JPWO2005087285A1

JPWO2005087285A1 - 角膜上皮シート及びその作製方法、並びに同シートを用いる移植方法

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Publication number: JPWO2005087285A1
Application number: JP2006510890A
Authority: JP
Inventors: 橋本　公二; 公二橋本; 裕次白方; 裕一大橋; 羽室　淳爾; 淳爾羽室
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-03-11
Filing date: 2005-02-14
Publication date: 2008-01-24
Also published as: KR20070008590A; CN1929877A; EP1736180A1; EP1736180A4; CA2559582A1; WO2005087285A1; US20070280993A1

Abstract

高い治療効果が望めるとともに移植時の安全性が高い角膜上皮シートを提供する。(a)角膜上皮細胞を調製し、一方で(b)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養し、(c)前記角膜上皮細胞を前記コラーゲンゲル上に播種ないし載置し、(d)異種動物細胞非存在下、前記角膜上皮細胞を培養して増殖させることによって、角膜上皮シートを作製する。

Description

本発明は角膜上皮シートに関する。詳細には、本発明は、異種動物由来細胞をフィーダー細胞として使用することなく、角膜上皮細胞をコラーゲンゲル上で培養・増殖させることによって作製される角膜上皮シート及び同シートの作製方法、並びに同シートの利用（移植方法等）に関する。

再生医療の貢献が期待されている組織の一つが角膜である。角膜は、眼球を構成する光学系の最も外層にあり、透明な血管のない組織であって、涙液と共に平滑な表面を形成することにより良好な視力を得ることに貢献している。また、角結膜上皮細胞は常に外界と接し、外界の微生物などの異物、紫外線などの光線などから眼球を守る防御作用を持っている。すなわち、角結膜上皮細胞は、角膜の透明性と眼球全体を防御し恒常性を維持するために極めて重要な役割を果たしている。

角膜は、例えば、角膜炎、角膜潰瘍、穿孔等の病態により濁り、透明性が失われてしまう場合がある。このような角膜の濁りによる永続的な視力の低下に対しては、眼球提供者から提供された角膜を用いる角膜移植による治療が行われている。角膜移植は、患者の透明性が失われた角膜を取り除いた後、透明な角膜を移植するというものであって、この移植により透明性が回復し、再び視力を取り戻すことができる。
このような角膜移植によって効果的な治療効果が期待できる場合がある一方で、角膜の移植だけでは対処できない疾病が存在する。例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、化学外傷、熱傷などである。通常、角結膜上皮細胞は、毎日分裂を繰り返し、古くなった細胞は、はがれ落ち、幹細胞組織から新たな細胞が再生される。ところが以上のような病態では、角膜を再生させる幹細胞組織に障害があることがわかってきている。

角膜上皮を再生させる幹細胞組織は「角膜輪部組織」と呼ばれ、ちょうど黒目と白目の境界部分に限局し、外界に露出された特殊な環境にある。上述した病態では、この幹細胞組織自体がなんらかの障害を受けて根絶してしまうと考えられている。そして、この幹細胞組織の根絶により、その欠損部分は周りに存在する結膜上皮で覆われ、透明性に欠け、視力の極端な低下がもたらされる。このように上述の病態では角膜輪部が枯渇しているため、単に角膜を移植するだけでは移植された角膜を長期に維持できない。そのため恒久的な眼表面再建を図るためには角膜輪部をも移植する必要がある。この角膜輪部を移植する方法の一つとして羊膜移植法が開発されている（メディカル朝日１９９９年９月号：ｐ６２〜６５、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３４０：１６９７〜１７０３、１９９９：非特許文献１）。この移植法に用いられる羊膜は、帝王切開した妊婦等の胎盤から得られる。羊膜は厚い基底膜をもつことから、移植された場合、角結膜上皮細胞が増殖、分化するための基質として作用する。さらに、羊膜は免疫原性がほとんどないことに加え、抗炎症、瘢痕形成抑制などの作用を併せ持つことから、羊膜上に移植される角結膜上皮やこれらの幹細胞組織は移植受容者（レシピエント）の拒絶反応等から保護されることになる。

