JP5409359B2

JP5409359B2 - 細胞の単離方法、細胞用無血清培養培地および細胞の培養方法

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Publication number: JP5409359B2
Application number: JP2009523552A
Authority: JP
Inventors: 誠一横尾; 聡山上
Original assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 2007-07-13
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2028-01-11
Also published as: WO2009011139A1; JPWO2009011139A1; EP2177602A1; US20100184221A1; EP2177602B1; EP2177602A4

Description

本発明は、細胞の単離方法、細胞を動物由来の未知因子および細胞外基質が存在しない条件下において培養することが可能な無血清培地、及び、当該無血清培地を用いた細胞の培養方法に関する。

幹細胞は臓器や組織を形成し得る細胞であり、成体であってもほとんどの臓器や組織に存在していると考えられている。幹細胞のうち胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は万能細胞であり全ての組織や臓器に分化する能力を持っている。一方、体性幹細胞は全ての臓器や組織に分化できるわけでなく特定の組織や臓器に分化する。ヒト組織から採取できる体性幹細胞は患者自身から採取でき、拒絶反応の恐れがないため再生医療に対する移植材料として注目されている。

ヒトにおける体性幹細胞は現在までに間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、網膜幹細胞、角膜内皮幹細胞などが知られている。しかし、幹細胞が組織に含まれる割合は極めて微量であり、また正確に幹細胞の分離をしなければならない。幹細胞の分離には、予め幹細胞マーカーと考えられる細胞表面に発現している蛋白質を同定し、それらの蛋白質に対する抗体を準備し、結合させて分離する方法などが行われている。この方法では幹細胞を分離し同定する前に幹細胞マーカーを同定しなければならず、そのため確度が低く、多くの幹細胞マーカー候補を用いて分離しても幹細胞が正確に分離できるとは限らなかった。
更に分離した細胞を幹細胞と証明するためには他の細胞へ分化する能力や元の組織を形成する能力を厳密に試験をしなければならない。そのため、幹細胞の分離と同定には多くの場合、無血清培地が使われるが、単離されていない幹細胞の性状は不明である。そのため、幹細胞の無血清培養においてどのような因子が効果的であるか確定するのは非常に困難である。

培養に用いられる培地であるが、幹細胞が要求する因子が不明であるため、多くの幹細胞の培養には動物血清や脳下垂体抽出物や3T3繊維芽細胞との共培養による放出物など動物由来の未知成分を使用する。動物血清や脳下垂体抽出物には様々な因子が含まれており、個体間のロットの違いがあり、試験・研究における再現性の確認や結果の精度に問題を生じる。また、動物由来成分は未知因子を含め非常に膨大な種類の蛋白質や元素、脂質、ビタミンなどが含まれており、動物由来成分に含まれる膨大な種類の組成中から幹細胞の培養に効果的な因子を探索することは非常に困難である。

また血清や脳下垂体抽出物の使用は既知、未知の動物由来成分や病原体による細胞の汚染の可能性が指摘されており、問題の解決が望まれている。

そのため、上記のような問題を解決するために無血清培地の開発が進められている。例えば、特開平６−７８７５９号（特許文献１）においては、基礎培地に、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、エタノールアミンおよび亜セレン酸ナトリウムを含有し、さらに、アミノ酸、ビタミン、補助因子および通常の無機塩を含有するハイブリドーマ、トランスフェクトーマまたは腫瘍細胞系統増殖のための無血清細胞培養培地が開示されている。

特開２００７−７７号（特許文献２）においては、付着性動物細胞培養用培地に、コルチゾル及び／またはプロラクチンのいずれか１種以上のホルモンを有効成分として添加した間葉系幹細胞用無血清培地および培養法が開示されている。

また、特開２００７−３７４２６号（特許文献３）では、基礎培地に特定のアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドを添加してなる動物間葉系幹細胞培養用無血清培地が開示されている。
上記のとおり、動物細胞培養用の無血清培地は、種々のものが開示されている。

しかしながら、上皮系や内皮系といった付着性細胞に存在する体性幹細胞に適応できる汎用性の高い無血清培地は報告されていなかった。そのため、細胞種によって培養法が異なり、試験、研究結果の単純な比較が難しかった。

また、付着系細胞の培養には、現在、主にプラスチック容器が使用されているが、プラズマ処理などにより表面加工による細胞の付着性を向上させ、あるいはラミニンやコラーゲンなどの動物由来細胞外基質によりコーティングすることで細胞の付着性を向上させる必要があり、これらコーティングが細胞本来の機能に影響を与える可能性がある。
そのため、動物組織より採取した付着性幹細胞を用いて各種試験・研究を行い明確な結果を得るには血清など未知因子が含まれず、細胞外基質を必要としない培養条件下でもって幹細胞の分化機能を保持し、また意図的に分化させ組織を構築させ得る培地の開発および単離法の開発が望まれている。
特開平６−７８７５９号公報特開２００７−７７号公報特開２００７−３７４２６号公報

本発明の課題は、新規な細胞の単離方法と培養方法を提供すること、および、明確な研究試験結果が得られ、血清と同等以上の増殖を得られ、更に幹細胞の分化を完全に制御でき、動物由来未知因子および細胞外基質を必要としない細胞培養用培地を提供することである。

本発明者は上記課題を克服すべく鋭意検討した結果、組織から得られた細胞を細胞外基質によるコーティングやプラズマ処理などによる表面処理を施さない培養容器中でインキュベートすることにより、幹細胞などの細胞を特異的に培養容器に付着させて、効率よく単離できることを見出した。
すなわち、従来は、細胞外基質が存在せず、且つ培養表面処理が施されていない培養容器や培養担体には付着系細胞は付着できず、増殖できない環境と考えられていた。しかし、本発明者らは幹細胞などの細胞が自ら活発に細胞外基質を産生して増殖することができることを見出し、この知見を更に発展させ、細胞外基質非存在下かつ表面処理無施行下で幹細胞などの目的細胞のみを単離できる方法を見出した。
また、単離された細胞の培養において、血清や脳下垂体抽出物など動物由来未知因子が存在しない無血清基礎培地に一般的な培地添加構成物であるセレン、インシュリン、トランスフェリン、エタノールアミン（ＳＩＴＥ）およびレチノール、リノール酸、リノレイン酸、α−トコフェロールなどの脂溶性必須栄養素ならびに脂溶性栄養素のキャリアとしてアルブミンを添加した培地、および、さらに上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子(ＦＧＦ−７)や繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）といった各種増殖因子を添加した培地を使用することで、幹細胞などの細胞を再現性高く、且つ効率よく増殖させることを見出した。

