或神经前体细胞的性质与否,例如,可由上述的标志物确认。
本说明书中,神经干细胞和/或神经前体细胞的分化被抑制是指在神经干细胞和/或神经前体细胞产生出的全细胞之中,分化的细胞(例如神经细胞)的占的比例减少。分化的抑制也可为抑制从神经干细胞和/或神经前体细胞向神经细胞等的分化。分化抑制与否,例如,可由上述的分化标志物(例如βIII微管蛋白等的神经细胞标志物)确认。
在一实施方式中,在本发明中使用的神经干细胞和/或神经前体细胞被单离。“单离”是指进行除去目的成分或细胞以外的因子的操作,脱离天然(例、生物体内)存在的状态。
(3)本发明的培养基
作为本发明的一实施方式,本发明提供神经干细胞和/或神经前体细胞的培养用的培养基。本发明的培养基有维持神经干细胞和/或神经前体细胞的未分化性及多潜能性,促进增殖的效果。作为本发明的一实施方式,本发明的培养基用于维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化,用于促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖,或者,用于维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化并且增殖促进。
本发明的培养基含人血清白蛋白。添加的人血清白蛋白如前所述。对于本发明的培养基中所含的人血清白蛋白以外的成分只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果,就不特别限定,可适宜采用在通常的神经干细胞和/或神经前体细胞的培养中使用的组成。
本发明的培养基也可以通常在动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基调制。作为基础培养基,只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果,就不特别限定,例如,可举BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、火腿培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、或者这些的混合培养基等可在动物细胞的培养中使用的培养基。本发明的培养基也可以作为干细胞培养用而通常使用的培养基作为基础培养基调制。作为市售的干细胞培养用的基础培养基,可举出RHB培养基(StemCells,Inc.)、TeSRTM-E6(STEMCELL Technologies)、hESF-GRO培养基(NIPRO株式会社)、HESF-DIF培养基(NIPRO株式会社)、CSTI-7(株式会社细胞科学研究所)、Essential 6培养基(Life Technologies)等。
从回避未化学确定的成分的混入的观点来看,在本发明中使用的培养基优选为含有成分是化学确定的培养基(化学地确定的培养基;CDM)。
由于在血清中含促进神经干细胞和/或神经前体细胞的分化的成分,本发明的培养基优选是无血清培养基。在本发明中的“无血清培养基”是指不含无调整或未纯化的血清的培养基。在本发明中,只要是不含无调整或未纯化的血清,就混入有纯化的血液来源成分或动物组织来源成分(例如,EGF、bFGF等的生长因子)的培养基也含在无血清培养基中。
无血清培养基也可含有血清替代物。作为血清替代物,例如,可举适宜含有转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’巯基甘油、或者这些的均等物等。涉及的血清替代物,例如,可由WO98/30679中记载的方法调制。作为血清替代物,也可利用市售品。作为涉及的市售的血清替代物,例如,可举出GlutamaxTM(Life Technologies公司制)、N2(Life Technologies公司),但不限于这些。
将本发明的培养基在人神经干细胞和/或神经前体细胞中使用时,从避免异种来源的成分的混入的观点来看,优选不含牛血清白蛋白等的人以外的动物来源的血清白蛋白。
