KR101806001B1 - 각막 윤부 줄기 세포의 분리 방법 및 대량 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 각막 윤부 줄기 세포의 순수 분리 방법 및 대량 배양 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 각막 윤부 줄기 세포의 순수 분리 방법 및 대량 배양 방법은 각막 윤부 상피 세포로부터 분화 효율이 높은 각막 윤부 상피 줄기 세포를 효율적으로 순수 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 줄기 세포의 줄기세포능을 유지한 채로 in vitro 상에서 저렴한 방법으로 용이하게 각막 윤부 상피 줄기 세포의 대량 배양을 가능하게 하므로 인공 각막의 제조, 각막 재생, 또는 각막 손상의 치료법 등 다양한 분야에 실질적으로 상업화되어 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

각막 윤부 줄기 세포의 분리 방법 및 대량 배양 방법{Method for isolation and mass culture for limbal stem cells}
본 발명은 각막 윤부 상피 세포로부터 각막 윤부 줄기 세포의 순수 분리 방법 및 대량 배양하는 방법에 관한 것이다.
각막(cornea)은 눈의 표면에 존재하는 무혈관성 막으로서, 눈을 외부로부터 보호하고 빛을 통과 및 굴절시켜 사물을 볼 수 있게 해주는 중요한 안조직 중의 하나이다. 이러한 각막은 선천적인 유전적 각막 이상으로 또는 후천적으로 외상에 의해, 또는 감염, 염증, 변성 등에 의하여 손상되게 되면 시력 장애가 발생하게 되는데, 이러한 각막 손상에 대한 치료 방법으로는 타인의 각막을 이식 받는 방법 외에는 없다. 이러한 각막 이식의 경우에 각막을 기증받기도 어려울 뿐만 아니라, 각막을 기증 받아도 이식 받은 환자 중 30% 정도는 거부 반응을 나타내는 등 각막 이식 만으로는 많은 한계점을 가지고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 실제의 각막과 유사한 구조 및 기능을 가지는 인공 각막을 형성하여 이를 체내에 이식하고 손상된 각막을 재생하거나 대체하고자 하는 각막 재생 연구가 활발히 진행되어지고 있다(World J Stem Cells (2014) 6(4): 391-403).
대표적으로 각막 상피 세포 또는 구강 상피 세포를 이용한 세포 치료 등이 시도되고 있으나, 그 치료 효율이 현저히 낮을 뿐만 아니라 각막 손상의 재발율이 매우 높다는 한계점들을 가지고 있다. 따라서 줄기세포를 이용하여 각막을 재생하고자 하는 연구들이 최근 많이 진행되고 있으나, 아직까지 실질적으로 각막 재생 또는 각막 손상의 치료법으로 상업화되어 사용될 수 있을 정도로 순수 분리된 줄기 세포를 대량 증식시킬 수 있는 방법은 부족한 실정이다.
이와 같이, 각막 재생에 사용될 수 있는 줄기 세포의 순수 분리 방법 및 대량 배양 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 이중 마커를 이용하여 강한 줄기세포능을 가지는 각막 줄기 세포를 순수 분리하고, 이를 생체 외(in vitro)에서 대량 배양할 수 있는 방법을 제공하여 실질적으로 상업화가 가능한 각막 재생 및/또는 각막 손상의 치료법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 명세서에 있어서, "각막 윤부 상피 줄기 세포(limbal epithelial stem cells)"란 모든 세포 유형으로 분화될 수 있는 잠재력을 가지는 미분화 또는 실질적인 미분화 세포를 포괄적으로 포함하는 의미로서 각막을 이루는 세포 중의 하나로 분화할 수 있다면 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 p63a, ABCG2, integrin a9, ABCB5 등의 각막 윤부 상피 줄기 세포의 마커를 가지고 있는 세포를 의미한다.
