CN117242173A - 产生成熟角膜内皮细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过增加角膜内皮祖细胞中的转录因子的表达来产生角膜内皮细胞、例如成熟角膜内皮细胞的方法和其组合物。

Description

产生成熟角膜内皮细胞的方法
相关申请案
本申请案要求保护2021年5月3日提交的名称为“产生成熟角膜内皮细胞的方法(METHODS OF GENERATING MATURE CORNEAL ENDOTHELIAL CELLS)”的美国临时申请案第63/183,562号在35 U.S.C.§119(e)下的权利。
技术领域
本发明涉及用于产生成熟角膜内皮细胞和其组合物的方法。
背景技术
角膜发挥对于正常视力和维持眼睛健康而言重要的功能，包括提供眼睛的约三分之二的屈光力和保护眼睛免受损伤或感染。在世界范围内，角膜疾病和损伤为失明的主要原因。许多角膜疾病和损伤可通过移植供体角膜来治疗。在过去的15年中，角膜为身体内移植最多的器官且具有高成功率。举例来说，在美国每年进行约40,000例角膜移植。然而，在世界范围内，对用于移植的角膜的需求远超过当前供应源，且可用的供体组织的有限的质量和数量阻碍了治疗。一种造成供给角膜的供应源不足的因素为多达30％的供给角膜由于角膜内皮的质量不佳而被拒绝用于移植。角膜内皮的质量通常随供体年龄而降低，因为随着角膜老化或受损，内皮细胞死亡且未被替换。因此，随着人群老龄化，具有适合的健康角膜内皮的供体组织的供应源减少。此外，预期供给角膜的数目和质量会随着LASIK手术的盛行度增加而降低(这些角膜被拒绝用于移植)。
角膜疾病可涉及角膜的五个层中的一或多个：角膜上皮、鲍曼层(Bowman'slayer)、角膜基质、后弹力膜(Descemet's membrane)和角膜内皮。角膜上皮、角膜基质和角膜内皮为细胞层，而鲍曼层和后弹力膜主要由胶原蛋白纤维构成。角膜内皮为角膜的内表面上的细胞单层。其面向角膜与虹膜之间形成的腔室且通过调节流体水平来保持角膜透明。如果不存在功能性角膜内皮，那么角膜会变得混浊且视力受损。正常发挥功能的角膜内皮细胞维持角膜中的适当流体水平，例如，流体“渗漏”至基质中与主动泵送之间的平衡，所述主动泵送连续操作以使流体自基质移动至眼睛的前房。
已报道角膜内皮细胞几乎不具有或不具有体内增殖的能力，使得其在受损或以其它方式损失时不能被替换。在人类中，角膜内皮细胞层在出生时的填充密集度最高且随后细胞密度随着眼睛生长而快速降低(反映为相同数目的细胞覆盖更大的区域)。随后，角膜细胞密度随着年龄的增长而逐渐降低，明显地反映出不能被替换的细胞的逐渐损失。随着细胞密度降低，各细胞展开且覆盖更大的区域以维持细胞层的屏障和泵送功能。然而，如果细胞密度降低过多(低于约500至1000个细胞/mm2)，那么其功能会受损，引起角膜混浊、基质水肿、视力损失且最终失明。特别地，已报告在年龄为两个月的婴儿中，体内紧密填充的角膜内皮的细胞密度高达5624个细胞/mm2，在出生后第一年内降低至4252个细胞/mm2，且接着在早期儿童期快速降低(与角膜尺寸随着眼睛生长而增加相关)。在5岁时，角膜内皮密度降低至约3591±399个细胞/mm2且在10岁时进一步降低至约2697±246个细胞/mm2，且在整个成人期每年进一步降低约0.6％。参见佩(Peh)等人,移植(Transplantation).2011年4月,27；91(8):811-9。
影响角膜内皮的原发性疾病包括富克斯氏营养不良(Fuch's dystrophy)、虹膜角膜内皮综合征、后部多形性营养不良和先天性遗传性内皮营养不良。最有效的治疗为更换角膜内皮的继发性疾病，包括若干种角膜营养不良、隐形眼镜的使用、白内障手术和角膜移植中的晚期内皮衰竭。当仅角膜内皮受损时，优选治疗为后弹力膜剥除伴内皮角膜成形术(Descemet's stripping with endothelial keratoplasty；DSEK)，其包括去除后弹力膜和角膜内皮且随后移植供体组织。或者，在穿透性角膜移植(PKP)中，去除且更换整个角膜。
通常，角膜移植包括获得供体角膜(例如，来自死后解剖捐赠物)、测定供体角膜是否具有足够的质量且在其它方面适用，和手术更换受损或患病的角膜。已研发出用于更换整个角膜(穿透性角膜移植)或保留患者的后弹力膜和内皮且用供给组织更换其余层(板层角膜移植)的程序；后一种程序可降低移植排斥的风险，但还可能引起移植后的视力较差。此外，板层角膜移植可能不适用于治疗一些其中更换患者的角膜内皮和/或后弹力膜可能为指定治疗的病状。通常参见美国专利案第5,755,785号、美国专利案第5,649,944号、美国专利案第7,147,648号、美国专利案第7,300,653号、美国专利案第5,584,881号、美国专利案第5,686,414号、美国专利案第7,300,654号、美国专利申请案第10/525,391号，其各自以全文引用的方式并入本文中。正在研发角膜内皮手术更换的其它方法，包括后弹力膜内皮角膜成形术(Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty；DMEK)，其中供体组织仅由后弹力膜和角膜内皮组成。另一种可能有前景的治疗途径为角膜内皮重构，其中在移植之前在体外培养角膜内皮细胞。举例来说，在聚合物上培养所供给的人类角膜细胞，释放至生物粘着性明胶盘上，且接着成功地整合至经剥离的兔角膜中，其中明胶盘在移植之后溶解(薛(Hsiue)等人,移植.2006年2月,15；81(3):473-6，其以全文引用的方式并入本文中)。然而，利用培养物细胞的方法需要具有所述细胞的来源，且因此受如上文所描述的缺乏适合的供给组织的影响。此外，由于供给细胞的差异，发现难以产生具有恒定的质量和功效的角膜内皮细胞培养物。由于可能需要对自各供体获得的细胞进行广泛的安全性和/或功效测试，因此监管障碍还可能使此类方法在后勤方面难以大规模进行。这些和其它治疗方法进一步描述于托马斯·约翰(Thomas John),角膜内皮移植：DSAEK、DMEK和DLEK(CornealEndothelial Transplant:DSAEK,DMEK&DLEK)(Jp医药有限公司出版社(JP Medical Ltd),2010)中，其以全文引用的方式并入本文中。
其它大体上关于获得和使用角膜细胞的方法(包括治疗方法、培养方法、保存方法)、含有角膜细胞或可与角膜细胞结合使用的组合物和其类似物的公开内容包括于U.S.2007/0275365、US2010/0209402、US2010/0233240、US2011/0009488、US2009/0232772、美国专利案第5,166,048号、US2007/0092550、US2005/0214259、US2007/0148137、美国专利案第4,959,319号、美国专利案第5,310,728号、美国专利案第5,589,451号、US2010/0215717、美国专利案第5,703,047号、US2009/0222086、US2009/0263465、US2006/0228693、US2006/0240552、US2009/0270982、美国专利案第5,269,812号、美国专利案第7,371,513号、US2010/0069915、US2011/0166650、U.S.9,752,118、US 2018/0072989和U.S.9,752,118中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
因此，所属领域中需要用于制备角膜内皮细胞的简单和有效的方法。
发明内容
本发明通过提供可行且有效的用于制备角膜内皮细胞(CEC)，例如成熟CEC的方法来满足所属领域中的此需求，所述方法通过增加角膜内皮祖细胞或多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞或胚胎干细胞)中的至少一种选自由以下组成的群的转录因子的表达来进行：成对样同源结构域转录因子2(PITX2)、叉头框C1(FOXC1)、转录因子AP-2β(TFAP2B)、LIM同源框转录因子1β(LMX1B)和POU6F2(第6类Pou同源框2)。在一个方面中，本发明提供新颖和有效的用于产生CEC，例如成熟CEC的方法，其通过增加角膜内皮祖细胞或多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞或胚胎干细胞)中的至少一种选自由以下组成的群的转录因子的表达来进行：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
本发明的方法皆为简单、可行和有效的，且引起产生可用于本文中所公开的各种应用(例如，治疗眼部疾病，例如CEC的疾病)的CEC，例如成熟CEC。
本发明提供用于产生角膜内皮细胞的方法，所述方法包含增加角膜内皮祖细胞中的至少一种选自由PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2组成的群的转录因子的表达，从而产生角膜内皮细胞。
在某些实施例中，PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在某些实施例中，PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在一个实施例中，角膜内皮细胞为成熟角膜内皮细胞。
在另一实施例中，转录因子为PITX2。
在另一实施例中，PITX2为至少一种选自由以下组成的群的PITX2的同种型：PITX2，同种型1；PITX2，同种型2；PITX2，同种型3；PITX2，同种型4；和PITX2，同种型5。
在另一实施例中，转录因子为FOXC1。
在另一实施例中，转录因子为TFAP2B。
在另一实施例中，TFAP2B为至少一种选自由以下组成的群的TFAP2B的同种型：TFAP2B，同种型1和TFAP2B，同种型2。
在另一实施例中，转录因子为LMX1B。
在另一实施例中，LMX1B为至少一种选自由以下组成的群的LMX1B的同种型：LMX1B，同种型1；LMX1B，同种型2；和LMX1B，同种型3。
在另一实施例中，转录因子为POU6F2。
在另一实施例中，POU6F2为至少一种选自由以下组成的群的POU6F2的同种型：POU6F2，同种型1和POU6F2，同种型2。
在另一实施例中，方法进一步包含增加角膜内皮祖细胞中的一或多种选自由以下组成的群的转录因子的表达：ERG、ATF4、ATMIN、BHLHE40、CEBPD、CSRNP1、DRAP1、EGR1、ELF2、EMX2、ESRRA、ETS2、FOS、FOSB、FOSL2、GTF3A、HIF1A、JUN、JUNB、JUND、KLF10、KLF9、MBD3、NFE2L1、NME2、NR1D1、NR4A1、PA2G4、POU3F3、RELA、TBX2、TFDP1、TSC22D1、USF2、YBX1、ZNF207、ZNF358和ZNF395。
在另一实施例中，所述一或多种转录因子为ERG。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为BHLHE40。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为CEBPD。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为CSRNP1。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为EGR1。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为ESRRA。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为ETS2。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为FOS。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为FOSB。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为FOSL2。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为JUN。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为JUNB。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为JUND。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为KLF10。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为KLF9。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为NR1D1。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为NR4A1。在另一实施例中，所述一或多种转录因子为TSC22D1。
在另一实施例中，增加角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达包含使角膜内皮祖细胞与至少一种转录因子接触。
在另一实施例中，角膜内皮祖细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体。
在另一实施例中，角膜内皮祖细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体包含自我裂解序列。
在另一实施例中，角膜内皮祖细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体为病毒载体。
在另一实施例中，角膜内皮祖细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体为非病毒载体。
在另一实施例中，角膜内皮祖细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体为诱导型表达载体。
在另一实施例中，角膜内皮祖细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体包含以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸的启动子。
在一个实施例中，启动子为内源性启动子。
在一个实施例中，启动子为人工启动子。
在一个实施例中，启动子为诱导型启动子。
在另一实施例中，增加角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达包含用编码至少一种转录因子的病毒载体转导角膜内皮祖细胞。