即使是在本发明的培养基含人以外的动物来源的白蛋白时,从避免异种来源的成分的混入的观点来看,其量优选尽可能降低。具体而言,本发明的培养基中的人以外的动物来源的白蛋白的量通常是1000ng/mL以下,优选为500ng/mL以下,更优选为100ng/mL以下,再优选为10ng/mL以下,再更优选是0ng/mL。
本发明的培养基也可还含有培养基添加物。作为培养基添加物,可举出维生素类、谷氨酰胺等的非必须氨基酸、细胞因子及生长因子等的蛋白质、L-抗坏血酸、磷酸L-抗坏血酸基镁、丙酮酸钠、2-氨基乙醇、葡萄糖、碳酸氢钠、HEPES、胰岛素、黄体酮、硒酸钠、腐胺等,但不限于这些。优选在公知的浓度范围内含添加物。
本发明的培养基含必须氨基酸(L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸)。本发明的培养基优选为,含L-丝氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、L-半胱氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸及L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-酪氨酸。
本发明的培养基含1种以上、优选为2种以上、更优选为3种以上、再优选为4种以上选自肌醇、氯化胆碱、叶酸、D-泛酸钙、硫胺素(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、烟酸酰胺、维生素B12、核黄素(维生素B2)、D-生物素、D-葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、硫辛酸、腐胺盐酸盐的培养基添加物。
本发明的培养基优选含上皮细胞生长因子(EGF)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),更优选含bFGF。
在本发明中培养基中的bFGF的量的上限值只要是可达成期望的效果,就不限制,优选为1000ng/mL以下,更优选为500ng/mL以下,再优选为200ng/mL以下。
在本发明中,培养基中的bFGF的量的下限值只要是可达成期望的效果,就不限制,优选为0.1ng/mL以上、更优选为1ng/mL以上、再优选为10ng/mL以上。
在本发明中,培养基中的bFGF的量只要是可达成期望的效果,就不限制,优选为0.1ng/mL~1000ng/mL、更优选为1ng/mL~200ng/mL、再优选为10ng/mL~200ng/mL。
作为一实施方式,本发明的培养基含bFGF(终浓度10ng/mL~200ng/mL)。
另外,本发明的培养基优选基本上不含有促进神经干细胞和/或神经前体细胞的分化的效果的物质(本说明书中,也称为神经分化促进物质)。
作为神经分化促进物质的例,可举出BDNF(脑-来源的神经营养因子)、GDNF(神经胶质细胞系-来源的神经营养因子)、cAMP(单磷酸环腺苷)、dbcAMP(二丁酰cAMP)、DAPT(叔丁基(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰]氨基]丙酰]氨基]-2-苯基乙酸盐)、化合物E(N-[(1S)-2-[[(3S)-2,3-二氢-1-甲基-2-氧代-5-苯基-1H-1,4-苯并二氮杂环庚三烯-3-基]氨基]-1-甲基-2-氧代乙基]-3,5-二氟苯乙酰胺)、SU5402(2-[(1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸)、SU6668(3-[2,4-二甲基-5-[(E)-(2-氧代-1H-吲哚-3-亚基)甲基]-1H-吡咯-3-基]丙酸;Orantinib;3-[2,4-二甲基-5-[(E)-(2-氧代-1H-吲哚-3-亚基)甲基]-1H-吡咯-3-基]丙酸)。
基本上不含神经分化促进物质是指即使含神经分化促进物质,也无法促进神经干细胞和/或神经前体细胞的分化的量,根据使用的神经分化促进物质的种类适宜设定。
更优选为,本发明的培养基中所含的神经分化促进物质的浓度是0μM。
