CN109312301B

CN109312301B - 用于制备培养上皮细胞片的方法

Info

Publication number: CN109312301B
Application number: CN201780037143.1A
Authority: CN
Inventors: 中村隆宏; 木下茂; 橫尾诚一; 山上聪
Original assignee: Kyoto Prefectural Public Univ Corp; Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Current assignee: Kyoto Prefectural Public Univ Corp; Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2037-04-19
Also published as: EP3447126A1; US11479754B2; KR102311121B1; JP7024974B2; CN109312301A; JPWO2017183655A1; WO2017183655A1; US20190169571A1; EP3447126A4; SG11201809235QA; KR20180135015A

Abstract

一种用于制备上皮细胞片的方法，所述方法包括在无血清培养基中底物上培养来自口腔粘膜上皮细胞的细胞的步骤，其中所述无血清培养基包含：(i)EGF蛋白或KGF蛋白；(ii)B‑27补充剂；和(iii)ROCK抑制剂。

Description

用于制备培养上皮细胞片的方法

技术领域

本发明主要涉及用于制备培养上皮细胞片的方法。

背景技术

已经报道了用于制备用于角膜再生医学的培养的上皮片(培养的口腔粘膜上皮细胞片(COMECS))的方法(专利文献1和非专利文献1至3)。通过该方法获得的培养上皮片用于治疗难治性角膜结膜疾病，并具有良好的治疗效果。在日本，自体培养的口腔粘膜上皮片移植(COMET)正在作为高级医学治疗进行。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开号WO2006/003818

非专利文献

非专利文献1:Nakamura T,Endo K,Cooper LJ等，InvestigativeOphthalmology&Visual Science,2003年；44:106-116。

非专利文献2:Nakamura T,Inatomi T,Sotozono C等，The British Journal ofOphthalmology,2004年；88:1280-1284。

非专利文献3:Nakamura T,Takeda K,Inatomi T等，The British Journal ofOphthalmology,2011；95:942-946。

发明内容

要解决的技术问题

用于制备培养上皮的常规已知方法需要使用来自小鼠和胎牛血清的3T3饲养细胞。然而，从安全性和伦理角度的考虑来看，必须从培养系统中去除异种材料。因此，本发明人试图开发不需要使用饲养细胞或血清的培养方法(培养技术)。

解决问题的方案

本发明人进行了广泛的研究以解决上述问题，并且令人惊讶地发现，通过使用包含(i)EGF蛋白或KGF蛋白、(ii)B-27补充剂、和(iii)ROCK抑制剂的无血清培养基可以解决该问题。通过基于该发现的进一步进行的研究，完成了本发明。

具体地，本发明包括以下实施方案。

项目1.一种用于制备上皮细胞片的方法，所述方法包括在无血清培养基中底物上培养来自口腔粘膜上皮细胞的细胞，

其中所述无血清培养基包含：

(i)EGF蛋白或KGF蛋白，

(ii)B-27补充剂，和

(iii)ROCK抑制剂。

项目2.根据项目1所述的方法，其中，所述培养基还包含选自由(iv)多糖类、(v)儿茶素类、(vi)类皮质激素组成的组中的至少一种。

项目3.一种上皮细胞片，所述上皮细胞片是通过项目1或2所述的方法获得的。

项目4.一种用于使用来自口腔粘膜上皮细胞的细胞来制备上皮细胞片的无血清培养基，所述培养基包含：

(i)EGF蛋白或KGF蛋白，

(ii)B-27补充剂，和

(iii)ROCK抑制剂。

发明的有益效果

本发明提供了不需要使用饲养细胞或血清的培养方法。由本发明提供的培养上皮片在用于治疗难治性角膜结膜疾病上具有优异性能。因此，本发明可以进一步改善难治性角膜结膜疾病的治疗技术。

附图说明

图1示出了相差显微镜图像和培养的口腔粘膜上皮细胞片(COMECS)的组织学检查结果。(A-C)：培养第7天的相差显微镜图像；(D-F)：用苏木精和曙红(HE)染色的COMECS横截面的明视野显微镜图像(星号表示去除上皮的羊膜)；和(G-I)：培养条件的示意图。条：100μm。

图2示出了集群(colony)形成效率的评价结果。(A-D)：对照和FFSF培养中口腔粘膜上皮细胞的集群形成板的典型实例和相差显微镜图像。(E)：集群形成效率的测量结果。(F)：细胞数的测量结果。