メディカル朝日１９９９年９月号：ｐ６２〜６５、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３４０：１６９７〜１７０３、１９９９

角膜が結膜上皮で覆われ混濁を生じる眼表面疾患に対する外科的治療としては、現在は角膜上皮移植術が行われているが、強い炎症を伴った難治性角結膜疾患（Stevens-Johnson症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食など）においては、その予後が極めて不良である。その最大の理由として、強い抗原性を有する異系（アロ）の角膜上皮が宿主の免疫系に認識され拒絶を受けることが挙げられる。更に、拒絶反応の予防のため術後に多量の免疫抑制剤を全身及び局所投与することによる合併症もその予後不良の大きな要因となっている。一方、アロの角膜上皮を利用する場合には、ドナー不足の問題がある。一眼から得られる角膜を用いて数十の角膜上皮シートの作製できる技術を達成すればドナー不足の課題は解決される。

本発明は以上の背景及び課題に鑑みてなされたものであって、高い治療効果が望めるとともに移植時の安全性が高い角膜上皮シートを提供することを目的とする。かかる目的の下、本発明者らは、安全性を考慮して上皮細胞の培養時に異種動物由来の細胞（フィーダー細胞）を使用しない条件とした上で角膜上皮シートの作製を試みた。その結果、ヒト線維芽細胞を含有したコラーゲンゲル上で角膜上皮細胞を培養することによって、フィーダー細胞を使用することなく良好な重層化及び上皮化が達成された。特に、無血清培地を使用することによって良好な成績が得られた。
以上のように本発明者らは、異種動物由来の細胞を全く用いない安全で実用的な角膜上皮シートの作製に成功した。

本発明は以上の成果及び知見に基づいて完成されたものであって、次の構成を提供する。
［１］異種動物細胞非存在下、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上で増殖させた角膜上皮細胞を含有してなる角膜上皮シート。
［２］無血清培地を使用して前記角膜上皮細胞を増殖させることを特徴とする、［１］に記載の角膜上皮シート。
［３］血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用して前記角膜上皮細胞を増殖させることを特徴とする、［１］に記載の角膜上皮シート。

本発明の角膜上皮シートは、その作製過程において異種動物由来の細胞を使用しないことから安全性が極めて高いものとなる。また、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを使用することによって、極めて緻密な細胞層が形成され、重層培養がはじめて可能となり、移植後の生着性が非常に高くなる。

実施例の方法で作製した角膜上皮シートヘマトキシリン・エオジン染色像を示す図である。線維芽細胞を含むゲルの上に３−４層からなる角膜上皮細胞層が認められる。細胞の形態は正常角膜に近いもので、最上層では角層の形成は認められず、角膜の形態を示している。実施例の方法で作製した角膜上皮シートの電子顕微鏡像を示す図である。角膜上皮細胞層が３−４層の細胞で構成されている（Ａ）。基底膜部ではヘミデスモゾームの形成、ラミナデンサの形成が認められる（Ｂ）。細胞間ではデスモゾームが良好に形成されている（Ｃ）。最上層ではmicrovilliが形成されており、ヒト角膜の電子顕微鏡所見とほぼ同様の所見を呈している。これらのことより、微細構造も角膜の形態を呈していると考えられる。

本発明は、次の構成からなる角膜上皮シートを提供する。即ち、異種動物細胞非存在下、コラーゲンゲル上で増殖させた角膜上皮細胞からなる細胞層が形成されている角膜上皮シートである。本発明の角膜上皮シートは、角膜上皮の再生（再建）に利用される。以下に本発明の角膜上皮シート及びその製法の特徴を詳述する。

本発明の角膜上皮シートは、(a)角膜上皮細胞を調製するステップ、(b)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ、(c)前記角膜上皮細胞を前記コラーゲンゲル上に播種ないし載置するステップ、(d)異種動物細胞非存在下、前記角膜上皮細胞を培養して増殖させるステップを含む方法によって作製される。
ステップaでは角膜上皮細胞が調製される。特に記載のない限り、本明細書において「角膜上皮細胞」とは角膜上皮細胞層に含まれる細胞を包括した表現として使用され、即ち角膜上皮細胞の幹細胞及び前駆細胞をも含む。角膜上皮細胞の調製方法の一例を以下に示す。