すなわち、本発明は、動物由来の組織を細胞に解離させる工程、培養表面が表面処理されていない培養容器又は培養用担体に該細胞を播種してインキュベートする工程、および該培養容器又は該培養用担体の培養表面に付着した細胞を選択する工程を含む細胞の単離方法を提供する。
本発明はまた、細胞が幹細胞である前記方法を提供する。
本発明はまた、幹細胞が上皮系の幹細胞である前記方法を提供する。
本発明はまた、幹細胞が角膜上皮幹細胞、結膜上皮幹細胞、口腔粘膜上皮幹細胞、または皮膚上皮幹細胞である前記方法を提供する。
本発明はまた、前記いずれかの方法によって幹細胞または細胞を組織から単離する工程、および単離された幹細胞または細胞を培地で培養する工程を含む、幹細胞または細胞の培養方法を提供する。
本発明はまた、培地が無血清培地である前記方法を提供する。
本発明はまた、無血清培地が血清アルブミンを含む前記方法を提供する。
本発明はまた、無血清培地が、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、ヒト血清アルブミン、リノール酸、リノレイン酸、レチノ−ル、およびα−トコフェロールを含む前記方法を提供する。
本発明はまた、血清アルブミンがヒト血清アルブミンである前記方法を提供する。
本発明はまた、ヒト血清アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである前記方法を提供する。
本発明はまた、無血清培地が、分化刺激物を含む前記方法を提供する。
本発明はまた、分化刺激物が、EGF若しくはFGF-2若しくはFGF-7のいずれかから選択される前記方法を提供する。
本発明はまた、前記いずれかの方法によって、幹細胞を組織から単離する工程、および単離した幹細胞を培地で培養する工程を含む、幹細胞コロニーの製造方法を提供する。
本発明はまた、前記いずれかの方法によって、幹細胞または細胞を組織から単離する工程、および単離した幹細胞または細胞を培地で培養する工程を含む、細胞シートの製造方法を提供する。
本発明はまた、細胞シートが重層化上皮系細胞シートである前記方法を提供する。
本発明はまた、角膜輪部上皮組織を細胞に解離させる工程、培養表面が表面処理されていない培養容器又は培養用担体に該細胞を播種してインキュベートする工程、該培養容器又は該培養用担体の培養表面に付着した細胞を選択する工程、および単離した角膜上皮幹細胞を、EGFまたはFGF-7を含む無血清培地で培養する工程を含む、角膜上皮細胞シートの製造方法を提供する。
本発明はまた、角膜輪部上皮組織を細胞に解離させる工程、培養表面が表面処理されていない培養容器又は培養用担体に該細胞を播種してインキュベートする工程、該培養容器又は該培養用担体の培養表面に付着した細胞を選択する工程、および単離した角膜上皮幹細胞を、FGF-2を含む無血清培地で培養する工程を含む、ゴブレット細胞の製造方法を提供する。
本発明はまた、皮膚組織を細胞に解離させる工程、培養表面が表面処理されていない培養容器又は培養用担体に該細胞を播種してインキュベートする工程、該培養容器又は該培養用担体の培養表面に付着した細胞を選択する工程、および単離した皮膚上皮細胞を、EGFを含む無血清培地で培養する工程を含む、皮膚上皮細胞シートの製造方法を提供する。
本発明はまた、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、血清アルブミン、リノール酸、リノレイン酸、レチノール、およびα−トコフェロールを含み、血清を含まない、幹細胞培養用培地を提供する。
本発明はまた、血清アルブミンがヒト血清アルブミンである前記培地を提供する。
本発明はまた、ヒト血清アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである前記培地を提供する。

単離された角膜上皮幹細胞の顕微鏡写真。増殖させた角膜上皮幹細胞コロニーの顕微鏡写真。角膜上皮幹細胞コロニーのBrdU法およびHoechst33342による核染色の結果を示す図（写真）。角膜上皮幹細胞コロニーのサイトケラチン３（ＣＫ３）抗体とサイトケラチン１２（ＣＫ１２）抗体による免疫染色の結果を示す図（写真）。角膜上皮幹細胞にＦＧＦ−２を添加して得られたゴブレット細胞の（ａ）光学像、（ｂ）ＨＥ染色像（断面）、（ｃ）ＰＡＳ染色像を示す図（写真）。角膜上皮幹細胞から得られた（Ａ）角膜上皮シートの断面像、（Ｂ）剥離された角膜細胞シートを示す図、（Ｃ）羊膜上で作成された角膜上皮シートの断面図（写真）。単離された結膜上皮幹細胞の顕微鏡写真。結膜上皮幹細胞コロニーのサイトケラチン４（Ｋ４）抗体、サイトケラチン１３（ＣＫ１３）抗体、BrdU抗体、およびNestin抗体による免疫染色の結果を示す図（写真）。結膜上皮幹細胞コロニーの（Ａ）光学像、（Ｂ）MUC5ACのRT-PCR、（Ｃ）断面像を示す図（写真）。結膜細胞シートの断面像（写真）。（Ａ）口腔粘膜上皮幹細胞にＥＧＦを添加して得られた細胞コロニーの光学像、（Ｂ）口腔粘膜上皮幹細胞にＦＧＦ−２を添加して得られた細胞コロニーの光学像、（Ｃ）口腔粘膜上皮細胞シートの断面像（写真）。（A）高付着皮膚上皮細胞コロニーの光学像、（B）皮膚上皮シートの断面図、（C）サイトケラチン１（ＣＫ１）抗体による免疫染色の結果、および（D）サイトケラチン１０（ＣＫ１０）抗体による免疫染色の結果を示す図（写真）。

本来、上皮細胞など培養表面に付着しなければ培養が難しい付着系細胞は培養表面にプラズマ処理やコラーゲンなどの細胞外基質の塗布による付着性の向上が必要と考えられていた。しかし、体性幹細胞など特定の細胞は自ら細胞外基質を産生し分泌する能力を持っているので、これら培養表面へのコラーゲンなど細胞外基質の塗布や培養表面のプラズマ処理などは必要ない。
そのため、本発明の細胞の単離方法では、付着系幹細胞などの目的の細胞以外が生育できないような表面処理されていない培養表面上で、細胞を付着培養することにより、目的の細胞のみを単離することができる。「表面処理されていない」とは、ラミニンやコラーゲンなどの細胞外基質によりコーティングされておらず、かつ、プラズマ処理もされていないことを意味する。