本发明的培养基也可含脂肪酸。作为本发明的培养基中所含的脂肪酸,可举出油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、酪酸、醋酸、棕榈油酸、缬草酸(valerianic acid)、己酸、庚酸(庚基酸)、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、珠光脂酸、客烯酸、桐酸、花生酸、8,11-二十碳二烯酸、5,8,11-二十碳三烯酸、山嵛酸、木蜡酸、神经酸、蜡酸、褐煤酸、蜜蜡酸等,但不限于这些。本发明的培养基中所含的脂肪酸只要是可达成期望的效果,就不特别限定,可为饱和脂肪酸,也可为不饱和脂肪酸。
只要是可达成期望的效果,就不限定,在培养基中通常使用亚油酸。
在本发明的培养基中,通常含来源于基础培养基的脂肪酸。
在本发明中,培养基中的脂肪酸的量只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果,或不给期望的效果带来不良影响,就不特别限定,可为50μM以下,优选为25μM以下,更优选为22μM以下,再优选为20μM以下,再更优选是不足20μM。在脂肪酸的浓度是60μM的情况中,在神经干细胞和/或神经前体细胞之中,在其多数成为形成增殖能比通常低的黑色的异形球的细胞的点是不期望的,培养基中的脂肪酸的量优选50μM以下,由于量越少,就变得越难形成黑色的异形球而优选。
本发明的培养基优选含通常的基础培养基中所含的程度的量的脂肪酸,其量优选为0.01μM以上、更优选为0.05μM以上、再优选为0.1μM以上。
在本发明中培养基中的脂肪酸浓度只要是可达成期望的效果,就不限制,优选为0.01μM~50μM、更优选为0.05μM~25μM、再优选为0.05μM~22μM、再更优选是0.1μM~22μM、最优选为0.1μM~20μM。
当本发明的培养基含与脂肪酸结合的人血清白蛋白时,上述“培养基中的脂肪酸的量”除了培养基中的游离脂肪酸的量之外,也含与人血清白蛋白结合的脂肪酸的量。
当添加与脂肪酸结合的人血清白蛋白而制作本发明的培养基时,优选以可达成期望的培养基脂肪酸量的方式使用脂肪酸负载量适合的人血清白蛋白而制作本发明的培养基。
当2种以上的脂肪酸含在本发明的培养基中时,优选以其合计量成为上述范围的方式设定。
优选为,本发明的培养基是含bFGF(10ng/mL~200ng/mL)及人血清白蛋白(0.5mg/mL~10mg/mL),培养基中的脂肪酸量是0.05μM~50μM的无血清培养基。
更优选为,本发明的培养基是含bFGF(10ng/mL~200ng/mL)、人血清白蛋白(约1mg/mL~约2.1mg/mL),人以外的动物来源的血清白蛋白的浓度是500ng/mL以下,培养基中的脂肪酸量是约0.1μM~约20μM的无血清培养基。其中,“约”以容许±10%的含意使用。
作为优选的一实施方式,本发明的培养基,除了人血清白蛋白之外,含转铁蛋白、胰岛素、NaHCO3、硒、乙醇胺、bFGF。更优选为,本发明的培养基是除了人血清白蛋白之外,含转铁蛋白、胰岛素、NaHCO3、硒、乙醇胺、bFGF、肌醇、氯化胆碱、叶酸、D-泛酸钙、硫胺素(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、烟酸酰胺、维生素B12、核黄素(维生素B2)、D-生物素、D-葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、硫辛酸、腐胺、亚油酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸及L-天冬酰胺的无血清培养基。
作为一实施方式,本发明的培养基以DMEM/F-12培养基作为基础培养基,除了人血清白蛋白(0.5mg/mL~10mg/mL)之外,含转铁蛋白(0.5μg/mL~100μg/mL)、胰岛素(5μg/mL~1mg/mL)、NaHCO3(100μg/mL~5mg/mL)、硒酸钠(2ng/mL~1μg/mL)、乙醇胺(100ng/mL~100μg/mL)、bFGF(10ng/mL~200ng/mL)。