角膜上皮細胞は角膜輪部組織から得ることができる。例えば角膜輪部組織から内皮細胞を剥離除去し、結膜を切除し単一細胞懸濁液を作製する。そしてこれを窒素タンクで保存し、その後急速に37℃で融解して角膜上皮細胞浮遊液を調整する。必要に応じて継代培養する。継代培養には、例えば無血清培地であるEpiLife^TM（カスケード社）、MCDB153培地（日水製薬株式会社）やこれらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地などを使用することができる。

角膜上皮細胞は、角膜上皮シートの移植を受ける者（レシピエント）から調製することが好ましい。即ち、角膜上皮細胞のドナーと、角膜上皮シートのレシピエントが同一人であることが好ましい。このような自家細胞を用いることにより、免疫拒絶の問題が解消される。

ステップbではコラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞が培養される。「コラーゲンゲル」はヒト線維芽細胞の培養基質として機能する。コラーゲンゲルの原材料となるコラーゲンの種類は特に限定されず、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲンなどを用いることができる。複数の種類のコラーゲンが混在するものを用いることもできる。これらのコラーゲンは、ブタ、ウシ、ヒツジなどの動物の皮膚、軟骨などの結合組織から、酸可溶化法、アルカリ可溶化法、酵素可溶化法などにより抽出、精製することができる。尚、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシンなどの分解酵素で処理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるアテロコラーゲンとしたものを用いることが好ましい。コラーゲンゲルの材料として羊膜由来、特にヒト羊膜由来のコラーゲンを用いてもよい。ここで、羊膜由来とは、広く羊膜を出発原料として得られたものであることを意味する。

コラーゲンマトリクスが含有するヒト線維芽細胞の由来は特に限定されず、コラーゲンを産生するものであればいずれの組織由来のものでもよく、例えば、皮膚組織、口腔粘膜組織などから調製したヒト線維芽細胞を使用することができる。

コラーゲンマトリクスの作製方法の具体例を示す。まず、以下の手順で線維芽細胞を調製する。皮膚を採取し、続いて皮膚から真皮を剥離する。真皮を細切し、I型コラーゲンコートディッシュに密着させる。静置培養し、真皮片から遊走する線維芽細胞を継代する。細胞がディッシュ底面から剥離させ、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。適宜細胞を凍結保存（例えば液体窒素中で保存）する。
一方、Ｉ型コラーゲンを用いて中和コラーゲン液を調製する（後述の実施例を参照）。これを培養容器（例えばカルチャーインサート）に添加し、室温で10分間程度静置させてゲル化させる。次に、上述の方法によって予め培養しておいた対数増殖期の線維芽細胞をこのゲルに混和し、再度ゲル化させる。その後、静置培養する。以上の手順によって線維芽細胞を含有するコラーゲンマトリクスが得られる。この創意工夫により、必要な強度を有し、羊膜層や生体由来細胞を載置できるコラーゲンマトリクスとなったもので、本発明の根幹をなす。コラーゲンマトリクス上には、別途用意した角膜上皮細胞が播種（載置）される。
角膜上皮細胞は、例えば細胞密度が約1×10³個／cm²以上、好ましくは約1×10³個／cm²〜約1×10⁷個／cm²、更に好ましくは約1×10⁴個／cm²〜約1×10⁶個／cm²となるように播種される。