본 발명은 a) 각막 윤부 상피 세포(corneal limbal epithelial cells)를 획득하는 단계; b) 상기 각막 윤부 상피 세포를 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)이 코팅되어 있는 플레이트에서 배양하는 단계; c) 상기 배양된 각막 윤부 상피 세포 중 과다 증식하는 각막 윤부 상피 줄기 세포(limbal epithelial stem cells)를 분리하는 단계; 및 d) 상기 각막 윤부 상피 줄기 세포 중 각막 윤부 상피 줄기 세포 마커를 이용하여 분화 효율이 높은 줄기 세포를 순수 분리하는 단계를 포함하는, 각막 윤부 상피 줄기 세포의 분리 방법 및 상기 방법으로 분리된 각막 윤부 상피 줄기 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 각막 윤부 상피 세포(corneal limbal epithelial cells)를 획득하는 단계; b) 상기 각막 윤부 상피 세포를 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)이 코팅되어 있는 플레이트에서 배양하는 단계; c) 상기 배양된 각막 윤부 상피 세포 중 과다 증식하는 각막 윤부 상피 줄기 세포(limbal epithelial stem cells)를 분리하는 단계; d) 상기 각막 윤부 상피 줄기 세포 중 각막 윤부 상피 줄기 세포 마커를 이용하여 분화 효율이 높은 줄기 세포를 순수 분리하는 단계; 및 e) 상기 순수 분리된 각막 윤부 상피 줄기 세포를 대량 배양하는 단계를 포함하는, 각막 윤부 상피 줄기 세포의 대량 배양 방법 및 상기 방법으로 대량 배양된 각막 윤부 상피 줄기 세포를 이용한 손상된 각막의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 각막 윤부 상피 세포(corneal limbal epithelial cells)를 획득하는 단계; b) 상기 각막 윤부 상피 세포를 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)이 코팅되어 있는 플레이트에서 배양하는 단계; c) 상기 배양된 각막 윤부 상피 세포 중 과다 증식하는 각막 윤부 상피 줄기 세포(limbal epithelial stem cells)를 분리하는 단계; d) 상기 각막 윤부 상피 줄기 세포 중 각막 윤부 상피 줄기 세포 마커를 이용하여 분화 효율이 높은 줄기 세포를 순수 분리하는 단계; e) 상기 순수 분리된 각막 윤부 상피 줄기 세포를 대량 배양하는 단계; 및 f) 상기 각막 윤부 상피 줄기 세포를 분화(differentiation)시키는 단계를 포함하는, 인공 각막의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 인공 각막을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 a) 단계는 바람직하게는 각공막 조직(corneoscleral tissue)으로부터 각막 윤부 상피 세포를 분리할 수 있으나, 각막 윤부 상피 세포로서 분화 가능한 줄기 세포를 포함하고 있는 조직이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 세포외기질 단백질이란 조직 내 또는 세포 외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체로서, 세포가 외부로 분비하는 모든 단백질들을 의미하며, 바람직하게는 파이브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 콜라겐 IV(collagen IV), 엔탁틴(entactin), 매트리겔TM(MatrigelTM) 등의 단백질의 조합일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 파이브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 IV, 및 엔탁틴의 조합일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 파이브로넥틴 및 매트리겔TM 의 조합일 수 있으나, 각막 윤부 상피 줄기 세포가 정상적으로 배양될 수 있는 단백질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 b) 단계는 바람직하게는 CnT20 배지(Corneal Epithelium Medium)를 이용하여 1차 배양한 후에 우태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 이용하여 2차로 배양하는 방법일 수 있으나 각막 윤부 상피 세포로부터 각막 윤부 상피 줄기 세포가 과다 증식할 수 있는 배지라면 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 배지에는 바람직하게는 FGF, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, BDNF, Stem Cell Factor, EGF 등의 세포 성장 인자(cell growth factors)를 추가로 포함할 수 있으나, 각막 윤부 상피 줄기 세포가 증식하는데 필요한 인자들이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 각막 윤부 상피 줄기 세포 마커는 각막 윤부 상피 줄기 세포를 분리하는데 사용 가능한 당업자에게 알려져 있는 마커라면 제한이 없으나, 바람직하게는 ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member 2), ABCB5(ATP-binding cassette sub-family B member 5), ΔNp63α, 시토케라틴 3(cytokeratin 3), 시토케라틴 19(cytokeratin 19), 코넥신 43(connexin 43) 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 세포막에 존재하는 ABCG2 및 ABCB5의 조합일 수 있다. 세포막에 존재하는 마커인 ABCG2 및 ABCB5의 조합을 이용하면 세포에 영향을 최소한으로 주며 살아있는 세포를 순수 분리할 수 있을 뿐만 아니라 이중 마커를 이용함으로써 줄기세포능이 증가된 줄기 세포를 분리할 수 있다. 