JP5255846B2 - 生体内で細胞増殖可能な角膜内皮製剤 - Google Patents
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- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
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Description
〔2〕前記基材がコラーゲンである前記〔1〕に記載の製剤。
〔3〕シート状である前記〔1〕または〔2〕に記載の製剤。
〔4〕障害した角膜内皮の面積よりも小さい面積を覆うものである前記〔1〕〜〔3〕のいずれか1項に記載の製剤。
〔5〕障害した角膜内皮の面積の10〜90%の面積を覆うものである前記〔4〕に記載の製剤。
〔6〕移植後少なくとも3日間デスメ膜または角膜実質に接着し、その後
(1)剥離するものであるか、または
(2)基材が消失するものである
前記〔1〕〜〔5〕のいずれか1項に記載の製剤。
〔7〕水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑および角膜内皮炎からなる群より選ばれる疾患を治療するものである前記〔1〕〜〔6〕のいずれか1項に記載の製剤。
〔8〕前記〔1〕〜〔6〕のいずれか1項に記載の角膜内皮製剤を、それを必要とする対象に移植することを含む、水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑および角膜内皮炎からなる群より選ばれる疾患の治療方法。
〔9〕基材と、培養した角膜内皮細胞層とを含有してなる角膜内皮製剤を、障害した角膜内皮の面積よりも小さい面積を覆うように患者に移植する工程を含む角膜内皮細胞の増殖方法。
〔10〕基材と、培養した角膜内皮細胞層とを含有してなる角膜内皮製剤を患者に移植する工程を含む角膜内皮細胞の増殖方法であって、当該製剤は移植後少なくとも3日間デスメ膜または角膜実質に接着し、その後、
(1)当該製剤が剥離するか、または
(2)当該製剤の基材が消失する
ことを特徴とする増殖方法。
〔11〕生体内で細胞増殖可能な角膜内皮製剤の製造のための、基材と、当該基材上の培養した角膜内皮細胞層の使用。
〔12〕前記基材がコラーゲンである前記〔11〕に記載の使用。
〔13〕前記製剤がシート状である前記〔11〕または〔12〕に記載の使用。
〔14〕前記製剤が障害した角膜内皮の面積よりも小さい面積を覆うものである前記〔11〕〜〔13〕のいずれか1項に記載の使用。
〔15〕前記製剤が障害した角膜内皮の面積の10〜90%の面積を覆うものである前記〔14〕に記載の使用。
〔16〕前記製剤が移植後少なくとも3日間デスメ膜または角膜実質に接着し、その後
(1)剥離するものであるか、または
(2)基材が消失するものである
前記〔11〕〜〔15〕のいずれか1項に記載の使用。
〔17〕前記製剤が水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑および角膜内皮炎からなる群より選ばれる疾患を治療するものである前記〔11〕〜〔16〕のいずれか1項に記載の使用。
〔18〕前記〔1〕〜〔7〕のいずれか1項に記載の角膜内皮製剤、および当該剤を水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑および角膜内皮炎からなる群より選ばれる疾患の治療に使用しうることまたは使用すべきであることを記載した当該剤に関する記載物を含む商業パッケージ。
(1)細胞層が単層構造である。これは生体の角膜内皮細胞層が備える特徴の一つである。
(2)細胞層における細胞密度は約1,000〜約4,000細胞/mm2である。特に、成人をレシピエント(移植者)とする場合には約2,000〜約3,000細胞/mm2であることが好ましい。
(3)細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である。これは生体における角膜内皮細胞層を構成する細胞が備える特徴の一つである。本発明の製剤は生体の角膜内皮細胞層に類似し、生来の角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮するとともに、生体内で増殖能も発揮することができる。
(4)細胞層において細胞が規則正しく整列している。生体の角膜内皮細胞層においてはそれを構成する細胞は規則正しく整列しており、これによって角膜内皮細胞の正常な機能と高い透明性が維持され、また角膜の水分調整機能が適切に発揮されると考えられている。したがって、このような形態的な特徴を備えることにより、本発明の製剤は、生体における角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮することが期待される。
<1>角膜内皮細胞の採取および培養容器内(試験管内:インビトロ)での培養