コラーゲンマトリクス上に播種した角膜上皮細胞の培養（ステップd）は異種動物細胞非存在下で実施される。本発明において「異種動物細胞非存在下」とは、角膜上皮細胞を培養する際の条件として、当該角膜上皮細胞に対して異種である動物の細胞が使用されないことをいう。具体的には角膜上皮細胞としてヒト細胞を使用する場合に、マウスやラット等、ヒト以外の動物種の細胞が培養液中に存在（併存）しない条件のことをいう。このような条件で培養を実施することによって、最終的に得られる移植材料（即ち角膜上皮シート）に異種由来の成分（異種細胞自体を含む）が混入するおそれがなくなる。
角膜上皮細胞を培養する際に用いられる培地は、当該細胞を増殖させるものであれば特に限定されない特に、本発明では無血清で且つ異種動物由来のタンパク質を含まない培地を用いることが好ましい。一方、成長因子や抗生物質等が添加された培地を使用してもよい。但し、血清を含まない培地を使用することが好ましい。即ち、本発明における培養方法として無血清培養法を採用することが好ましい。血清由来の成分の混入による免疫拒絶等の問題を回避することができるからである。尚、血清を含む培地中で培養することにしてもよいが、その場合には同種由来の血清（ヒトの角膜上皮細胞を培養する際にはヒト由来の血清）を使用するか、自家血清を使用することが好ましい。勿論、可能であれば、免疫拒絶反応の惹起のおそれがなくなる自家血清を使用することが好ましい。
角膜上皮細胞の良好な増殖及び重層化を目的として培養ステップの途中で培養条件を変更することもできる。

ステップdの結果、コラーゲンマトリクス上で角膜上皮細胞が増殖する。このようにして得られた細胞層の表層の角化を促すために、細胞層の表層を空気に接触させるステップ（ステップe）を実施することが好ましい。尚、このステップを本明細書においてエアーリフティング（Air-lifting）とも呼ぶ。このステップeは、細胞層を形成する細胞の分化、バリア機能の誘導等を目的として行われる。
このステップは、培養液の一部をスポイト、ピペットなどを用いて一時的に除去することにより培養液表面を低下させ、これにより細胞層の最表層を一時的に培養液外に露出させることによって行うことができる。又は、細胞層をコラーゲンマトリクスごと持ち上げて、最表層を培養液表面から一時的に露出させることにより行うこともできる。更には、チューブなどを用いて空気を培養液中に送り込み、細胞層の最上層に空気を接触させてもよい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて細胞層の最表層を露出させる方法により行うことが好ましい。
このステップeを行う時間、即ち重層化した細胞層の最表層を空気に接触させる時間は、細胞の状態や培養条件などによって変動するが、例えば３日〜３週間程度であり、好ましくは５日〜２週間、更に好ましくは約１週間である。
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。

コラーゲンゲルを用いた三次元角膜上皮シートの作製
１．角膜上皮細胞の調製
１−１．角膜の調達
角膜はドナー用のものをNorthwest Lions Eye Bank（シアトル、米国）より購入した。
１−２．角膜上皮細胞の無血清培養法
角膜をダルベッコリン酸緩衝液（PBS）の入ったシャーレに移し、実体顕微鏡下に輪部をメスにて一辺が2〜3mmに細切する。細切した輪部を数回PBSにて洗浄し、70％エタノールに１分間浸し滅菌する。PBSにて洗浄後、ディスパーゼ液（ディスパーゼII、合同酒精社、250単位/mlダルベッコ変法MEM培地；DMEM）に浸し、4℃で一晩（18〜24時間）静置する。翌日、実体顕微鏡下にピンセットを用いて上皮を実質から剥離する。剥離した角膜上皮を、DMEMにて洗浄、続いて、PBSにて洗浄後、0.25%トリプシン溶液中にひたし、37℃、10分間の処理を行う。表皮をトリプシン中和液を入れたプラスチックシャーレに移しピンセットにて表皮片をほぐし、15mlの滅菌チューブに移す。PBSを添加し、角膜上皮細胞浮遊液を調整する。細胞数を数え、1000rpm、5分間遠心し細胞を沈殿させる。上清を吸引し、細胞を無血清培地であるEpiLife培地で懸濁し、60mmコラーゲンコートシャーレ（旭テクノグラス、I型コラーゲンコートディッシュ；4010-020）当たり1〜2×10⁶細胞/5ml培養液の割合で播種する。翌日培養液を交換し、以後１日おきに培養液を交換する。細胞密度が70〜80%程度になった時点で継代培養を行う。
尚、以上の方法では無血清培地中を使用して角膜上皮細胞を培養することにしたが、以下に示す手順のように血清を含む培地を使用することもできる。
(1)角膜輪部組織から内皮細胞を剥離除去し、結膜を切除する。
(2)ディスパーゼ液（ディスパーゼI、合同酒精社、250単位/mlダルベッコ変法MEM培地；DMEM）に浸して4℃で一晩（18〜24時間）静置する。
(3)0.25%トリプシン溶液中にひたし、37℃、10分間の処理を行う。
(4)顕微鏡下で上皮のみをトリプシン溶液中ではがす。
(5)ピペッティングして、30%FCS/DMEMを同量加えて懸濁する。
(6)PBS(-)で残りの細胞をさらに回収して遠心処理する。
(7)適量の培養液で単一細胞懸濁液とする。