그러나 각막 윤부 상피 줄기 세포에 존재하는 마커라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 상기 e) 단계는 바람직하게는 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)이 코팅되어 있는 플레이트에서 우태아혈청이 첨가되어 있는 DMEM을 이용하여 배양할 수 있으나, 각막 윤부 상피 줄기 세포가 줄기세포능을 유지한 채 분화되지 않고 증식할 수 있는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 f) 단계의 각막 윤부 상피 줄기 세포를 분화시키는 방법은 당업자에게 알려진 방법이라면 제한이 없으나, 바람직하게는 프로게스테론, 푸트레신, 라미닌, 인슐린, 아셀렌산나트륨, 트랜스페린, 뉴투린, 소닉 헤지호그(SHH), 노긴, 폴리스타틴, 레티노산, 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자의 임의의 유형, 시토신 β-d-아라비노 푸라노시드(Ara-C), 성장 및 분화 인자 5(GDF-5), 뉴로트로핀족의 구성원(신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀 3(NT-3), 뉴로트로핀 4(NT-4), 뇌유래 신경영양성 인자(BDNF), 변형성 성장 인자 α(TGF-α), 변형성 성장 인자 베타-1(TGF β1), 변형성 성장 인자 베타-3(TGF β3), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1), 골 형성 단백질(BMP-2, BMP-4), 아교 세포 유래 신경영양성 인자(GDNF), 미드카인, 아스코르브산, 아스코르브산 2 인산, 디부티릴 cAMP, 도파민, gp130과 복합체를 형성하는 수용체의 리간드(예를 들면, LIF, CNTF, SCF, IL-11 및 IL-6), 인슐린-트랜스페린-셀렌산(ITS), 덱사메타손, 부티르산 나트륨, 디메틸 술폭시드(DMSO), N-아세틸-시스테인, 인슐린 유사 성장 인자 I 또는 II(IGF-I 또는 IGF-II), β 글리세로포스페이트, 5-아자-데옥시-시티딘, 온코스타틴, 간세포 성장 인자(HGF), 니코틴아미드 또는 이들의 조합을 비롯한 분화제를 사용하여, DMEM, DMEM-F-12, MCDB, 신경기초 배지, 뉴투린, N2, B27 등 또는 이들의 조합을 비롯한 다양한 배지에서 분화를 유도할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 각막 윤부 상피 줄기 세포를 양막(amniotic membrane) 위에서 CnT20 배지 또는 CnT30 배지를 이용하여 배양하는 방법일 수 있다. 또한, 분화 영양 배지는 중성 세포 유지를 도와주는 첨가제, 예를 들면 N2 및 b-27 첨가제(Gibco) 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 각막 윤부 줄기 세포의 순수 분리 방법 및 대량 배양 방법은 각막 윤부 상피 세포로부터 분화 효율이 높은 각막 윤부 상피 줄기 세포를 효율적으로 순수 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 줄기 세포의 줄기세포능을 유지한 채로 in vitro 상에서 저렴한 방법으로 용이하게 각막 윤부 상피 줄기 세포의 대량 배양을 가능하게 하므로 인공 각막의 제조, 각막 재생, 또는 각막 손상의 치료법 등 다양한 분야에 실질적으로 상업화되어 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 각공막 조직으로부터 분리된 각막 윤부 상피 세포를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 CnT20 배지를 이용하여 배양한 각막 윤부 상피 세포를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 DMEM을 이용하여 배양한 각막 윤부 상피 세포를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 각막 윤부 상피 세포로부터 분리 및 증식된 각막 윤부 상피 줄기 세포를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 순수 분리된 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포의 줄기세포능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 q-RT-PCR을 이용하여 각막 상피 세포로의 분화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역학적 염색을 이용하여 각막 상피 세포로의 분화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 양막 위에서의 각막 상피 세포로의 분화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 각막 윤부 줄기세포의 대량 배양
1.1. 각막 윤부 상피세포의 분리
각막 재생을 위한 각막 윤부 줄기 세포(corneal limbal stem cells)를 대량 배양하는 방법을 개발하기 위하여, 일차적으로 각막 윤부 상피 세포(corneal limbal epithelial cells)를 분리하였다. 각막 윤부 상피세포를 분리하기 위하여 사람으로부터 분리된 각공막 조직(corneoscleral tissue)을 4개의 조직으로 자르고, 자른 각공막 조직을 각각 HBSS(Hank's balanced salt solution)가 담긴 60mm 세포 배양 플레이트에 담근 후 조직에 남아있던 홍채(iris)와 내피 세포(endothelial cells)를 제거하였다. 홍채와 내피 세포가 제거된 조직은 15mg/mL의 디스파제 II(Dispase II)와 10mM의 소비톨(sorbitol)이 첨가된 SHEM(Supplemented Hormonal Epithelial Medium)에 담근 후 4℃에서 18시간 정도 배양하였다. 그리고 배양된 조직을 비절단형 플랫 스테인레스강 스패튤라(noncutting flat stainless-steel spatula)를 이용하여 간질(stroma)층과 윤부의 상피(limbal epithelium)층을 분리하여 각막 윤부 상피 세포를 분리하였다. 분리된 각막 윤부 상피 세포는 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 각막 윤부 상피 세포가 성공적으로 분리되었다는 것을 확인하였다.