角膜内皮細胞はレシピエント自身または適当なドナーの角膜から常法で採取される。しかし、同種由来の角膜内皮細胞を準備することが好ましい。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿等の培養容器に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、角膜内皮細胞が生育できる適当な培養液中で角膜内皮細胞を培養する。培養液としては例えば市販のDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)にFBS(ウシ胎仔血清)、b−FGF(basic−fibloblast growth factor)、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加したものを使用することができる。培養容器(培養皿)にはその表面にI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ角膜内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をFNC coating mix(登録商標)等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。かくして、角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われるからである。
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずtrypsin−EDTA等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に培養液を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。尚、ここでの遠心処理の条件としては、例えば、500rpm(30G)〜1000rpm(70G)、1〜10分を挙げることができる。
細胞浮遊液は、コラーゲンシート等の基材上に播種され、培養に供される。この際、最終的に製造される角膜内皮製剤において所望の細胞密度の細胞層が形成されるように播種する細胞数が調整される。具体的には細胞密度が約1,000〜約4,000細胞/mm2の細胞層が形成されるように細胞を播種する。培養は上記の初期培養などと同様の条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば3〜30日間である。
また、本発明の製剤は、生体内で生着した細胞が増殖できるため、障害した角膜内皮の面積の約10〜90%、好ましくは約10〜50%、さらに好ましくは約20〜40%を覆うものであってもよい。製剤を小さくすることにより、創口のサイズを最小限に留めることができるため、術後炎症が軽微であり、同時に術後感染の可能性を低くすることができる。
移植用培養角膜内皮細胞の調製
カニクイザル(3〜8才、雄、株式会社ケアリー)を安楽死させた後に眼球を摘出した。摘出眼より角膜組織からデスメ膜ごと角膜内皮細胞を採取し、ディスパーゼ処理を行って角膜内皮細胞を分離した。分離した角膜内皮細胞を、FNC coating mix(登録商標)でコーティングした培養用12ウェルプレート(コーニング製)に播種し(1×105cells/well)、1%ウシ胎児血清および2mg/ml bFGF(Gibco Invitrogen)を添加した培養液(DMEM、Gibco Invitrogen製)中、37℃、5%CO2の条件下にて培養を行い、コンフルエントに達したらTrypsin-EDTA処理により細胞を剥離させ、約1:3の密度で3回継代培養した。培養角膜内皮細胞を最終的に1:3の密度でコラーゲンシート(アサヒテクノグラス製)に播種し、前記と同様の条件下で3〜4週間培養し、角膜内皮シートを調製した。得られた角膜内皮シートを、移植実験に用いた。
培養角膜内皮移植術
カニクイザル(3〜5才、雌、株式会社ケアリー、日本クレア株式会社、有限会社ラボプロダクツ)4頭を塩酸ケタミンと塩酸キシラジンの混合麻酔の筋肉注射により全身麻酔を施した後、ケージから処置台へ運んだ。処置台にてマスクを用いた吸入麻酔を開始した後、全身状態の安定を確認した上で、4頭4眼(片眼)に対し、角膜と結膜の境界部分である輪部から1mm外側の強膜に約5〜6mmの強角膜切開を行い、同部位から角膜内皮細胞を機械的擦過により可能な限りすべて除去した(直径約9mm)。角膜内皮細胞を除去した範囲は、トリパンブルー染色により確認した。3眼に実施例1で得られた角膜内皮シートを移植した。コントロールとして、1眼に培養角膜内皮細胞なしのコラーゲンシートの移植を行った。シートの移植は、次のようにして行った。すなわち、前房内を眼内灌流液(BBS plus(登録商標))で洗浄した後、前房内の空間を保持するためにヒアルロン酸ナトリウム(オペガン(登録商標))を注入し、続いてスパーテルを用いて、シート全面に微量のフィブリン糊が塗布された5mm径の上記実施例1で得られた角膜内皮シート(細胞密度:2700個/mm2)またはコラーゲンシート(シートのみ)を前房内に挿入した。角膜内皮シートは、内皮細胞層が前房側になるように挿入した。次に、前房内にフィルター滅菌した空気を注入し、シートを角膜実質に接着させた。その後、約20〜30分間、処置したサルは、顔面を上向きの状態に維持させた。強角膜創を10-0ナイロン糸で縫合してから眼内からの前房水の漏出がないことを確認し、移植を終了させた。
移植後6ヶ月間、細隙灯顕微鏡による前眼部の観察と写真撮影、角膜厚測定、非接触型角膜内皮スペキュラーマイクロスコープ(コーナンメディカ、ノンコンロボSP−9000LC)による観察を行った。