作为别的优选的实施方式,本发明的培养基,除了人血清白蛋白之外,含bFGF、hLIF、葡萄糖、谷氨酰胺、NaHCO3、HEPES、胰岛素、转铁蛋白、黄体酮、硒酸钠、腐胺。更优选为,本发明的培养基是除了人血清白蛋白之外,含葡萄糖、谷氨酰胺、NaHCO3、HEPES、胰岛素、转铁蛋白、黄体酮、硒酸钠、腐胺、肌醇、氯化胆碱、叶酸、D-泛酸钙、硫胺素(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、烟酸酰胺、维生素B12、核黄素(维生素B2)、D-生物素、D-葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、硫辛酸、腐胺、亚油酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-天冬酰胺的无血清培养基。
作为一实施方式,本发明的培养基以DMEM/F-12培养基作为基础培养基,除了人血清白蛋白(0.5mg/mL~10mg/mL)之外,含bFGF(10ng/mL~200ng/mL)、hLIF(1ng/mL~100ng/mL)、葡萄糖(1mg/mL~10mg/mL)、谷氨酰胺(100μg/mL~1mg/mL)、NaHCO3(100μg/mL~5mg/mL)、HEPES(100μg/mL~5mg/mL)、胰岛素(5μg/mL~1mg/mL)、转铁蛋白(0.5μg/mL~100μg/mL)、黄体酮(2ng/mL~1μg/mL)、硒酸钠(2ng/mL~1μg/mL)、腐胺(100μg/mL~10mg/mL)。
本发明的培养基也可用于粘附培养、悬浮培养、包埋培养、组织培养等的任何的培养方法。优选为,本培养基用于悬浮培养。
本发明的培养基也可在任何动物来源的神经干细胞和/或神经前体细胞的培养中适宜地使用。可使用本发明的培养基培养的神经干细胞和/或神经前体细胞是例如,小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等的啮齿类、兔等的兔目、猪、牛、山羊、马、绵羊等的有蹄目、狗、猫等的食肉目、人、猴、恒河猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等的灵长类等来源的神经干细胞和/或神经前体细胞,优选为人来源的神经干细胞和/或神经前体细胞。
(4)本发明的方法
作为本发明的一实施方式,本发明提供神经干细胞和/或神经前体细胞的培养方法,其特征在于,将人血清白蛋白添加到培养基中。所述方法也是使神经干细胞和/或神经前体细胞增殖,维持未分化的方法。
作为本发明的一实施方式,本发明的方法包括将神经干细胞和/或神经前体细胞用本发明的培养基培养的工序。另外,作为别的本发明的实施方式,本发明的方法包括向不含人血清白蛋白的培养基添加人血清白蛋白,在人血清白蛋白存在下培养一定期间的工序。
只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果,就不特别限制,在本发明的方法中的培养神经干细胞和/或神经前体细胞的期间通常是2天以上、优选为4天以上、再优选为8天以上。
当将神经干细胞和/或神经前体细胞持续培养4天以上时,优选3天更换一次、优选为2天更换一次培养基。
在本发明的方法中向培养基添加人血清白蛋白的时间只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果的长度的时间,就不特别限定,优选为,在培养期间中的全期间用含人血清白蛋白的培养基进行培养。培养基的组成如前所述。