图3示出了对照COMECS和FFSF COMECS的形态学和细胞生物学特征。(A-F)：透射电子显微镜图像；和(G-V)：抗体染色图像。细胞核用碘化丙啶(PI)染色。条：50微米。

图4示出了FFSF COMECS中角膜特异性标记物表达的分析结果。(A)：PCR结果；(B-F)：K12的抗体染色结果、与碘化丙啶(PI)的共染色。(B)：体内人口腔粘膜上皮(人口腔粘膜(HO))；(C)：体内人角膜上皮(人角膜(HC))；(D)：对照COMECS；(E)：培养的角膜上皮细胞片；(F)：FFSF COMECS。条：50微米。

图5示出了克隆分析的结果。(A)：全克隆(Holoclone)型的初始克隆(Originalclone)；(B)：部分克隆(Meroclone)型的初始克隆；(C)：亚克隆(Paraclone)型的初始克隆。(D)：全克隆型指示剂皿；(E)：部分克隆型指示剂皿；(F)：亚克隆型指示剂皿。(G)：全克隆型的p75的免疫染色；(H)：部分克隆型的p75的免疫染色；(I)：亚克隆型的p75的免疫染色。

图6示出COMEC的异种移植结果。(A，D)：有/无荧光素处理的移植前兔眼的裂隙灯照片；(B，E)：有/无荧光素处理的移植后第7天兔眼的裂隙灯照片；(C，F)：有/无荧光素处理的的移植后第14天兔眼的裂隙灯照片。(G)：在移植区域用抗人核抗体染色。(H，I)：HE染色。针对(J)桥粒斑蛋白(desmoplakin)、(K)胶原蛋白7(Collagen7)、(L)角蛋白3(K3)、(M)角蛋白12(K12)、(N)Ki76和(O)p76的抗体染色。核与碘化丙啶共染色。条：100μm。

图7示出了通过主组分分析(PCA)的FFSF COMECS的基因表达谱图。

图8示出了图3G-V的黑白反转图像。图8分别示出了抗体染色图像(标记物)和核染色图像(碘化丙啶(PI))。

图9示出了图4B-F的黑白反转图像。图9分别示出了K12的抗体染色图像和核染色图像(碘化丙啶(PI))。

图10示出了图5G-I的黑白反转图像。图10分别示出了p75的抗体染色图像和核染色图像(碘化丙啶(PI))。

图11示出了图6G的黑白反转图像。

图12示出了图6J-O的黑白反转图像。图12分别示出抗体染色图像(标记物)和核染色图像(碘化丙啶(PI))。

具体实施方式

本发明的无血清培养基包含：

(i)EGF蛋白或KGF蛋白，

(ii)B-27补充剂，和

(iii)ROCK抑制剂。

作为本发明中使用的无血清培养基的基础培养基，可以使用已知的无血清培养基，特别是用于培养干细胞的无血清培养基。具体实例包括：最低必需培养基(MinimumEssential Medium，MEM)、杜尔贝科改良鹰培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium，DMEM)、汉姆F12培养基(Ham’s F12 medium)、基础培养基鹰(Basal Medium Eagle，BME)、伊斯科夫改良杜尔贝科培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium，IMDM)、罗斯威尔公园纪念学院培养基(Roswell Park Memorial Institute medium，RPMI)、限定的角质细胞无血清培养基(efined Keratinocyte Serum Free Medium，限定的角质细胞-SFM)等、及其混合物。

是生长因子的EGF(上皮生长因子)蛋白和KGF(角质细胞生长因子)蛋白都是已知的蛋白质。从避免使用异基因材料的角度考虑，EGF蛋白或KGF蛋白优选来自人。作为EGF蛋白或KGF蛋白，可以使用重组蛋白。

在最终浓度中，EGF(上皮生长因子)蛋白或KGF(角质细胞生长因子)蛋白的量可以是约1至100ng/ml，优选约2至50ng/ml，更优选约5至20ng/ml。

B-27(商标)补充剂是已知的无血清补充剂，并且可以使用市售产品。例如，作为其应用，B-27补充剂已知添加到用于培养和维持神经细胞的培养基中。B-27补充剂包含生物素、左旋肉碱、皮质酮、乙醇胺、D(+)半乳糖、还原型谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、乙酸视黄酯、硒、三碘-L-甲状腺原氨酸、维生素E、维生素E乙酸酯、牛白蛋白、过氧化氢酶、胰岛素、超氧化物歧化酶和转铁蛋白。