望ましい培養表面としてはガラス、プラスチックなどの表面に−ＣＯＯＨなど粒子表面の電離基の解離が無いものが望ましい。また表面の水滴を横から見たときに水滴が固体面となす角度θdegを接触角と呼ぶが、このときの接触角が０から１の範囲内では付着系動物幹細胞の付着も阻害される。よって培養表面の接触角は１度以上が望ましい。
表面処理されていない培養容器の具体例としては、ポリスチレン製のFALCON 351143やKord-Valmark 2901、住友ベークライトのセルデスク(MS-92132) 非表面処理品などが挙げられるが、これらに限定はされない。
その他のプラスチック製の浮遊培養用Dish、例えば、住友ベークライト社MS-1160RやMS-1135R、コーニング社の無処理表面デイッシュ 430589も使用できる。
表面処理されていない培養用担体の具体例として、プラスチック製の担体が挙げられる。プラスチックの種類では、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルフォン、ポリアミン-ポリスチレングラフト共重合体、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート−ポリブチレンテレフタレートポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、セグメント化ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリN-イソアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエステルなどが挙げられる。
担体の形状としては、皿状のもの、板状のもの、袋状のもの、ボトル状のもの、ビーズ、不織布などが挙げられるが細胞が付着できる表面が露出していれば特に限定されない。
また、培養に使用できる容器や担体の種類は
http://idb.exst.jaxa.jp/jdata/02042/199603J02042000/199603J02042000.html#2.1
を参照して入手することもできる。

本発明の単離法が適用できる幹細胞としては、ヒト又はヒト以外の哺乳類動物由来の組織、器官、臓器から得られるものが好ましく、特にＥＳ細胞、体性幹細胞等の未分化型細胞が好ましく、さらに付着性の体性幹細胞が好ましく、上皮系の幹細胞がより好ましい。
幹細胞としては、例えば、神経幹細胞、角膜内皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、結膜上皮幹細胞、皮膚上皮幹細胞、口腔粘膜上皮幹細胞、食道上皮幹細胞、甲状腺上皮幹細胞、副甲状腺上皮幹細胞、胸腺上皮幹細胞、エナメル上皮幹細胞、毛包等の外胚葉系幹細胞；尿細管上皮幹細胞等の中胚葉系幹細胞；消化管上皮幹細胞、胆道上皮幹細胞、膵管上皮幹細胞等の内胚葉系幹細胞等が挙げられる。
本発明の単離法が適用できる細胞としては、ヒト又はヒト以外の哺乳類動物由来の組織、器官、臓器から得られるものが好ましく、さらに付着性の体性細胞が好ましく、上皮系の細胞がより好ましい。

以下、実際に哺乳動物組織からの付着系動物幹細胞の単離方法と幹細胞の培養ならびに増殖因子による分化制御と組織構築に至る方法を詳細に説明する。

まず、体外に取り出された動物由来の組織をハサミ等で小片化した後、細胞に解離させる。細胞に解離させる際には、コラゲナーゼやトリプシン／ＥＤＴＡ溶液によって処理することが好ましい。
次に、得られた細胞を上記の表面処理されていない培養容器に入れてインキュベートして幹細胞のみを選択的に培養容器に付着させる。インキュベートは、細胞の種類にもよるが、例えば、３７℃で５〜２４時間行うことが好ましい。幹細胞を培養容器に付着させる際に使用する液体媒体は、リン酸緩衝液等の緩衝液や後述する各種成分を含んだ無血清培地でもよいが、好ましくは後述する各種成分を含んだ無血清培地に分化刺激物を添加したものが用いられる。
インキュベート後に、非付着細胞を除去することによって容器に付着した幹細胞を選択することができる。

上記のようにして単離された幹細胞を培養して増殖させる際には任意の培地を使用することができるが、未知の因子による影響をなくすために無血清培地を用いることが好ましく、本発明の細胞培養用培地を用いることが特に好ましい。

本発明の細胞培養用培地は、無血清であり、付着系動物幹細胞の培養に用いることが好ましい。本発明の細胞培養用培地は動物細胞培養用無血清基礎培地に以下のものを添加して構成される。動物細胞培養用基礎培地としては、動物細胞培養用に汎用される基礎培地を使用することができるが、ＤＭＥＭ(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、ハムＦ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）、ＲＰＭＩ１６４０などを使用することができる。

本発明の細胞培養用培地は、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、およびエタノールアミンを含むことが出来る。
各添加物の添加濃度は細胞の増殖に効果があり毒性を示さない範囲であれば特に限定されないが、好ましくは、インシュリンは０．１ｍｇ／Ｌ以上、トランスフェリンは０．１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、亜セレン酸ナトリウムは１μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌ、エタノールアミンは０．５ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌである。
各々の構成成分の役割については、インシュリンはグルコースおよびアミノ酸の細胞への取り込みを促進するポリペプチドであり、トランスフェリンは必須微量元素である鉄の輸送蛋白質であり、セレンは必須微量元素であり、エタノールアミンは細胞膜を構成するリン脂質の塩基成分である。

さらに、本発明の細胞培養用培地は血清アルブミン、レチノール、およびα−トコフェロールを含むことが出来る。これらの添加物の添加濃度は細胞の増殖に効果があり毒性を示さない範囲であれば特に限定されないが、好ましくは、血清アルブミンは０．１ｇ／Ｌ以上、レチノールは０．１ｍｇ／Ｌ〜１２ｍｇ／ｍｌ、α−トコフェロールは０．１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／ｍｌである。
これらの役割については、血清アルブミンは脂肪酸を可溶化させ細胞への脂肪酸取り込みを促進する脂肪酸複合蛋白質である。レチノールおよびα−トコフェロールは必須栄養素である。レチノール、α−トコフェロールについては培地中に可溶化させたほうが望ましい。よってこれらは培地中に可溶化させることができる。たとえば、シクロデキストランやシクロアミロースといった錯体に包接または結合させ可溶化させる方法がある。またレチノールは広義のビタミンＡ、即ちレチナール、レチノイン酸、およびこれらの3-デヒドロ体、その誘導体でも置き換えられる。
さらに本発明の細胞培養用培地はリノール酸、リノレイン酸を含めることが好ましい。これらの添加物の添加濃度は細胞の増殖に効果があり毒性を示さない範囲であれば特に限
定されないが、好ましくは、リノール酸は０．５μｇ／Ｌ以上、リノレイン酸は０．５μｇ／Ｌ以上である。
これらの役割については、血清アルブミンは脂肪酸を可溶化させ細胞への脂肪酸取り込みを促進する脂肪酸複合蛋白質であり、リノール酸およびリノレイン酸は必須脂肪酸である。リノール酸、リノレイン酸は培地中に可溶化させたほうが望ましい。よってこれらは培地中に可溶化させることができる。

本発明で用いられる血清アルブミンはヒト血清アルブミンが好ましく、組換えヒト血清アルブミンがより好ましい。組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）は、遺伝子組換え技術を用いて調製されたものであれば特に限定されないが、例えば、医薬品（注射剤）として利用可能な程度に十分に精製されたものが好ましい。
ｒＨＳＡは、遺伝子操作を経て調製されたＨＳＡ産生宿主により産生されるＨＳＡであれば特に限定されないが、好ましくは産生宿主に由来する夾雑成分（例えば、蛋白質、多糖類等）を実質的に含まない、より好ましくは公知の手段でｒＨＳＡ産生宿主を培養した後、その培養濾液または菌体、細胞からそれぞれ公知の分離手段および精製手段により採取および精製されたものが用いられる。ｒＨＳＡの産生宿主としては、サッカロマイセス属やピキア属などの酵母、動物細胞、トランスジェニック動物などが挙げられる。ｒＨＳＡについては特開2005-204539に詳細に記載されている。