在本发明的方法中,神经干细胞和/或神经前体细胞,除了在使用的培养基中含人血清白蛋白之外,能由粘附培养、悬浮培养、组织培养等的公知的方法培养。培养方法能根据目的适宜选择。作为神经干细胞和/或神经前体细胞的粘附培养方法的例,可举出在Flanagan LA等人,J Neurosci Res.2006Apr;83(5):845-56、Conti L等人,PLoSBiology.,2005Sep;3(9):e283等中记载的方法。神经干细胞和/或神经前体细胞的悬浮培养是指在培养基中,在对培养器或饲养细胞(使用时)非粘附性的条件下培养神经干细胞和/或神经前体细胞。作为神经干细胞和/或神经前体细胞的悬浮培养方法的例,可举出神经球法(Reynolds BA and Weiss S.,Science,USA,1992Mar 27;255(5052):1707-10)、无血清凝集悬浮培养法(SFEB法、SFEBq法;Watanabe等人,Nature Neuroscience 8,288-296(2005))等。神经干细胞和/或神经前体细胞的组织培养是指以含神经干细胞和/或神经前体细胞的组织作为切片等的组织片或组织整体培养的方法。作为神经干细胞和/或神经前体细胞的组织培养,可举出在O’Rourke NA等人,Science.1992Oct 9;258(5080):299-302.、Komuro H等人,Science.1992Aug 7;257(5071):806-9中记载的切片培养法等。在本发明的方法中,神经干细胞和/或神经前体细胞优选在含人血清白蛋白的培养基中悬浮培养。
通过悬浮培养,神经干细胞和/或神经前体细胞形成球状的块、所谓的神经球。在进行悬浮培养时,神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖的有无、程度可通过对形成的神经球的大小,或者构成神经球的细胞的数进行测定来评价。另外,神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖的有无或,其程度也可通过使用锥虫蓝等的细胞染色试剂而测量活细胞数来评价。
在本发明的方法中,在神经干细胞和/或神经前体细胞的培养中使用的培养器只要是能培养神经干细胞和/或神经前体细胞,就不特别限定,可举出瓶、组织培养用瓶、皿、平皿、组织培养用皿、多联皿、微平板、微孔板、多联盘、多孔板、显微镜载玻片、室玻片、培养皿、管、托盘、培养袋、及滚瓶。
在神经干细胞和/或神经前体细胞的培养中使用的培养器可为细胞粘附性的,也可为细胞非粘附性的,根据目的适宜选择。在由悬浮培养培养神经干细胞和/或神经前体细胞时,为了除去易分化的细胞,优选使用粘附性的培养器。
另外,在由粘附培养培养神经干细胞和/或神经前体细胞时,培养器优选也是细胞粘附性的。细胞粘附性的培养器可以使与培养器的表面的细胞的粘附性提高的目的而用细胞外基质(ECM)等的任意的细胞支持用基质或模拟它们的功能的人工物包被。细胞支持用基质可为以干细胞或饲养细胞(使用时)的粘附作为目的的任意的物质。
此外的培养条件可适宜设定。例如,培养温度只要是可达成促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖及未分化性的维持等的期望的效果,就不特别限定是约30~40℃、优选为约37℃。CO2浓度是约1~10%、优选为约2~5%。氧浓度通常是1~40%,根据培养条件等适宜选择。
(5)含人血清白蛋白的培养基以及含神经干细胞和/或神经前体细胞的培养组合物
本发明提供培养组合物(本说明书中,也称为本发明的培养组合物),其还含上述本发明的培养基以及神经干细胞和/或神经前体细胞。该培养组合物含通过培养细胞得到的结果物。与本发明的培养组合物关联的各用语的定义及实施方式与在上述中记载的相同。
在本发明的培养组合物中的神经干细胞和/或神经前体细胞是生存、增殖的细胞。
在本发明的培养组合物中的神经干细胞和/或神经前体细胞的纯度(神经干细胞和/或神经前体细胞占全细胞数的数的百分率)通常是70%以上、优选为80%以上、更优选为90%以上、再优选为99%以上、最优选为100%。
在本发明的培养组合物中,神经干细胞和/或神经前体细胞存在于本发明的培养基中。在一实施方式中,本发明的培养组合物是神经干细胞和/或神经前体细胞在本发明的培养基中的悬浮液。本发明的培养组合物也可封入适合的容器中。
作为一实施方式,本发明的培养组合物可在冷冻保存的状态下提供。本发明的培养组合物能冷冻保存,可根据需要解冻-复苏而使用。冷冻保存可使用公知的细胞冷冻保存方法。作为冷冻保存的例,可举出向本发明的培养组合物加二甲基亚砜,在-80~-200℃、优选为-196℃(液氮中)的条件下保存本发明的培养组合物的方法。
接下来显示实施例,对本发明更详细地进行说明,但这些不限定本发明的范围。