在另一实施例中，增加角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达包含用编码至少一种转录因子的表达载体转染角膜内皮祖细胞。
在另一实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前，将角膜内皮祖细胞培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天。
在另一实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之后，将角膜内皮祖细胞培养至少10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
在另一实施例中，增加PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。
在另一实施例中，增加FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，增加TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，增加LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，增加POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B、LMX1B和MRGPRX3。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B和LMX1B。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群的标记物的表达：COL8A1、COL8A2、SLC4A11和MRGPRX3。
在另一实施例中，增加的一或多种标记物的表达包含相对于角膜内皮祖细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现降低的NGFR、SOX10、HNK1、SSEA4、NANOG、OCT4、vWF和/或CD31的表达。
在另一实施例中，降低的NGFR、SOX10、HNK1、SSEA4、NANOG、OCT4、vWF和/或CD31的表达包含相对于角膜内皮祖细胞降低至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍或4倍。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现以下中的一或多个：增加的泵送功能、增强的紧密接合区形成、增加的对氧化应力的抗性和增加的多边形形态。
在另一实施例中，增加的泵送功能、增强的紧密接合区形成、增加的对氧化应力的抗性和增加的多边形形态包含相对于角膜内皮祖细胞增加至少5％、10％、15％、20％或25％。
在另一实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组朝向角膜内皮细胞的转录组偏移至少1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。
在另一实施例中，在向有需要的个体的角膜施用角膜内皮细胞后，角膜呈现以下中的一或多个：增加的泵送活性、增加的紧密接合区形成、增加的对氧化应力的抗性、增加的透明度和降低的厚度。
在另一实施例中，角膜内皮祖细胞衍生自多能干细胞。
在另一实施例中，角膜内皮祖细胞衍生自多能干细胞，所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
在另一实施例中，诱导角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达包含使用编码所述至少一种转录因子的基因开关构建体。
在另一实施例中，诱导角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达包含使用编码所述至少一种转录因子的基因开关构建体，其中所述基因开关构建体为转录基因开关构建体。
在另一实施例中，诱导角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达包含使用编码所述至少一种转录因子的基因开关构建体，其中所述基因开关构建体为转录后基因开关构建体。
本发明还提供用于产生多能干细胞衍生的角膜内皮细胞的方法，所述方法包含：(a)培养多能干细胞和诱导角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞的形成，其中多能干细胞包含有包含编码至少一种选自由以下组成的群的转录因子的核酸的表达载体：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2，和(b)增加角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的所述至少一种来自表达载体的转录因子的表达，从而产生角膜内皮细胞。
在某些实施例中，PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在某些实施例中，PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在一个实施例中，角膜内皮细胞为成熟角膜内皮细胞。
在另一实施例中，多能干细胞为胚胎干细胞。
在另一实施例中，多能干细胞为诱导性多能干细胞。
在另一实施例中，转录因子为PITX2。
在另一实施例中，PITX2为至少一种选自由以下组成的群的PITX2的同种型：PITX2，同种型1；PITX2，同种型2；PITX2，同种型3；PITX2，同种型4；和PITX2，同种型5。
在另一实施例中，转录因子为FOXC1。
在另一实施例中，转录因子为TFAP2B。
在另一实施例中，TFAP2B为至少一种选自由以下组成的群的TFAP2B的同种型：TFAP2B，同种型1和TFAP2B，同种型2。
在另一实施例中，转录因子为LMX1B。
在另一实施例中，LMX1B为至少一种选自由以下组成的群的LMX1B的同种型：LMX1B，同种型1；LMX1B，同种型2；和LMX1B，同种型3。
在另一实施例中，转录因子为POU6F2。
在另一实施例中，POU6F2为至少一种选自由以下组成的群的POU6F2的同种型：POU6F2，同种型1和POU6F2，同种型2。
在另一实施例中，方法进一步包含增加一或多种选自由以下组成的群的转录因子的表达：ERG、ATF4、ATMIN、BHLHE40、CEBPD、CSRNP1、DRAP1、EGR1、ELF2、EMX2、ESRRA、ETS2、FOS、FOSB、FOSL2、GTF3A、HIF1A、JUN、JUNB、JUND、KLF10、KLF9、MBD3、NFE2L1、NME2、NR1D1、NR4A1、PA2G4、POU3F3、RELA、TBX2、TFDP1、TSC22D1、USF2、YBX1、ZNF207、ZNF358和ZNF395。
在另一实施例中，一或多种转录因子为ERG。在另一实施例中，一或多种转录因子为BHLHE40。在另一实施例中，一或多种转录因子为CEBPD。在另一实施例中，一或多种转录因子为CSRNP1。在另一实施例中，一或多种转录因子为EGR1。在另一实施例中，一或多种转录因子为ESRRA。在另一实施例中，一或多种转录因子为ETS2。在另一实施例中，一或多种转录因子为FOS。在另一实施例中，一或多种转录因子为FOSB。在另一实施例中，一或多种转录因子为FOSL2。在另一实施例中，一或多种转录因子为JUN。在另一实施例中，一或多种转录因子为JUNB。在另一实施例中，一或多种转录因子为JUND。在另一实施例中，一或多种转录因子为KLF10。在另一实施例中，一或多种转录因子为KLF9。在另一实施例中，一或多种转录因子为NR1D1。在另一实施例中，一或多种转录因子为NR4A1。在另一实施例中，一或多种转录因子为TSC22D1。
在另一实施例中，表达载体为病毒载体。
在另一实施例中，表达载体为非病毒载体。
在另一实施例中，表达载体为诱导型表达载体。
在另一实施例中，表达载体包含启动子，其以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸。
在另一实施例中，表达载体包含启动子，其以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸，其中启动子为内源性启动子。
在另一实施例中，表达载体包含启动子，其以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸，其中所述启动子为人工启动子。
在另一实施例中，表达载体包含启动子，其以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸，其中启动子为诱导型启动子。
在另一实施例中，增加角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达包含诱导角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的至少一种转录因子的表达。
在另一实施例中，诱导角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的至少一种转录因子的表达包含使用编码至少一种转录因子的基因开关构建体。
在另一实施例中，诱导角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的至少一种转录因子的表达包含使用编码至少一种转录因子的基因开关构建体，其中所述基因开关构建体为转录基因开关构建体。
在另一实施例中，诱导角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的至少一种转录因子的表达包含使用编码至少一种转录因子的基因开关构建体，其中所述基因开关构建体为转录后基因开关构建体。
在另一实施例中，用编码至少一种转录因子的病毒载体转导多能干细胞。
在另一实施例中，用编码至少一种转录因子的表达载体转染多能干细胞。
在另一实施例中，步骤(a)包含将多能干细胞与小型/母体抗果蝇皮肤生长因子(Small/Mothers Against Decapentaplegic；SMAD)蛋白质信号传导的至少一种抑制剂一起培养，以诱导多能干细胞分化成角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞。
在另一实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前，将角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天。
在另一实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之后，将角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞培养至少8、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
在另一实施例中，增加PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，增加FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，增加TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，增加LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，增加POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B、LMX1B和MRGPRX3。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B和LMX1B。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群的标记物的表达：COL8A1、COL8A2、SLC4A11和MRGPRX3。
在另一实施例中，增加的一或多种标记物的表达包含相对于角膜内皮祖细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞呈现降低的NGFR、SOX10、HNK1、SSEA4、NANOG、OCT4、vWF和/或CD31的表达。
在另一实施例中，降低的NGFR、SOX10、HNK1、SSEA4、NANOG、OCT4、vWF和/或CD31的表达包含相对于角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞降低至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍或4倍。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现以下中的一或多个：增加的泵送功能、增强的紧密接合区形成、增加的对氧化应力的抗性和增加的多边形形态。
在另一实施例中，增加的泵送功能、增强的紧密接合区形成、增加的对氧化应力的抗性和增加的多边形形态包含相对于角膜内皮祖细胞增加至少5％、10％、15％、20％或25％。
在另一实施例中，在向有需要的个体的角膜施用角膜内皮细胞后，角膜呈现以下中的一或多个：增加的泵送活性、增加的紧密接合区形成、增加的对氧化应力的抗性、增加的透明度和降低的厚度。
在另一实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组朝向角膜内皮细胞的转录组偏移至少1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。
在另一实施例中，增加至少一种转录因子的表达使神经脊干细胞的转录组朝向角膜内皮细胞的转录组偏移至少1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。
本发明还提供由本发明的方法产生的角膜内皮细胞群体。
本发明还提供由包含以下的方法产生的角膜内皮细胞群体：增加角膜内皮祖细胞中的选自由PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2组成的群的至少一种转录因子的表达，从而产生角膜内皮细胞。
本发明还提供通过包含以下的方法产生的角膜内皮细胞群体：(a)培养多能干细胞和诱导角膜内皮祖细胞的形成，其中多能干细胞包含有包含编码至少一种选自由以下组成的群的转录因子的核酸的表达载体：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2，和(b)增加角膜内皮祖细胞中的来自表达载体的至少一种转录因子的表达，从而产生角膜内皮细胞。