在最终浓度中，B-27(商标)补充剂的量可以为约0.2至20％(w/v)、优选约0.5至10％(w/v)、更优选约1至5％(w/v)。

ROCK抑制剂没有特别限制，只要它是特异性抑制Rho相关激酶(ROCK)的功能的化合物即可。实例包括Y27632((R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己甲酰胺)、Y39983((R)-(+)-N-(4-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-基)-4-(1-氨基乙基)-苯甲酰胺)、法舒地尔盐酸盐(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪盐酸盐)等。

在最终浓度中，ROCK抑制剂的量可以为约1至100μM/L、优选约2至50μM/L、更优选约5至20μM/L。

本发明的无血清培养基可以进一步包含一种或多种儿茶素类。儿茶素类的实例包括儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯等。其中，表没食子儿茶素没食子酸酯是优选的。在最终浓度中，儿茶素类的量可以为约0.5至100mg/ml、优选约1至50mg/ml、更优选约2至20mg/ml。

本发明的无血清培养基可以进一步包含一种或多种多糖类。多糖的实例包括葡聚糖、纤维素、甘露聚糖、淀粉、琼脂糖等。其中，葡聚糖(例如，平均分子量为约40000的葡聚糖40)是优选的。在最终浓度中，多糖的量可以为约0.1至20％(w/v)、优选约0.2至10％(w/v)、和约0.5至5％(w/v)。

本发明的无血清培养基可以进一步包含一种或多种类皮质激素。类皮质激素的实例包括可的松、氢化可的松、皮质酮等。其中，氢化可的松是优选的。在最终浓度中，类皮质激素的量可以为约0.01至5％(w/v)、优选约0.05至2％(w/v)、和约0.1至1％(w/v)。

本发明的无血清培养基可包含除上述组分之外的任何组分。此类组分的实例包括通常用于干细胞培养基中的那些，例如缓冲液、无机盐、抗生素(例如，以下中的一种或多种：青霉素、卡那霉素、链霉素等)。

在本说明书中，“％(w/v)”表示重量/体积百分比，“％(v/v)”表示体积/体积百分比。

除了使用上述无血清培养基之外，本发明的上皮细胞片可以用与用于制备用在COMET中的上皮片的已知方法相同的方式制备。具体地，用于制备本发明的上皮细胞片的方法包括在本发明的无血清培养基中底物上培养自口腔粘膜上皮细胞的细胞。

在本发明的方法中，在“饲养细胞”的存在下不进行培养。此外，在培养基中不添加蛋白质组分，例如血清组分。

来自口腔粘膜上皮的细胞是可以从例如口腔内边缘粘膜上皮部分、唇部、腭部和颊部的细胞获得的细胞。优选地，来自口腔粘膜上皮的细胞包括口腔粘膜上皮干细胞和/或口腔粘膜上皮祖细胞。

来自口腔粘膜上皮的细胞可以是来自待移植入上皮细胞片的受试者的细胞(自体细胞)或来自其他个体的细胞(同种异体细胞)。从减少排斥的角度考虑，自体细胞是优选的。

为了去除结缔组织等杂质，来自口腔粘膜上皮的细胞优选经受酶(如分散酶或胰蛋白酶)处理、过滤处理等。

底物没有特别限制，只要其是可以是上皮细胞片的基质的底物即可。作为底物，可以使用包含胶原蛋白作为主要组分的膜。在优选的实施方案中，基底膜是羊膜或去除上皮的羊膜。去除上皮的羊膜是已知的，并且可以根据例如以下文献制备：Koizumi N等，InvestOphthalmol Vis Sci.2000年8月；41(9)：2506-13。

通过在底物上培养来自口腔粘膜上皮的细胞，在底物上形成上皮细胞片。优选的是，将来自口腔粘膜上皮的细胞接种在底物上，使得例如细胞密度为约1×10³个细胞/cm²或更大、优选约1×10³个细胞/cm²至1×10⁷个细胞/cm²或更大、更优选约1×10⁴个细胞/cm²至1×10⁶个细胞/cm²。

