JPWO2010084970A1 - 標的細胞誘導用フィーダー細胞 - Google Patents

標的細胞誘導用フィーダー細胞 Download PDF

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Abstract

不死化遺伝子、及び自殺遺伝子を導入したことを特徴とする標的細胞誘導用フィーダー細胞及び該標的細胞誘導用フィーダー細胞を用いた標的細胞シートの製造方法を提供する。

Description

本発明は、標的細胞誘導用フィーダー細胞及び該標的細胞誘導用フィーダー細胞を用いた標的細胞シートの製造方法に関する。
角膜上皮幹細胞は角膜輪部に存在すると考えられており、重症の化学外傷や熱傷、Steven-Johnson症候群や眼類天疱瘡等の難治性疾患により角膜輪部の幹細胞が傷害されると、角膜上皮面は結膜組織で覆われ重症の視力障害に陥ってしまう。このような傷害の治療方法としては、輪部角膜移植等が行われているが、ドナー不足や同種移植による拒絶反応の問題がある。
そこで、近年、自己の細胞を用いた培養角膜上皮細胞移植、つまり角膜上皮細胞や口腔粘膜細胞などの自己細胞を利用して上皮細胞シートを作製し移植する方法が試みられており、ドナー不足や拒絶反応の問題をクリアする方法として既に臨床応用されている。
このような上皮細胞シートの作製方法としては、自己の角膜上皮細胞や口腔粘膜細胞を利用して、一般的にはマウス由来の繊維芽細胞（３Ｔ３細胞）をマイトマイシンＣで不活性化させた後にフィーダー（Feeder）細胞として羊膜やコラーゲン等の基質上あるいは温度応答性培養皿上で共培養する方法も知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。
しかしながら、この方法ではマウス由来の細胞を共培養に用いているため、異種細胞からの感染並びに異種細胞混入の危険性が考えられる。
上記した異種細胞混入等の問題を解決するために、フィーダー細胞としてヒト繊維芽細胞を用いた角膜上皮細胞シートの製造方法も知られている（特許文献４参照）。
しかしながら、ヒト繊維芽細胞を用いて角膜上皮細胞シートを製造した場合においても、フィーダー細胞の除去が簡便ではないという問題があった。
ＷＯ２００４／０７８２２５号パンフレット ＷＯ２００６／００３８１８号パンフレット ＷＯ２００６／０７５６０２号パンフレット ＷＯ２００５／０８７２８５号パンフレット
本発明は、標的細胞誘導用フィーダー細胞、該標的細胞誘導用フィーダー細胞を用いた標的細胞シートの製造方法、標的細胞に対する誘導候補因子の機能決定方法及び誘導候補因子の遺伝子を導入したフィーダー細胞を用いた標的細胞の培養方法並びに該標的細胞の移植方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、望ましくはシートを得ようとする標的細胞と同種生物由来の細胞であって、ヒト角膜上皮細胞と解剖学的に隣接する細胞に、不死化遺伝子及び自殺遺伝子を導入することによって、フィーダー細胞の長期継代培養が可能となり、フィーダー細胞が不要になれば選択薬剤により死滅させることができ、さらにフィーダー細胞を選択薬剤で死滅させることができることから標的細胞との接着培養もできるという優れた効果を有することを見出した。さらに、前記フィーダー細胞にマーカー遺伝子を導入することによって、標的細胞にフィーダー細胞が混入した時には視覚的に確認することもできるという優れた効果を有することを見出し、この知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］不死化遺伝子、及び自殺遺伝子を導入したことを特徴とする標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［２］標的細胞に隣接する細胞由来である上記［１］記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［３］ヒト角膜実質細胞由来である上記［１］記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［４］ヒト皮膚線維芽細胞由来である上記［１］記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［５］不死化遺伝子がｈＴＥＲＴ遺伝子である上記［１］〜［４］のいずれかに記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［６］自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼ遺伝子である上記［１］〜［５］のいずれかに記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［７］さらに、マーカー遺伝子を導入したことを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれかに記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［８］マーカー遺伝子がＥＧＦＰ遺伝子である上記［７］記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［９］標的細胞が細胞培養時にフィーダー細胞を必要とするヒト由来の細胞である上記［１］〜［８］のいずれかに記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［１０］標的細胞がヒト角膜上皮細胞、ヒト角膜内皮細胞、ヒト結膜上皮細胞、又はヒト腎臓由来細胞、である上記［１］〜［９］のいずれかに記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［１１］さらに、標的細胞の刺激因子の遺伝子を導入したことを特徴とする上記［１］〜［９］のいずれかに記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［１２］標的細胞の刺激因子が、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンファミリー、免疫ブログリンスーパーファミリー、セレクチンファミリー、ニューロリギン、ニューレキシンおよび細胞表面プロテオグリカンから選ばれる１以上のヒトの細胞接着分子；上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリー、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリー、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ファミリーおよび線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーから選ばれる１以上の増殖因子；又はJaggedファミリーおよびDelta様メンバーから選ばれる１以上のNotchリガンドである上記［１１］記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞、
［１３］（ａ）細胞培養用キャリアを用いて上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞を培養する工程、（ｂ）前記（ａ）工程の細胞培養用キャリア上に標的細胞を播種ないし静置し、標的細胞を培養し増殖させる工程、を含んでなる標的細胞シートの製造方法、
［１４］さらに、（ｃ）標的細胞誘導用フィーダー細胞と標的細胞シートとを分離する工程を含んでなる上記［１３］記載の製造方法、
［１５］前記（ｃ）工程における分離が、標的細胞シートを、自殺遺伝子で誘導される毒性物質の前駆体で処理することであることを特徴とする上記［１４］記載の製造方法、
［１６］自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼ遺伝子であり、自殺遺伝子で誘導される毒性物質の前駆体がガンシクロビルである上記［１５］記載の製造方法、
［１７］標的細胞がヒト角膜上皮細胞、ヒト角膜内皮細胞、ヒト結膜上皮細胞、又はヒト腎臓由来細胞である上記［１３］〜［１６］のいずれかに記載の製造方法、
［１８］前記（ａ）又は（ｂ）工程で、ヒト血清を用いる上記［１３］〜［１７］のいずれかに記載の製造方法、
［１９］（ａ’）細胞培養用キャリアを用いて、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載のフィーダー細胞を培養する工程、（ｂ’）上記［１］〜［１０］のいずれかに記載のフィーダー細胞に標的細胞の誘導候補因子の遺伝子を導入し、得られた誘導候補因子の遺伝子導入フィーダー細胞を細胞培養用キャリアを用いて培養する工程、（ｃ’）前記（ａ’）工程および（ｂ’）工程の細胞培養用キャリア上にそれぞれ標的細胞を播種ないし静置し、標的細胞を培養し増殖させる工程、および（ｄ’）各細胞培養用キャリア上で培養された細胞を評価する工程、を含んでなる標的細胞に対する誘導候補因子の機能決定方法、
［２０］（i）本発明のフィーダー細胞に標的細胞の誘導候補因子の遺伝子を導入する工程、（ii）前記工程(i)で得られた誘導候補因子の遺伝子導入フィーダー細胞を細胞培養用キャリアを用いて培養する工程、および（iii）前記（ii）工程の細胞培養用キャリア上にそれぞれ標的細胞を播種ないし静置し、標的細胞を培養し増殖させる工程、を含んでなる標的細胞の培養方法、及び
［２１］上記［１３］〜［１８］のいずれかに記載の標的細胞シートの製造方法により得られた標的細胞シートを目的とする部位に移植する工程を含むこと特徴とする標的細胞の移植方法、
に関する。
本発明のフィーダー細胞を用いることにより、標的細胞を培養し、標的細胞の細胞シートを製造することができる。また、本発明のフィーダー細胞を用いることにより、ヒト角膜内皮細胞、ヒト結膜上皮細胞、ヒト腎臓由来細胞、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞等を簡便に培養することができる。
図１は、実施例１で用いた、ヒト角膜実質細胞への遺伝子導入に用いる組換えレンチウイルスベクターの構成を示す。図１Ａは、実施例１のｈＴＥＲＴ遺伝子、IRES-EGFP遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を導入したレンチウイルスベクターを示す。図１Ｂは、実施例１の配列番号３で示されるＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子を導入したレンチウイルスベクターを示す。図中、ＬＴＲは長端末反復（Long terminal repeat）を表し、ＥＦはヒト伸長因子（１αサブユニット）遺伝子プロモーターを表し、ｈＴＥＲＴはヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子を表し、ＩＲＥＳは配列内部リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site）を表し、ＥＧＦＰは高感度緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein）の遺伝子を表し、ＰＧＫはグリセレートキナーゼ（phosphoglycerate kinase）プロモーターを表し、Ｎｅｏｍｙｃｉｎｒはネオマイシン耐性遺伝子を表し、ＴＫはHSVチミジンキナーゼを表し、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎｒはピューロマイシン耐性遺伝子を表す。 図２は、ヒト角膜実質細胞へのトランスフェクションの模式図を示す。 図３は、ヒト角膜実質細胞に対するガンシクロビル処置の影響を示す。左図は、ｈＴＥＲＴ遺伝子を導入され、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を導入されていないヒト角膜実質細胞のガンシクロビルの処置後の細胞数の変化（％）を示し、右図は、ｈＴＥＲＴ遺伝子及びＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を導入されたヒト角膜実質細胞のガンシクロビルの処置後の細胞数の変化（％）を示す。