1.2. 각막 윤부 줄기 세포의 분리 및 배양
실시예 1.1과 동일한 방법으로 분리된 각막 윤부 상피 세포 중 각막 윤부 줄기 세포를 분리하기 위하여, 5% 매트리겔(Matrigelⓡ, Corningⓡ), 0.05mg/mL 파이브로넥틴(fibronectin, Sigma-Aldrichⓡ), 5% 매트리겔 및 0.05mg/mL 파이브로넥틴을 코팅시킨 각각의 플레이트에 CnT20 배지(Corneal Epithelium Medium, CELLnTEC)를 채우고, 분리된 각막 윤부 상피 세포를 접종한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 삼일 동안 배양하였다. 매트리겔 및/또는 파이브로넥틴을 플레이트에 코팅하는 방법은 총량이 3mL이 되도록 60mm 플레이트에 첨가하고 5초간 플레이트를 흔들어 바닥에 모두 매트리겔 및/또는 파이브로넥틴에 적셔지도록 한 후, 남아있는 매트리겔 및/또는 파이브로넥틴을 제거하고 4℃에서 12시간 동안 플레이트를 보관한 후에 이후 실험에 사용하였다. 그리고 다시 새로운 CnT20 배지로 교체한 후 다시 배양을 하였고, 이틀마다 새로운 배지로 교체하며 8~10일간 배양하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 각막 윤부 상피 세포가 정상적으로 증식되지 않은 것을 확인하였다. 각막 윤부 상피 세포의 증식 방법을 찾기 위하여, 분리된 각막 윤부 상피 세포를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 첨가되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibcoⓡ) 또는 CnT20 배지에서 5% 매트리겔(Matrigel), 0.05mg/mL 파이브로넥틴(fibronectin), 5% 매트리겔(Matrigel) 및 0.05mg/mL 파이브로넥틴(fibronectin)을 코팅시킨 각각의 플레이트 위에서 삼일 동안 배양하였다. 그리고 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후 10% 우태아혈청이 첨가되어 있는 DMEM으로 교체한 후 다시 배양을 하였고, 이틀마다 새로운 배지로 교체하며 8~10일간 배양하였다. 처음부터 DMEM을 이용하여 배양한 경우에는 세포가 증식하지 못하였고, CnT20 배지에서 삼일 동안 배양한 후에 DMEM을 이용하여 배양한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 5% 매트리겔 또는 0.05mg/mL 파이브로넥틴을 각각 코팅한 플레이트에서는 각막 윤부 상피 세포가 정상적으로 증식되지 못하였지만, 5% 매트리겔 및 0.05mg/mL 파이브로넥틴을 모두 이용하여 코팅한 플레이트에서는 각막 윤부 상피 세포가 활발하게 증식되었으며, 8~10일 동안 배양하면 각막 윤부 상피 세포 중 과다 증식(highly proliferative)하는 콜로니가 생성되는 것을 확인하였다.