更に無血清であるため酸素や細胞自身から産生されるフリーラジカルによる細胞毒性を消失させる目的で、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼの１種類以上を添加してもよい。これらの添加物の添加濃度は細胞に効果があり毒性を示さない範囲であれば特に限定されないが、好ましくは、ＳＯＤは０．２５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、カタラーゼは０．１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、グルタチオンペルオキシダーゼは０．１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌである。これらは他の抗酸化作用を持つ他の酵素やアスコルビン酸、およびその誘導体など抗酸化作用を持つ化学物質で置き換えることもできる。

また細胞の増殖促進を目的に、トリヨードサイロニン、プトレスシン、プロゲストロンを添加してもよい。これらの添加物の添加濃度は細胞に効果があり毒性を示さない範囲であれば特に限定されないが、好ましくは、トリヨードサイロニンは０．２μｇ／Ｌ〜２００μｇ／Ｌ、プトレスシンは１０μＭ〜１ｍＭ、プロゲストロンは２ｎＭ〜２００ｎＭである。

このように調製した細胞培養用培地に各種分化刺激物を加えることで幹細胞の分化制御ができる。
以下に、各種幹細胞の単離、増殖、分化および細胞シートの作製について説明する。

角膜上皮幹細胞の場合、角膜輪部上皮組織を単離し、これを本発明の単離方法に供することによって得ることができる。
単離された細胞が角膜上皮幹細胞であることは、角膜上皮細胞の分化マーカーであるサイトケラチン３（ＣＫ３）やサイトケラチン１２（ＣＫ１２）の発現が見られる細胞を細胞分裂によって供給する能力（他細胞への分化能と増殖能）、またこれらの角膜上皮細胞マーカーに陽性な重層化した角膜上皮組織を形成する能力（組織形成能）、によって確認することができる。分化マーカー発現の確認は、ＲＴ−ＰＣＲやノーザンブロットなどのｍＲＮＡの解析や、抗体染色などのタンパク質の解析によって行うことができる。増殖能はＢｒｄＵ法やＫｉ６７による免疫染色のほか、培養中の細胞が分裂途中に顕微鏡で染色体を視認することで確認することができる。組織形成能は細胞を培養し重層化した上皮組織を形成しかつ分化マーカーの発現を調べることで確認できる。
得られた角膜上皮幹細胞は、分化刺激を加えることによって幹細胞の持つ分化能の範囲内において所望の細胞に分化させることができる。例えば、幹細胞培養用培地にＥＧＦやＦＧＦ−７を添加し、培養することにより、角膜上皮幹細胞を角膜上皮細胞に分化させることができる。また、角膜上皮幹細胞にＦＧＦ−２を添加することにより、ゴブレット細胞に分化させることができる。
そして、角膜上皮幹細胞は細胞コロニーとして得ることもできるが、得られた角膜上皮幹細胞をシート状に増殖させ、EDTA処理などによって剥離することで角膜上皮細胞シートを得ることもできる。角膜上皮細胞シートは羊膜上に作製することもできる。得られた角膜上皮細胞シートは重層化することもできる。
得られた角膜上皮細胞シートは難治性角膜上皮障害などの難治性眼表面疾患の再生医療による治療に適用することができる。

結膜上皮幹細胞の場合、結膜を強角膜片より採取し、これを本発明の単離方法に供することによって得ることができる。
単離された細胞が結膜上皮幹細胞であることは、結膜上皮細胞の分化マーカーであるサイトケラチン４（ＣＫ４）やサイトケラチン１３（ＣＫ１３）の発現が見られる細胞を細胞分裂によって供給する能力（他細胞への分化能と増殖能）、またこれらの結膜上皮細胞マーカーに陽性な重層化した結膜上皮組織を形成する能力（組織形成能）、によって確認することができる。
得られた結膜上皮幹細胞は、分化刺激を加えることによって幹細胞の持つ分化能の範囲内において所望の細胞に分化させることができる。例えば、幹細胞培養用培地にＥＧＦやＦＧＦ−７を添加し、培養することにより、結膜上皮幹細胞を結膜上皮細胞に分化させることができる。また、ＦＧＦ−２を添加することにより、ゴブレット細胞に分化させることができる。
そして、結膜上皮幹細胞は細胞コロニーとして得ることもできるが、得られた結膜上皮幹細胞をシート状に増殖させ、EDTA処理などによって剥離することで結膜上皮細胞シートを得ることもできる。結膜上皮細胞シートは羊膜上に作製することもできる。得られた結膜上皮細胞シートは重層化することもできる。
得られた結膜上皮細胞シートは腫瘍摘出後の上皮再建、緑内障手術におけるろ過包の形成などに適用することができる。

口腔粘膜上皮幹細胞の場合、口腔粘膜上皮細胞を採取し、これを本発明の単離方法に供することによって得ることができる。
単離された細胞が口腔粘膜上皮幹細胞であることは、口腔粘膜上皮細胞の分化マーカーであるＣＫ３、ＣＫ４、ＣＫ１３の発現が見られる細胞を細胞分裂によって供給する能力（他細胞への分化能と増殖能）、またこれらの口腔粘膜上皮細胞マーカーに陽性な重層化した口腔粘膜上皮組織を形成する能力（組織形成能）、によって確認することができる。
得られた口腔粘膜上皮幹細胞は、分化刺激を加えることによって幹細胞の持つ分化能の範囲内において所望の細胞に分化させることができる。例えば、幹細胞培養用培地にＥＧＦやＦＧＦ−７を添加し、培養することにより、口腔粘膜上皮幹細胞を口腔粘膜上皮細胞に分化させることができる。またＦＧＦ−２を添加することにより、ゴブレット細胞に分化させることができる。
そして、口腔粘膜上皮幹細胞は細胞コロニーとして得ることもできるが、得られた口腔粘膜上皮幹細胞をシート状に増殖させ、EDTA処理などによって剥離することで口腔粘膜上皮細胞シートを得ることもできる。口腔粘膜上皮細胞シートは羊膜上に作製することもで
きる。得られた口腔粘膜上皮細胞シートは重層化することもできる。
得られた口腔粘膜上皮幹細胞シートは、口腔粘膜上皮の再建や両眼性の眼表面疾患などの治療に適用することができる。