調製した角膜上皮細胞の凍結保存条件（保存液組成含む）及び融解条件の一例を以下に示す。
凍結保存条件：1℃/時間の速度で-20℃まで温度を低下させ、その後窒素タンクで保存する。
保存液組成：20%FCS/10%DMSO/DMEM
融解条件：出来るだけ急速に37℃で融解し、PBSで10倍希釈する。

２．線維芽細胞の調製
剥離した真皮をDMEMにて洗浄後、一辺が1〜2mmにメスを用いて細切する。細切した真皮片をI型コラーゲンコートディッシュに約1cmの間隔で密着させる。CO₂インキュベーターに30分間静置し、完全に密着させる。その後、牛胎児血清を10％含むDMEM培地を約5ml添加し、7日間静置する。7日目に初回の培養液交換を行う。真皮片から線維芽細胞が遊走してくるのを確認する。細胞が増殖し、真皮片の周囲5mmまで遊走してきた段階で、継代を行う。PBSで洗浄後、0.125%トリプシン、0.05%EDTAを含む溶液を3ml添加し、37℃、3分間処理する。細胞がディッシュ底面から剥離したことを顕微鏡で確認した後、3 mlのトリプシンインヒビターを添加し細胞を回収し50mlのチューブに移す。PBSを用いて残りの細胞を回収し、1000rpm、5分間の遠心処理にて細胞を沈殿させ、上清を吸引後、牛胎児血清を10％含むDMEM培地を添加し、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。継代の細胞密度はおおむね1：3程度とする。適宜細胞を凍結保存する。凍結保存液は10％グリセロール、20%FCS、70%DMEMを用い、液体窒素中で保存する。

３．中和コラーゲンゲルの作製
I型コラーゲン溶液（セルマトリクスタイプ1A：3mg/ml：新田ゼラチン）：6容量に対して0.1N NaOH：１容量、8倍濃度DMEM：１容量、20％FCS/DMEM：10容量の割合で中和コラーゲン液（コラーゲンの最終濃度：1mg/ml）を4℃にて作製し、直径24 mmのカルチャーインサート（Corning-Costar社）に１mlずつ添加し、室温で10分間静置しゲル化させる。あらかじめ培養しておいた対数増殖期の線維芽細胞（ディスパーゼ処理し表皮を剥離した残りの真皮からoutgrowth法で培養し5-10代継代した細胞を用いる。）を5x10⁵細胞/ml、10%FCS/DMEMの濃度に調整し、この細胞懸濁液：2容量に対して中和コラーゲン液：8容量の割合で混和し、細胞を含む中和コラーゲン溶液を調製する（コラーゲンの最終濃度：0.8mg/ml）。この溶液を各カルチャーインサートに3.5mlずつ添加し、CO₂インキュベーター内(37℃、5%CO₂)に静置する。約30分でゲル化したことを確認する。その後10％FCS/DMEMをゲルが浸る程度（カルチャーインサイト内側に3ml、カルチャーインサート外側に3ml）加え5日間静置培養する。培養2日目よりゲルは収縮を開始しはじめ、線維芽細胞の増殖を位相差顕微鏡下に観察できる。