例如，通过本领域技术人员已知的技术，可以使用上述无血清培养基进行培养。进行培养的技术的优选实例是，但不限于，在约37℃、二氧化碳浓度为约5-10％(v/v)下进行培养的技术。在这种条件下的培养可以通过使用例如已知的CO₂培养箱进行。

培养期可以是例如约7天至3周。

为了获得由分层的细胞层组成的上皮细胞片，本发明的培养方法优选包括将细胞层的最上表面暂时暴露于培养基的外部。细胞层的最上表面可以通过例如暂时去除培养基的一部分或者将细胞层与基底膜一起提升而暂时暴露于培养基的外部。使细胞层的最上表面与空气接触的持续时间可以是例如约3天至2周、优选在1周内、更优选在3天内。

通过本发明的培养方法获得的上皮细胞片可以用作患有难治性角膜结膜疾病的患者的移植材料。难治性角膜结膜疾病的实例包括角膜上皮干细胞变得不可逆地功能失调或丧失的疾病，例如史蒂文斯-约翰逊(Stevens-Johnson syndrome)综合征、眼类天疱疮和碱蚀。

移植方法的具体实例如下。首先，在患有角膜结膜疾病的患者的角膜缘中切开瘢痕组织。随后，去除侵入角膜的瘢痕结膜组织，并暴露角膜基质。此后，在角膜缘稍内侧的部分缝合角膜上皮片。该方法类似于COMET，其具有良好的治疗结果，并且预期该过程以高度稳定的方式进行。

在通过本发明的培养方法获得的上皮细胞片中，如后面描述的“实施例”中所示，可以检测上皮干细胞标记物(例如，p75神经营养因子受体：p75NTR，CD271)和增殖细胞标记物(例如，Ki76)的表达；因此，可以认为存在维持作为干细胞的特性的细胞。还可以检测角膜上皮细胞标记物(例如，角蛋白12和角蛋白3)的表达。此外，与已知的上皮细胞片相比，基因表达模式与角膜上皮细胞中的基因表达模式具有高度的相似性。对于具有难治性角膜结膜疾病的患者，通过本发明的培养方法获得的具有这些特征的上皮细胞片作为移植材料非常有用。

实施例

下面结合实施例更详细地描述本发明；然而，本发明不限于这些实施例。

1.细胞片的制备

〈材料〉

口腔组织来自志愿者供体和经历口腔外科手术的患者的剩余组织。收集后1至2小时内处理所有样品。

〈培养〉

根据已知方法培养口腔粘膜上皮细胞(非专利文献1至3)。

简而言之，在局部麻醉下进行小的口腔粘膜活检。将获得的口腔粘膜组织在4℃下用1.2IU分散酶温育5小时，然后用0.05％(w/v)胰蛋白酶-EDTA溶液处理10分钟以分离上皮细胞。

将获得的口腔粘膜上皮细胞(1-2×10⁵个细胞/ml)接种在铺展在培养插件(culture insert)上的去除上皮的羊膜(AM)(羊膜胶原片)上。

根据本发明的FFSF(无饲养层和无血清)系统的培养基的组成如下所述。

FFSF(无饲养层和无血清)

■培养基

用于干细胞的培养基

■添加组分

重组人EGF(10ng/ml)(Life Technologies)

Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y-27632(1μl/ml)(Abcam Plc.，Cambridge，MA)

B27(2％(w/v))(Life Technologies)

氢化可的松(1μl/ml)(Lonza)

(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(10ng/ml)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)

右旋糖酐40(1％(w/v))(Tokyo Kasei Kougyou，Tokyo)

青霉素-链霉素(50IU/ml)(Life Technologies)

作为对照，使用以下组合物进行培养。

对照1(KSFM)

■培养基

用于干细胞的培养基：定义的K-SFM(Life Technologies)

■添加组分

添加的伴随补充剂

对照2(KGM+3T3(对照))

■培养基

角质细胞生长介质(KGM：ArBlast Co.,Ltd.,Kobe,Japan)

■添加成分

5％(w/v)FBS(Fetal bovine serum，胎牛血清)(Hyclone,Tauranga,NewZealand)

■饲养细胞(共培养)

NTH-3T3成纤维细胞(基于丝裂霉素C(MMC)的灭火处理已经完成)