皮膚上皮幹細胞の場合、皮膚上皮細胞を採取し、これを本発明の単離方法に供することによって得ることができる。そして、皮膚上皮幹細胞は細胞コロニーとして得ることもできるが、得られた皮膚上皮幹細胞をシート状に増殖させ、EDTA処理などによって剥離することで皮膚上皮細胞シートを得ることもできる。皮膚上皮細胞シートは羊膜上に作製することもできる。得られた皮膚上皮細胞シートは重層化することもできる。
得られた皮膚上皮細胞シートは、皮膚の再建や重度の熱傷などの治療に適用することができる。
採取された皮膚上皮細胞が皮膚上皮幹細胞であることは、皮膚上皮幹細胞自らが発現していない皮膚上皮細胞特異的ケラチンパターンであるサイトケラチン１（ＣＫ１）およびサイトケラチン１０（ＣＫ１０）を発現する細胞を細胞分裂によって供給する能力（他細胞への細胞分化能と増殖能）、更には重層化した皮膚上皮組織を形成する能力（組織形成能）によって確認することができる。また皮膚上皮幹細胞の細胞分化能は現在の知見では知られていない別種の細胞へ変化することによっても確認することが出来る。
以上、角膜上皮幹細胞、結膜上皮幹細胞および口腔粘膜上皮幹細胞、皮膚上皮幹細胞について説明したが、その他の幹細胞または細胞についても同様にして単離することができる。

[実施例]
以下、本発明を、実施例を挙げて、より具体的に説明するが、本発明の保護範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

無血清基礎培地ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）にＳＩＴＥ培地添加物（ＳＩＧＭＡ）を加え、インシュリン濃度が１０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン濃度が５．５ｍｇ／Ｌ、亜セレン酸ナトリウム濃度が５μｇ／Ｌ、エタノールアミン濃度が２ｍｇ／Ｌとなるようにした。
さらに、ウシ血清アルブミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．５ｇ／Ｌ、リノール酸５μｇ／Ｌ（ＳＩＧＭＡ）、リノレイン酸５μｇ／Ｌ（ＳＩＧＭＡ）、レチノール１００μｇ／Ｌ（ＳＩＧＭＡ）、α−トコフェロール１ｍｇ／Ｌ（ＳＩＧＭＡ）を添加した。
さらに、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）２．５ｍｇ／Ｌ（ＳＩＧＭＡ）、カタラーゼ（ＳＩＧＭＡ）、グルタチオンペルオキシダーゼ１ｍｇ／Ｌ（和光純薬）を添加した。
さらに、トリヨードサイロニン、２０μｇ／Ｌ、プトレスシン１００μＭ（ＳＩＧＭＡ）、プロゲストロン２０ｎＭ（ＭＰＢＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）を添加して幹細胞培養用培地（A）とし、以下の実施例に使用した。
また、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２基礎培地(ＳＩＧＭＡ)にＳＩＴＥ培地添加物（ＳＩＧＭＡ）を加え、インシュリン濃度が１０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン濃度が５．５ｍｇ／Ｌ、亜セレン酸ナトリウム濃度が５μｇ／Ｌ、エタノールアミン濃度が２ｍｇ／Ｌとなるようにし、ヒト組換えアルブミン（田辺三菱製薬）２．５ｇ／Ｌ、レチノール１００μｇ／Ｌ（ＳＩＧＭＡ）、α−トコフェロール１ｍｇ／Ｌ（ＳＩＧＭＡ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）２．５ｍｇ／Ｌ（ＳＩＧＭＡ）、カタラーゼ（ＳＩＧＭＡ）、グルタチオンペルオキシダーゼ１ｍｇ／Ｌ（和光純薬）を添加した。トリヨードサイロニン、２０μｇ／Ｌ、プトレスシン１００μＭ（ＳＩＧＭＡ）、プロゲストロン２０ｎＭ（ＭＰＢＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）、を添加して幹細胞培養用培地（B）とし実施例に使用した。なお、田辺三菱製薬社製のヒト組換えアルブミン製剤には、リノール酸およびリノレイン酸が含まれていたため、本培地の調製の際には、新たにこれらを加えてはいない。

（角膜上皮幹細胞の単離）
幹細胞用浮遊培養用容器の作成は、特願 2005-369270号(特開２００７−１６６９７７)に記載の方法に従って、生細胞分離用遠心分離管記載のポリヒドロキシエチルメタクリレートをエタノールに溶解させ、市販されている浮遊培養用プラスチック培養容器にコーティングし風乾させて作成した。この幹細胞用浮遊培養用容器は研究者が意図しない幹細胞の付着を防止する目的で用いることができる。

米国アイバンクより入手した研究用ヒト輸入角膜より結膜組織を除去した後、角膜上皮幹細胞が存在するとされる角膜輪部上皮組織を、ハサミを用いて切除した。切除した角膜輪部上皮組織を、コラゲナーゼＴＹＰＥＩＡ（ＳＩＧＭＡ）０．０２％を添加した付着系動物幹細胞培養用無血清培地を１０ｍｌ満たした幹細胞用浮遊培養用容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で一晩培養し組織を溶解させ細胞の凝集体を得た。

得られた細胞凝集体を遠心管ＳＴＥＭＦＵＬＬ（住友ベークライト社）中に回収し、１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで遠心操作を行い、コラゲナーゼを含む付着系動物幹細胞培養用無血清培地を取り除いた後、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄し、再び１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで遠心操作を行いＰＢＳ（−）を取り除いた。その後、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて単一細胞に分散させた後、ＰＢＳ（−）による洗浄を三回行いトリプシン／ＥＤＴＡを取り除き、２０ｎｇ／ｍｌの終濃度になるようＥＧＦを加えた幹細胞培養用培地（A）１ｍｌに細胞を懸濁した。細胞懸濁液の細胞密度をコールターカウンターＺ1（ベックマンコールター社製）を用いて計測した。

細胞数を計測した後、１０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように幹細胞培養用培地（A）を用いて幹細胞用浮遊培養用容器中で希釈した。この幹細胞を含む細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌノントリートメントプレート（ＦＡＬＣＯＮ）に１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し一晩３７℃５％ＣＯ_２の環境下で一晩培養した。

その後、培地上清を取り除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄したのち、幹細胞培養用培地(A)で１回洗浄を行い、ノンコートプラスチックプレートに付着していない細胞を取り除き図１で示される角膜上皮幹細胞のみを単離した。