４．角膜上皮細胞の播種
線維芽細胞の培養開始後5日目にはコラーゲンゲルの底面はメンブレンに密着し、一方でコラーゲンゲル上部は収縮して直径13-15mm、厚さ2-3 mm程度となる。また、コラーゲンゲル中央はちょうどクレーター状に陥凹している。この陥凹している上に角膜上皮細胞を播種する。即ち、１−２．で調製した角膜上皮細胞をトリプシン・EDTAを用いてディッシュから剥離し・回収する。1000rpm、5分間遠心し、上清を除去し、3〜4ｘ10⁶細胞/ml程度に調整する。容量的には50〜60μlの懸濁液をコラーゲンゲル上に添加できる。角膜上皮細胞がゲルに密着するように1.5〜2.0時間CO₂インキュベーター内で静置し、その後表皮細胞増殖用無血清培地を緩やかに添加し（カルチャーインサート内側に3ml、カルチャーインサート外側に3ml）、さらに14日間液相下で培養を続ける。角膜上皮細胞播種3日目に培養液を重層化用培養液（下記参照）に変更し、以後2日に1回培養液を交換する。
重層化用培地は以下のごとく調整する。ダルベッコ変法MEM培地：F-12培地＝1:1、カルシウム濃度；1.95mM、monoethanolamine;0.1mM、0-phosphoethanolamine;0.1mM、insulin;5ug/ml、hydrocortisone;0.4ug/ml、L-glutamine;4mM、Adenin;0.18mM、transfferin;5ug/ml、selenious acid;53nM、triiodothyronine;20pM、serine;1mM、choline chloride;0.64mM、linoleic acid;2ug/ml、FCS;2%

５．気相下培養
角膜上皮細胞を播種後14日目に空気曝露（エアーリフティング）を行う。空気曝露用の維持容器に滅菌したフィルターペーパーを設置し、重層化用培地をフィルターペーパーが浸る程度（約9ml）添加する。カルチャーインサート内側の培養液を注意深く除去し、カルチャーインサートをフィルターペーパー上に移し、CO₂インキュベーター内で培養する。培養液は3日目に交換する。3日間の空気曝露により培養角膜が完成する。

６．組織学的検索
空気曝露後3日目では角膜上皮は3〜4層となり、角層の形成が認められ、正常ヒト角膜とほぼ同様の構造を呈していた（図１、２）。

本発明が提供する角膜上皮シートは、角膜上皮の再生（再建）に利用される。また、本発明の角膜上皮シートを遺伝子治療に利用することも可能である。遺伝子治療には大きくin vivo 法とex vivo法があり、前者は遺伝子を直接生体内に導入する方法で、後者はいったん細胞を取り出し、遺伝子を導入した後再び体内に戻す方法である。遺伝子治療の現在の技術水準に鑑みると、培養角膜上皮に遺伝子を導入しさえすれば即座にex vivo法へと発展する。各種ウイルスベクターによるケラチノサイトへの遺伝子導入の有効性が示されてきており、特に、アデノウイルスベクターを用いた場合ほぼ100％のケラチノサイトに導入可能である。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

異種動物細胞非存在下、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上で増殖させた角膜上皮細胞を含有してなる角膜上皮シート。
無血清培地を使用して前記角膜上皮細胞を増殖させることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の角膜上皮シート。
血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用して前記角膜上皮細胞を増殖させることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の角膜上皮シート。
以下のステップを含んでなる、角膜上皮シートの作製方法：
(a)角膜上皮細胞を調製するステップ；
(b)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ；
(c)前記角膜上皮細胞を前記コラーゲンゲル上に播種ないし載置するステップ；
(d)異種動物細胞非存在下、前記角膜上皮細胞を培養して増殖させるステップ。
以下のステップを更に含むことを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の作製方法：
(e)前記角膜上皮細胞が増殖した後、最表層を空気に接触させるステップ。
前記ステップdが、無血清培地を使用して実施されることを特徴とする、請求の範囲第４項又は第５項に記載の作製方法。
前記ステップdが、血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用して実施されることを特徴とする、請求の範囲第４項又は第５項に記載の作製方法。
請求の範囲第１〜３項のいずれかの角膜上皮シートを移植材料として使用する移植方法。