그리고 과다 증식된 콜로니를 아큐테이즈(accutase)를 이용하여 플레이트로부터 분리하고, 10% 우태아혈청이 포함되어 있는 DMEM을 5% 매트리겔(Matrigel)과 0.05mg/mL 파이브로넥틴(fibronectin)이 코팅되어있는 플레이트에 첨가한 후 분리된 콜로니를 배양하여 과다 증식하는 새로운 세포, 즉, 각막 윤부 상피 줄기 세포(limbal epithelial stem cells; LESC)를 분리 및 배양하였다. 분리된 각막 윤부 상피 줄기 세포를 배양한 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 분리된 각막 윤부 상피 줄기 세포가 정상적으로 과다 증식되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여, 5% 매트리겔 및 0.05mg/mL 파이브로넥틴이 코팅된 플레이트와 DMEM을 이용하면 각막 윤부 상피 줄기 세포를 효율적으로 분리 및 증식시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
매트리겔은 그 조성이 명확하지 않기 때문에, 윤부 상피 줄기 세포의 증식 조건을 좀더 명확히 하기 위하여, 0.12mg/mL의 라미닌(laminin, Sigma-Aldrichⓡ), 0.06mg/mL의 콜라겐 IV(collagen IV, collagen IV), 0.016mg/mL의 엔탁틴(entactin, R&D systems) 및 0.05mg/mL 파이브로넥틴(fibronectin)을 플레이트에 코팅하고, 배지에는 추가로 성장 인자(Growth factors, Gibcoⓡ)를 추가로 넣어주었다. 나머지 실험 방법은 상기와 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과 5% 매트리겔을 사용한 것과 동일하게 윤부 상피 줄기 세포가 정상적으로 과다 증식되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 매트리겔을 대체하여 라미닌, 콜라겐 IV 및 엔탁틴 혼합물을 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
1.3. ABCG2 +/ ABCB5 + 각막 윤부 상피 줄기 세포의 분리 및 배양
실시예 1.2와 동일한 방법으로 배양된 각막 윤부 상피 줄기 세포 중 각막 재생 용도로 사용할 정도로 분화 효율이 높은 세포를 분리하기 위하여, ABCG2 와 ABCB5 두 개의 마커를 이용하여 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포(ABCG2+/ABCB5+ double positive limbal epithelial stem cells)를 분리하였다. 분리를 위하여 과다 증식된 세포에 ABCG2 및 ABCB5 항체를 결합시키고, 형광유세포분석법(fluorescence activated cell sorter; FACS)을 이용하여 두 개의 마커를 모두 가진 세포 만을 순수 분리하였다. 각각의 단일클론항체(monoclonal antibody)는 BD Biosciences에서 구입하여 사용하였다. 그리고 10% 우태아혈청이 포함되어 있는 DMEM을 5% 매트리겔(Matrigel)과 0.05mg/mL 파이브로넥틴(fibronectin)이 코팅되어있는 플레이트에 첨가한 후 순수 분리된 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포를 배양하였다. 그리고 동일한 방법으로 계대 배양하며 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포를 대량 배양하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포가 순수 분리되었으며, 이를 세포외기질 단백질(extracellular matrix ptotein)이 코팅되어 있는 플레이트에서 우태아혈청이 포함되어 있는 DMEM 배지를 이용하여 줄기세포능을 유지한 채로 대량 배양할 수 있다는 것을 확인하였다.
1.4. ABCG2 +/ ABCB5 + 각막 윤부 상피 줄기 세포의 줄기세포능 확인
ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포가 실질적으로 줄기 세포로의 특성인 줄기세포능(stemness)을 가지고 있는지 확인하기 위하여, 분리된 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포의 텔로머레이즈 활성(telomerase activity)을 측정하였다. 텔로머레이즈 활성은 TRAPeze® Telomerase Detection kit를 이용하여 측정하였으며, 대조군으로는 일반 각막 상피 세포(corneal epithelial cell; CEC)를 이용하였다. 그 결과는 도6A에 나타내었다. 또한, 유전자 이상(genomic abnormality)을 측정하여 재확인하였다. 유전자 이상을 측정하기 위하여 분리된 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포를 60번(passage) 계대 배양한 후에 DAPI로 염색하고 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 대조군으로는 대장암 세포주인 SW620 세포주를 이용하였다. 그 결과는 도 6B에 나타내었다.