在某些实施例中，PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在某些实施例中，PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
本发明还提供医药组合物，其包含由本发明的方法产生的角膜内皮细胞群体和药学上可接受的载剂。
本发明还提供医药组合物，其包含由包含以下的方法产生的角膜内皮细胞群体和药学上可接受的载剂：增加角膜内皮祖细胞中的至少一种选自由PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2组成的群的转录因子的表达，从而产生角膜内皮细胞。
本发明还提供医药组合物，其包含通过包含以下的方法产生的角膜内皮细胞群体和药学上可接受的载剂：(a)培养多能干细胞和诱导角膜内皮祖细胞的形成，其中多能干细胞包含有包含编码至少一种选自由以下组成的群的转录因子的核酸的表达载体：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2，和(b)增加角膜内皮祖细胞中的来自表达载体的至少一种转录因子的表达，从而产生角膜内皮细胞。
在某些实施例中，PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在某些实施例中，PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
本发明还提供角膜内皮细胞群体，其包含相对于角膜内皮细胞群体中的转录因子的内源性表达量增加的至少一种选自由以下组成的群的转录因子的表达量：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
在一个实施例中，角膜内皮细胞为成熟角膜内皮细胞。
在另一实施例中，角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B、LMX1B和MRGPRX3。
在某些实施例中，PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在某些实施例中，PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在另一实施例中，角膜内皮细胞群体中的角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B和LMX1B。
在另一实施例中，角膜内皮细胞群体中的角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群的标记物的表达：COL8A1、COL8A2、SLC4A11和MRGPRX3。
在另一实施例中，增加的表达包含至少一种转录因子的外源性表达。
在另一实施例中，角膜内皮细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体。
在另一实施例中，角膜内皮祖细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体包含自我裂解序列。
在另一实施例中，角膜内皮细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体为病毒载体。
在一个实施例中，病毒载体选自由以下组成的群：腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、仙台病毒(sendai virus)载体和逆转录病毒载体。
在另一实施例中，角膜内皮细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体为非病毒载体。
在一个实施例中，非病毒载体选自由以下组成的群：质粒DNA、线形双链DNA(dsDNA)、线形单链DNA(ssDNA)、纳米质粒、微型环DNA、单链寡脱氧核苷酸(ssODN)、DDNA寡核苷酸、单链mRNA(ssRNA)和双链mRNA(dsRNA)。
在另一实施例中，非病毒载体包含裸核酸、脂质体、树枝状聚合物、纳米粒子、脂质-聚合物系统、固体脂质纳米粒子和/或脂质体鱼精蛋白/DNA脂质复合物(LPD)。
在另一实施例中，角膜内皮细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体为诱导型表达载体。
在另一实施例中，角膜内皮细胞包含有包含编码至少一种转录因子的核酸的表达载体，其中所述表达载体包含以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸的启动子。
在另一实施例中，启动子为内源性启动子。
在另一实施例中，启动子为人工启动子。
在另一实施例中，启动子为诱导型启动子。
在一个实施例中，转录因子为PITX2。
在另一实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮细胞群体中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，转录因子为FOXC1。
在另一实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮细胞群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，转录因子为TFAP2B。
在另一实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮细胞群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，转录因子为LMX1B。
在另一实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮细胞群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，转录因子为POU6F2。
在另一实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮细胞群体中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
在另一实施例中，角膜内皮细胞群体为成熟角膜内皮细胞群体。
在另一实施例中，角膜内皮细胞衍生自多能干细胞。
在另一实施例中，多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
在另一实施例中，角膜内皮细胞群体包含至少106个角膜内皮细胞。
本发明还提供包含表达载体的多能干细胞，所述表达载体包含编码至少一种选自由以下组成的群的转录因子的核酸：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
在某些实施例中，PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在某些实施例中，PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在一个实施例中，表达载体为病毒载体。
在另一实施例中，表达载体为非病毒载体。
在另一实施例中，表达载体为诱导型表达载体。
在另一实施例中，表达载体包含启动子，其以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸。
在另一实施例中，启动子为内源性启动子。
在另一实施例中，启动子为人工启动子。
在另一实施例中，启动子为诱导型启动子。
在另一实施例中，多能干细胞包含编码至少一种转录因子的基因开关构建体。
在另一实施例中，基因开关构建体为转录基因开关构建体。
在另一实施例中，基因开关构建体为转录后基因开关构建体。
本发明还提供角膜内皮细胞，其包含有包含编码至少一种选自由以下组成的群的转录因子的核酸的表达载体：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
在某些实施例中，PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在某些实施例中，PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在一个实施例中，角膜内皮细胞为成熟角膜内皮细胞。
在另一实施例中，表达载体为病毒载体。
在另一实施例中，表达载体为非病毒载体。
在另一实施例中，表达载体为诱导型表达载体。
在另一实施例中，表达载体包含启动子，其以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸。
在另一实施例中，启动子为内源性启动子。
在另一实施例中，表达载体包含启动子，其以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸，其中所述启动子为人工启动子。
在另一实施例中，表达载体包含启动子，其以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸，其中所述启动子为诱导型启动子。
在另一实施例中，多能干细胞包含编码至少一种转录因子的基因开关构建体。
在另一实施例中，多能干细胞包含编码至少一种转录因子的基因开关构建体，其中所述基因开关构建体为转录基因开关构建体。
在另一实施例中，多能干细胞包含编码至少一种转录因子的基因开关构建体，其中所述基因开关构建体为转录后基因开关构建体。
本发明还提供包含本发明的角膜内皮细胞群体、角膜内皮细胞的组合物或角膜内皮细胞的医药组合物。
本发明还提供包含由本发明的方法制备的角膜内皮细胞群体、角膜内皮细胞的组合物或角膜内皮细胞的医药组合物。
本发明还提供用于治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包含向个体施用有效量的根据本发明的角膜内皮细胞群体；包含角膜内皮细胞的组合物；角膜内皮细胞；或包含有角膜内皮细胞群体、包含角膜内皮细胞的组合物或角膜内皮细胞的医药组合物，从而治疗个体中的疾病。
本发明还提供用于治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包含向个体施用有效量的通过本发明的方法制备的角膜内皮细胞群体；包含角膜内皮细胞的组合物；角膜内皮细胞；或包含有角膜内皮细胞群体、包含角膜内皮细胞的组合物或角膜内皮细胞的医药组合物，从而治疗个体中的疾病，其中角膜。
在一个实施例中，疾病选自由以下组成的群：富克斯氏营养不良、虹膜角膜内皮综合征、后部多形性营养不良、先天性遗传性内皮营养不良、角膜营养不良和角膜移植中的晚期内皮衰竭。
本发明还提供用于治疗有需要的个体的方法，其中所述个体呈现引起大疱性角膜病变的角膜水肿的症状，其中所述个体患有由使用隐形眼镜或白内障手术引起的眼部损伤或其中所述个体患有持续性手术创伤，所述方法包含向个体施用根据本发明的角膜内皮细胞群体；包含角膜内皮细胞的组合物；角膜内皮细胞；或包含有角膜内皮细胞群体、包含角膜内皮细胞的组合物或角膜内皮细胞的医药组合物，从而治疗个体。
本发明还提供用于治疗有需要的个体的方法，其中所述个体呈现引起大疱性角膜病变的角膜水肿的症状，其中所述个体患有由使用隐形眼镜或白内障手术引起的眼部损伤或其中所述个体患有持续性手术创伤，所述方法包含向个体施用有效量的通过本发明的方法制备的角膜内皮细胞群体；包含角膜内皮细胞的组合物；角膜内皮细胞；或包含有角膜内皮细胞群体、包含角膜内皮细胞的组合物或角膜内皮细胞的医药组合物，从而治疗个体。
本发明还提供试剂盒，其包含根据本发明的包含角膜内皮细胞群体的组合物；包含角膜内皮细胞的组合物；角膜内皮细胞；或包含有角膜内皮细胞群体、包含角膜内皮细胞的组合物或角膜内皮细胞的医药组合物。
本发明还提供试剂盒，其包含根据本发明的方法制备的包含角膜内皮细胞群体的组合物；包含角膜内皮细胞的组合物；角膜内皮细胞；或包含有角膜内皮细胞群体、包含角膜内皮细胞的组合物或角膜内皮细胞的医药组合物。
在一个实施例中，试剂盒包含表达载体，所述表达载体包含编码至少一种选自由以下组成的群的转录因子的核酸：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
在某些实施例中，PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在某些实施例中，PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
本发明还提供试剂盒，其包含至少一种选自由以下组成的群的转录因子：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
通过以下详细说明和图式进一步说明本发明。
附图说明
图1为用于自多能干细胞产生CEC，例如成熟CEC的方法的示意性说明。由hPSC诱导神经脊分化持续6天。在6天之后，将培养基更换成支持成熟的培养基。在第10天进行慢病毒感染，且通过qPCR分析来自第14天和第21天(或来自约d14至约d28的样品)的样品的由所引入的慢病毒表达的转录因子的表达。
图2为一组条形图，其展示在通过用表达转录因子的慢病毒进行转导来将转录因子(PITX2、FOXC1、TFAP2B和LMX1B)引入iPSC衍生的角膜内皮祖细胞之后的第21天时的这些转录因子的表达量。在iPSC衍生的CEC分化的第10天进行转导且在分化的第21天进行qPCR分析。使用1:10或1:50的载体与培养基的体积比实现感染。与用绿色荧光蛋白(GFP)或聚凝胺处理的对照细胞相比，经转导的细胞中的转录因子的表达量增加。
图3为一组条形图，其展示在经表达PITX2、FOXC1、TFAP2B和LMX1B(单独或以各种组合形式)的慢病毒转导的角膜内皮祖细胞的CEC分化期间，COL8A1(未成熟至成熟CEC的标记物)和Slc4a11(成熟CEC的标记物)的表达量。使用1:10或1:50的载体与培养基的体积比实现感染。在iPSC衍生的CEC分化的第21天进行qPCR分析。与仅用GFP或聚凝胺处理的细胞相比，未成熟至成熟(COL8A1)和成熟(SLC4A11)CEC标记物上调。在存在嘌呤霉素(puromycin)的情况下，表达的增加更多。
图4为一组条形图，其展示经表达转录因子的载体稳定感染的hPSC细胞系中的转录因子PITX2(A)、FOXC1(B)和TFAP2B(C)的表达。将转录因子单独地或以与其它转录因子组合的形式引入。使用1:10或1:50的载体与培养基的体积比实现感染，接着进行嘌呤霉素选择。条形图D和E展示在经稳定感染的hPSC细胞系中的不同转录因子的表达增加后，未成熟至成熟CEC标记物COL8A1(D)和成熟CEC标记物SLC4A11(E)的表达。通过qPCR分析来测定表达。与用单独的GFP处理的对照细胞相比，经工程改造以表达一或多种转录因子的细胞中的COL8A1(D)和成熟CEC标记物SLC4A11的表达量增加。