图1示出了培养结果(图1A-F)及培养模式的示意图(图1G-I)。

在相差显微镜图像中，观测到在所有培养条件下培养开始后3天内在去除上皮的羊膜(denuded amniotic AM)上形成集群。在培养开始后第7天，形成覆盖整个AM的口腔粘膜上皮细胞的汇合原代培养物(图1A-C)。然而，细胞的形态在KSFM和对照之间以及在KSFM和FFSF之间明显不同。在对照和FFSF条件下，口腔粘膜上皮细胞呈现鹅卵石样形态(图1B、图C)。另一方面，在KSFM条件下，主要观测到伸长和膨胀变大的细胞(图1A)。

培养2周后，在对照和FFSF条件下，观测到包含4至5层的分层结构，分化充分进行(图1E，F)，并观测到与角膜上皮相似的形态。另一方面，仅在KSFM条件下观测到单层结构(图1D)。

上述结果证明了本发明的FFSF(无饲养层和无血清)COMECS的可能性，其可获得分层细胞片。

2.集群形成效率

关于构成所获得的上皮细胞片的细胞，评价集群形成效率(CFE)。

具体地，将在实施例1的对照和FFSF培养条件下获得的细胞(2×10³)接种在6孔板(N＝4)上。在培养的第7天，收集细胞，固定并用0.1％(w/v)的甲苯胺蓝(truidine blue)染色。由三位研究人员独立地对细胞的数量计数，并确定获得的数据的平均值。

图2示出了结果。在相差显微镜观测中，在培养的第7天观测到卵形和圆形细胞(图2A-D)。CFE倾向于在FFSF细胞中高于对照(21.2±5.5％vs 17.15±5.9％，N＝4)(图2E)。此外，测量了使用来自相同供体的细胞情况下的细胞总数，可以发现FFSF中的细胞总数大于对照中的细胞总数(10.5±2.1×10⁵vs 7.5±1.4×10⁵，p<0.1，N＝4)(图2F)。

上述结果表明，本发明的方法(FFSF培养系统)能够使人口腔粘膜上皮细胞的增殖能力维持在至少与使用常规方法的情况相似或更优的水平。

3.透射电子显微镜观测

使用透射电子显微镜，观测所获得的上皮细胞片的形态。

图3A-F示出了结果。在对照和FFSF COMECS中，细胞是健康的，并且证实分化成圆柱状基底层细胞(basal columnar cells)、基底层上立方翼细胞(suprabasal cuboidwing cells)和表在性扁平细胞(flat squamous superficial cells)(图3A-D)。在所有细胞层中，口腔粘膜上皮细胞通过许多桥粒(desmosomes)与相邻细胞紧密连接(图3E，F)。

4.抗体染色

对获得的上皮细胞片进行各种标记物的抗体染色。

图3G-V示出了用碘化丙啶共染色的结果(核染色)。在对照和FFSF COMECS中，证实了：ZO-1，其是位于顶端细胞中的一种紧密连接相关因子(图3G，H；箭头)；桥粒斑蛋白，其是细胞-细胞粘附因子(图3I，J)；胶原蛋白7和层粘连蛋白5(图3K-N)，其在基底膜中是基底膜组成因子；口腔粘膜上皮特异性角蛋白13(K13)和角膜特异性角蛋白3(K3)(图3O-R)；Ki67，其是经历活性细胞增殖的细胞的标记物(图3S，T)；以及p75，其是口腔粘膜上皮干细胞/祖细胞标记物(图3U，V)。

因此，FFSF COMECS具有细胞连接、基底膜组成蛋白、分化能力、增殖能力和干细胞潜能，这被认为对于临床适应和应用是必要的。

5.基因表达分析

通过RT-PCR方法进行以下基因的表达分析。

表1

角蛋白12(K12)	角膜上皮细胞标记物
		角蛋白3(K3)	角膜上皮细胞标记物
ALDH3	角膜上皮细胞标记物
		TKT	角膜上皮细胞标记物
p75	干细胞/祖细胞标记物
		HPRT	管家基因(对照)

使用的引物如下。

表2

用于PCR的序列

F：正向 R：反向

图4A示出了结果。在角膜上皮标记物中，K12作为特异性标记物是高度可靠的。其他角膜上皮标记物包括K3、ALDH3和TKT。在FFSF COMECS中检测到K12的表达，而在对照COMECS中未检测到K12的表达。另一方面，在两者中都检测到作为角膜上皮标记物的K3、ALDH3和TKT，以及作为干细胞/祖细胞标记物的p75。