グラフの値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 図４Ａは、ヒト角膜上皮細胞シートの製造方法の模式図を示す。図４Ｂは、上から順に実施例２で得られたフィーダー細胞、ヒト角膜上皮細胞、ヒト角膜上皮細胞シートを示す。 図５は、本発明の遺伝子導入フィーダー細胞を用いて細胞培養した写真である。標的細胞はそれぞれ、Ａがヒト結膜上皮細胞、Ｂがヒト角膜内皮細胞、Ｃがヒト腎臓由来細胞（２９３Ｔ細胞）を示す。 図６は、ヒト血清を用いた培養で得られたヒト角膜上皮細胞を示す。 図７は、マウス角膜障害モデルにおけるヒト角膜上皮細胞シートの移植を示す。図７Ａは培養角膜上皮細胞シートの移植手順を示す。図７Ｂはマウスの輪部を含めた角膜上を５０％エタノールで浸すことで角膜上皮細胞層を完全に除去し、処除去置後１５日目における角膜を示す。図７Ｃはマウスの輪部を含めた角膜上を５０％エタノールで浸すことで角膜上皮細胞層を完全に除去し、除去直後に実施例８で得られたヒト角膜上皮細胞シートを移植し、移植後７日目における角膜を示す。Ｄは前記移植後、３−５層に重層化した角膜上皮細胞をＨＥ染色し、顕微鏡観察した結果を示し、矢印部分は重層化した角膜上皮細胞を示す。Ｅは移植後の角膜上皮細胞のヒトミトコンドリア(緑色)とＤＡＰＩ(青色)染色結果を示し、矢印部分はヒト角膜上皮細胞を示す。Ｆは移植後の角膜上皮細胞のサイトケラチン３（緑色）とＤＡＰＩ（青色）染色結果を示し、矢印部分はヒト角膜上皮細胞を示す。 図８は、ヒト角膜実質細胞への遺伝子導入に用いる組換えレンチウイルスベクターの構成を示す。図８Ａは、実施例９のＤＬＬ１・ブラストシジン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクター又はＤＬＬ４・ブラストシジン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクターを示す。図８Ｂは、実施例９のＥ−カドヘリン・ハイグロマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクターを示す。図中、ＬＴＲは長端末反復（Long terminal repeat）を表し、Ψはパッケージングシグナルを表し、ＰＵｂＣはヒトユビキチン（human ubiquitin C）遺伝子プロモーターを表し、ＤＬＬ１はDelta-like 1遺伝子を表し、ＤＬＬ４はDelta-like 4遺伝子を表し、ＰＳＶ４０はＳＶ４０遺伝子プロモーターを表し、ＥＭ７は大腸菌を発現させるためのＥＭ７遺伝子プロモーターを表し、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｒはブラストシジン耐性遺伝子を表し、ＰＥＦはヒト伸長因子（１αサブユニット）遺伝子プロモーターを表し、Ｅ−cadherinは、Ｅ−カドヘリン遺伝子を表し、ＰＰＧＫはグリセレートキナーゼ（phosphoglycerate kinase）遺伝子プロモーターを表し、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒはハイグロマイシン耐性遺伝子を表す。 図９は、ＲＴ−ＰＣＴの測定結果を示す。図９ＡはｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞のＲＴ−ＰＣＴの測定結果を示し、図９Ｂは、DLL1、DLL4又はE-cadherin＋ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞のＲＴ−ＰＣＴの測定結果を示す。 図１０は実施例１０のヒト角膜上皮細胞のコロニー形成率を示す。グラフの値（％）は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。 図１１は、遺伝子導入ヒト角膜実質細胞およびヒト皮膚線維芽細胞におけるヒト角膜上皮細胞コロニーの形成を示す写真である。図１１ＡはｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を用いたヒト角膜上皮細胞コロニーの形成結果を示し、図１１ＢはｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト皮膚線維芽細胞を用いたヒト角膜上皮細胞コロニーの形成結果を示す。 図１２は、遺伝子導入ヒト角膜実質フィーダー細胞を用いた角膜内皮細胞培養結果の写真である。
本発明の第一の態様は、不死化遺伝子及び自殺遺伝子を導入したことを特徴とする標的細胞誘導用フィーダー細胞株である。以下、第一の態様について説明する。
本発明の標的細胞誘導用フィーダー細胞株は、不死化遺伝子、及び自殺遺伝子をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターにより宿主細胞に導入することにより作製することができる。
本発明において「不死化遺伝子」とは、細胞を無限分裂寿命化する遺伝子を意味し、特に限定されないが、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｒａｓ等の癌遺伝子、アデノウイルスＥ１Ａ、ＳＶ４０由来の大型Ｔ抗原遺伝子（ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子）、ポリオーマウイルスの大型Ｔ抗原遺伝子、パピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のＥ６及びＥ７遺伝子又はヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human telomerase reverse transcriptase：ｈＴＥＲＴ）遺伝子等が例として挙げられ、テロメラーゼから派生する遺伝子、又は、テロメラーゼの発現もしくは活性を調節する遺伝子（例えば、myc遺伝子がテロメラーゼ活性を高めると言われている）等も例として挙げられ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子、又はヒトテロメラーゼ逆転写酵素が好ましい。前記ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子は、公知のＤＮＡ型腫瘍ウイルスの腫瘍抗原（Ｔ抗原）遺伝子である。前記ｈＴＥＲＴ遺伝子は、正常細胞のＴＥＲＴ遺伝子由来である。本発明においては、特にヒトテロメラーゼ遺伝子（ｈＴＥＲＴ）を好適に用いることができる。ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子としては、特に限定されないが、野生型のＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子（ＳＶ４０ ＴＡｇ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿００１６６９）を用いてもよく、温度感受性の変異を有するＳＶ４０ｔｓＴ抗原遺伝子を用いてもよい。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）としては、特に限定されないが、全長ヒトテロメラーゼ逆転写酵素アイソフォーム１（ｈＴＥＲＴ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿００３２１９；配列番号１、アミノ酸配列は配列番号２で示される）を好適に用いることができる。哺乳類の体細胞では染色体末端に存在するテロメアが細胞分裂ごとに短縮し、一定の分裂回数の後、増殖が停止する。テロメラーゼ逆転写酵素は、このテロメア長を維持する酵素であり、この遺伝子を導入することにより細胞分裂回数を延長して細胞を不死化できることが見いだされている（Counter et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95, 14723-14728: 1998）。また、上記した不死化遺伝子は単独又は２以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明において「自殺遺伝子」とは、細菌やウイルス由来の酵素であって、活性の低い抗ウイルス剤を代謝して強い細胞障害活性のある物質に変換させる働きを有する酵素をコードする遺伝子を意味し、このような自殺遺伝子が導入された細胞は、抗ウイルス剤（以下、「自殺遺伝子で誘導される毒性物質の前駆体」ともいう。）の投与により選択的に死滅する。従って、自殺遺伝子をフィーダー細胞に導入した場合、抗ウイルス剤の投与により目的に応じてフィーダー細胞を選択的に除去することができる。自殺遺伝子と抗ウイルス剤との組み合わせとしては、特に限定されないが、単純ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼ（Herpes Simplex Virus-thymidine kinase；ＨＳＶ−ＴＫ、以下、「ＴＫ」とも略称する。）遺伝子と、抗ウイルス剤として臨床で用いられているガンシクロビル（Ganciclovir：ＧＣＶ）又はアシクロビル（aciclovir：ＡＣＶ）との組み合わせ、大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子と抗菌剤である５−フルオロシトシンとの組み合わせ等が例として挙げられる（Elion GB. Am. J. Med. 73, 7, 1982；Craig AM. Proc. Acad. Sci. USA 89, 33, 1992）。その有効性が既に動物実験にて証明されており（Moolten FL, Wells JM:J Natl Cancer Inst. 82:297-300, 1990；Culver KW, Ram Z, Wallbridge S, Ishii H, Oldfield EH. Science 1992；256：1550）、ヒト前立腺癌の遺伝子治療の臨床応用においてもその有効性が確認されているという点から、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子（配列番号３）と、ガンシクロビル又はアシクロビルとの組み合わせが好ましい。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子は、ウイルス特有のチミジンキナーゼであり、３７６アミノ酸（配列番号４）からなるＨＳＶ−ＴＫをコードしている。ＨＳＶ−ＴＫの基質特異性はヒト細胞が有するチミジンキナーゼとは異なっており、グアノシンの類似物質であるアシクロビル（ＡＣＶ）やガンシクロビル（ＧＣＶ）をリン酸化する活性を有する（Moolten FW and Wells JM. Tumor chemosensitivity conferred by inserted herpes themidine kinase genes: paradigm for a prospective cancer control strategy. Cancer Res 46:5276-5281, 1986.、Reardon JE. Herpes simplex virus type 1 and human DNA polymerase interactions with 2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate analogues: kinetics of in corporation into DNA and induction of inhibition. J Biol Chem 264:19039-19044, 1989.）。アシクロビル又はガンシクロビルは、基質とするキナーゼを発現していない細胞に対しては毒性を示さないが、ウイルス感染、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子導入等によりＨＳＶ−ＴＫが発現している細胞では、アシクロビル又はガンシクロビルはリン酸化され、一リン酸化物となり、さらには内在性のグアニル酸キナーゼとチミジンキナーゼにより一リン酸化物から二、三リン酸化物へと変換される。この最終産物である三リン酸化物がＤＮＡポリメラーゼ阻害やＤＮＡ伸長障害を引き起こすことで細胞に強い障害を与え、最終的に細胞を死に至らせる。このようにＨＳＶ−ＴＫはアシクロビル又はガンシクロビルとの組み合わせにより生物活性を示す。