图5为呈现人类角膜内皮细胞中富集的转录因子同种型的表。
图6为一组条形图，其展示根据如本文中所描述的方法产生的CEC细胞内的血管内皮标记物vWF和CD31的RNA表达量。
具体实施方式
本发明提供可行和有效的用于产生CEC，例如成熟CEC的方法。所述方法包括增加角膜内皮祖细胞或多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞或胚胎干细胞)中的至少一种选自由以下组成的群的转录因子的表达，从而产生CEC，例如成熟CEC：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。本发明还提供通过这些方法产生的组合物和使用这些组合物的方法。CEC，例如成熟CEC，经由多能或多潜能干细胞的定向分化而产生，所述干细胞包括人类诱导性多能干细胞(hiPSC)、人类胚胎干细胞(hESC)和体细胞(包括经转分化的细胞和干细胞，例如神经脊干细胞)。本发明的方法为可行和有效的，且引起产生可用于本文中所公开的各种应用(例如，治疗眼部疾病，例如角膜的疾病)的CEC，例如成熟CEC。预期这些细胞可提供用于治疗用途的难以收集的供给角膜的替代物。
以下详细说明公开如何制备和使用本发明。
为了使本发明可更易于理解，首先对某些术语进行定义。还应注意，不论何时叙述参数的值或值的范围，旨在使所述值的范围内的值和范围还为本发明的一部分。
在以下描述中，出于说明的目的，阐述特定数量、材料和配置以便提供对本发明的透彻理解。然而，所属领域的一般技术人员将显而易见，本发明可在无这些特定细节的情况下实践。在一些情况下，可省略或简化熟知的特征以免混淆本发明。此外，说明书中提及例如“一个实施例”或“一实施例”的短语意谓结合实施例所描述的特定特性、结构或特征包括于本发明的至少一个实施例中。说明书中多处出现的例如“在一个实施例中”的短语未必皆指同一实施例。
定义
除非另外规定，否则以下术语中的每一者具有此章节中所阐述的含义。
不定冠词“一(a/an)”是指相关名词中的至少一者，且可与术语“至少一个”和“一或多个”互换使用。
连词“或”和“和/或”可与非排他性分离词(disjunction)互换地使用。
根据本申请案，术语“约”意谓参考值的+/-5％。
“角膜内皮细胞”或“CEC”通常是指在角膜之后表面上排列且面向眼睛的前房的富含线粒体的细胞(在活机体中)。CEC还可使用本文中所描述的方法自另一种细胞类型产生，例如通过神经脊干细胞、胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)的分化。自NCSC、ES细胞或iPS细胞分化的CEC可由其呈现内源性CEC的一或多种属性来鉴别或识别，所述一或多种属性例如CEC标记物的表达；形成具有明显的六边形形状的大小均匀的细胞的单层的能力；形成允许溶质和营养物自眼房液渗漏至角膜的更浅的表层，同时以相反方向(自基质至眼房液)主动泵送水的“渗漏泵”的能力。示范性CEC标记物包括(但不限于)：Na+/K+ATP酶、ZO-1、KLF13、AQP1、胶原蛋白VIII、SLC16A3、CFTR、NBC1、CA2、AE2 SCL4A2、SCL16A1、CA12、CA4、FOXC1。举例来说，CEC通常表达胶原蛋白VIII、Na+K+ATP酶泵和ZO-1，且不表达vWF和CD31(后者存在于血管内皮细胞中)。此外，CEC可表达一或多种角膜内皮泵标记物(其包括：Na+/K+ATP酶、SLC4A4、SLC4A11、AQP1、CA2、CA4、CA12、SCL14A2、SLC16A1、SLC16A3、SLC16A7、CFTR、NHE1、ADCY10、电压依赖性阴离子通道VDAC2和VDAC3、氯离子通道蛋白质CLCN2和CLC)、眼周神经脊标记物(其包括：PITX2和FOXC1)和/或细胞粘附和基质蛋白(其包括：紧连蛋白(Occludin)、连结蛋白(Connexin)43、9.3E抗原、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、N钙粘素、VE钙粘素、E钙粘素、β连环蛋白、p120、p190层粘连蛋白α4、巢蛋白-2和轴突引导因子4)。举例来说，CEC可表达至少一种角膜内皮泵标记物、至少一种眼周神经脊标记物以及至少一种细胞粘附和基质蛋白。角膜内皮细胞包括如本文中所定义的成熟角膜内皮细胞。
在另一实施例中，CEC显示指示CEC成熟的整体基因表达图谱。通过所属领域中已知的任何方法(例如转录组学分析或微阵列分析)获得整体基因表达图谱。
如本文中所使用的术语“成熟角膜内皮细胞”或“成熟CEC”是指呈现与成熟表型相关的标记物的CEC，所述标记物包括COL8A1、COL8A2、SLC4A11和MRGPRX3中的一或多个。成熟CEC形成具有明显六边形或多边形形态的大小均匀的细胞的单层，其中细胞呈现彼此之间的紧密粘附和形成紧密接合区的能力，所述紧密接合区形成维持基质脱水的屏障。部分归因于成熟CEC彼此之间的紧密粘附、形成紧密接合区的能力、细胞之间的紧密接合区的数目和调节角膜内皮泵的蛋白质的表达，成熟CEC呈现高水平的泵送功能。紧密接合区形成屏障以减少流入基质的水且经改进的泵活性可促进维持角膜中的适当流体水平。成熟角膜内皮细胞还可呈现对氧化应力的抗性。成熟角膜内皮细胞可表达与泵送功能相关的标记物，例如SLC4A11和SLC4A4。成熟角膜内皮细胞中可表达的其它与泵送功能相关的标记物包括Na+/K+ATP酶、AQP1、CA2、CA4、CA12、SCL14A2、SLC16A1、SLC16A3、SLC16A7、CFTR、NHE1、ADCY10、电压依赖性阴离子通道VDAC2和VDAC3、氯离子通道蛋白质CLCN2和CLC。
成熟CEC可呈现体内功效，举例来说，在将成熟角膜内皮细胞移植至患有角膜病症的个体中之后，可将成熟角膜内皮细胞植入受体角膜上且形成细胞的单层，其中所述细胞形成紧密接合区。可使用所属领域技术人员已知的方法实现移植。举例来说，可使用利用生物材料的经生物工程改造的角膜移植物来实现移植(参见例如2019年4月11日申请的PCT公开案第WO 2019/198086号)。由于形成紧密接合区和表达与泵送功能相关的标记物，体内成熟CEC可改进受体角膜的泵送功能，引起角膜的透明度增加。所移植的成熟CEC还可降低受体角膜的厚度且增加受体角膜的透明度。成熟角膜内皮细胞中可表达的其它标记物包括(但不限于)PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B、LMX1B、AQP1、ATP1A1、TJP1、NCAM1、CDH2、SLC4A4、CD166、POU6F2、CD248和MRGPRX3。在一个实施例中，成熟角膜内皮细胞中表达的标记物为PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2b、LMX1B和MRGPRX3。在一个实施例中，成熟角膜内皮细胞中表达的标记物为PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B和LMX1B。在一个实施例中，成熟角膜内皮细胞中表达的标记物为COL8A1、COL8A2、SLC4A11和MRGPRX3。
“神经脊干细胞”或“NCSC”通常是指具有产生各种细胞类型的发育潜力的神经祖细胞，所述细胞类型例如黑色素细胞、颅面骨骼、周边神经系统、神经胶质、平滑肌、角化细胞和角膜内皮。神经脊干细胞可自iPSC或hES细胞分化，例如使用如本文中所描述或如WO/2010/096496或U.S.9,752,118中所描述的双重SMAD抑制剂，其各自以全文引用的方式并入本文中。神经脊干细胞可使用Wnt促效剂(例如Wnt3a和/或(2'Z,3'E)-6-溴靛玉红至3'-肟(BIO))和SMAD抑制剂(例如SB431542和/或诺金(Noggin))的组合自hES细胞或iPSC分化；参见梅南德兹(Menendez)等人,美国国家科学院院刊(PNAS),2011年11月29日,第108卷,第48号,19240-19245。举例来说，在hESC与SB431542和BIO(在存在或不存在诺金的情况下)或与Wnt3a和SB431542接触之后报道NCSC的有效诱导。NCSC还可自神经玫瑰结(neuralrosettes)的培养物获得，例如通过在MS5基质饲养细胞上培养hES细胞(参见李(Lee)等人,干细胞(Stem Cells)25(8),1931-1393(2007)，其以全文引用的方式并入本文中)。NCSC还可自许多组织获得，包括在正在发育的胚胎中，在神经管、坐骨神经、消化道和背根节中；和在青少年和成年人中，在背根节、骨髓、皮肤、心脏、角膜、牙齿和颈动脉体中。参见名越(Nagoshi)等人,细胞生物化学杂志(Journal of Cellular Biochemistry)107:1046-1052(2009)；克兰(Crane)和特雷纳(Trainor),细胞和发育生物学年鉴(Annu.Rev.CellDev.Biol.)2006.22:267-86；和布鲁姆(Blum),脑研究通报(Brain Research Bulletin)83(2010)189-193，其各自以全文引用的方式并入本文中。
可通过本文中鉴别和所属领域中已知的标记物的表达鉴别神经脊干细胞。示范性神经脊干细胞标记物包括(但不限于)：SOX10、AP2、HNK1、PAX3、PAX7和p75(NGFR)，以及低或不存在Pax6表达。眼周间质(POM)为对PITX2和FOXC1呈阳性的神经脊细胞的亚群，其还可表达TFAP2B和/或LMX1B。
术语“角膜内皮祖细胞”通常是指后神经脊阶段细胞，其开始获取CEC的一些特征，例如早期至中期CEC标记物(ZO1、Na+/K+ATP酶、N-钙粘素、NCAM1、CD166、PITX2、FOXC1、COL8A1、TFAP2B、SLC4A4)的表达，和形成多边形或六边形细胞的单层的能力。这些细胞未必以与成熟CEC相等的量或以与成熟CEC相同的表达量百分比来表达CEC标记物。
如本文中所使用，术语“标记物”或“细胞标记物”是指其存在可鉴别特定细胞或细胞类型的基因(例如，以RNA形式)或蛋白质。细胞的标记物可不限于一种标记物，标记物可指标记物的“模式”，使得指定的标记物组可区分一种细胞或细胞类型与另一种细胞或细胞类型，例如包括一些标记物的表达且不存在或存在较低的指示其它细胞类型的其它标记物的表达的模式。举例来说，CEC群体(例如成熟CEC)可对CEC(例如成熟CEC)的标记物呈阳性且对指示其它细胞类型的标记物呈阴性，例如不存在表达于其它内皮细胞类型上的标记物、不存在由hES细胞或iPSC表达的标记物和/或不存在由神经脊干细胞表达的标记物。此外，当通过细胞染色方法(例如，免疫荧光和其类似方法)检测到标记物表达时，可鉴别细胞对提供所预期的染色模式(例如标记物ZO-1的紧密接合区定位)的特定标记物呈阳性。可通过所属领域中已知的任何方法检测标记物的表达，包括(但不限于)：西方墨点法(Westernblotting)、基于mRNA扩增的方法(例如，PCR、等温扩增等，其可包括逆转录且可用于检测来自单一细胞或多种细胞的表达)、北方墨点法(Northern blotting)、免疫染色等。此外，可由受基因元件控制的报告子构建体(例如，荧光蛋白，其表达可以目视方式检测；抗生素抗性基因，其表达可通过在存在抗生素的情况下的细胞存活率来检测等)的表达来推断所述标记物的表达，所述基因元件赋予细胞类型特异性表达，例如一种前述标记物或其片段的启动子。来自文献的示范性报告子构建体为pOCT4-GFP和pOCT4-LUC基因，其分别驱动ES细胞中的GFP和荧光素酶的表达，其表达皆可使用常规方法容易地检测。其它可使用的检测标记物表达的方法为所属领域中已知的。通常参见奥苏贝尔(Ausubel),现代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)(现代实验指南,1988)；奥苏贝尔等人,精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)(现代实验指南；第5版,2002)；桑布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆实验指南(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),第3版,2001)；桑布鲁克等人,分子克隆实验指南精编版(The Condensed Protocols fromMolecular Cloning:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社,2006)，其各自以全文引用的方式并入本文中。
如本文中所使用，“增加”或“增加的”在其指表达或活性的水平时意谓与对照性表达或活性的水平相比增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。“增加”在其指表达或活性的水平时还意谓与对照性表达或活性的水平相比增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、79％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
如本文中所使用，术语“增加表达”是指相对于转录因子的内源性核酸水平和/或蛋白质水平，增加编码本文中所公开的转录因子的核酸(例如，RNA或DNA)的水平和/或活性和/或增加本文中所公开的转录因子的水平和/或活性。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达包含使细胞(例如，角膜内皮祖细胞或多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)与至少一种转录因子接触。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达包含用编码至少一种转录因子的病毒载体转导细胞(例如，角膜内皮祖细胞或多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达包含用编码至少一种转录因子的表达载体转染细胞(例如，角膜内皮祖细胞或多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)。
在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达包含相对于细胞(例如，角膜内皮祖细胞或多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)中的至少一种转录因子的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达包含相对于细胞(例如，角膜内皮细胞或多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)中的至少一种转录因子的内源性表达量增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或1000％。