【实施例】
【实施例1:人血清白蛋白功能评价】
【(1)从人多能性干细胞向神经球的诱导】
制成添加B27辅助物(1x;Life Technologies)、bFGF(PeproTech inc.)、hLIF(Millipore)、Y27632(和光纯药工业)的Media激素混合物(MHM)培养基,在该培养基中将iPS细胞用TrypLETM Select分散为单一细胞的在37℃、5%CO2、4%O2环境下进行悬浮培养。培养基的更换7天进行一次。培养后,神经干细胞和/或神经前体细胞形成为球状的细胞块的神经球。
【(2)神经球的培养法】
制成添加B27辅助物(1x;Life Technologies)、bFGF(最终浓度20ng/mL;PeproTech inc.)、hLIF(最终浓度10ng/mL;Millipore)的Media激素混合物(MHM)培养基(Life Technologies),在该培养基中将从人多能性干细胞诱导的神经干细胞和/或神经前体细胞在37℃、5%CO2、4%O2环境下进行悬浮培养。培养基的交换7天进行一次。培养后,神经干细胞和/或神经前体细胞形成为球状的细胞块的神经球。
在神经球的传代中,使用TrypLE Select(Life Technologies)。从神经球培养中的培养皿除去培养基,置换为TrypLE Select。在TrypLE Select内于37℃进行温育10分钟,其后进行移液器吸吐而使成为单一的细胞。将分散的细胞在上述培养基中接种至成为1.0×105细胞/mL,在37℃、5%CO2环境下进行培养。
【(3)人血清白蛋白功能评价】
使用在(2)中培养的神经球而进行培养基的功能评价。制成添加bFGF(最终浓度20ng/mL)、hLIF(最终浓度10ng/mL)的Media激素混合物(MHM)培养基(Life Technologies)而作为受试基础培养基。在向此受试基础培养基添加人血清白蛋白(基本上无脂肪酸(~0.005%)、Sigma Aldrich)至各自成为最终浓度0.2、1、2.1mg/mL的培养基(人血清白蛋白添加培养基)或未添加的培养基(对照培养基)中进行神经球培养,进行人血清白蛋白的功能评价。7天进行一次培养基更换,培养14天后,在显微镜下进行形成的神经球的形态的观察。结果示于图1。(再者,在(3)的培养开始前,将(3)所述的培养前使用的培养基稀释而充分地去除,以尽可能抑制该培养前使用的培养基的带入。)
用对照培养基培养的神经球在14天的培养后,失去球状的形态,显示见于分化的神经细胞的突起的延伸的细胞形态。一方面,在1mg/mL人血清白蛋白添加培养基、2.1mg/mL人血清白蛋白添加培养基中培养的神经球在14天的培养后仍维持球状的形态,与培养前比较,神经球变大。在这些培养基中培养的神经球中未显示见于分化的细胞的突起的延伸的细胞形态。用0.2mg/mL人血清白蛋白添加培养基培养的神经球在一部分中观察到见于分化的细胞的突起延伸的细胞形态,但也观察到多数与对照培养基比突起的数少而维持球状形态的神经球。
结果显示人血清白蛋白浓度依赖性的神经球的分化抑制倾向。观察到多数人血清白蛋白的量是0.2mg/mL以上、且维持球状形态的神经球,特别是以人血清白蛋白1mg/mL以上确认到良好的神经球像的形成。
【实施例2:向神经细胞的分化诱导】
证实在添加了人血清白蛋白的培养基中培养的神经球维持作为神经干细胞和/或神经前体细胞的性质。
与实施例1同样地,将人多能性干细胞来源的神经球在2.1mg/mL人血清白蛋白添加培养基中培养14天,其后进行分化诱导培养。为了分化诱导培养,进行在人血清白蛋白添加培养基中培养的神经球的分散处理。在分散处理中,使用TrypLE Select(LifeTechnologies)。从神经球培养中的培养皿除去培养基,置换为TrypLE Select。在TrypLESelect内于37℃进行10分钟温育,其后进行移液器吸吐而使成为单一的细胞。细胞数测定使用血细胞计数板进行。分散的细胞接种到用聚-L-鸟氨酸/纤连蛋白包被的48孔板上至成为1.5×105细胞/孔,在添加B27辅助物(1x;Life Technologies)的Media激素混合物(MHM)(Life Technologies)培养基中培养20天。在37℃、5%CO2环境下进行培养,培养基更换是2天进行一次。