本発明の標的細胞誘導用フィーダー細胞株は、特に限定されないが、視覚的に細胞を判別が可能になる点からマーカータンパク質の発現能を保持していることがより好ましい。本発明の標的細胞誘導用フィーダー細胞株が含有するマーカー遺伝子としては、ＥＹＦＰ（enhanced yellow fluorescent protein）遺伝子、ＥＣＦＰ（enhanced cyan fluorescent protein）遺伝子、ＤｓＲｅｄ１遺伝子又はＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）遺伝子等が例として挙げられ、ＥＧＦＰ遺伝子が好ましい。本発明に用いる本発明の標的細胞誘導用フィーダー細胞は、マーカータンパク質の発現により、視覚的に細胞の残存を確認することができ、移植時のフィーダー細胞の混入のリスクを低減させることができる。
本発明で使用される発現ベクターとしては、特に限定されないが、プラスミドベクター、又はウイルスベクター等が例として挙げられ、組み換えウイルスベクター産生細胞の培養上清をろ過し、目的とする細胞に添加するだけで効率よく遺伝子導入が可能である点でウイルスベクターが好ましい。プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ等が例として挙げられる。ウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、レンチウイルス等のレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、センダイウイルス等が例として挙げられ、レンチウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルスが好ましい。上記発現ベクター内のプロモーターの種類等を含めた構成は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されない。上記発現ベクターに含まれるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭｕＭＬＶ ＬＴＲ、ヒトＣＭＶ、ヒトＥＦ１α、ヒトＵｂＣ、ＰＧＫ等が例として挙げられる。
上記した遺伝子の導入方法としては、特に限定されないが、例えば、レンチウイルス（Invitrogen社ViraPowerレンチウイルス発現システム)、レトロウイルス（IMGENEX社RetroMaxレトロウイルス発現システム、タカラバイオ社Retrovirus Constructive System、Ambionm社pSilencer Retro System)、アデノウイルス（MicroBix社AdMaxシステム、Invitrogen社ViraPowerアデノウイルス発現システム）等のウイルスシステム又はＨＶＪリポソーム等を用いて行う方法が例として挙げられる。
また、上記した不死化遺伝子、自殺遺伝子、所望によりマーカー遺伝子の導入の順番は、特に限定されず、いずれから導入してもよいが、培養の容易さの点から不死化遺伝子を最初に導入することが好ましい。
上記した遺伝子を発現ベクターにより導入する宿主細胞としては、通常、標的細胞と同種生物由来の細胞を用いればよい。また、特に限定されないが、解剖学的に標的細胞に隣接した細胞が好ましく、例えば、標的細胞がヒト角膜上皮細胞又はヒト角膜内皮細胞である場合、前記宿主細胞としては、ヒト角膜実質細胞が好適な例として挙げられる。ヒト角膜実質細胞は、例えば、摘出された眼組織から角膜組織を単離し、はさみ等で細かく（約１ｍｍ角）に切断し、得られた角膜断片を、ＩＶ型コラゲナーゼで消化することにより得ることができる。角膜実質細胞は、ウシ胎児血清や仔ウシ血清１０〜２０％を含む適当な液体培地、例えばイーグルＭＥＭ培地、ダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培地、ハム培地Ｆ１２、勝田培地ＤＭ−１６０等に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中で培養され、トランスフェクションに供される。また、前記宿主細胞としては、前記したように、標的細胞と同種生物由来の細胞であれば特に限定されず、例えば皮膚細胞を用いることができ、好ましくは、皮膚線維芽細胞を用いることもできる。例えば、ヒト皮膚細胞由来の遺伝子導入フィーダー細胞を用いてヒト角膜上皮細胞シート等を作製することができる。
当該遺伝子導入の後の細胞株の樹立、継代に関して、一般的な動物細胞培養技術であれば特に限定されず、液体培地、例えばイーグルＭＥＭ培地、ダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培地（Dulbecco's modified Eagle's medium；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ham's F12 medium）、勝田培地ＤＭ−１６０等で培養されてもよい。培養温度、培地ｐＨ、ＣＯ２濃度等の条件は、動物細胞培養において通常使用される一般的な条件を適宜採用することができる。２〜３日ごとに新鮮な培地に交換し、細胞増殖が飽和点に達した時に継代する。ヘテロな集団でもかまわないが、一旦、細胞増殖が止まってからも培養を続け、再増殖を始めた細胞群を単クローンの細胞群として分別した方が好ましい。クローンの分離方法は特に限定されないが、例えば、以下のようにして行うことができる。トリプシンとＥＤＴＡ溶液を浸染させた小径の濾紙を目的のクローン細胞群上に静置し、培養容器より細胞を剥離して濾紙に付着させる。濾紙小片に付着したクローン細胞群を、濾紙ごと別の培養容器に移す。また、コロニーをピックアップする方法、限界希釈法や、セルソーターを用いる方法によってもクローンを分離することができる。
本発明のフィーダー細胞の標的細胞としては、細胞培養時にフィーダー細胞を必要とする細胞であれば特に限定されないが、細胞培養時にフィーダー細胞を必要とするヒト由来の細胞が好ましく、具体例として、ヒト角膜上皮細胞、又はヒト結膜上皮細胞等の眼上皮細胞；ヒト角膜内皮細胞；ヒトｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）又はヒトＥＳ細胞（Embryonic Stem cells）等の幹細胞が好適な例として挙げられ、樹立細胞株は容易に増殖できるという点でヒト腎臓由来細胞等も好適な例として挙げられる。
本発明のフィーダー細胞は、さらに標的細胞の刺激因子の強制発現が可能である。前記標的細胞の刺激因子としては、特に限定されず、標的細胞の種類特異的に決定されうる刺激因子であればよい。このような標的細胞の刺激因子としては、例えば、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンファミリー、免疫ブログリンスーパーファミリー、セレクチンファミリー、ニューロリギン、ニューレキシン、細胞表面プロテオグリカン等のヒトの細胞接着分子；上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリー、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリー、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ファミリー又は線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー等の増殖因子；Jaggedファミリー、Delta様メンバー等のNotchリガンド等が挙げられる。前記刺激因子の遺伝子を本発明のフィーダー細胞に導入することにより、細胞表面に強制発現させることが可能である。これらをはじめとする細胞−細胞間に影響を与えうる因子群を本フィーダー細胞から細胞表面に強制発現させることができる。これによって、角膜細胞又はｉＰＳ細胞等の標的細胞の増殖、分化に影響を与えることが可能になり、制御困難であった標的細胞をコントロールできる。例えば、ＤＬＬ蛋白質強制発現フィーダー細胞を用いて細胞増殖抑制作用をコントロールできる。また、前記した増殖因子の発現によって細胞の増殖促進又は正常形態の維持をはじめとする増殖維持培養効果を改善できる。
前記したように、本発明のフィーダー細胞は、現在まで制御不能であった細胞を適切にコントロールできるようにする再生医療における強力なツールとなりうる。前記標的細胞の刺激因子の遺伝子は、特に限定されず、１又は２以上を本発明のフィーダー細胞に導入することができる。
前記カドヘリンスーパーファミリーとしては、例えば、クラシックカドヘリン又はノンクラシックカドヘリン等が挙げられる。クラシックカドヘリンとしては、例えば、Ｅ−カドヘリン（E-cadherin）、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｒ−カドヘリン、Ｍ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン等が挙げられる。ノンクラシックカドヘリンとしては、例えば、デスモコリン（desmocollin）、デスモグレイン(desmoglein)、Ｔ−カドヘリン、プロトカドヘリン、Fat等が挙げられる。インテグリンファミリーは、２本の異なる膜１回貫通型タンパク質（ａ鎖とｂ鎖）のヘテロ二量体分子である。１９種のａ鎖と、８種のｂ鎖がある。少なくとも２５種のａｂヘテロ二量体が存在する。分子の大部分は細胞外に突き出、細胞内ドメインにはテーリン、ビンキュリン、テンシン及びａ−アクチニンを介してアクチンフィラメントが結合する。インテグリンファミリーとしては、例えば、LFA-1、VLA1-5、VLA-4等が挙げられる。免疫ブログリンスーパーファミリーとしては、例えば、免疫系ファミリー、神経系ファミリー等が挙げられる。免疫系ファミリーとしては、例えば、Ｉｇ、ＴＣＲ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６（FcγRIII）、ＣＤ５６(NCAM-1）、ＣＤ５７、ＭＨＣ（クラスI、クラスII）等が挙げられる。神経系ファミリーとしては、例えば、ＩＣＡＭ−１等が挙げられる。セレクチンファミリーとしては、例えば、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン又はＬ−セレクチン等が挙げられる。ニューロリギンとしては、例えば、ニューロリギン１、ニューロリギン２、SynCAM1等が挙げられる。前記Delta様メンバーとしては、例えば、Dll 1(Delta-like 1)、Dll 3(Delta-like 3)又はDll 4 (Delta-like 4)等が挙げられる。前記ＥＧＦファミリーとしては、特に限定されないが、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレギュリンAmphiregulin：AR) 、ＨＢ−ＥＧＦ、エピレギュリン（Epiregulin：EPR)、ベータセルリン（Betacellulin：BTC) 、ニューレギュリン（Neuregulins 1-4 ：NRG 1-4)、テラトカルシノーマ由来増殖因子 （Teratocarcinoma Derived Growth Factor (Cripto 1)）等が挙げられる。前記ＶＥＧＦファミリーとしては、特に限定されないが、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子 placental growth factor)−１、ＰｌＧＦ−２等が挙げられる。前記ＩＧＦファミリーとしては、特に限定されないが、例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２等が挙げられる。前記ＦＧＦファミリーとしては、特に限定されないが、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）等が挙げられる。前記Jaggedファミリーとしては、例えば、JAG1,JAG2等が挙げられる。