如本文中所使用，“降低”或“降低的”在其指表达或活性的水平时意谓与对照性表达或活性的水平相比降低至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。“降低”在其指表达或活性的水平时还意谓与对照性表达或活性的水平相比增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、79％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
本发明的各种方法包括涉及与对照物比较值、水平、特性、特征、和/或性质的步骤。“对照物”可为所属领域的一般技术人员熟悉的适用于比较目的的任何对照物或标准。在一个实施例中，“对照物”为在增加如本文中所描述的细胞(例如，多能干细胞、角膜内皮祖细胞、CEC，例如成熟CEC)中的转录因子的表达之前测定的值、水平、特性、特征、性质等。举例来说，可在细胞中表达转录因子之前或在不存在转录因子的情况下测定转录因子的表达量、CEC谱系的细胞(CEC)的标记物(例如，成熟CEC活性或形态，例如泵送功能、对氧化应力的抗性或细胞群体中的紧密接合区形成)的表达量。在另一实施例中，“对照物”为在呈现例如正常特性的细胞或生物体(例如，对照性或正常细胞或生物体)中测定的值、水平、特性、特征、性质等。在另一实施例中，“对照物”为在转录因子的表达之前测定的预定值、水平、特性、特征、性质等。在另一实施例中，“对照物”意谓可作为CEC，例如成熟CEC的对照物的角膜内皮祖细胞。
“对照细胞”可指与表达转录因子的细胞进行比较的细胞。“对照细胞”可不表达转录因子。“对照细胞”与使用其作为对照物的细胞相比可在不同条件(包括剂量、时间长度等)下与表达转录因子的表达载体接触。
如本文中所使用，术语“内源性”是指核酸、多核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA、基因、肽或多肽在其位于细胞或细胞的基因组中的天然位置处的原生形式。
如本文中所使用，“外源性”是指来源于细胞外部或细胞的基因组外部的核酸、多核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA、基因、肽或多肽。
如本文中所使用，术语“成熟”是指细胞(例如，角膜内皮祖细胞)变得特殊化程度和/或功能性更高(例如，与其体内功能状态类似)所需的过程。在一个实施例中，角膜内皮祖细胞变成CEC，例如成熟CEC的过程称为成熟。
如本文中所使用，术语“多能干细胞”、“PS细胞”或“PSC”包括胚胎干细胞、诱导性多能干细胞和胚胎衍生的多能干细胞，与用于衍生多能干细胞的方法无关。在功能上将多能干细胞定义为满足以下条件的干细胞：：(a)当在免疫缺乏(SCID)小鼠中移植时能够诱发畸胎瘤；(b)能够分化成所有三种胚层的细胞类型(例如，可分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞类型)；(c)表达胚胎干细胞的一或多种标记物(例如，表达OCT4、碱性磷酸酶、SSEA-3表面抗原、SSEA-4表面抗原、NANOG、TRA-1-60、TRA-1-81、SOX2、REX1等)；和(d)能够自我更新。术语“多能”是指细胞形成身体或躯体(即，胚体)的所有谱系的能力。举例来说，胚胎干细胞和诱导性多能干细胞为一种能够自三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层中的每一者形成细胞的多能干细胞。多能性为发育性能的连续体，其范围介于不能产生完全生物体的不完全或部分多能细胞至能够产生完全生物体的更原始、更多能的细胞(例如，胚胎干细胞)。可使用例如所属领域中已知的方法产生示范性多能干细胞。示范性多能干细胞包括(但不限于)衍生自囊胚期胚胎的内细胞团的胚胎干细胞、衍生自卵裂期或桑椹胚期胚胎的一或多种分裂球的胚胎干细胞(任选地在不破坏胚胎的其余部分的情况下)、通过将体细胞重编程为多能状态而产生的诱导性多能干细胞和由胚胎生殖(EG)细胞产生的多能细胞(例如，通过在存在FGF-2、LIF和SCF的情况下培养)。此类胚胎干细胞可自通过授精或通过无性方式产生的胚胎材料产生，无性方式包括体细胞核转移(somatic cell nuclear transfer；SCNT)、孤雌生殖和雄核生殖。
在一个实施例中，多能干细胞可经基因工程改造或以其它方式经修饰例如以增加寿命、性能、导向；预防或降低免疫反应；或递送自此类多能细胞(例如，角膜内皮细胞)获得的细胞中的所需因子。举例来说，多能干细胞且因此，所得分化细胞可经工程改造或以其它方式经修饰以不具有或具有降低的β2微球蛋白、I类基因(包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G)、TAP1、TAP2、甲巯蛋白、CTIIA、RFX5、TRAC或TRAB基因的表达。如以全文引用的方式并入本文中的WO2012145384和WO2013158292中所描述，在一些实施例中，细胞(例如多能干细胞和所得分化细胞，例如成熟CEC)包含β-2微球蛋白(B2M)基因中的经基因工程改造的破坏。在一些实施例中，细胞进一步包含能够编码单链融合人类白血球抗原(HLA)I类蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质包含直接或经由连接子序列共价连接至HLA-1α链的至少一部分的B2M蛋白的至少一部分。在一些实施例中，HLA-1α链选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。在一些实施例中，细胞包含人类白血球抗原(HLA)II类相关基因中的经基因工程改造的破坏。在一些实施例中，HLA II类相关基因选自含有调节因子X相关锚蛋白的蛋白质(RFXANK)、调节因子5(RFX5)、调节因子X相关蛋白(RFXAP)、II类反式活化因子(CIITA)、HLA-DPA(α链)、HLA-DPB(β链)、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA和HLA-DOB。在一些实施例中，细胞包含一或多种编码单链融合HLA II类蛋白或HLA II类蛋白的多核苷酸。
多能干细胞和所得分化细胞可经工程改造或以其它方式经修饰以增加基因的表达。在一个实施例中，多能干细胞可经工程改造以表达一或多种本发明的转录因子或增加其表达。存在多种用于工程改造细胞以调节一或多种基因(或蛋白质)的表达的技术，包括使用病毒载体，例如AAV载体；锌指核酸酶(ZFN)；转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)；和用于基因组工程改造的基于CRISPR/Cas的方法；以及使用转录和翻译抑制剂，例如反义和RNA干扰(其可使用稳定整合的载体和游离基因组载体来实现)。
术语“胚胎”或“胚胎型”意谓尚未植入母体宿主的子宫膜中的正在发育的细胞块。“胚胎细胞”为自胚胎分离或胚胎中所含的细胞。此细胞还包括早在二细胞阶段获得的分裂球和在提取后聚集的分裂球。
如本文中所使用，术语“胚胎衍生的细胞”(EDC)广义地指桑椹胚衍生的细胞、囊胚衍生的细胞(包括内细胞团、胚盾或上胚层的细胞)或早期胚胎的其它多能干细胞(包括原始内胚层、外胚层和中胚层以及其衍生物)。“EDC”还包括分裂球和来自聚集的单一分裂球的细胞块或来自不同发育期的胚胎，但不包括已以细胞系形式传代的人类胚胎干细胞。
如本文中所使用，术语“胚胎干细胞”、“ES细胞”或“ESC”广义地指自囊胚或桑椹胚的内细胞团分离且以细胞系形式连续传代的细胞。所述术语还包括自胚胎的一或多个分裂球分离(优选不破坏胚胎的其余部分)的细胞(参见例如钟(Chung)等人,细胞-干细胞(CellStem Cell).2008年2月7日；2(2):1 13-7；美国公开案第20060206953号；美国公开案第2008/0057041号，其各自以全文引用的方式并入本文中)。ES细胞可由卵细胞被精子或DNA授精、核转移、孤雌生殖或通过任何用于产生在HLA区域中具有纯合性的ES细胞的手段而获得。ES细胞还可指从由精子和卵细胞的融合、核转移、孤雌生殖或染色质的重编程和随后将重编程染色质并入质膜以产生细胞而产生的接合子、分裂球或囊胚期哺乳动物胚胎获得的细胞。在一个实施例中，胚胎干细胞可为人类胚胎干细胞(或“hES细胞”)。在一个实施例中，人类胚胎干细胞并非自授精超过14天的胚胎获得。在另一实施例中，人类胚胎干细胞并非自体内发育的胚胎获得。在另一实施例中，自通过体外授精产生的植入前胚胎获得人类胚胎干细胞。
如本文中所使用，“诱导性多能干细胞”或“iPS细胞”或“iPSC”通常是指由重编程体细胞获得的多能干细胞。iPS细胞可通过在体细胞中表达或诱导表达各因子(“重编程因子”)的组合而生成，所述因子为例如OCT4(有时称为OCT 3/4)、SOX2、MYC(例如c-MYC或任何MYC变体)、NANOG、LIN28和KLF4。在一个实施例中，重编程因子包含OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4。在另一实施例中，重编程因子包含OCT4、SOX2、NANOG和LIN28。在某些实施例中，在体细胞中表达至少两种重编程因子，以成功地重编程体细胞。在其它实施例中，在体细胞中表达至少三种重编程因子，以成功地重编程体细胞。在其它实施例中，在体细胞中表达至少四种重编程因子，以成功地重编程体细胞。在另一实施例中，在体细胞中表达至少五种重编程因子，以成功地重编程体细胞。在另一实施例中，在体细胞中表达至少六种重编程因子，例如OCT4、SOX2、c-MYC、NANOG、LIN28和KLF4。在其它实施例中，鉴别其它重编程因子且单独使用或与一或多种已知的重编程因子组合使用，以将体细胞重编程为多能干细胞。
可使用胎儿、产后、新生儿、青少年或成人体细胞产生iPS细胞。体细胞可包括(但不限于)成纤维细胞、角质细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、器官和组织细胞，以及各种血液细胞，包括(但不限于)造血细胞(例如，造血干细胞)。在一个实施例中，体细胞为成纤维细胞，例如真皮成纤维细胞、滑膜成纤维细胞、或肺成纤维细胞，或非成纤维细胞型体细胞。
可自细胞库获得iPS细胞。或者，可通过所属领域中已知的方法新产生iPS细胞。可使用来自特定患者或匹配供体的材料来特异性产生iPS细胞，从而产生组织匹配的细胞。在一个实施例中，iPS细胞可为大体上不具有免疫原性的通用供体细胞。
可通过在体细胞中表达或诱导表达一或多种重编程因子来产生诱导性多能干细胞。可通过使用病毒载体(例如(但不限于)慢病毒载体或逆转录病毒载体)感染或使用其它基因编辑技术(例如CRISPR、Talen、锌指核酸酶(ZFN))，在体细胞中表达重编程因子。此外，可使用非整合载体(例如游离基因组质粒)或RNA(例如合成mRNA)或经由RNA病毒(例如仙台病毒)在体细胞中表达重编程因子。当使用非整合载体表达重编程因子时，可使用载体对体细胞进行电穿孔、转染或转化，而在细胞中表达所述因子。举例来说，在小鼠细胞中，使用整合病毒载体的四种因子(OCT3/4、SOX2、c-MYC和KLF4)的表达即足以重编程体细胞。在人类细胞中，使用整合病毒载体的四种因子(OCT3/4、SOX2、NANOG和LIN28)的表达即足以重编程体细胞。
可通过使体细胞与至少一种诱导重编程因子的表达的试剂(例如小型有机分子试剂)接触来诱导重编程因子的表达。
体细胞还可使用其中表达重编程因子(例如，使用病毒载体、质粒和其类似物)和诱导重编程因子的表达(例如，使用小型有机分子)的组合方法重编程。
在细胞中表达或诱导重编程因子后，可培养细胞。随时间推移，培养皿中出现具有ES特征的细胞。可基于例如ES细胞形态或基于可选择或可检测标记物的表达来选择和继代培养细胞。可培养细胞以产生与ES细胞类似的细胞的培养物。
为了确认iPS细胞的多能性，可在一或多种多能性分析法中测试细胞。举例来说，可测试细胞的ES细胞标记物的表达；可评估细胞在移植至SCID小鼠中时产生畸胎瘤的能力；可评估细胞分化以产生所有三种胚层的细胞类型的能力。
iPS细胞可来自任何物种。这些iPS细胞已使用小鼠和人类细胞成功地产生。此外，已使用胚胎、胎儿、新生儿和成人组织成功地产生iPS细胞。因此，可使用来自任何物种的供体细胞容易地产生iPS细胞。因此，可自任何物种产生iPS细胞，包括(但不限于)人类、非人类灵长类动物、啮齿类动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)、犬(家养和野生犬)、猫科动物(家养和野生猫科动物，例如狮子、老虎、猎豹)、兔、仓鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸等)和其类似物。
如本文中所使用，“有效量”广泛地指在施用患者以用于治疗疾病时足以实现此类疾病的治疗的化合物或细胞的量。有效量可为有效实现防治的量和/或有效实现预防的量。有效量可为可有效实现缓解的量、有效实现以下目的的量：预防病征/症状的发生、降低病征/症状的发生的严重程度、消除病征/症状的发生、减缓病征/症状的发生的发展、预防病征/症状的发生的发展和/或实现病征/症状的发生的防治。“有效量”可视疾病和其严重程度以及所治疗的患者的年龄、体重、医疗史、敏感性和先前存在的病状而变化。在本发明中，术语“有效量”与“治疗有效量”具有相同含义。
语“接触”(例如，使细胞(例如角膜内皮祖细胞或多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)与根据本发明的转录因子接触)旨在包括任何用于将转录因子引入细胞和/或体外共同培育转录因子和细胞的方法(例如，将转录因子添加至培养物中的细胞中)。在一些实施例中，术语“接触”并不旨在包括细胞在体内暴露于可能天然存在于个体中的如本文中所公开的转录因子。可以任何适合的方式进行使细胞与如本文中所公开的转录因子接触的步骤。可在贴壁培养物或悬浮培养物中处理细胞，且可大体上同时(例如，共同以混合物形式)或依序(例如，与第一转录因子的添加间隔1小时、1天或更长时间以内)添加转录因子。应理解，与如本文中所公开的转录因子接触的细胞还可同时或接着与另一试剂，例如生长因子或其它分化试剂或环境接触，以使细胞稳定或使细胞进一步分化。在一个实施例中，使细胞与转录因子接触包括用包含编码转录因子的核酸的载体转导细胞或用包含编码转录因子的核酸的表达载体转染细胞，且可包括在所属领域中已知(例如用于培养多能和/或分化细胞)的条件下培养细胞，例如实施例中进一步描述。