（増殖因子による角膜上皮細胞への分化試験）
幹細胞培養用培地(A)に上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ：和光純薬より入手）を２０ｎｇ／ｍＬの濃度になるよう添加して単離した角膜上皮幹細胞の培養を３７℃ ５％ＣＯ₂の環境下で行った。単離された角膜上皮幹細胞は活発に分裂を始め、図２に示される約一週間で円形の単一細胞由来の細胞集団（コロニー）を形成した。このコロニーを増殖能が確認できるＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ）取り込み試験法（ＢｒｄＵ法）やＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による核染色を行った結果を図３に示す。コロニーはＤＮＡ合成を行った細胞に取り込まれたＢｒｄＵに対する検出抗体、ＦＩＴＣ-Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ＢｒｄＵａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒｏｃｈｅ）に対して陽性であり、また細胞分裂の際に現れる染色体が確認できることから角膜上皮細胞が活発に増殖していることがわかる。コロニーの形態は上皮細胞の特徴である敷石状であり、角膜上皮特異的ケラチン発現パターンであるＣＫ３およびＣＫ１２の蛋白質発現を免疫染色法で調べた。ＣＫ３の検出に用いるために一次抗体ＡＥ−５（Ｐｒｏｇｅｎ）を使用し、ＣＫ１２の検出を行うために一次抗体Ｎ−１６（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して免疫抗体反応を行った。その後、二次抗体であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａｌｅｘａ４８８：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を反応させた。その結果図４で示される角膜上皮細胞特異的なサイトケラチンパターンであるＣＫ３とＣＫ１２の発現が確認された。これらの結果から角膜輪部上皮組織より採取された角膜上皮幹細胞は角膜上皮細胞への分化能を持つことが確認された。

（増殖因子によるゴブレット細胞への分化試験）
幹細胞培養用培地(A)に繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２：和光純薬より入手）を４０ｎｇ／ｍＬの濃度になるよう添加し、単離した角膜上皮幹細胞の培養を３７℃ ５％ＣＯ₂の環境下で行った。
単離された角膜上皮幹細胞は活発に分裂を始め、培養３−５日ほどで中央部が盛り上がり突起物を形成し、特異的な形状をした単一細胞由来のコロニーが現われた（図５ａ）。この中央部の突起物の断面を見ると、細胞成分が少なく細胞塊ではなく細胞外基質の塊だと判明した（図５ｂ）。そこでゴブレット細胞で陽性になるＰＡＳ染色を行なったところ陽性であり（図５ｃ）、角膜上皮幹細胞をゴブレット細胞へ分化制御させることができた。

（幹細胞による組織形成試験）
幹細胞培養用培地(A)に上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ：和光純薬より入手）を２０ｎｇ／ｍＬの濃度になるよう添加し、単離した角膜上皮幹細胞を３７℃ ５％ＣＯ_２の環境下で三週間培養した。三週間培養した後１０％ホルマリンで固定しパラフィンで包埋を行なった後に断面を図６Ａで示されるヘマトキシリン・エオジン染色法で確認した。幹細胞は５層前後に重層化した角膜上皮組織を形成した。また、三週間培養した角膜上皮幹細胞を剥離して得られた角膜上皮シートの写真を図６Ｂに示す。

（角膜上皮シートの作成）
次に幹細胞培養用培地(B)を用いた羊膜上角膜上皮シートの作成を行なった。羊膜は帝王切開予定の提供者から眼科研究と治療の目的で使用する旨説明した上で同意を得て入手した。羊膜は無菌的に採取され、絨毛膜をピンセットで除去したのち冷凍保存されたものを使用した。羊膜はＰＢＳ（−）で洗浄されたあと、コーニング社製、５０ｍｌ遠心管中で、０．０２％ＥＤＴＡ/ＰＢＳ（-）溶液中で３７℃、２時間、恒温槽でインキュベートした。その後コーニング社製セルスクレイパーで羊膜上皮を剥離し、羊膜基質のみを採取し、コーニング社製ＴｒａｎｓＷｅｌｌ６ｗｅｌｌＰｌａｔｅに貼り付けた。

米国アイバンクより研究用として提供された成人強角膜片より、角膜周辺部に位置する角膜上皮幹細胞が豊富に存在する角膜輪部上皮組織をピンセットでつまみ、はさみで除去して組織片を入手した。２０ｎｇ／ｍＬの濃度になるようＥＧＦ（和光純薬）を添加した幹細胞培養用培地（B）で浸した羊膜基質に1mm×1mm程度の大きさの角膜輪部組織片を置き、２−３日に一度の培地交換を行いながら、４週間培養を続け、角膜上皮細胞シートを作成した。図６Cにその実施例を示す。

（結膜幹細胞の単離と細胞シートの作製）
米国アイバンクより入手した研究用ヒト輸入角膜より結膜を採取し、得られた結膜をハサミを用いて切除した。切除した結膜を、コラゲナーゼＴＹＰＥＩＡ（ＳＩＧＭＡ）０．０２％を添加した幹細胞培養用培地(A)を１０ｍｌ満たした幹細胞用浮遊培養用容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で一晩培養し組織を溶解させ細胞の凝集体を得た。

得られた細胞凝集体を遠心管ＳＴＥＭＦＵＬＬ（住友ベークライト社）中に回収し、１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで遠心操作を行い、コラゲナーゼを含む幹細胞培養用培地(A)を取り除いた後、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄し、再び１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで遠心操作を行いＰＢＳ（−）を取り除いた。その後、0.05%トリプシン／0.02%ＥＤＴＡで１０分間処理して単一細胞に分散させた後、ＰＢＳ（−）による洗浄を三回行いトリプシン／ＥＤＴＡを取り除き、ＥＧＦ（和光純薬）が２０ｎｇ／ｍＬの濃度になるように加えられた幹細胞培養用培地(A)１ｍｌに細胞を懸濁した。細胞懸濁液の細胞密度をコールターカウンターＺ1（ベックマンコールター社製）を用いて計測した。

細胞数を計測した後、１０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＥＧＦ（和光純薬）が２０ｎｇ／ｍＬの濃度になるように加えられた幹細胞培養用培地(A)を用いて幹細胞用浮遊培養用容器中で希釈した。この幹細胞を含む細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌノントリートメントプレート（ＦＡＬＣＯＮ）に１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し一晩３７℃ ５％ＣＯ_２の環境下で一晩培養した。

その後、培地上清を取り除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄したのち、幹細胞培養用培地(A)で１回洗浄を行い、ノンコートプラスチックプレートに付着していない細胞を取り除き結膜幹細胞のみを単離した。

幹細胞培養用培地(A)で付着細胞を培養し、発現蛋白、増殖能、組織形成能を評価した。

その結果、結膜由来の播種細胞中、0.6%が付着し、そのうち27%の細胞がコロニーを形成し、細胞の形態は上皮様であった（図７）。
引き続き、細胞の同定のために発現蛋白質を解析した。結膜上皮特異的サイトケラチンパターンである、ＣＫ４、およびＣＫ１３の蛋白質発現を確認するために、ｍｏｕｓｅａｎｔｉ-ｈｕｍａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ４（ＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）および、ｍｏｕｓｅａｎｔｉ−ｈｕｍａｎｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１３（ＡｍｅｒｉｃａｎＲｅｓｅｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ）からなる抗体を使用して免疫染色を行い、これを二次抗体であるＡｌｅｘａ，Ｆｌｕｏｒ４８８ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で反応させた。また未分化細胞マーカー蛋白質であるＮｅｓｔｉｎをｍｏｕｓｅａｎｔｉ−Ｎｅｓｔｉｎ（ＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色し、二次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧで検出した。その結果、上皮様形態を持つこれらの細胞コロニーは、結膜上皮特異的サイトケラチンパターンＣＫ４、およびＣＫ１３を発現しており、結膜上皮細胞であることが示された。また未分化細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎが陽性であった。
一方、角膜上皮特異的マーカーであるＣＫ３とＣＫ１２は陰性であった。また、BrdU 法によりコロニーを形成する細胞は増殖能を有することがわかった（図８）。
なお、コロニーはP2まで継代可能であり、自己複製能を有していることがわかった。