本発明の第二の態様は、（ａ）細胞培養用キャリアを用いて上記のように調製した標的細胞誘導用フィーダー細胞を培養する工程、（ｂ）前記（ａ）工程の細胞培養用キャリア上に標的細胞を播種ないし静置し、標的細胞を培養し増殖させる工程、を含んでなる標的細胞シートの製造方法である。以下、第二の態様について説明する。標的細胞をヒト角膜上皮細胞とした場合を例として、ヒト角膜上皮細胞シートの製造方法の模式図を図４Ａに示す。
工程（ａ）におけるフィーダー細胞培養用キャリアとしては、特に限定されないが、温度応答性細胞培養皿、羊膜又はコラーゲンゲル等が好適な例として挙げられる。工程（ａ）における、フィーダー細胞培養用キャリアを用いた前記フィーダー細胞の培養方法は、特に限定されないが、例えば、温度応答性細胞培養皿、羊膜若しくはコラーゲンゲルの表面に標的細胞誘導用フィーダー細胞を播種する又は、コラーゲンゲルの内部に標的細胞誘導用フィーダー細胞を包含させて培養する方法が例として挙げられる。温度応答性細胞培養皿としては、特に限定されないが、例えば、特開２００６−３２０３０４号、特開２００８−２７１９１２号に記載ものが好適な例として挙げられる。温度応答性細胞培養皿の市販品としては、アップセル（商品名；セルシード社製）等が例として挙げられる。羊膜又はコラーゲンゲルは標的細胞の培養基質として機能する。「羊膜」とは、哺乳動物において子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲンに富む実質組織上に基底膜、上皮層が形成されて構成される。羊膜としてヒト羊膜を使用することが好ましい。ヒト羊膜は、例えば分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜、胎盤等から採取することができる。具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、胎盤及び臍帯からなる一体物を処理、精製することによりヒト羊膜を調製することができる。処理、精製方法は、特開平５−５６９８号に記載される方法等の公知の方法を採用できる。すなわち、分娩時に得られる胎仔膜より羊膜を剥離し、超音波洗浄等の物理的処理及び酵素処理等により残存組織を除去し、適宜洗浄工程を経てヒト羊膜を調製することができる。
このように調製したヒト羊膜は、使用時まで凍結して保存しておくことができる。ヒト羊膜の凍結は、例えば−８０℃、ＤＭＥＭとグリセロールとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。凍結保存することにより操作性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。
羊膜をそのまま使用することもできるが、羊膜から掻爬処理等によって上皮を除去したものを使用することが好ましい。上皮の除去によって、抗原性が低下する。例えば、上記のように凍結保存したヒト羊膜を解凍した後、ＥＤＴＡやタンパク分解酵素で処理して細胞間の接着を緩め、そしてセルスクレイパー等を用いて上皮を掻爬することにより、上皮が除去されたヒト羊膜を調製することができる。また、羊膜を予め乾燥処理しておくことが好ましい。ここでの乾燥処理としては、例えば、凍結乾燥、風乾、真空乾燥、減圧乾燥等を例として挙げることができる。中でも凍結乾燥を採用することが好ましい。凍結乾燥処理の場合は羊膜の柔軟性が低下しにくいからである。
コラーゲンゲルの原材料となるコラーゲンの種類は特に限定されず、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン等を用いることができる。複数の種類のコラーゲンが混在するものを用いることもできる。これらのコラーゲンは、ブタ、ウシ、ヒツジ等の動物の皮膚、軟骨等の結合組織から、酸可溶化法、アルカリ可溶化法、酵素可溶化法等により抽出、精製することができる。なお、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシン等の分解酵素で処理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるアテロコラーゲンとしたものを用いることが好ましい。コラーゲンゲルの材料として羊膜由来、特にヒト羊膜由来のコラーゲンを用いてもよい。ここで、羊膜由来とは、広く羊膜を出発原料として得られたものであることを意味する。
コラーゲンゲルの内部に前記フィーダー細胞（以下、遺伝子導入フィーダー細胞ともいう。）を包含させて培養する場合、コラーゲンゲル包埋培養法を用いることができる。この場合のコラーゲンゲルの作製方法の具体例を示す。例えば、Ｉ型コラーゲンを用いて中和コラーゲン液を調製する。これを培養容器（例えばカルチャーインサート）に添加し、室温で１０分間程度静置させてゲル化させる。次に、上述の方法によって予め培養しておいた対数増殖期の上記フィーダー細胞をこのゲルに混和し、再度ゲル化させる。その後、静置培養する。以上の手順によってフィーダー細胞を含有するコラーゲンゲルが得られる。
コラーゲンゲルの表面に前記フィーダー細胞を播種して培養する場合、付着コラーゲンゲル培養法又は浮遊コラーゲンゲル培養法を用いることができる。付着コラーゲンゲル培養法では、コラーゲンゲルを培養皿に作製し、フィーダー細胞の細胞懸濁液を前記ゲル上に播種し、細胞がゲルに接着した後、通常の単層培養法と同様に培養を行う。ゲル内に、血清、その他の生理活性物質を入れる場合には、ゲル調製用コラーゲン混合液を作った際に混ぜておく。培養液は急速にコラーゲンゲル中に浸入していくので、ゲル中に血清等を入れることは必ずしも必要ではない。浮遊コラーゲンゲル培養法では、前記付着コラーゲンゲル培養法で培養して、細胞がコラーゲンゲルに接着し単層を形成した後に、ゲルを培養皿よりはがし、培養液中にフィーダー細胞の接着したまま浮遊させる。ゲルをはがす際には、注射針またはピンセットを用いて培養皿にそって一周回した後に、周辺から中央に向かって針を押すようにすればゲルは培養液中に浮遊する。コラーゲンゲルは、市販品として、例えばコラーゲンゲル培養キット（新田ゼラチン社製）を用いて製造することができる。
本工程（ａ）において、培養温度、培地ｐＨ、ＣＯ２濃度等の条件は、特に限定されず、動物細胞培養において通常使用される一般的な条件を適宜採用することができる。フィーダー細胞は、通常、コンフルエントになるまで培養すればよいが、例えば、上皮細胞のように重層化する細胞であれば、さらに１〜２週間程度培養することにより、重層化させればよい。これにより、生体における状態に近い状態で得ることができる。
本工程（ａ）で用いる上記遺伝子導入フィーダー細胞は、予めマイトマイシンＣ等を用いて不活性化しておくことがより好ましい。次の工程（ｂ）でフィーダー細胞自体が増殖することによって標的細胞の増殖が阻害されることを防止し、標的細胞の増殖効率を上昇させるためである。このような不活性化は、放射線処理等によっても行うことができる。羊膜又はコラーゲンゲル上にフィーダー細胞を播種して培養することにより、羊膜又はコラーゲンゲル表面にフィーダー細胞層を形成させる。
工程（ｂ）において、標的細胞は必要に応じて、一般的な動物細胞培養技術により培養することができ、また市販品を購入して入手することもできる。例えば、標的細胞が角膜上皮細胞の場合、角膜上皮細胞は角膜輪部組織から得ることができる。例えば角膜輪部組織から内皮細胞を剥離除去し、結膜を切除し単一細胞懸濁液を作製したのち、これを窒素タンクで保存し、その後急速に３７℃で融解して角膜上皮細胞浮遊液を調製し、必要に応じて継代培養することにより得ることができる。継代培養には、例えば無血清培地であるＥｐｉＬｉｆｅＴＭ（カスケード社）、ＭＣＤＢ１５３培地（日水製薬株式会社）やこれらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地等を使用することができる。標的細胞が角膜上皮細胞の場合を例とすると、角膜上皮細胞は、角膜上皮シートの移植を受ける者（レシピエント）から調製することが好ましい。すなわち、標的細胞のドナーと、標的細胞シートのレシピエントが同一人であることが好ましい。このような自家細胞を用いることにより、免疫拒絶の問題が解消される。
工程（ｂ）において、工程（ａ）で培養した前記フィーダー細胞を細胞培養用キャリア上に、標的細胞が播種（載置）される。標的細胞がヒト角膜上皮細胞である場合を例に挙げて説明すると、角膜上皮細胞は、例えば細胞密度が好ましくは約１×１０３個／ｃｍ２〜１×１０６個／ｃｍ２、より好ましくは約１×１０４個／ｃｍ２〜約１×１０５個／ｃｍ２となるように播種することができる。上記範囲であれば、角膜上皮細胞本来の性質を維持しながら増殖させることができる。
工程（ｂ）における標的細胞の培養は異種動物細胞非存在下で実施される。本発明において「異種動物細胞非存在下」とは、例えば、標的細胞が角膜上皮細胞の場合を例として説明すると、角膜上皮細胞を培養する際の条件として、当該角膜上皮細胞に対して異種である動物の細胞が使用されないことをいう。具体的には角膜上皮細胞としてヒト細胞を使用する場合に、マウスやラット等、ヒト以外の動物種の細胞が培養液中に存在（併存）しない条件のことをいう。このような条件で培養を実施することによって、最終的に得られる移植材料（すなわち、角膜上皮シート）に異種由来の成分（異種細胞自体を含む）が混入するおそれがなくなる。
本発明の第二の態様において、必要に応じて、各工程で適宜ヒト血清を加えてもよい。ヒト血清の添加量および濃度は、細胞培養における常法に従って決定することができ、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えば５％〜１０％ヒト血清を用いることができる。
工程（ｂ）において、標的細胞を培養する際に用いられる培地は、当該細胞を増殖させるものであれば特に限定されない。例えば、ＭＣＤＢ１５３培地（日水製薬株式会社）や、ＥｐｉＬｉｆｅＴＭ（カスケード社）、これらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地、上皮細胞の成長に通常用いられるＤＭＥＭとハムＦ１２培地とを所定割合で混ぜた培地が例として挙げられる。標的細胞がヒト角膜上皮細胞である場合、前記培地の具体例としては、特に限定されないが、ＦＢＳ（５〜１０％）、インシュリン（例えば、５μｇ／ｍｌ）、コレラトキシン（Cholera toxin）（例えば、１ｎＭ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、及びペニシリン（例えば、１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（例えば、１００μｇ／ｍｌ）を添加した、ＤＭＥＭとハムＦ１２培地の混合培地（混合体積比１：１）等が例として挙げられる。また、グルタミン、インスリン、トランスフェリン（Transferrin）、又はセレニウム（Selenium）等をさらに添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２混合培地を用いることもできる。培養温度、培地ｐＨ、ＣＯ２濃度等の条件は、動物細胞培養において通常使用される一般的な条件を適宜採用することができる。培養時間は、特に限定されないが、２〜３週間程度が好ましい。
さらに、本発明の標的細胞シートの製造方法は、必要に応じて、（ｃ）標的細胞誘導用フィーダー細胞と標的細胞シートとを分離する工程を含んでいてもよい。工程（ｃ）において、上記工程（ｂ）で培養した標的細胞の細胞シートを、自殺遺伝子で誘導される毒性物質の前駆体で処理し、フィーダー細胞を選択的に除去し、標的細胞の細胞シートを得ることができる。細胞培養用キャリアとして羊膜又はコラーゲンゲルを使用した場合、羊膜やコラーゲンゲルは除去してもしなくても可能である。コラーゲンゲルを用いる場合、本発明の細胞シートを移植に用いるのであれば、細胞との生着性を考慮して、得られた細胞シートを必要に応じてコラゲナーゼ処理してもよいが、しなくてもよい。なお、コラゲナーゼ処理と自殺遺伝子で誘導される毒性物質の前駆体による処理の順序は特に限定されない。細胞培養用キャリアとして温度応答性細胞培養皿を使用した場合、上記抗ウイルス剤による処理に続いて、例えば、培養温度（例えば３７℃程度）から培養皿の温度を、培養温度未満（例えば３２℃以下）にし、３０分程度そのまま静置する又は培地を穏やかにピペッティングすることにより、細胞シートを回収することができる。