“接触”还指使细胞(例如，多能干细胞、角膜内皮祖细胞、神经脊干细胞、CEC，例如成熟CEC)与调节表达转录因子的诱导型表达载体的表达的试剂(例如，活化/诱导来自包含诱导型启动子的载体或包含基因开关的载体的转录因子的表达的试剂，例如小分子试剂)接触。
术语“接触”(例如，使角膜内皮祖细胞或多能干细胞与根据本发明的转录因子接触)旨在包括任何用于将转录因子引入角膜内皮祖细胞或多能干细胞中和/或在体外共同培育转录因子和角膜内皮祖细胞或多能干细胞的方法(例如，向培养物中的细胞中添加转录因子)。在一些实施例中，术语“接触”并不旨在包括角膜内皮祖细胞或多能干细胞体内暴露于可天然存在于个体中的如本文中所公开的转录因子。可以任何适合的方式进行使角膜内皮祖细胞或多能干细胞与如本文中所公开的转录因子接触的步骤。可在贴壁培养物或悬浮培养物中处理细胞，且可大体上同时(例如，共同以混合物形式)或依序(例如，与第一转录因子的添加间隔1小时、1天或更长时间以内)添加转录因子。应理解，与如本文中所公开的转录因子接触的细胞还可同时或接着与另一试剂，例如生长因子或其它分化试剂或环境接触，以使细胞稳定或使细胞进一步分化。在一个实施例中，使角膜内皮祖细胞或多能干细胞与转录因子包括用包含编码转录因子的核酸的载体转导角膜内皮祖细胞或多能干细胞，或用包含编码转录因子的核酸的表达载体转染角膜内皮祖细胞或多能干细胞，且可包括在所属领域中已知(例如，用于培养分化细胞)的条件下培养细胞，例如实例中进一步描述。
如本文中所使用，术语“分化”为未特化(“未定型”)或特化程度较低的细胞获得特化细胞(例如CEC，例如成熟CEC)的特征的过程。分化细胞为在细胞谱系中占据更特殊位置的细胞。举例来说，iPSC或hES细胞可分化成各种分化程度较高的细胞类型，包括CEC，例如成熟CEC。在某些实施例中，在体外进行细胞的分化且排除体内分化。
如本文中所使用，术语“经培养”或“培养”是指将细胞放置于尤其含有维持所培养的细胞的生命所需的营养物(包括任何指定的添加物)的培养基中。当用于维持细胞的培养基含有指定物质时，此类细胞系“在存在此类指定物质的情况下”培养。培养可在其中细胞可保持暴露于培养基的任何容器或设备中进行，包括(但不限于)皮氏培养皿(petridish)、培养皿(culture dish)、血液收集袋、滚瓶、培养瓶、试管、微量滴定孔、中空纤维筒或所属领域中已知的任何其它设备。
如本文中所使用，术语“继代培养”或“传代”是指将来自先前培养物的一些或所有细胞转移至新鲜的生长培养基和/或涂布于新的培养皿上且进一步培养细胞。可进行继代培养例如以延长寿命、富集所需细胞群体和/或扩增培养物中的细胞的数目。举例来说，所述术语包括以较低细胞密度将一些或所有细胞转移、培养或涂布至新的培养容器以允许细胞增殖。
如本文中所使用，“施用(administration)”、“施用(administering)”和其变异形式是指将组合物或药剂引入个体且包括同时和依序引入组合物或药剂。“施用”可指例如治疗、药物动力学、诊断、研究、安慰剂以及实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。施用包括自行施用和由另一者施用。可通过任何适合的途径进行施用。适合的施用途径允许组合物或药剂发挥其所欲功能。举例来说，如果适合的途径为静脉内，那么通过将组合物或药剂引入个体的静脉来施用组合物。
如本文中所使用，术语“个体(subject/individual)”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物个体，尤其人类。本文中所描述的方法适用于人类疗法和兽医学应用。在一些实施例中，个体为哺乳动物，且在特定实施例中，个体为人类。
如本文中所使用，术语活性剂(例如，CEC，例如成熟CEC)的“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量”或“医药学上有效量”可互换地用于指足以提供所欲治疗益处的量。然而，剂量水平是基于各种因素，包括损伤类型、患者的年龄、体重、性别、医学状况、病状的严重程度、施用途径、预期的细胞移植、长期存活期和/或所使用的特定活性剂。因此，给药方案可广泛变化，但可常规地由医师使用标准方法确定。此外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“医药学上有效量”包括所描述发明的组合物的防治或预防量。在所描述发明的防治或预防应用中，以足以消除或降低风险、减轻严重程度或延迟疾病、病症或病状发作的量，向容易发生所述疾病、病症或病状或处于其风险下的患者施用医药组合物或药剂，包括所述疾病、病症或病状的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在所述疾病、病症或病状发展期间呈现的中间病理性表型。通常优选的是，使用最大剂量，即，根据一些医学判断的最高安全剂量。术语“剂量(dose/dosage)”在本文中可互换使用。
如本文中所使用，术语“治疗作用”是指治疗的结果，其结果确定为所期望的且有益的。治疗作用可包括直接地或间接地抑制、减少或消除疾病表达。治疗作用还可包括直接地或间接地抑制、减少或消除疾病表达的发展。
对于本文中所描述的治疗剂(例如，CEC，例如成熟CEC)，可最初由初步体外研究和/或动物模型确定治疗有效量。还可由人类数据确定治疗有效剂量。可基于所施用的化合物的相关生物可用性和性能来调节所施用的剂量。基于上文所描述的方法和其它熟知方法调节剂量以达成最大功效在所属领域的一般技术人员的能力范围内。
药物动力学原理为修改给药方案以在最小的不可接受的副作用下获得所需程度的治疗功效提供基础。在药剂的血浆浓度可测量且与治疗窗相关的情况下，可获得关于剂量修改的额外指导。
如本文中所使用，术语“治疗(treat)”“治疗(treating)”和/或“治疗(treatment)”包括消除、大体上抑制、减缓或逆转病状的发展，大体上改善病状的临床症状，或大体上预防病状(例如病理学病状)的临床症状的出现，从而获得有利或所需的临床结果。治疗还指实现以下中的一或多个：(a)降低病症的严重程度；(b)限制所治疗的病症的特征性症状的发展；(c)限制所治疗的病症的特征性症状的恶化；(d)限制先前患有病症的患者的病症复发；和(e)限制先前无病症的症状的患者的症状复发。
有利或所需临床结果，例如药理学和/或生理学作用包括(但不限于)预防可能易患疾病、病症或病状但尚未经历或呈现出疾病的症状的个体发生疾病、病症或病状(预防性治疗)；缓解疾病、病症或病状的症状；减轻疾病、病症或病状的程度；使疾病、病症或病状稳定(即，不恶化)；防止疾病、病症或病状扩散；延迟或减缓疾病、病症或病状进程；改善或缓和疾病、病症或病状；和其组合，以及与在不接受治疗的情况下的预期存活期相比延长存活期。
如本文中所使用，疾病的“病征”广泛地指疾病的任何异常指示，其可在对患者进行检查后发现；疾病的客观指示而非症状(其为疾病的主观指示)。
如本文中所使用，疾病的“症状”广泛地指患者经历和指示疾病的任何病理现象或在结构、功能或感觉上与正常情况的偏差。
I.本发明的方法
本发明是基于发现用于促进CEC，例如成熟CEC的成熟且从而实现产生成熟和功能性CEC的方法，其包括增加至少一种选自由以下组成的群的转录因子的表达：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。本发明的方法是可行且有效的，且引起例如由多能干细胞产生可用于本文中所公开的各种应用的CEC，例如成熟CEC，所述应用为例如治疗影响CEC或适于通过移植或施用CEC来治疗的疾病或病症，包括例如原发性疾病，例如富克斯氏营养不良(Fuch's dystrophy)、虹膜角膜内皮综合征、后部多形性营养不良和先天性遗传性内皮营养不良，可使用更换角膜内皮作为有效治疗的继发性疾病，包括角膜营养不良，或其中个体呈现引起大疱性角膜病变的角膜水肿的症状、个体患有由使用隐形眼镜或白内障手术引起的眼部损伤或其中个体考虑角膜移植的疾病。
在一些实施例中，增加PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。
在一些实施例中，增加FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。
在一些实施例中，增加TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。
在一些实施例中，增加LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。
在一些实施例中，增加POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。
在一些实施例中，角膜内皮祖细胞包含表达载体，其包含编码至少一种转录因子的核酸。
在一些实施例中，增加角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达包含诱导角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达。
在一些实施例中，角膜内皮祖细胞衍生自多能干细胞，例如诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。可使用任何用于使多能细胞分化成角膜内皮祖细胞的方法。举例来说，可通过分化如本文中所描述的多能干细胞来获得角膜内皮祖细胞。
在一些实施例中，多能干细胞可经工程改造以包含表达载体，其包含编码至少一种转录因子的核酸。在一些实施例中，表达载体包含以可操作方式连接至编码至少一种转录因子的核酸的启动子，例如内源性启动子、人工启动子或诱导型启动子。
用于产生角膜内皮细胞的细胞
在本发明的某些实施例中，公开用于通过增加角膜内皮祖细胞中的至少一种选自由以下组成的群的转录因子的表达来产生CEC，例如成熟CEC的方法和组合物：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。在一些实施例中，CEC，例如成熟CEC和角膜内皮祖细胞衍生自多能干细胞，例如诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞和/或成人干细胞。在其它实施例中，CEC，例如成熟CEC和角膜内皮祖细胞可衍生自体细胞。
A.干细胞
在正在发育的胚胎中，干细胞可分化成所有特化的胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充特化细胞，且还维持再生器官(例如血液、皮肤或肠道组织)的正常运转。
多能干细胞(例如人类胚胎干细胞(ESC)和诱导性多能干细胞(iPSC))能够在体外长期增殖，同时保留分化成身体的所有细胞类型(包括角膜内皮祖细胞)的潜力。因此，这些细胞可潜在地为药物开发和移植疗法提供无限供应的患者特异性功能性CEC。多能干细胞体外分化成CEC，例如成熟CEC可涉及在不同分化阶段添加不同生长因子且可能需要分化约10-30天(参见例如图1)。与体细胞相比，多能干细胞由于其无限的增殖能力而更宜作为用于CEC分化的起始细胞群体。
多能干细胞，例如胚胎干(ES)细胞或iPS细胞，可为所公开的方法的起始材料。在本文中的任何实施例中，多能干细胞可为人类多能干细胞(hPSC)。可以所属领域中已知的任何方式培养多能干细胞(PSC)，例如在存在或不存在饲养细胞的情况下。此外，使用任何方法产生的PSC皆可用作起始物质以产生CEC，例如成熟CEC。举例来说，hES细胞可衍生自囊胚期胚胎，所述胚胎为卵子和精子的体外授精的产物。或者，hES细胞可衍生自由早期卵裂期胚胎移出的一或多个分裂球，任选地不破坏胚胎的其余部分。在其它实施例中，可使用核转移产生hES细胞。在另一实施例中，可使用iPSC。作为起始材料，可使用先前冷冻保存的PSC。在另一实施例中，可使用从未进行冷冻保存的PSC。
在本发明的一个方面中，在存在饲养细胞或不存在饲养细胞的条件下将PSC涂布于细胞外基质上。在一个实施例中，可在细胞外基质上培养PSC，包括(但不限于)层粘连蛋白、纤维结合蛋白、玻璃连结蛋白、Matrigel、CellStart、胶原蛋白或明胶。在一些实施例中，细胞外基质为具有或不具有e-钙粘素的层粘连蛋白。在一些实施例中，层粘连蛋白可选自包含以下的群：层粘连蛋白521、层粘连蛋白511或iMatrix511。在一些实施例中，饲养细胞为人类饲养细胞，例如人类真皮成纤维细胞(HDF)。在其它实施例中，饲养细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
在某些实施例中，在培养PSC时所使用的培养基可选自适合于培养PSC的任何培养基。在一些实施例中，可使用任何能够支持PSC培养的培养基。举例来说，所属领域技术人员可在市售或专有培养基中选择。
支持多能性的培养基可为所属领域中已知的任何此类培养基。在一些实施例中，支持多能性的培养基为NutristemTM。在一些实施例中，支持多能性的培养基为TeSRTM。在一些实施例中，支持多能性的培养基为StemFitTM。在其它实施例中，支持多能性的培养基为KnockoutTMDMEM(赛默飞世尔科技(Gibco))，其可补充有KnockoutTM血清替代物(赛默飞世尔科技)、LIF、bFGF或任何其它因子。这些示范性培养基中的每一者为所属领域中已知的和市售的。在其它实施例中，支持多能性的培养基可补充有ROCK抑制剂、bFGF或任何其它因子。在一个实施例中，可以低浓度(例如4ng/mL)补充bFGF。在另一实施例中，可以较高浓度(例如100ng/mL)补充bFGF，此可引发PSC分化。
用于本发明的制造方法中的PSC的浓度不受特定限制。举例来说，当使用10cm培养皿时，使用每个培养皿1×104-1×108个细胞，优选每个培养皿5×104-5×106个细胞，更优选每个培养皿1×105-1×107个细胞。
在一些实施例中，PSC以约1,000-100,000个细胞/cm2的细胞密度涂布。在一些实施例中，PSC以约5000-100,000个细胞/cm2、约5000-50,000个细胞/cm2或约5000-15,000个细胞/cm2的细胞密度涂布。在其它实施例中，以约10,000个细胞/cm2的密度涂布PSC。
在一些实施例中，用分化培养基更换支持多能性的培养基(例如，StemFitTM或其它类似培养基)以使细胞分化成神经脊干细胞或角膜内皮祖细胞。在一些实施例中，将培养基自支持多能性的培养基更换为分化培养基可在PSC的细胞培养期间的不同时间点进行，且还可取决于PSC的初始涂布密度。在一些实施例中，培养基的更换可在将PSC在多能性培养基中培养2-14天后进行。在一些实施例中，培养基的更换可在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天进行。
在一些实施例中，适用于本文中所描述的方法的干细胞包括(但不限于)胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间质干细胞、骨髓衍生的干细胞、造血干细胞、软骨细胞祖细胞、表皮干细胞、胃肠道干细胞、神经干细胞、肝干细胞、衍生之间质干细胞、胰脏祖细胞、毛囊干细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞。