さらに培養すると、単一細胞由来のコロニー中央部に無構造分泌物が見られた。この細胞コロニーはゴブレット細胞特異的マーカーであるMUC5AC陽性であった。そして、コロニー断面をPAS染色したところ、PAS陽性（ムチン産生）であり、ゴブレット細胞に分化していることがわかった（図９）。なお、MUC5ACは配列番号１および２のプライマーを使用したRT-PCRによって発現を調べた。

単一細胞由来コロニーをEDTAでシート状に剥離後、6-well transwell上で3T3 feeder cellや血清が存在しない環境で、5-6層の結膜シートを作製した。
細胞コロニーによって組織形成能に差があり、強弱3つのタイプに分類できたが、写真は最も組織形成能が高かったものを示す（図１０）。

以上より、ヒト結膜上皮の幹細胞やtransient amplifying cellを含む未分化細胞を採取し、単一細胞由来の３次元結膜上皮細胞シートを無血清、feeder Cell-free培地で作製できた。

（口腔粘膜上皮幹細胞の単離と細胞シートの作製）
抜歯の際に不要となった口腔粘膜上皮組織を提供者の同意を得た後入手した。口腔粘膜上皮組織はＤＭＥＭ/Ｆ１２（ＳＩＧＭＡ）中に１．２Ｕ／ｍｌとなるようＤｉｓｐａｓｅII（Ｒｏｃｈｅ）を添加した組織溶解溶液に４℃で４時間以上酵素処理を行った。その後ピンセットで口腔粘膜上皮組織より、上皮細胞層だけを用手的に剥離し、住友ベークライト社製遠心管ＳＴＥＭＦＵＬＬ中に回収した。

ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄し、１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで遠心操作を行いＰＢＳ（−）を取り除いた。その後、0.05%トリプシン／0.02%ＥＤＴＡで１０分間処理して単一細胞に分散させた後、ＰＢＳ（−）による洗浄を三回行いトリプシン／ＥＤＴＡを取り除き、増殖因子を加えていない幹細胞培養用培地(A)１ｍｌに細胞を懸濁した。細胞懸濁液の細胞密度をコールターカウンターＺ1（ベックマンコールター社製）を用いて計測した。

細胞数を計測した後、１０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように幹細胞培養用培地(A)を用いて幹細胞用浮遊培養用容器中で希釈した。この幹細胞を含む細胞懸濁液をＦＡＬＣＯＮ、２４ｗｅｌｌノントリートメントプレートに１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し一晩３７℃５％ＣＯ_２の環境下で一晩培養した。

その後、培地上清を取り除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄したのち、幹細胞培養用培地（A）で１回洗浄を行い、ノンコートプラスチックプレートに付着していない細胞を取り除き口腔粘膜上皮幹細胞のみを単離した。

幹細胞培養用培地（A）で付着細胞を培養し、単離した細胞のコロニー形成能、およびＦＧＦ−２の刺激による分泌物産生の評価を行った。

２０ｎｇ／ｍＬの濃度になるようＥＧＦ（和光純薬）を添加した幹細胞培養用培地(A)で培養を続けたところ図１１（Ａ）で示される上皮様コロニーを得た。また４０ｎｇ／ｍＬの濃度になるようＦＧＦ−２（和光純薬）を添加した幹細胞培養用培地(A)で培養を続けたところ図１１（Ｂ）で示される分泌物を放出するゴブレット細胞様コロニーを得た。

次に幹細胞培養用培地(A)を用いた口腔粘膜上皮シートの作成を試みた。羊膜は実施例５に記載と同様の方法で入手、調製した。

口腔粘膜上皮組織より、コラゲナーゼとトリプシンを用いて採取した口腔粘膜上皮細胞を、２０ｎｇ／ｍＬの濃度になるようＥＧＦ（和光純薬）を添加した幹細胞培養用培地(A)に懸濁した。羊膜基質に１０万個／ｗｅｌｌの細胞密度で口腔粘膜上皮細胞を播種した。その後、２−３日に一度の培地交換を行いながら、３週間培養を続け、口腔粘膜上皮シートを作成した。図１１（Ｃ）にその実施例を示す。

（高付着皮膚上皮細胞コロニーの単離）
形成外科手術の際に不要となった皮膚を提供者の同意を得た後入手した。皮膚組織をＤＭＥＭ/Ｆ１２（ＳＩＧＭＡ）中に１．２Ｕ／ｍｌとなるようＤｉｓｐａｓｅII（Ｒｏｃｈｅ）を添加した組織溶解溶液に４℃で４時間以上酵素処理を行った。その後皮膚組織より、表皮細胞層だけをピンセットで用手的に剥離し、住友ベークライト社製遠心管ＳＴＥＭＦＵＬＬ中に回収した。

ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄し、１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで遠心操作を行いＰＢＳ（−）を取り除いた。その後、0.05%トリプシン／0.02%ＥＤＴＡで１０分間処理して単一細胞に分散させた後、ＰＢＳ（−）による洗浄を三回行いトリプシン／ＥＤＴＡを取り除き、２０ｎｇ／ｍＬ濃度になるようＥＧＦを添加した幹細胞培養用培地(A)１ｍｌに細胞を懸濁した。細胞懸濁液の細胞密度をコールターカウンターＺ1（ベックマンコールター社製）を用いて計測した。細胞数を計測した後、１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように幹細胞培養用培地(A)を用いて希釈した。