도 6A에 나타난 바와 같이, ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포는 정상 각막 상피 세포와 비교하여 매우 높은 텔로머레이즈 활성을 가지고 있다는 것을 확인하였으며, 도 6B에 나타난 바와 같이, 대조군인 대장암 세포주의 경우에는 대부분의 염색체가 비정상적인 반면, ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포는 비정상적인 염색체가 거의 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 본 발명의 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포는 줄기 세포로의 특성인 줄기세포능을 가지고 있는 정상적인 줄기 세포 임을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 본 발명의 각막 윤부 상피 줄기 세포를 이용하여 각막 재생에 효과적으로 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 각막 윤부 상피 줄기 세포의 각막 상피 세포로의 분화
2.1. qRT - PCR을 이용한 분화 확인
실시예 1.3과 동일한 방법으로 분리 및 배양한 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포를 DMEM, CnT20 배지, 또는 CnT30 배지로 각각 교체한 후에 5일 동안 배양하여 각막 상피 세포로의 분화를 유도하고, 각막 윤부 줄기 세포 마커인 p63a, ABCG2, 및 Integrin a9과 각막 상피 세포 마커인 CK3 및 CK12의 발현량을 qRT-PCR(quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 이용하여 각막 상피 세포로 분화되었는지를 확인하였다. 확인을 위하여 분화가 유도된 세포를 회수하고, RNeasy Mini Kit을 이용하여 프로토콜에 따라 회수된 세포로부터 RNA를 추출하고, 추출된 RNA 1ug을 이용하여 one step RT-PCR kit를 이용하여 qRT-PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, CnT20 배지 또는 CnT30 배지에서 배양한 줄기 세포의 경우 각막 윤부 줄기 세포 마커인 p63a, ABCG2 및 integrin a9의 발현량은 감소되고, 각막 상피 세포 마커인 CK3 및 CK12는 증가된 것을 확인하였고, 이를 통하여, CnT20 배지 또는 CnT30 배지를 이용하여 실시예 1의 방법으로 분리된 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포를 정상적으로 각막 상피 세포로 분화시킬 수 있다는 것과 DMEM 배지를 이용하여 배양할 경우에는 분화를 억제하고 각막 윤부 상피 줄기 세포를 정상적으로 계대 배양할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
2.2. 면역학적 염색을 이용한 분화 확인
ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포가 정상적으로 각막 상피 세포로 분화되었는지 재확인하기 위하여 면역학적 염색을 이용하여 분화 여부를 확인하였다. 확인을 위하여, 10% 우태아혈청이 포함되어 있는 DMEM에서 배양되고 있는 각막 윤부 상피 줄기 세포를 CnT30 배지로 교체한 후 5일 동안 추가 배양하고, 형광이 표지된 p63a 및 CK3의 각각의 단일클론항체와 DAPI로 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하였고, 대조군으로는 DMEM에서 배양하고 있는 각막 윤부 상피 줄기 세포를 형광이 표지된 ABCG2 및 p63a의 각각의 단일클론항체와 DAPI로 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 각각의 단일클론항체(monoclonal antibody)는 BD Biosciences에서 구입하여 사용하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, qRT-PCR 결과와 동일하게 CnT30 배지를 이용하여 분화시킨 세포의 경우 줄기 세포 마커인 ABCG2 및 p63a의 발현량은 감소되고, 각막 상피 세포 마커인 CK3은 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, CnT30 배지를 이용하여 실시예 1의 방법으로 분리된 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포를 정상적으로 각막 상피 세포로 분화시킬 수 있다는 것과 DMEM 배지를 이용하여 배양할 경우에는 분화를 억제하고 각막 윤부 상피 줄기 세포를 정상적으로 계대 배양할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
2.3. 양막 위에서의 분화 확인
각막 혼탁(corneal opacity)을 예방 및 경감하는데 사용되고 있는 양막(amniotic membrane) 위에서도 정상적으로 분화되는지 확인하기 위하여, ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포를 GFP-Lentivirus를 이용하여 감염시킨 후에 GFP가 발현되는 1.5X105 세포를 양막(1cmX1cm) 위에 접종하고 CnT30 배지를 이용하여 10일 동안 배양하였다. 그리고 실시예 2.2와 동일한 방법으로 CK3 마커를 염색하여 각막 상피 세포로 분화되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 양막 위에서 배양된 각막 윤부 상피 줄기 세포는 CK3의 발현량이 증가하였으며, 이를 통하여 본 발명의 ABCG2+/ABCB5+ 각막 윤부 상피 줄기 세포가 양막 위에서 정상적으로 각막 상피 세포로 분화되었다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 본 발명의 줄기 세포를 양막 위에 배양하여 효과적으로 각막 재생에 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (25)