在一些实施例中，用于本文中所描述的方法的干细胞自脐带、胎盘、羊水、绒毛、囊胚、骨髓、脂肪组织、脑、周边血液、胃肠道、脐带血、血管、骨骼肌、皮肤、肝脏和月经血分离。
自各种来源分离人类干细胞的详细程序描述于Current Protocols in StemCell Biology(2007)中，其以全文引用的方式并入本文中。自各种来源分离和培养干细胞的方法还描述于美国专利案第5,486,359号、第6,991,897号、第7,015,037号、第7,422,736号、第7,410,798号、第7,410,773号、第7,399,632号中；其各自以全文引用的方式并入本文中。
B.体细胞
在本发明的某些方面中，还提供转分化方法，即，将一种体细胞类型直接转化成另一种，例如自其它体细胞衍生CEC，例如成熟CEC。转分化可涉及使用CEC分化转录因子基因或基因产物以增加体细胞中此类基因的表达量，以产生CEC，例如成熟CEC。
然而，人类体细胞的供应可能有限，尤其来自活供体的体细胞。为了向CEC分化提供无限供应的起始细胞，可通过引入永生化基因或蛋白质，例如hTERT和/或其它致癌基因使体细胞永生化。细胞的永生化可为可逆的(例如使用可去除的表达卡匣)或可诱导的(例如使用诱导型启动子)。
在本发明的某些方面中，体细胞可为初生细胞(非永生化细胞)，例如自动物新鲜分离的细胞，或可衍生自细胞系(永生化细胞)。细胞在自个体分离后可维持在细胞培养物中。在某些实施例中，细胞在用于本发明的方法中之前传代一次或超过一次(例如，2-5、5-10、10-20、20-50、50-100次或更多次)。在一些实施例中，细胞在用于本发明的方法中之前已传代不超过1、2、5、10、20或50次。
本文中所使用或描述的体细胞可为原生体细胞，或经工程改造的体细胞，即，已经基因改变的体细胞。本发明的体细胞通常为哺乳动物细胞，例如人类细胞、灵长类动物细胞或小鼠细胞。其可通过熟知方法获得，且可自任何含有活的体细胞的器官或组织获得，例如血液、骨髓、皮肤、肺、胰脏、肝脏、胃、肠道、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏、尿道和其它泌尿器官等。
适用于本发明的哺乳动物体细胞包括(但不限于)塞特利氏细胞(Sertolicells)、内皮细胞、粒层上皮细胞、神经元、胰岛细胞、表皮细胞、上皮细胞、肝细胞、毛囊细胞、角质细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红血球、巨噬细胞、单核细胞、单核细胞、心肌细胞和其它肌肉细胞等。
本文中所描述的方法可用于将一或多种体细胞，例如体细胞的群落或群体编程为CEC，例如成熟CEC。在一些实施例中，本发明的细胞群体为大体上均匀的，因为至少90％的细胞显示相关表型或特征。在一些实施例中，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9、99.95％或更多的细胞显示相关表型或特征。在本发明的某些实施例中，体细胞具有分裂能力，即，体细胞不为有丝分裂后的。
体细胞可部分或完全分化。如本文中所描述，部分分化的体细胞和完全分化的体细胞皆可分化以产生角膜内皮细胞。
用于本发明的方法的转录因子
可通过增加角膜内皮祖细胞中的至少一种本文中所描述的转录因子的表达来产生CEC，例如成熟CEC。可使用任何对促进CEC、成熟或功能重要的转录因子，例如选自表1中所描述的转录因子的至少一种转录因子。表1中所列举的转录因子的所有同种型和变体可包括在本发明中。本发明的转录因子的某些同种型或变体的寄存编号的非限制性实例描述于表1中。
表1.用于产生成熟角膜内皮细胞的转录因子
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在一些实施例中，至少一种转录因子选自由以下组成的群：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
在一些实施例中，可通过增加角膜内皮祖细胞中的本文中所描述的转录因子的组合的表达来产生CEC，例如成熟CEC。举例来说，在一些实施例中，可通过增加角膜内皮祖细胞中的PITX2和至少一种(例如，1、2、3或4种)本文中所描述的其它转录因子的表达来产生CEC，例如成熟CEC。在一些实施例中，可通过增加角膜内皮祖细胞中的FOXC1和至少一种(例如，1、2、3或4种)本文中所描述的其它转录因子的表达来产生CEC，例如成熟CEC。在一些实施例中，可通过增加角膜内皮祖细胞中的TFAP2B和至少一种(例如，1、2、3或4种)本文中所描述的其它转录因子的表达来产生CEC，例如成熟CEC。在一些实施例中，可通过增加角膜内皮祖细胞中的LMX1B和至少一种(例如，1、2、3或4种)本文中所描述的其它转录因子的表达来产生CEC，例如成熟CEC。在一些实施例中，可通过增加角膜内皮祖细胞中的POU6F2和至少一种(例如，1、2、3或4种)本文中所描述的其它转录因子的表达来产生CEC，例如成熟CEC。
在一些实施例中，转录因子的组合选自表1A中所描述的转录因子的组合：
表1A.转录因子的组合的实例
在一些实施例中，转录因子为成对样同源结构域转录因子2(PITX2)。如本文中所使用，“PITX2”是指熟知的基因和蛋白质。术语PITX2包括蛋白质同种型和交替剪接或转录变体。PITX2还称为垂体同源框2、ARP1、Brx1、IDG2、IGDS、IGDS2、IHG2、IRID2、Otlx2、PTX2、RGS、RIEG、RIEG1、RS、成对样同源结构域2和ASGD4。由PITX2基因编码的蛋白质为调节原胶原离氨酰基羟化酶基因表达的转录因子且涉及眼睛、牙齿和腹部器官的发育。人类PITX2mRNA转录物的序列可见于国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation；NCBI)Ref Seq寄存编号NM_153427(SEQ ID NO:1)中。PITX2同种型包括PITX2同种型2(NM_001204397，SEQ ID NO:2)、PITX2同种型3(NM_001204398，SEQ ID NO:3)、PITX2同种型4(NM_001204399，SEQ ID NO:4)、PITX2同种型5(NM_000325，SEQ ID NO:5)和PITX2同种型6(NM_153426，SEQ ID NO:6)。
PITX2 mRNA序列的其它实例可容易地使用公开可用的数据库获得，例如GenBank、UniProt和OMIM。
PITX2的示范性序列包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任一者的核苷酸序列或由其编码的氨基酸序列。在一些实施例中，PITX2包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任一者的核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施例中，PITX2包含与由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明的方法涉及使PITX2的表达相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的Pitx2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少500倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少1,000倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少10,000倍。
在一些实施例中，转录因子为叉头框C1(FOXC1)。如本文中所使用，“FOXC1”是指熟知的基因和蛋白质。术语FOXC1包括蛋白质同种型或交替剪接或转录变体。FOXC1还称为ARA、FKHL7、FREAC-3、FREAC3、IGDA、IHG1、IRID1、RIEG3、叉头框C1、ASGD3。由FOXC1基因编码的蛋白质为在胚胎和眼睛发育的调节中起作用的转录因子。人类FOXC1 mRNA转录物的序列可见于国家生物技术信息中心(NCBI)Ref Seq寄存编号NM_001453(SEQ ID NO:7)中。FOXC1mRNA序列的其它实例可容易地使用公开可用的数据库获得，例如GenBank、UniProt和OMIM。
FOXC1的示范性序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或由其编码的氨基酸序列。在一些实施例中，FOXC1包含与SEQ ID NO:7的核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施例中，FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明的方法涉及使FOXC1的表达相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少500倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少1,000倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少10,000倍。
在一些实施例中，转录因子为转录因子AP-2β(TFAP2B)。如本文中所使用，“TFAP2B”是指熟知的基因和蛋白质。TFAP2B还称为AP-2B、AP2-B、转录因子AP-2β、PDA2。术语TFAP2B包括交替剪接或转录变体(例如，TFAP2B转录变体X)和蛋白质同种型。由TFAP2B基因(AP2-β)编码的蛋白质是可认为在胚胎发育期间刺激细胞增殖和抑制特异性细胞类型的最终分化的转录因子。人类TFAP2B mRNA转录物的序列可见于国家生物技术信息中心(NCBI)Ref Seq寄存编号NM_003221(SEQ ID NO:8)中。TFAP2B mRNA序列的其它实例可容易地使用公开可用的数据库获得，例如GenBank、UniProt和OMIM。
TFAP2B的示范性序列包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或由其编码的氨基酸序列。在一些实施例中，TFAP2B包含与SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施例中，TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明方法涉及使TFAP2B的表达相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少500倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少1,000倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少10,000倍。
在一些实施例中，转录因子为LIM同源框转录因子1β(LMX1B)。如本文中所使用，“LMX1B”是指熟知的基因和蛋白质。术语LMX1B包括蛋白质同种型和交替剪接或转录变体。LMX1B还称为LMX1.2、NPS1、LIM同源框转录因子1β、FSGS10。由LMX1B基因编码的蛋白质为在脊椎动物肢体的背腹侧图案化中起重要作用的转录因子。人类LMX1B mRNA转录物的序列可见于国家生物技术信息中心(NCBI)Ref Seq寄存编号NM_001174146(SEQ ID NO:9)中。LMX1B同种型包括LMX1B同种型2(NM_002316，SEQ ID NO:10)和LMX1B同种型3(NM_00117，SEQ ID NO:11)。LMX1B mRNA序列的其它实例可容易地使用公开可用的数据库获得，例如GenBank、UniProt和OMIM。
示范性LMX1B的序列包含SEQ ID NO:9-11中的任一者的核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列。在一些实施例中，LMX1B包含与SEQ ID NO:9-11中的任一者的核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施例中，LMX1B包含与由SEQ ID NO:9-11的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明的方法涉及使LMX1B的表达相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少500倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少1,000倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少10,000倍。
在一些实施例中，转录因子为POU类别6同源框2(POU6F2)。如本文中所使用，“POU6F2”是指熟知的基因和蛋白质。术语POU6F2包括交替剪接或转录变体和蛋白质同种型。由POU6F2基因编码的蛋白质为涉及例如细胞定型和分化的发育过程的转录因子。人类POU6F2 mRNA转录物的序列可见于国家生物技术信息中心(NCBI)Ref Seq寄存编号NM_007252(SEQ ID NO:12)中。POU6F2的其它同种型包括POU6F2同种型2(NM_001166018，SEQID NO:13)。POU6F2 mRNA序列的其它实例可容易地使用公开可用的数据库获得，例如GenBank、UniProt和OMIM。
示范性POU6F2的序列包含SEQ ID NO:12-13中的任一者的核苷酸序列或由其编码的氨基酸序列。在一些实施例中，POU6F2包含与SEQ ID NO:12-13中的任一者的核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施例中，POU6F2包含与由SEQ ID NO:12-13的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明的方法涉及使POU6F2的表达相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少500倍。增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少1,000倍。增加的POU6F2的表达包含相对于角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少10,000倍。