随后，通过抗体染色方法验证RT-PCR的结果。

图4B-E示出了结果。结果表明，人口腔粘膜上皮细胞(体内)和对照COMECS均未表达K12(图4B，C)，而在FFSF COMECS中观察到K12的局部表达和发散表达(图4F)。

FFSF COMECS中K12的表达模式可以与角膜上皮(体内)和通过常规方法(对照)获得的培养的角膜上皮细胞片中的表达模式不同(图4C，E)。

6.克隆分析

进行对通过本发明的方法获得的上皮细胞片的克隆分析。该分析按照以下文献进行：Barrandon Y，Green H.美利坚合众国国家科学院院刊(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America)，1987年；84：2302-2306。

图5示出了结果。全克隆的典型初始克隆很大，具有光滑的周界，并且主要包含小细胞。在平板上，全克隆形成大的、快速生长的集群，并且不超过5％的细胞最终分化(图5A，D)。亚克隆的典型初始克隆很小并且主要包含大的分化细胞。在平板上，亚克隆没有形成集群或形成均匀的小的最终集群(图5C，F)。部分克隆显示出介于全克隆和亚克隆之间的特性。在平板上，部分克隆形成了生长的集群和不生长的集群(图5B，E)。全克隆为23.6±12.5％，部分克隆为34.9±10.5％，亚克隆为41.5±11.3％。这表明在皮肤和眼表面中识别的全克隆型、部分克隆型和亚克隆型细胞构成FFSF COMECS的增殖室。

进行免疫组织化学分析以研究p75在这些克隆类型中的表达。结果表明，在全克隆型细胞的细胞膜中证实了p75的强表达(图5G)，在部分克隆型细胞的一些小细胞的细胞膜中证实了p75的中度表达(图5H)。证实了在亚克隆型细胞中很少有p75的表达(图5I)。

这些结果表明，通过本发明的方法可以获得含有高水平表达p75的全克隆型干细胞的COMECS。

7.COMECS的异种移植

根据以下文献将制备的上皮细胞片异种移植到白化兔(2至2.5kg)中：KobayashiM，Nakamura T，Yasuda M等，干细胞转化医学(Stemcells translational medicine)，2015；4：99-109。

图6示出了结果。

在手术之前，完全去除包括角膜缘区域的角膜上皮细胞(图6A)。荧光素染色证实角膜上皮细胞被完全去除(图6D)。

将本发明的人FFSF COMECS移植到角膜表面上并用10-0尼龙缝合线(N＝3)固定。在移植手术后第7天和再次在2周后，人FFSF COMECS被移植到其中的所有治疗的眼球的角膜表面被证实是透明和光滑的，没有过度的术后炎症(图6B，C)。荧光素染色证实整个角膜覆盖有异种COMECS(图6E，F)。

手术后第14天的组织学检查证实移植的COMECS与宿主组织良好连接，没有上皮下细胞浸润(图6H，I)。苏木精-伊红染色证实移植的COMECS含有良好分层的分化细胞(图6H，I)。用抗人核抗体染色证实了移植的人COMECS的存在(图6G)。

还检查了移植的COMECS中多种细胞标记物的表达模式。发现桥粒斑蛋白(Desmoplakin)在细胞膜中表达(图6J)，并且是基底膜组成蛋白的胶原蛋白7也发现被表达(图6K)。在所有移植的COMECS中清楚地表达角蛋白3(K3)，并且在移植区域中发散地表达角蛋白12(K12)(图6L，M)。证实了在移植的COMECS的基底层中的Ki67和p75的表达(图6N，O)。这些结果表明，移植的细胞在兔角膜表面保持增殖能力和作为干细胞/祖细胞的性能，并且制备的FFSF COMECS可以很好地应用于体内环境并且在手术后也保持良好的视觉功能。

8.基因表达状况分析

关于本发明的上皮细胞片(FFSF COMECS)、对照上皮细胞片(对照COMECS)、角膜上皮(体内HC)和口腔粘膜上皮(体内HO)，提取总RNA，制备cDNA，使用GeneChip Human GenomeU133 Plus 2.0(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行基因表达谱的分析。使用AffymetrixGeneChip操作软件(GCOS)1.0版进行阵列数据分析。