この細胞懸濁液をＶａｌｍａｒｋ、ノントリートメント６０ｍｍペトリデイッシュに２５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種し一晩３７℃５％ＣＯ_２の環境下で一晩培養した。その後、培地上清を取り除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄したのち、幹細胞培養用培地(A)で１回洗浄を行い、ノンコートプラスチックデイッシュに付着していない細胞を取り除き上皮幹細胞で見られる高付着能細胞のみを単離した。２０ｎｇ／ｍＬの濃度になるようＥＧＦ（和光純薬）を添加した幹細胞培養用培地(A)で培養を続けたところ図１２Ａで示される上皮様コロニーを得た。
実施例５と同様の方法で調製されたコーニング社製ＴｒａｎｓＷｅｌｌ６ｗｅｌｌＰｌｅａｔｅに貼り付けた羊膜基質上に皮膚上皮細胞を１０万個ずつ播種し、その後、２−３日に一度の培地交換を行いながら、３７℃ ５％ＣＯ_２の環境下で３週間培養を続け、細胞シートを作成した（図１２Ｂ）。
１０％ホルマリンで固定しパラフィンで包埋を行なった後にヘマトキシリン・エオジン染色法にて細胞シート断面の評価を行なった。細胞シートは重層化しており、基底層を有し表面が角化様の細胞シートを確認した。細胞シートの組織評価のため皮膚上皮特異的ケラチンパターンであるサイトケラチン１（ＣＫ１）ＡＥ１(ＰＲＯＧＥＮＢｉｏｔｅｃｈｎｉｋＧｍｂＨ)−サイトケラチン１０（ＣＫ１０）ＶＩＫ−１０（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｉｎｃ）を用いて免疫染色を行なった。二次染色はＡｌｅｘａ，Ｆｌｕｏｒ４８８ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で反応させた。その結果、皮膚上皮細胞から作成された細胞シートは皮膚上皮特異的サイトケラチンパターンＣＫ１、およびＣＫ１０を発現しており、皮膚上皮細胞シートであることが示された（図１２Ｃ、Ｄ）。

本発明の方法を用いることにより、組織から細胞、特に幹細胞を容易に効率良く単離することができる。従来は細胞の培養に付着を促す培養表面プラズマ処理などの表面処理や細胞外基質の塗布が必要であったが、幹細胞自身に細胞外基質を生産させ分泌させることができるため、不要であり、表面処理や塗布された細胞外基質による細胞への影響を排除することができる。さらに本発明の細胞培養に用いる無血清培地は動物由来未知因子が含まれていないため、未知の病原体の排除に効果があるのみならず再現性が高く明確な実験、試験結果を得ることができる。
本発明によって調製することが出来る幹細胞は産業上大きな利用可能性を持っている。本発明によって得られた幹細胞は、その一個の細胞から数百万の細胞で構成された組織を作成することが可能である。このような大量の細胞を供給する幹細胞を狙って感染するウィルスが存在する可能性は十分ある。それがウィルスにとって自身のDNAまたはRNAを感染、増殖させるのに最も良い方法であると考えられる。そのためウィルスの中には幹細胞を見分けて感染する機構を持つものが存在する可能性がある。また幹細胞自身にとっても自身へのウィルス感染は重大な脅威となりえる。そのため感染に対する防御機構を保持して
いると予想される。また幹細胞自身の機能異常による疾病も多く存在すると考えられる。しかしこれらは現在人類の知見の手には届いていない。現在まで幹細胞を無血清で容易に単離する手段が存在しなかったためである。しかし、本発明によってその知見はいつでも手に入れられる。本発明は感染症や癌に対する医薬品の開発などに用いる研究用試薬や試料の調製法として非常に大きな価値があると考えられる。
また上皮系幹細胞は特定増殖因子の刺激により、ムチンを活発に分泌し、または特定の細胞外基質を大量に分泌する。これらの代謝経路を幹細胞が保持していることが予想され、これらの代謝経路を明らかにすることは、酵母による組替え体を産業利用する上で収量効率化に大きな効果を及ぼすと考えられる。
また、本発明の培地は血清を用いた場合と比較して細胞の増殖能が優れており、適切な増殖因子の存在下で幹細胞が組織や他細胞へ分化する能力を発揮したまま培養できる。増殖因子の添加のみで細胞の分化を完全に制御できて生体組織を形成させることができる。これら形成された生体組織は血清を用いた場合と比較して未知の感染症の可能性が排除でき、例えば難治性角膜上皮障害を治療するためなどの再生医療に用いることが可能である。

Claims

動物由来の組織を細胞に解離させる工程、培養表面が表面処理されていない培養容器又は培養用担体に該細胞を播種してインキュベートする工程、および該培養容器又は該培養用担体の培養表面に付着した細胞を選択する工程を含む単離方法によって角膜上皮幹細胞、結膜上皮幹細胞、口腔粘膜上皮幹細胞および皮膚上皮幹細胞から選択される幹細胞を組織から単離する工程、および単離された前記幹細胞をインシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、血清アルブミン、リノール酸、リノレイン酸、レチノール、およびα−トコフェロールを含む無血清培地で培養する工程を含む、前記幹細胞の培養方法。
血清アルブミンがヒト血清アルブミンである請求項１に記載の前記幹細胞の培養方法。
ヒト血清アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項２に記載の前記幹細胞の培養方法。
無血清培地が、EGF、FGF-2およびFGF-7から選択される分化刺激物を含む請求項１〜３の
いずれかに記載の前記幹細胞の培養方法。
動物由来の組織を細胞に解離させる工程、培養表面が表面処理されていない培養容器又は培養用担体に該細胞を播種してインキュベートする工程、および該培養容器又は該培養用担体の培養表面に付着した細胞を選択する工程を含む単離方法によって角膜上皮幹細胞、結膜上皮幹細胞、口腔粘膜上皮幹細胞および皮膚上皮幹細胞から選択される幹細胞を組織から単離する工程、および単離した前記幹細胞をインシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、血清アルブミン、リノール酸、リノレイン酸、レチノール、およびα−トコフェロールを含む無血清培地で培養する工程を含む、前記幹細
胞のコロニーの製造方法。
動物由来の組織を細胞に解離させる工程、培養表面が表面処理されていない培養容器又は培養用担体に該細胞を播種してインキュベートする工程、および該培養容器又は該培養用担体の培養表面に付着した細胞を選択する工程を含む単離方法によって、角膜上皮幹細胞、結膜上皮幹細胞、口腔粘膜上皮幹細胞および皮膚上皮幹細胞から選択される幹細胞を組織から単離する工程、および単離した前記幹細胞をインシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、血清アルブミン、リノール酸、リノレイン酸、レチノール、およびα−トコフェロールを含む無血清培地で培養する工程を含む、角膜上皮細胞シート、結膜上皮細胞シート、口腔粘膜上皮細胞シートおよび皮膚上皮細胞シートから選択される細胞シートの製造方法。
細胞シートが重層化された前記上皮細胞シートである請求項６に記載の前記細胞シートの製造方法。
インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、血清アルブミン、リノール酸、リノレイン酸、レチノール、およびα−トコフェロールを含み、血清を含まない、角膜上皮肝細胞、結膜上皮幹細胞、口腔粘膜上皮幹細胞および皮膚上皮幹細胞から選択される幹細胞培養用培地。
血清アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項８に記載の前記幹細胞培養用培地。
ヒト血清アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項９に記載の前記幹細胞培養用培地。
EGF、FGF-2およびFGF-7から選択される分化刺激物をさらに含む、請求項８〜１０のいず
れかに記載の前記幹細胞培養用培地。