自殺遺伝子で誘導される毒性物質の前駆体（抗ウイルス剤）として、ガンシクロビルを使用する場合、培養後の細胞の状態によって異なるため、その添加量は特に限定されないが、１×１０−２〜１×１０−６Ｍ程度の濃度が好ましく、１×１０−３〜１×１０−５Ｍ程度の濃度がより好ましい。処理時間としては、特に限定されないが、４〜１４日程度が好ましく、６〜１０日程度がより好ましい。コラゲナーゼ処理に用いるコラゲナーゼの濃度は、培養後の細胞の状態によって異なるため、特に限定されないが、０．０１〜０．５％程度が好ましい。処理時間は、０．１〜２時間程度が好ましく、０．５〜１時間程度がより好ましい。処理温度は特に限定されないが、３０〜４０℃程度が好ましい。
工程（ｂ）の結果、細胞培養用キャリア上で標的細胞が増殖する。得られた細胞が、例えば角膜上皮細胞のように重層化する細胞の場合、細胞層の重層化を促すために、細胞層の表層を空気に接触させる工程（工程ｄ）を実施してもよい。なお、この工程を本明細書においてエアーリフティング（Air-lifting）ともよぶ。この工程（ｄ）は、細胞層を形成する細胞の分化、バリア機能の誘導等を目的として行われる。当該工程（ｄ）は、工程（ｂ）の後に行ってもよく、工程（ｃ）の後に行ってもよい。
この工程は、培養液の一部をスポイト、ピペット等を用いて一時的に除去することにより培養液表面を低下させ、これにより細胞層の最表層を一時的に培養液外に露出させることによって行うことができる。又は、細胞層をコラーゲンマトリクスごと持ち上げて、最表層を培養液表面から一時的に露出させることにより行うこともできる。さらには、チューブ等を用いて空気を培養液中に送り込み、細胞層の最上層に空気を接触させてもよい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて細胞層の最表層を露出させる方法により行うことが好ましい。
この工程（ｄ）を行う時間、すなわち重層化した細胞層の最表層を空気に接触させる時間は、細胞の状態や培養条件等によって変動するが、例えば３日〜３週間程度が好ましく、５日〜２週間程度がより好ましい。
また、上記した標的細胞シートの製造方法において、前記した標的細胞を用いて、上記と同様に細胞シートを製造することができ、標的細胞がヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞等の幹細胞である場合、幹細胞を細胞シートとして回収することができ、また各種分化誘導因子を導入すれば様々な分化細胞を細胞シートとして回収することができる。
本発明の他の態様としては、
（ａ）細胞培養用キャリアを用いて上記のようにして得られた標的細胞誘導用フィーダー細胞を培養する工程、（ｂ）前記（ａ）工程の細胞培養用キャリア上にヒト角膜内皮細胞を播種ないし静置し、ヒト角膜内皮細胞を培養し増殖させる工程、を含んでなるヒト角膜内皮細胞の培養方法、
（ａ）細胞培養用キャリアを用いて上記のようにして得られたヒト角膜実質細胞株を培養する工程、（ｂ）前記（ａ）工程の細胞培養用キャリア上に前記（ｂ）工程で調製したヒト結膜上皮細胞を播種ないし静置し、ヒト結膜上皮細胞を培養する工程、を含んでなるヒト結膜上皮細胞の培養方法、又は
（ａ）細胞培養用キャリアを用いて上記のようにして得られた標的細胞誘導用フィーダー細胞を培養する工程、（ｂ）前記（ａ）工程の細胞培養用キャリア上に前記（ｂ）工程で調製したヒト腎臓由来細胞を播種ないし静置し、ヒト腎臓由来細胞を培養する工程、を含んでなるヒト腎臓由来細胞の培養方法が例として挙げられる。
本発明フィーダー細胞を用いた培養方法によれば、対象となる標的細胞の種類によって培養細胞密度を適宜決定することが可能である。例えば、対象となる細胞を高密度培養する必要がなく、低密度で培養した場合でも、より生体における状態と近い細胞を得ることができる。細胞密度は、対象となる標的細胞の種類によって適宜検討できるため、特に限定されないが、対象となる細胞の細胞密度は、例えば、０．５×１０１〜９×１０２ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度であってもよい。
さらに、本発明の他の態様としては、（ａ’）細胞培養用キャリアを用いて、本発明のフィーダー細胞を培養する工程、（ｂ’）本発明のフィーダー細胞に標的細胞の誘導候補因子の遺伝子を導入し、得られた誘導候補因子の遺伝子導入フィーダー細胞を細胞培養用キャリアを用いて培養する工程、（ｃ’）前記（ａ’）工程および（ｂ’）工程の細胞培養用キャリア上にそれぞれ標的細胞を播種ないし静置し、標的細胞を培養し増殖させる工程、および（ｄ’）各細胞培養用キャリア上で培養された細胞を評価する工程、を含んでなる標的細胞に対する誘導候補因子の決定方法が挙げられる。
誘導候補因子としては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、例えば前記した標的細胞の刺激因子でもよい。細胞の培養工程は、前記した方法と同様にして行うことができる。標的細胞、細胞培養用キャリアも前記したものを使用することができる。細胞を評価する工程において、評価方法は常法に従って、対象の細胞の種類によって適宜選択できるが、例えばコロニー形成数をカウントすることにより細胞増殖に与える影響を評価できる。本発明により、標的細胞に対する誘導候補因子の機能を評価、決定できる。これにより、標的細胞に対する刺激因子をスクリーニングできる。
さらに、本発明の他の態様としては、（i）本発明のフィーダー細胞に標的細胞の誘導候補因子の遺伝子を導入する工程、（ii）前記工程(i)で得られた誘導候補因子の遺伝子導入フィーダー細胞を細胞培養用キャリアを用いて培養する工程、および（iii）前記（ii）工程の細胞培養用キャリア上にそれぞれ標的細胞を播種ないし静置し、標的細胞を培養し増殖させる工程、を含んでなる標的細胞の培養方法が挙げられる。誘導候補因子としては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、例えば前記した標的細胞の刺激因子でもよい。細胞の培養工程は、前記した方法と同様にして行うことができる。標的細胞、細胞培養用キャリアも前記したものを使用することができる。
さらに、本発明の他の態様としては、前記標的細胞シートの製造方法により得られた標的細胞シートを目的とする部位（特に限定されないが、例えば、ヒト表層角膜等）に移植する工程を含むこと特徴とする標的細胞の移植方法が挙げられる。
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
以下の手順で、ｈＴＥＲＴ遺伝子及びＴＫ遺伝子を導入したヒト角膜実質細胞株（以下、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞という。）を作製した。ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞作製の模式図を図２に示す。
１．ヒト角膜実質細胞の培養
輸入角膜（ＵＳＡ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ）の強角膜片から上皮細胞ならびに内皮細胞を除去（せっしで削りとる）した。実質を数分割後、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン入り３５ｍｍディッシュに内皮側を下にして３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
２．レンチウイルスベクターの調製
図１に示したレンチウイルスの作製に必要な目的遺伝子発現ベクターとパッケージングプラスミドを用いて、遺伝子導入レンチウイルスベクターを以下の手順で作製した。
（１）hTERT・GFP・ネオマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクターの作製
レンチウイルスベクター内のlong terminal repeat（LTR）の間で、ＥＦ１プロモーター下に、配列番号１で示されるhTERT遺伝子断片及びIRES-EGFP遺伝子断片をサブクローニングした。さらに下流にはＰＧＫプロモーター下にネオマイシン耐性遺伝子を配置した。本レンチウイルスベクターを図１Ａに示す。
（２）TK・ピューロマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクターの作製
レンチウイルスベクター内のＥＦ１プロモーター下に、配列番号３で示されるＴＫ遺伝子断片を配列番号５、６で示されるプライマーを用いてサブクローニングした。さらに下流にはＰＧＫプロモーター下にピューロマイシン耐性遺伝子を配置した。本レンチウイルスベクターを図１Ｂに示す。
（３）hTERT・GFP・ネオマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルス（ｈＴＥＲＴ組換えレンチウイルス）及びTK・ピューロマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルス（ＴＫ組換えレンチウイルス）の作製
１０ｃｍディッシュに２９３Ｔ細胞を約２×１０６ｃｅｌｌｓ播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した（培地：ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）。培養から１〜２日後（５０〜８０％コンフルエント）のトランスフェクションの約３時間前に培地交換し、トランスフェクションキット（商品名：CalPhosTM Mammalian Transfection Kit；Clontech Laboratories, Inc社製）を用いて、上記のようにして作製したhTERT・GFP・ネオマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクタープラスミドとパッケージングプラスミド（ｐＬＰ１（ｇａｇ／ｐｏｌ））、ＲＥＶプラスミド（ｐＬＰ２（Ｒｅｖ））、エンベローププラスミド（ｐＬＰ／ＶＳＶＧ（ＶＳＶ−Ｇ））をトランスフェクションした。トランスフェクションから１日経過後に培地交換を実施した。さらに、培地交換から１日後に、培養上清を回収（０．４５μｍフィルター濾過）し、超遠心（４℃，２００００ｒｐｍ，２ｈｒｓ）後に、ＤＭＥＭ培地に懸濁させて、hTERT・GFP・ネオマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルス（以下、「ｈＴＥＲＴ組換えレンチウイルス」という。）を調製した（−８０℃で保存）。
同様にして、TK・ピューロマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクターを用いて、TK・ピューロマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルス（以下、「ＴＫ組換えレンチウイルス」という。）を調製した（−８０℃で保存）。
３．ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞（Feeder細胞）の作製
前述のように培養したヒト角膜実質細胞に、上記ｈＴＥＲＴ組換えレンチウイルスを感染させた。感染後３日目からＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）による選択を実施し、ｈＴＥＲＴ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を作製した。さらに、ｈＴＥＲＴ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞に上記ＴＫ組換えレンチウイルスを感染させた。感染後３日目から、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Puromycin）による選択を実施し、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を作製した。作製方法の模式図を図２に示す。
４．結果
ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞は、マーカータンパク質であるＥＧＦＰの発現（蛍光）によりｈＴＥＲＴ遺伝子の導入を確認することができた。また、ｈＴＥＲＴ遺伝子導入前のヒト角膜実質細胞では３７℃、５％ＣＯ２条件下で（培地：ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，1００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）、約９代の継代しかできなかったが、ｈＴＥＲＴ遺伝子を導入したｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞では５０代以上の長期継代をすることが可能となった。
［比較例］
ＴＫ遺伝子を導入しない以外は、実施例１と同様にして、ｈＴＥＲＴ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を作製した。
［試験例］
以下の方法により、遺伝子導入ヒト角膜実質細胞に対するガンシクロビル処置の影響を調べた。２４穴プレートに比較例のｈＴＥＲＴ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞及び実施例１のｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した（培地：ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン， １００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）。播種後、１日目においてガンシクロビル処置を開始した（処置濃度：０，１０−７，１０−６，１０−５，１０−４Ｍ；タイムコース：０，２，４，６，８，１０，１２日）。各時点における各濃度あたり３ウェルを用いて、各遺伝子導入ヒト角膜実質細胞に対するガンシクロビル処置の影響を計測した（ｎ＝３）。各時点において、トリパンブルー染色法により細胞数を計測した。トリパンブルー染色には血球計算盤（hematometer、製品名：Burker-Turk deep 1/10 mm、製品番号：Tokyo No.0880、エルマ販売株式会社製）を用い、染色後直ちに各試料を血球計算盤の計測チャンバーに入れ、計測チャンバーに各試料をセットした直後に細胞数を計測した。計測結果を図３に示す。なお、ガンシクロビル処置０日目のそれぞれの処置濃度における細胞数の平均値を基準（１００％）として各時点での細胞数を表示した。
図３に示すように、比較例のｈＴＥＲＴ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞においては、ガンシクロビル処置後１２日目にすべての処置濃度で細胞数の減少は認められなかった（図３左図）。一方、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞においては、ガンシクロビル処置後６日目に１０−４Ｍ処置群で細胞がすべて死滅したのが認められた（図３右図）。また、他の処置濃度群（１０−７，１０−６，１０−５Ｍ）においてもガンシクロビル処置後８日目以降で濃度依存的な細胞数の減少が認められた。
［実施例２］
以下の手順で、ヒト角膜上皮細胞シートを製造した。ヒト角膜上皮細胞シートの製造方法の模式図を図４Ａに示す。
１．コラーゲンゲルにおけるｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞の培養
コラーゲンゲル培養キット（新田ゼラチン）を用いて６穴プレートにコラーゲンゲル（Ｉ型コラーゲン）を作製した。前記コラーゲンゲル上（新田ゼラチン）に、上記実施例１で作製したｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した（培地：ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，1００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）。培養で得られたｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞（Feeder細胞）の写真を図４Ｂ上段に示す。
２．ヒト角膜上皮細胞の調製
輸入角膜（USA Eye Bank）の強角膜片を２．４Ｕ／ｍｌ Ｄｉｓｐａｓｅ溶液を用いて３７℃、１時間反応させた。次いで、０．０２％ ＥＤＴＡ溶液を用いて室温で２分間反応させたのち、ＰＢＳで２回洗浄した。得られた細胞を角膜上皮細胞培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２／５％ＦＢＳ／インスリン−トランスフェリン−セレニウム／１ｎＭ コレラトキシン／１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）に浸した状態で、顕微鏡下でせっしを用いて角膜輪部近辺の角膜上皮幹細胞をこすりとり、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清除去後、０．２５％ トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を１ｍｌ添加し、懸濁させ、３７℃で１５〜２０分間反応させた。次いで、角膜上皮細胞培養培地を等量（１ｍｌ）添加し、懸濁させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清除去後、角膜上皮細胞培養培地に懸濁させ、ヒト角膜上皮細胞の懸濁液を得た。
３．ヒト角膜上皮細胞の播種及び培養
上記懸濁液を、コラーゲンゲル上で培養したｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞上に約６×１０４個／ｃｍ２の細胞密度となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した（培地：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２／５％ＦＢＳ／インスリン−トランスフェリン−セレニウム／１ｎＭ コレラトキシン／１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）。播種後、３、４日目に培地交換を行い、１８日培養した。培養で得られたヒト角膜上皮細胞の写真を図４Ｂ中段に示す。
４．抗ウイルス剤処理及びコラゲナーゼ処理
培養後、ガンシクロビル１０−４Ｍを添加した状態で約１週間培養（２、３日おきに培地交換）し、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を完全に死滅させた。次いで、コラゲナーゼ（Collagenase）溶液（０．１％）を添加し、３７℃で約３０分間反応させ、角膜上皮細胞シートを回収した。ただし、コラゲナーゼ処理は必須ではない。得られた角膜上皮細胞シートの写真を図４Ｂ最下段に示す。
［実施例３］
実施例２の「コラーゲンゲルにおけるｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞の培養」において、コラーゲンゲル上に播種する前に、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞をマイトマイシンＣ（８μｇ／ｍｌ）で３７℃、２時間処理する以外は実施例２と同様にして角膜上皮細胞シートを回収した。
実施例２及び３から、本発明のフィーダー細胞を用いてヒト角膜上皮細胞シートを作製できることが確認できた。本発明の製造方法は、フィーダー細胞として一般的に用いられているマウス３Ｔ３細胞を用いないため、異種細胞からの感染の危険は回避できる。また、初代培養により得られたヒト角膜実質細胞は数代しか継代培養できず、移植を想定した場合に利用が制限されていたが、本発明のフィーダー細胞株はＴＥＲＴ遺伝子が導入されたことにより長期継代が可能となった。さらに、細胞の混入の危険性を考慮して、マーカー遺伝子並びに自殺遺伝子（ＴＫ）を導入することで、フィーダー細胞が不要になればガンシクロビルにより細胞を死滅させることが可能になり、またマーカー遺伝子により細胞が混入した際には確認することも可能となった。フィーダー細胞をガンシクロビルで死滅させることができることから、角膜上皮細胞との接着培養も可能になった。ガンシクロビルは抗ヘルペスウイルス薬として臨床で利用可能なため、細胞シート作製時にフィーダー細胞が混入し、細胞シート移植が実施されたとしても細胞を死滅させ、除去することができる。
［実施例４］
１．コラーゲンゲルにおけるｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞の培養
実施例２記載の「コラーゲンゲルにおけるｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞の培養」と同様にコラーゲンゲル上でｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を培養した。
２．ヒト結膜上皮細胞の調製
上記実施例２の「ヒト角膜上皮細胞の調製」において、ＰＢＳで２回洗浄した後は以下の処理に代えて、ヒト結膜上皮細胞を調製した。
ＰＢＳで洗浄後、得られた細胞から結膜のみを切除し、結膜上皮細胞培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２／５％ＦＢＳ／インスリン−トランスフェリン−セレニウム／１ｎＭ コレラトキシン／１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）に浸した状態で、はさみを用いて細かく刻み、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清除去後、０．２５％ トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を１ｍｌ添加し、懸濁させ、３７℃で１５〜２０分間反応させた。次いで、結膜上皮細胞培養培地を等量（１ｍｌ）添加し、懸濁した後、フィルターにより細胞塊を除去し、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清除去後、結膜上皮細胞培養培地に懸濁させ、ヒト結膜上皮細胞の懸濁液を得た。
３．ヒト結膜上皮細胞の播種及び培養
上記懸濁液を、コラーゲンゲル上で培養したｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞上に約４×１０４個／ｃｍ２の細胞密度となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した（培地：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２／５％ＦＢＳ／インスリン−トランスフェリン−セレニウム／１ｎＭ コレラトキシン／１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）。播種後、３、４日目に培地交換を行い、１８日培養した。
以上のことから、フィーダー細胞として、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を用いた場合に、ヒト結膜上皮細胞を培養できることが確認できた。培養で得られた細胞の写真を図５Ａに示す。
［実施例５］
実施例２記載の「コラーゲンゲルにおけるｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞の培養」と同様にコラーゲンゲル上でｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を培養した。次いで、不死化ヒト角膜内皮細胞を、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞上に播種し、３７℃、１０％ＣＯ２条件下で培養した（培地：ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／３０μｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミン／２ｎｇ／ｍｌ ｂ−ＦＧＦ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）。