图7示出了主组分分析(PCA)映射的结果。结果表明，体内人角膜上皮的基因表达谱与体内人口腔粘膜上皮的基因表达谱完全不同。本发明的上皮细胞片(FFSF COMECS)和对照上皮细胞片(对照COMECS)的基因表达谱介于人角膜上皮和人口腔粘膜上皮之间。与对照COMECS的基因表达谱相比，FFSF COMECS的基因表达谱倾向于更接近人角膜上皮的基因表达谱。该结果表明，本发明的方法影响上皮细胞的完整性和特征。

序列表

<110> 京都府公立大学法人

<120> 用于制备培养上皮细胞片的方法

<130> P17-054WO

<150> JP 2016-084471

<151> 2016-04-20

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人K12 F

<400> 1

aatcatgggg cagatcttgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人K12 R

<400> 2

aaggtgatgg tttggaggaa 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人K3 F

<400> 3

ggcagagatc gagggtgtc 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人K3 R

<400> 4

gtcatccttc gcctgctgta g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人ALDH3 F

<400> 5

ttgcagagac atccagtggt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人ALDH3 R

<400> 6

ttggtctaga aaggggtgga 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TKT F

<400> 7

ctgcttcatc cggaccag 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TKT R

<400> 8

cacacttcat acccgcccta 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人p75 F

<400> 9

tgagtgctgc aaagcctgca a 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人p75 R

<400> 10

tctcatcctg gtagtagccg t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人β-肌动蛋白F

<400> 11

ggacttcgag caagagatgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人β-肌动蛋白R

<400> 12

atctgctgga aggtggacag 20

Claims

1.一种用于制备上皮细胞片的方法，所述上皮细胞片中存在表达上皮干细胞标记物p75、增殖细胞标记物Ki67和角膜上皮细胞标记物角蛋白12的细胞，所述方法包括在没有饲养细胞的用于培养干细胞的无血清培养基中底物上培养口腔粘膜上皮细胞，

其中所述无血清培养基包含:

（i）10 ng/ml的最终浓度的量的EGF蛋白，

（ii）1至5%w/v的最终浓度的量的B-27补充剂，

（iii）1 μl/ml的最终浓度的量的ROCK抑制剂Y-27632，

（iv）10 ng/ml的最终浓度的量的（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯，

（v）0.5至5%w/v的最终浓度的量的右旋糖苷，和

（vi）1 μl/ml的最终浓度的量的氢化可的松。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述无血清培养基是最低必需培养基、杜尔贝科改良鹰培养基、汉姆F12培养基、基础培养基鹰、伊斯科夫改良杜尔贝科培养基、罗斯威尔公园纪念学院培养基、限定的角质细胞无血清培养基、或其混合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述EGF蛋白是重组蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述口腔粘膜上皮细胞是自体细胞或同种异体细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，培养期为7天至3周。

6.一种使用口腔粘膜上皮细胞来制备上皮细胞片的无血清培养基，所述上皮细胞片中存在表达上皮干细胞标记物p75、增殖细胞标记物Ki67和角膜上皮细胞标记物角蛋白12的细胞，所述培养基包含：

（i）10 ng/ml的最终浓度的量的EGF蛋白，

（ii）1至5%w/v的最终浓度的量的B-27补充剂，

（iii）1 μl/ml的最终浓度的量的ROCK抑制剂Y-27632，

（v）0.5至5%w/v的最终浓度的量的右旋糖苷，和

（vi）1 μl/ml的最终浓度的量的氢化可的松；

其中，所述无血清培养基为用于培养干细胞的培养基，以及

所述制备是在没有饲养细胞的情况下进行的。

7.根据权利要求6所述的无血清培养基，其中，所述无血清培养基是最低必需培养基、杜尔贝科改良鹰培养基、汉姆F12培养基、基础培养基鹰、伊斯科夫改良杜尔贝科培养基、罗斯威尔公园纪念学院培养基、限定的角质细胞无血清培养基、或其混合物。

8.根据权利要求6所述的无血清培养基，其中，所述EGF蛋白是重组蛋白。

9.根据权利要求6所述的无血清培养基，其中，所述口腔粘膜上皮细胞是自体细胞或同种异体细胞。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的无血清培养基在使用口腔粘膜上皮细胞来生产上皮细胞片的用途，其中所述上皮细胞片中存在表达上皮干细胞标记物p75、增殖细胞标记物Ki67和角膜上皮细胞标记物角蛋白12的细胞。