培养后,固定细胞,使用对于作为神经细胞标志物的βIII微管蛋白的抗体而进行免疫染色。结果示于图2。
分化诱导培养的细胞含多数βIII微管蛋白阳性的神经细胞。表示在人血清白蛋白添加培养基中培养的神经球可有效率地分化为神经细胞。
【实施例3:脂肪酸的功能评价】
向人血清白蛋白添加培养基还添加脂肪酸而进行功能评价。实施例3的目的是确认脂肪酸负载量多的人血清白蛋白的作用。
与实施例1同样地制成2.1mg/mL人血清白蛋白添加培养基。制成向此培养基添加油酸(东京化成工业)至各自成为最终浓度20μM、60μM的培养基、或者未添加油酸的培养基,在这些培养基中进行神经球培养。(再者,含脂肪酸及人血清白蛋白的培养基也可通过使脂肪酸预先与指定的浓度的人血清白蛋白溶液混合,将该混合液添加到培养基中来制作。)估计培养基中的油酸的大致100%与HSA结合。7天进行一次培养基更换,培养14天后,在显微镜下进行形成的神经球的形态的观察。结果示于图3。
在20μM油酸添加培养基中培养的神经球显示与用未添加脂肪酸的培养基中培养的神经球同样的良好的神经球的形态。一方面,在60μM油酸添加培养基中培养的神经球中,确认到多数显示黑色的异形球的形态。
【实施例4:人血清白蛋白功能评价】
【(1)长期自我再生神经上皮样干细胞(Long-term self-renewing neuroepithelial-like stem cells)(以下称为LtNES细胞)诱导法】
从iPS细胞形成EB,在向相当于从E6培养基(Life Technologies或STEMCELLTechnologies)除去抗坏血酸及转铁蛋白的组成的培养基添加转铁蛋白(终浓度0.5~10μg/mL)、乙醇胺(终浓度5~50μM)的培养基中培养4天。向聚L鸟氨酸(PO)包被的皿接种EB,在上述培养基中培养10天左右,确认形成了Rosette样的结构。取出Rosette部分,作为神经球在上述培养基中进行7天左右悬浮培养。将神经球用胰蛋白酶/EDTA分散,在PO/层粘连蛋白包被的皿上在上述培养基中培养,制成LtNES细胞。LtNES细胞混在有神经干细胞及神经前体细胞。
再者,对于上述E6培养基(Essential 6培养基),在Life Technologies公司主页<URL:http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A1516401>中记载了,以E8培养基作为基础的制法制作,不含bFGF和TGFβ。再者,在Nat Methods 2011May;8(5):424-429中记载了E8培养基(Essential 8培养基)。
另外,上述E6培养基的成分也记载在Stem Cells.2014Apr;32(4),1032-42的摘要中。
【(2)人血清白蛋白功能评价】
向相当于从E6培养基(Life Technologies或STEMCELL Technologies)除去抗坏血酸及转铁蛋白的组成的培养基添加转铁蛋白(终浓度0.5~10μg/mL)、乙醇胺(终浓度5~50μM)、bFGF(终浓度5~100ng/mL)而制成受试基础培养基。
制成向受试基础培养基添加人血清来源白蛋白(Sigma Aldrich)至成为终浓度0、0.21、1、2.1mg/mL的受试培养基。
使用各受试培养基,培养从人多能性干细胞诱导的LtNES细胞(1.5×105细胞)。细胞的培养在37℃、5%CO2气氛下的温育器内进行。2天进行一次培养基更换,培养4~5天。培养后,代替受试培养基而添加TrypLE Select,37℃、温育1分钟而进行细胞分散处理。将TrypLE Select用培养基稀释后,进行移液器吸吐,作为单一的细胞,对细胞数进行计数,评价。细胞数测定进行由锥虫蓝(Life Technologies公司)的死细胞染色的基础上,用血细胞计数板进行。
结果示于图4。在1mg/mL人血清白蛋白添加培养基中细胞数最增加,在0.21、2.1mg/mL人血清白蛋白添加培养基中细胞也显示良好的增殖。