以上のことから、フィーダー細胞として、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を用いた場合に、ヒト角膜内皮細胞を培養できることが確認できた。培養で得られた細胞の写真を図５Ｂに示す。
［実施例６］
実施例２記載の「コラーゲンゲルにおけるｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞の培養」と同様にコラーゲンゲル上でｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を培養し、ヒト腎臓由来細胞（２９３Ｔ細胞）をＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した（培地：ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）。
以上のことから、フィーダー細胞として、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を用いた場合に、ヒト腎臓由来細胞を培養できることが確認できた。培養で得られた細胞の写真を図５Ｃに示す。
上記実施例４〜６の結果から、本発明のフィーダー細胞は、角膜上皮細胞のみならず、結膜上皮細胞、角膜内皮細胞、腎臓由来細胞等の様々な細胞培養にも応用できることが確認できた。
［実施例７］
ＦＢＳに代えてヒト血清（Lonza,No.14-402E）を培地に用いる以外は、実施例１のｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞の培養（培地：ＤＭＥＭ／１０％ヒト血清／１００Ｕ／ｍｌペニシリン，1００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）および実施例２のヒト角膜上皮細胞の培養（培地：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２／５％ヒト血清／インスリン−トランスフェリン−セレニウム／１ｎＭコレラトキシン／１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ／１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）と同様の方法にて、ヒト角膜上皮細胞の培養を実施し、ヒト角膜上皮細胞を培養することが可能であった。ヒト血清を用いた培養で得られたヒト角膜上皮細胞の写真を図６に示す。
［実施例８］
雄のＩＣＲマウス（ＳＬＣ）を用いてヒト角膜上皮細胞シートの移植を行った。移植手順の模式図を図７Ａに示す。移植はネンブタールの腹腔内投与による麻酔下で行った。マウスの輪部を含めた角膜表面に５０％エタノールを約３０秒浸し、表層角膜切除を行った。５０％エタノールで浸すことで角膜上皮細胞層を完全に除去し、除去直後に、実施例２と同様の方法（コラゲナーゼ処理なし）で作製したヒト角膜上皮細胞シートを直径５ｍｍのトレパンで切り抜き、該ヒト角膜上皮細胞シートを角膜表面上に移植した。該細胞シートと眼瞼とを手術用８．０縫合糸を用いて縫合した。ヒト角膜上皮細胞シートの移植をしないものをコントロールとして移植の効果を対比した。移植後、抗生物質ならびにステロイド剤を投与した。移植７日後に眼球摘出を実施し、４％パラホルムアルデヒドにより４℃、３−４時間固定した。結果を図７Ｂ（コントロール）および図７Ｃ（移植検体）に示す。テクノビット包埋（Technovit 8100; Heraeus Kluzer）によりサンプルを調製し、５μｍの切片を作製した。該切片を用いてＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色ならびに免疫染色を実施した。ＨＥ染色は常法に従って行い、結果を図７Ｄに示す。免疫染色は以下の手順に従って実施した。０．０５％ trypsin-EDTAで３７℃、１０分間反応後、ＰＢＳで洗浄した。ブロッキング液（ブロックエース; DS pharma biomedicalと０．３％ tritonX-100）で室温、１時間反応後、一次抗体を４℃、一晩反応させた（一次抗体：マウスモノクローナル抗サイトケラチン３抗体（１：５０；Progen）、マウスモノクローナル抗ヒトミトコンドリア抗体（１：１０；Millipore））。ＰＢＳで洗浄後、二次抗体を室温、６０分間反応させた（二次抗体：Alexa Fluor 488抗マウスＩｇＧ抗体（１：２００；Invitrogen））。ＰＢＳで洗浄後、核染色（０．１μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ；Sigma）を室温、５分間実施した。ＰＢＳで洗浄後、水溶性封入剤で封入した。
図７Ｂから明らかなように、ヒト角膜上皮細胞シートを移植しなかった場合（コントロール）、処置後１５日目において角膜は完全に血管を伴った結膜組織に覆われ透明性は失われていた。一方、図７Ｃに示されるように、移植眼においては移植後７日目の時点においては、結膜組織の進入は認められず、角膜の透明性は維持されていた。図７Ｄの顕微鏡観察の結果から、角膜上皮細胞が３−５層に重層化したことが認められた。また、図７Ｆの免疫染色の結果から、角膜上皮細胞マーカーであるサイトケラチン３の発現も認められた。さらに、図７Ｄおよび図７Ｆで示された角膜上皮細胞がヒト由来の移植細胞であることを示すためにヒトミトコンドリアに対する免疫染色を上記と同様の方法で実施した。結果を図７Ｅに示す。この結果から、本角膜上皮細胞がヒト由来の細胞であることが示された。以上の結果から、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を用いて作製したヒト角膜上皮細胞シートはマウス角膜上皮障害モデルにおいて移植可能であることが示され、生体へ適応しうるものである。
［実施例９］
実施例１で得られたｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞に、下記のレンチウイルスを用いて標的細胞誘導候補因子を導入し、以下の手順で誘導因子発現細胞を作製した。
１．レンチウイルスベクターの調製
図８に示したレンチウイルス作製に必要な目的遺伝子発現ベクターとパッケージングプラスミドを用いて、遺伝子導入レンチウイルスベクターを以下の手順で作製した。
（１）DLL1/DLL4・ブラストシジン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクターの作製
レンチウイルスベクター（pLenti6/UbC/V5-DEST, インビトロジェン）内のＵｂＣプロモーター下にDelta-like 1（ＤＬＬ１）あるいはDelta-like 4（ＤＬＬ４）遺伝子断片をサブクローニングし、DLL1/DLL4・ブラストシジン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクターを作製した。本レンチウイルスベクターを図８Ａに示す。
（２）E-cadherin・ハイグロマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクターの作製
レンチウイルスベクター内のＥＦ１プロモーター下にE-cadherin遺伝子断片をサブクローニングした。さらに下流にはＰＧＫプロモーター下にハイグロマイシン耐性遺伝子を配置し、E-cadherin・ハイグロマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルスベクターを作製した。本レンチウイルスベクターを図８Ｂに示す。
（３）、DLL1・ブラストシジン耐性遺伝子発現レンチウイルス（ＤＬＬ１組換えレンチウイルス）、DLL4・ブラストシジン耐性遺伝子発現レンチウイルス（ＤＬＬ４組換えレンチウイルス）及びE-cadherin・ハイグロマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルス（E-cadherin組換えレンチウイルス）の作製
上記レンチウイルスの作製方法と同様にして、DLL1・ブラストシジン耐性遺伝子発現レンチウイルス（以下、「ＤＬＬ１組換えレンチウイルス」という。）、DLL4・ブラストシジン耐性遺伝子発現レンチウイルス（以下、「DLL4組換えレンチウイルス」という。）、E-cadherin・ハイグロマイシン耐性遺伝子発現レンチウイルス（以下、「E-cadherin組換えレンチウイルス」という。）を調製した（−８０℃で保存）。
２．DLL1、DLL4又はE-cadherin＋ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞の作製
実施例１で得られたｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞に、上記DLL1、DLL4、E-cadherin組換えレンチウイルスを感染させた。感染後、２日目からブラストシジン（１０μｇ／ｍＬ）あるいはハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）による選択を実施し、DLL1、DLL4あるいはE-cadherin＋ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を作製した。ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞とＤＬＬ１、ＤＬＬ４あるいはE-cadherin＋ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞からＲＮＡを抽出した（RNeasy Mini Kit, Qiagen）。DNase I（インビトロジェン）処理後、ｃＤＮＡ合成を実施した（First-strand cDNA Synthesis System for Quantitative RT-PCR, Marligen biosciences）。調製したｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応条件は以下に示す通りである。なお、ＰＣＲのプライマーは、ＤＬＬ１（470 bp）、ＤＬＬ４（249 bp）、E-cadherin（172 bp）およびコントロールとしてGAPDH（255 bp）に対して設計し、配列番号７〜１４で示されるプライマーを用いた。ＰＣＲ反応産物は２％アガロースゲルにより電気泳動を行った。
≪ＰＣＲ条件≫
94℃ 5 min, 35 cycles (94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 30 sec), 72℃ 10 min
ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞においては、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４ならびにE-cadherinの発現は認められなかった（図９Ａ）。一方、各組み換えレンチウイルスを感染させた細胞においては、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４ならびにE-cadherinの各遺伝子の発現が認められた（図９Ｂ）。以上の結果から、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞には、さらに、標的細胞を誘導するための誘導因子を導入することが可能であった。すなわち、本遺伝子導入ヒト角膜実質細胞には、さまざまな誘導因子を導入して培養又は分化誘導が困難な標的細胞を誘導するためのフィーダー細胞として機能させることが可能である。
［実施例１０］
後記するフィーダー細胞を用いて、実施例２の「ヒト角膜上皮細胞の調製」ならびに「ヒト角膜上皮細胞の播種及び培養」と同様にして、ヒト角膜上皮細胞の培養を実施した。フィーダー細胞として実施例１で得られたｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞および実施例９で得られたＤＬＬ１＋ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を用い、ヒト角膜上皮細胞を１０００個播種した（各３ウェル）。播種後、１２日目において１０％ホルムアルデヒドにより室温、３０分間固定した。１％ローダミン溶液（Wako）により室温、１０分間染色し、ＰＢＳで洗浄した。染色されたコロニーの数を目視で計測した。コロニー数の計測結果を図１０に示す。