角膜内皮細胞移植眼では、移植翌日および3日後にはデスメ膜に角膜内皮シートが接着しており角膜浮腫は軽度であった。2週後には角膜内皮シートは前房内に脱落していたが、角膜は透明化し、6ヶ月まで角膜の透明性を維持した(図1)。角膜厚は、移植直後には約1000μmの角膜浮腫を認めたが、次第に浮腫が消失して角膜厚は減少し、約3ヶ月でほぼ術前の角膜厚に回復した(図4)。6ヶ月での非接触型角膜内皮スペキュラーマイクロスコープの観察では角膜後面に約2400個/mm2の六角形細胞が観察された(図3)。術後6ヶ月の時点で脱落した角膜内皮シートの摘出を行ったが、その後も角膜の透明性は維持されており、内皮細胞密度の減少は認められなかった。また最終観察時まで拒絶反応の所見は認められなかった。一方、コントロールとして角膜内皮細胞のないコラーゲンシートのみを移植した1眼では、移植直後から顕著な角膜浮腫を生じ、経過中に改善することなく、角膜厚および内皮スペキュラーによる内皮細胞密度は測定不能であった(図4)。
角膜内皮の組織学的評価
実施例2で培養角膜内皮移植術を施行したカニクイザル4頭のうち、2頭をそれぞれ移植後6ヶ月に安楽死させ、摘出した角膜組織を走査型および透過型電子顕微鏡により観察した。
2頭とも角膜内面(本来の角膜内皮細胞が存在する部位)には、径約15−30マイクロメートルの多角形の角膜内皮細胞が一層に配列しており、細胞間には良好な接着が認められた。また、角膜内皮細胞と本来の基底膜であるデスメ膜の間には新たな基底膜層が形成されていた(図5)。このことから、角膜内皮細胞は角膜裏面に良好に接着しており、本来の角膜内皮細胞と同様の細胞生物的な構造を構築していることが明らかとなり、正常な角膜内皮機能を発揮していると考えられる。
移植後19ヶ月の評価
実施例2で培養角膜内皮移植術を施行したカニクイザル4頭のうち、1頭では角膜創傷治癒の長期観察を行った。移植後19ヶ月にわたって角膜の透明性は良好に維持され、非接触型角膜内皮スペキュラーマイクロスコープにより約1900個/mm2の角膜内皮細胞が維持された。また、スペキュラーマイクロスコープの画像解析データからは、変動係数(coefficient of variation;CV値)が0.33、六角形細胞率が60と角膜内皮細胞に関するパラメータは正常範囲にあり、角膜内皮細胞の状態が変動の少ない安定した状態にあることが明らかとなった(図6)。
生体内での角膜内皮細胞増殖能が低いカニクイザルで培養角膜内皮細胞移植を行い、6ヶ月間の長期観察を行った結果、密度約2400個/mm2の角膜内皮細胞が観察された。この結果より、移植した培養角膜内皮細胞が生体内で再び増殖を開始したことが示唆される。ヒトと同様に生体内では細胞増殖能が極めて低いと考えられているカニクイザル角膜内皮細胞が、一旦生体外へ取り出して適切な環境で培養することによって再び増殖能を獲得し、移植後も増殖能が維持されることが明らかとなった。
また、実施例4の19ヶ月間の長期評価の結果から、本発明の製剤は、長期間安定かつ良好に角膜内皮の機能を保持できることが示された。
角膜内皮細胞の解析
実施例1と同様の方法で調製された角膜内皮シートを実施例2と同様の方法でカニクイザル(4才、雌、株式会社ケアリー)1頭に角膜内皮移植術を施した。移植後1週間で内皮シートは脱落したが、その時点での角膜を摘出してアリザリン染色を行い、さらにインプレッションサイトロジー法により、内皮細胞のみを採取した。採取したサンプルを、オス由来の細胞にのみ認められるY染色体に特異的に発現している遺伝子であるアメロゲニン遺伝子(AMEL)およびSRY遺伝子についてPCR法による解析を行った。その結果、アリザリン染色では、内皮シートが接着していた周辺部位にデスメ膜上に角膜内皮細胞が増殖進展していることが確認された(図7)。また、シート脱落後の角膜内皮組織には、オス由来のアメロゲニンおよびSRY遺伝子が検出され、これらのデスメ膜上に増殖した細胞はオス(すなわち内皮シート)に由来する角膜内皮細胞であることが示唆された(図8)。
本出願は、日本で出願された特願2006−011521(出願日:2006年1月19日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (6)
- 基材と、培養したヒト由来の角膜内皮細胞層とを含有してなる、生体内で細胞増殖可能な角膜内皮製剤であって、障害した角膜内皮の10〜90%の面積を覆うものである、製剤。
- 前記基材がコラーゲン、ゼラチン、セルロース、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ハイドロキシアパタイトまたは羊膜である請求項1に記載の製剤。
- シート状である請求項1または2に記載の製剤。
- 障害した角膜内皮の面積の10〜50%の面積を覆うものである請求項1〜3のいずれか1項に記載の製剤。
- 移植後少なくとも3日間デスメ膜または角膜実質に接着し、その後
(1)剥離するものであるか、または
(2)基材が消失するものである
請求項1〜4のいずれか1項に記載の製剤。 - 水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑および角膜内皮炎からなる群より選ばれる疾患を治療するものである請求項1〜5のいずれか1項に記載の製剤。
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