【工业实用性】
由本发明可使维持神经干细胞和/或神经前体细胞的未分化性及多潜能性的状态下促进细胞增殖变得可能,削减神经干细胞和/或神经前体细胞培养中所耗的人的成本及金钱的成本。
在含其中述及的专利、专利申请说明书、科学文献的全部刊物中记载的内容,通过引用,以与明示其全部同程度地并入本说明书中。
本申请以在日本申请的特愿2015-069979(申请日:2015年3月30日)作为基础,其内容全部包含在本说明书中。

Claims (29)

1.神经干细胞和/或神经前体细胞用培养基,其含人血清白蛋白。
2.权利要求1所述的培养基,其用于维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化。
3.权利要求1或者2所述的培养基,其用于促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖。
4.权利要求1所述的培养基,其用于
维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化,且
促进神经干细胞和/或神经前体细胞的增殖。
5.权利要求1~4之任一项所述的培养基,其中所述神经干细胞和/或神经前体细胞源于多能性干细胞。
6.权利要求1~5之任一项所述的培养基,其中人血清白蛋白是重组的人血清白蛋白。
7.权利要求1~5之任一项所述的培养基,其中所述人血清白蛋白源于人血浆。
8.权利要求1~7之任一项所述的培养基,其中所述培养基中含脂肪酸。
9.权利要求1~8之任一项所述的培养基,其中所述培养基中的脂肪酸量是50μM以下。
10.权利要求1~9之任一项所述的培养基,其中所述培养基中的脂肪酸量是20μM以下。
11.权利要求1~10之任一项所述的培养基,其中所述培养基中的人血清白蛋白量是0.2mg/mL以上20mg/mL以下。
12.权利要求1~11之任一项所述的培养基,其中所述培养基中的人血清白蛋白量是0.5mg/mL以上10mg/mL以下。
13.权利要求1~12之任一项所述的培养基,其用于悬浮培养。
14.权利要求1~13之任一项所述的培养基,其为无血清培养基。
15.权利要求1~14之任一项所述的培养基,其含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
16.权利要求15所述的培养基,其中所述培养基中的bFGF量是1ng/mL以上200ng/mL以下。
17.使神经干细胞和/或神经前体细胞增殖的方法,其特征在于,向培养基添加人血清白蛋白。
18.维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化的方法,其特征在于,向培养基添加人血清白蛋白。
19.维持神经干细胞和/或神经前体细胞不分化地促进所述神经干细胞和/或神经前体细胞增殖的方法,其特征在于,向培养基添加人血清白蛋白。
20.权利要求17~19之任一项所述的方法,其中所述神经干细胞和/或神经前体细胞源于多能性干细胞。
21.权利要求17~20之任一项所述的方法,其中所述人血清白蛋白是重组的人血清白蛋白。
22.权利要求17~20之任一项所述的方法,其中所述人血清白蛋白源于人血浆。
23.权利要求17~22之任一项所述的方法,其中所述培养基中含脂肪酸。
24.权利要求17~23之任一项所述的方法,其中所述培养基中的脂肪酸量是50μM以下。
25.权利要求17~24之任一项所述的方法,其中所述培养基中的脂肪酸量是20μM以下。
26.权利要求17~25之任一项所述的方法,其中所述培养基中的人血清白蛋白量是0.2mg/mL以上20mg/mL以下。
27.权利要求17~26之任一项所述的方法,其中所述培养基中的人血清白蛋白量是0.5mg/mL以上10mg/mL以下。
28.权利要求17~27之任一项所述的方法,其中在该培养基中对神经干细胞和/或神经前体细胞进行悬浮培养。
29.培养组合物,其含权利要求1~16之任一项所述的培养基、及神经干细胞和/或神经前体细胞。
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