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  8. a) 각공막 조직 유래 각막 윤부 상피 세포를 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)이 코팅되어 있는 플레이트에서 배양하는 단계;
    b) 상기 배양된 각막 윤부 상피 세포 중 과다 증식하는 각막 윤부 상피 줄기 세포(limbal epithelial stem cells)를 분리하는 단계;
    c) 상기 각막 윤부 상피 줄기 세포 중 각막 윤부 상피 줄기 세포 마커를 이용하여 분화 효율이 높은 줄기 세포를 순수 분리하는 단계; 및
    d) 상기 순수 분리된 각막 윤부 상피 줄기 세포를 대량 배양하는 단계를 포함하는, 생체외(in vitro) 각막 윤부 상피 줄기 세포의 대량 배양 방법으로서,
    상기 a) 단계는 CnT20 배지(Corneal Epithelium Medium)를 이용하여 1차 배양한 후에 우태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 이용하여 2차로 배양하는 것을 특징으로 하며,
    상기 a) 단계의 세포외기질 단백질은 파이브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 콜라겐 IV(collagen IV), 및 엔탁틴(entactin)을 포함하는 것을 특징으로 하며,
    상기 c) 단계의 줄기 세포 마커는 ABCG2(ATP-binding cassette subfamily G member 2) 및 ABCB5(ATP-binding cassette sub-family B member 5)를 이용하는 것을 특징으로 하며,
    상기 d) 단계는 우태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 이용하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 삭제
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  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 세포외기질 단백질은 파이브로넥틴(fibronectin) 및 매트리겔TM(MatrigelTM)의 조합인 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 8 항에 있어서,
    상기 d) 단계는 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)이 코팅되어 있는 플레이트에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 삭제
  16. a) 각공막 조직 유래 각막 윤부 상피 세포를 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)이 코팅되어 있는 플레이트에서 배양하는 단계;
    b) 상기 배양된 각막 윤부 상피 세포 중 과다 증식하는 각막 윤부 상피 줄기 세포(limbal epithelial stem cells)를 분리하는 단계;
    c) 상기 각막 윤부 상피 줄기 세포 중 각막 윤부 상피 줄기 세포 마커를 이용하여 분화 효율이 높은 줄기 세포를 순수 분리하는 단계;
    d) 상기 순수 분리된 각막 윤부 상피 줄기 세포를 대량 배양하는 단계; 및
    e) 상기 각막 윤부 상피 줄기 세포를 분화(differentiation)시키는 단계를 포함하는, 생체외(in vitro) 인공 각막의 제조 방법으로서,
    상기 a) 단계는 CnT20 배지(Corneal Epithelium Medium)를 이용하여 1차 배양한 후에 우태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 이용하여 2차로 배양하는 것을 특징으로 하며,
    상기 a) 단계의 세포외기질 단백질은 파이브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 콜라겐 IV(collagen IV), 및 엔탁틴(entactin)을 포함하는 것을 특징으로 하며,
    상기 c) 단계의 줄기 세포 마커는 ABCG2(ATP-binding cassette subfamily G member 2) 및 ABCB5(ATP-binding cassette sub-family B member 5)를 이용하는 것을 특징으로 하며,
    상기 d) 단계는 우태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 이용하여 배양하는 것을 특징으로 하며,
    상기 e) 단계는 CnT20 배지 또는 CnT30 배지를 이용하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제 16 항에 있어서,
    상기 세포외기질 단백질은 파이브로넥틴(fibronectin) 및 매트리겔TM(MatrigelTM)의 조합인 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제 16 항에 있어서,
    상기 d) 단계는 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)이 코팅되어 있는 플레이트에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 삭제
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  25. 제 16 항에 있어서,
    상기 e) 단계는 각막 윤부 상피 줄기 세포를 양막(amniotic membrane) 위에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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