図１０に示されるように、ＤＬＬ１＋ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞をフィーダー細胞として用いた場合（右）、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞をフィーダー細胞として用いた場合（左）と比較してコロニー形成が抑制された。従って、ＤＬＬ１には角膜上皮細胞のコロニー形成を抑制する作用があることが明らかになった。以上のように、本発明の遺伝子導入ヒト角膜実質細胞にさまざまな因子を導入することで標的細胞に対する導入因子の機能について評価することができる。
［実施例１１］
以下の手順で、ヒト皮膚線維芽細胞にｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子を導入した。さらに、ヒト角膜上皮細胞のコロニー形成について観察した。
１．ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト皮膚線維芽細胞（Feeder細胞）の作製
正常ヒト皮膚線維芽細胞（倉敷紡績株式会社 製品番号：ＫＦ−４１０９）に実施例１で使用したｈＴＥＲＴ組換えレンチウイルスおよびＴＫ組換えレンチウイルスを感染させた。感染後、２日目からＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）による選択を実施し、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト皮膚線維芽細胞を作製した（培地：正常ヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地（Medium 106S, 倉敷紡績株式会社 製品番号：Ｍ−１０６−５００Ｓ）／低血清増殖添加剤（ＬＳＧＳ，倉敷紡績株式会社 製品番号：Ｓ−００３−５）／１００ Ｕ／ｍｌペニシリン, １００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）。
２．ヒト角膜上皮細胞の調製ならびにヒト角膜上皮細胞の播種及び培養
フィーダー細胞として、前記のようにして得られたｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト皮膚線維芽細胞および実施例１のｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を用いて、実施例２の「ヒト角膜上皮細胞の調製」ならびに「ヒト角膜上皮細胞の播種及び培養」と同様にして、ヒト角膜上皮細胞の培養を実施した。前記フィーダー細胞を用い、ヒト角膜上皮細胞を１０００個播種した。播種後、１０日目において１０％ホルムアルデヒドにより室温、３０分間固定した。１％ローダミン溶液（Wako）により室温、１０分間染色し、ＰＢＳで洗浄した。結果を図１１に示す。
３．結果
図１１Ｂの結果から、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト皮膚繊維芽細胞をフィーダー細胞としてヒト角膜上皮細胞を培養した場合、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞をフィーダー細胞として利用した時（図１１Ａ）と同様にヒト角膜上皮細胞のコロニー形成が認められ、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト皮膚繊維芽細胞が角膜上皮細胞の培養に利用可能であることが明らかとなった。以上の結果から、細胞種を変えてｈＴＥＲＴならびにＴＫ遺伝子を導入してもフィーダー細胞として利用することが可能であり、すなわち標的細胞の培養に最適なフィーダー細胞にｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子を導入すれば標的細胞の誘導ならびに標的細胞シートの作製を行うことが可能である。
［実施例１２］
１．ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞上におけるヒト角膜内皮細胞の培養
輸入角膜（USA Eye Bank）の強角膜片からデスメ膜を含めて角膜内皮細胞を実体顕微鏡下でせっしを用いて採取し、角膜内皮面を下にしてFNC Coating Mix（Athena Enzyme Systems）でコーティングした６穴プレートで３７℃、１０％ＣＯ２条件下で培養した（培地：DMEM／10%FBS／25 ng/ml b-FGF／100 U/mlペニシリン, 100 μg/mlストレプトマイシン）。６穴プレートにマイトマイシンＣ（８μｇ／ｍｌ）で処置したｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞を2×104 cells/cm2で播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した（培地：DMEM／10%FBS／100 U/mlペニシリン, 100 μg/mlストレプトマイシン）。播種後、1日目においてｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞上にHigh density（2×104 cells/cm2）およびLow density（2×101 cells/cm2）のヒト角膜内皮細胞を播種し、３７℃、１０％ＣＯ２条件下で培養した（培地：DMEM／10%FBS／25 ng/ml b-FGF／100 U/mlペニシリン, 100 μg/mlストレプトマイシン）。なお、コントロールとしてFNC Coating Mixをコーティングした6穴プレート（フィーダー細胞なし）にHigh density（2×104 cells/cm2）およびLow density（2×101 cells/cm2）のヒト角膜内皮細胞を播種し、培養した。播種後、２６日目に細胞観察を行った。観察結果を図１２に示す。
２．結果
生体における角膜内皮細胞は六角形の細胞であり、High densityで培養した場合、フィーダー細胞の有無に関わらず、生体における状態に近い細胞形態を維持し培養することが可能であった（図１２左上及び右上）。一方、Low densityで培養した場合、フィーダー細胞上で培養した際はHigh densityの場合と同様の細胞形態を示したが（図１２右下）、フィーダー細胞が無い場合においては、線維芽細胞様の形態を示した（図１２左下）。以上の結果から、ｈＴＥＲＴ＋ＴＫ遺伝子導入ヒト角膜実質細胞をフィーダー細胞としてヒト角膜内皮細胞を培養すれば、より早期に生体における状態に近い角膜内皮細胞を得ることができる。
本発明に係る標的細胞誘導用フィーダー細胞は、細胞培養及び細胞シートの製造に有用である。特に、角膜の再生を目的とした移植に利用し得るヒト角膜上皮細胞シートを製造するのに有用である。

Claims (19)

  1. 不死化遺伝子、及び自殺遺伝子を導入したことを特徴とする標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  2. 標的細胞に隣接する細胞由来である請求項１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  3. ヒト角膜実質細胞由来である請求項１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  4. ヒト皮膚線維芽細胞由来である請求項１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  5. 不死化遺伝子がｈＴＥＲＴ遺伝子である請求項１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  6. 自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼ遺伝子である請求項１又は４に記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  7. さらに、マーカー遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  8. マーカー遺伝子がＥＧＦＰ遺伝子である請求項７記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  9. 標的細胞が細胞培養時にフィーダー細胞を必要とするヒト由来の細胞である請求項１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  10. 標的細胞がヒト角膜上皮細胞、ヒト角膜内皮細胞、ヒト結膜上皮細胞、又はヒト腎臓由来細胞である請求項１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  11. さらに、標的細胞の刺激因子の遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  12. 標的細胞の刺激因子が、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンファミリー、免疫ブログリンスーパーファミリー、セレクチンファミリー、ニューロリギン、ニューレキシンおよび細胞表面プロテオグリカンから選ばれる１以上のヒトの細胞接着分子；上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリー、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリー、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ファミリーおよび線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーから選ばれる１以上の増殖因子；又はJaggedファミリーおよびDelta様メンバーから選ばれる１以上のNotchリガンドである請求項１１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞。
  13. （ａ）細胞培養用キャリアを用いて請求項１記載の標的細胞誘導用フィーダー細胞を培養する工程、および（ｂ）前記（ａ）工程の細胞培養用キャリア上に標的細胞を播種ないし静置し、標的細胞を培養し増殖させる工程、を含んでなる標的細胞シートの製造方法。
  14. さらに、（ｃ）標的細胞誘導用フィーダー細胞と標的細胞シートとを分離する工程を含んでなる請求項１３記載の製造方法。
  15. 前記（ｃ）工程における分離が、標的細胞シートを、自殺遺伝子で誘導される毒性物質の前駆体で処理することであることを特徴とする請求項１４記載の製造方法。
  16. 自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼ遺伝子であり、自殺遺伝子で誘導される毒性物質の前駆体がガンシクロビルである請求項１５記載の製造方法。
  17. 標的細胞がヒト角膜上皮細胞、ヒト角膜内皮細胞、ヒト結膜上皮細胞、又はヒト腎臓由来細胞である請求項１３記載の製造方法。
  18. 前記（ａ）又は（ｂ）工程で、ヒト血清を用いる請求項１３記載の製造方法。
  19. （ａ’）細胞培養用キャリアを用いて、請求項１記載のフィーダー細胞を培養する工程、（ｂ’）請求項１記載のフィーダー細胞に標的細胞の誘導候補因子の遺伝子を導入し、得られた誘導候補因子の遺伝子導入フィーダー細胞を細胞培養用キャリアを用いて培養する工程、（ｃ’）前記（ａ’）工程および（ｂ’）工程の細胞培養用キャリア上にそれぞれ標的細胞を播種ないし静置し、標的細胞を培養し増殖させる工程、および（ｄ’）各細胞培養用キャリア上で培養された細胞を評価する工程、を含んでなる標的細胞に対する誘導候補因子の決定方法。
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