增加转录因子的表达
用于递送编码本发明的转录因子的核酸的载体可经构建以在本发明的细胞(例如，角膜内皮祖细胞、神经脊干细胞或多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)中表达转录因子。在一些实施例中，核酸为DNA。在一些实施例中，核酸为RNA。在一些实施例中，核酸为经修饰的DNA。在一些实施例中，核酸为经修饰的RNA。
此外，蛋白质转导组合物或方法还可用于在本发明的方法中实现转录因子的表达。
A.核酸递送系统
所属领域技术人员将熟知如何经由标准重组技术构建载体(参见例如桑布鲁克等人,2001和奥苏贝尔等人,1996，其各自以全文引用的方式并入本文中)。包含编码至少一种本发明的转录因子的核酸的载体包括(但不限于)病毒载体、非病毒载体和/或诱导型表达载体。
如本文中所使用，“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或经修饰的核苷酸，和其呈单链或双链形式的聚合物。所述术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键联的核酸，其为合成、天然存在和非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性且在某些情况下，以与参考核苷酸类似的方式代谢。此类类似物的实例包括(但不限于)硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
如本文中所使用，“核苷酸”如所属领域中公认地用于包括具有天然碱基(标准)和所属领域中熟知的经修饰的碱基的核苷酸。此类碱基通常位于核苷酸糖部分的l'位置。核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸酯基。核苷酸可在糖、磷酸酯和/或碱基部分处未经修饰或经修饰(还可互换地称为核苷酸类似物、经修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；参见例如乌斯曼(Usman)和麦克斯维根(McSwiggen),见上文；(埃克斯坦(Eckstein))等人,国际PCT公开案第WO 92/07065号；乌斯曼(Usman)等人,国际PCT公开案第WO 93/15187号；乌尔曼(Uhlman)和佩曼(Peyman),见上文，其皆以引用的方式并入本文中)。所属领域中存在经修饰的核酸碱基的若干实例，如由林巴赫(Limbach)等人,核酸研究(Nucleic AcidsRes).22:2183,1994概述。可引入核酸分子中的碱基修饰的一些非限制性实例包括次黄嘌呤、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞嘧啶核苷(例如，5-甲基胞嘧啶核苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核糖核苷)、5-卤尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等(伯金(Burgin)等人,生物化学(Biochemistry)35:14090,1996；乌尔曼(Uhlman)和佩曼(Peyman),见上文)。在此方面中，“经修饰的碱基”意谓位于l'位置或其等效位置处的除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶以外的核苷酸碱基。
载体还可包含其它组分或功能，从而进一步调节基因递送和/或基因表达，或以其它方式为目标细胞提供有益的特性。此类其它组分包括例如影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞吸收载体核酸的组分；影响吸收后多核苷酸在细胞内定位的组分(例如介导核定位的药剂)；和影响多核苷酸表达的组分。
此类组分还可包括标记物，例如可检测和/或选择标记物，其可用于检测或选择已吸收且表达由载体递送的核酸的细胞。此类组分可作为载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和吸收的组分或功能的某些病毒载体)，或载体可经修饰以提供此类功能。大量此类载体为所属领域中已知的且通常为可用的。当载体维持在宿主细胞中时，载体可在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定复制，并入宿主细胞的基因组内，或维持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。
所属领域技术人员将熟知如何经由标准重组技术构建载体(参见例如，马尼亚蒂斯(Maniatis)等人,1988和奥苏贝尔等人,1994，其各自以引用的方式并入本文中)。
1.病毒载体
本发明的某些方面中提供编码至少一种本发明的转录因子的病毒载体。病毒载体为一种利用病毒序列将核酸和可能的蛋白质引入细胞中的表达构建体。可用于递送本发明的某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例描述如下。
在一些实施例中，病毒载体为非整合病毒载体。本发明的示范性非整合病毒载体选自由以下组成的群：腺相关病毒(AAV)载体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV3B、AAV-2i8、RhlO、Rh74等；腺病毒(Ad)载体，包括其复制胜任型、复制缺陷型和无肠形式，例如Ad7、Ad4、Ad2、Ad5等；猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头状瘤病毒载体、埃-巴二氏病毒载体(Epstein-Barr virus vector)、疱疹病毒载体、痘疮病毒载体、哈维鼠类肉瘤病毒载体(Harvey murine sarcoma virus vector)、鼠类乳房肿瘤病毒载体或劳斯肉瘤病毒载体(Rous sarcoma virus vector)。
在一些实施例中，病毒载体为整合病毒载体，例如逆转录病毒载体。逆转录病毒由于能够将其基因整合至宿主基因组中、转移大量外来遗传物质、感染广泛范围的物种和细胞类型和在特殊细胞系中封装而有希望作为基因递送载体。
在一些实施例中，整合病毒载体衍生自逆转录病毒载体(例如，莫洛尼鼠类白血病病毒载体(Moloney murine leukemia virus vector；MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如，衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)或由其衍生的载体。
重组载体还能够感染非分裂细胞，且可在本发明的方法中用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。举例来说，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒描述于美国专利案第5,994,136号中，其以全文引用的方式并入本文中，其中用两种或更多种携带封装功能的载体(即，gag、pol和env，以及rev和tat)转染适合的宿主细胞(即，产生病毒的细胞，且不为本发明的角膜内皮祖细胞或CEC)。
2.游离基因组载体和其它非病毒载体
在本发明的某些方面中还可提供基于质粒或脂质体的染色体外(即，游离基因组)载体的使用。此类游离基因组载体可包括例如基于oriP的载体和/或编码EBNA-1的衍生物的载体。这些载体可允许将DNA的大型片段引入细胞中且在染色体外维持、每个细胞周期复制一次、有效地分配至子细胞且大体上不引发免疫反应。
其它染色体外载体包括其它基于亲淋巴性疱疹病毒的载体。示范性亲淋巴性疱疹病毒包括(但不限于)EBV、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(Kaposi's sarcoma herpes virus；KSHV)；狨疱疹病毒(Herpes virus saimiri；HS)和马立克氏病病毒(Marek's diseasevirus；MDV)。还涵盖其它来源的基于游离基因组的载体，例如酵母ARS、腺病毒、SV40或BPV。
在一些实施例中，载体为非病毒载体。在一些实施例中，非病毒载体选自由以下组成的群：质粒DNA、线性双链DNA(dsDNA)、线性单链DNA(ssDNA)、纳米质粒、微型环DNA、单链寡脱氧核苷酸(ssODN)、DDNA寡核苷酸、单链mRNA(ssRNA)和双链mRNA(dsRNA)。
在一些实施例中，非病毒载体包含裸核酸、脂质体、树枝状聚合物、纳米粒子、脂质-聚合物系统、固体脂质纳米粒子和/或脂质体鱼精蛋白/DNA脂质复合物(LPD)。
在一些实施例中，非病毒载体包含mRNA。在一些实施例中，mRNA可以裸修饰mRNA形式传递，例如在蔗糖-柠檬酸盐缓冲液或生理盐水溶液中。在其它实施例中，非病毒载体包含与转染试剂，例如Lipofectamine 2000、jetPEI、RNAiMAX和/或Invivofectamine复合的mRNA。为了保护mRNA免受核酸酶降解且屏蔽其负电荷，含有胺的材料还常用作非病毒载体。最成熟的mRNA递送方法的一为共同调配至脂质纳米粒子(LNP)中。LNP调配物典型地由以下构成：(1)可离子化或阳离子脂质或聚合材料，其携有三级胺或四级胺以囊封聚阴离子mRNA；(2)两性离子脂质(例如，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])，其与细胞膜中的脂质类似；(3)胆固醇，其使LNP的脂质双层稳定；和(4)聚乙二醇(PEG)脂质，其为纳米粒子提供水合层、改进胶体稳定性且减少蛋白质吸收。包含mRNA的示范性非病毒载体描述于科瓦尔斯基(Kowalksi)等人,2019,分子治疗(Mol Ther.)；27(4):710-728中；其以全文引用的方式并入本文中。
3.基于转位子的系统
根据一个特定实施例，核酸的引入可使用转位子-转位酶系统。所使用的转位子-转位酶系统可为熟知的睡美人(Sleeping Beauty)、青蛙王子(Frog Prince)转位子-转位酶系统(关于后者的描述参见例如EP1507865)或TTAA特异性转位子piggyBac系统。
转位子为可在单个细胞的基因组内移动至不同位置的DNA序列，此过程称为转位。在所述过程中，其可引起突变且改变基因组中的DNA的量。存在多种移动遗传元件，且其可基于其转位机制进行分组。I类移动遗传元件或逆转录转位子通过首先转录为RNA，随后通过逆转录酶逆转录成DNA，且随后插入基因组中的另一位置来复制自身。II类移动遗传元件使用转位酶在基因组内“剪贴”而直接自一个位置移动至另一个位置。
4.同源重组
同源重组(HR)为一种靶向基因组修饰技术，自1980年代中期以来一直为在哺乳动物细胞中进行基因组工程改造的标准方法。使用大范围核酸酶或导向核酸内切酶，例如I-SceI，已用于提高HR的效率。天然大范围核酸酶以及经工程改造以具有改进的靶向特异性的大范围核酸酶皆已用于提高HR效率。另一种提高HR效率的途径为用可编程DNA特异性结构域工程改造嵌合核酸内切酶。锌指核酸酶(ZFN)为此类嵌合分子的一个实例，其中锌指DNA结合结构域与IIS型限制性核酸内切酶，例如FokI的催化结构域融合。另一种此类特异性分子包括与IIS型限制性核酸内切酶，例如FokI的催化结构域融合的转录活化因子样效应子(TALE)DNA结合结构域。另一种促进靶向基因组修饰的此类分子包括CRISPR/Cas系统，例如冉(Ran)等人,2013；自然实验室指南(Nature Protocols)8:2281-2308中所述；其以全文引用的方式并入本文中。
B.调节元件
载体中所包括的真核表达卡匣优选含有(以5'至3'方向)以可操作方式连接至蛋白编码序列的真核转录启动子、包括介入序列的剪接信号和转录终止/聚腺苷酸化序列。
1.启动子/强化子
“启动子”为控制序列，其为核酸序列中控制转录起始和速率的区域。其可含有调节蛋白质和分子可结合的基因元件，例如RNA聚合酶和其它转录因子，以起始核酸序列的特异性转录。短语“可操作地定位”、“以可操作方式连接(operatively linked/operablylinked)”、“在……控制下”和“在转录控制下”意谓启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或定向，以控制所述序列的转录起始和/或表达。
启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。额外启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些元件定位于起始位点上游的30-110bp区中，但许多启动子已证实还含有位于起始位点下游的功能元件。为了“在启动子的控制下”引入编码序列，将转录阅读框架的转录起始位点的5'端置于所选择的启动子的“下游”(即，3'端)。“上游”启动子刺激DNA的转录且促进经编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间距通常为灵活的，因此当元件相对彼此倒置或移动时保留启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间距可在活性开始下降之前增加至间隔50bp。视启动子而定，个别元件似乎可协作地或独立地起活化转录作用。启动子可与或可不与“强化子”(其是指涉及核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列)结合使用。
除以合成方式产生启动子和强化子的核酸序列以外，可结合本文中所公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCRTM产生序列(参见美国专利案第4,683,202号和第5,928,906号，其各自以全文引用的方式并入本文中)。此外，经考虑，还可使用引导非核细胞器(例如线粒体、叶绿体和其类似物)内的序列的转录和/或表达的控制序列。
所使用的启动子可为组成性的、组织特异性的、诱导性的和/或适用于在适当条件下引导所引入的DNA区段的大量表达，例如在重组蛋白质和/或肽的大规模产生方面有利。启动子可为人工或内源性的。
在一些实施例中，启动子为诱导型启动子。术语“诱导型启动子”为所属领域中已知的，且是指仅响应于刺激而具有活性的启动子。诱导型启动子响应于内源性或外源性刺激，例如化合物(化学诱导剂)的存在或响应于环境、激素、化学和/或发育信号而选择性地表达核酸分子。诱导型启动子包括例如由光、热、应力(例如盐应力或渗透应力)、植物激素、创伤或化学物质(例如乙醇、脱落酸(ABA)、茉莉酸酯、水杨酸或安全剂)诱导或调节的启动子。在一些实施例中，诱导型启动子为EF1a启动子。在一些实施例中，诱导型启动子为PGK启动子。
在一些实施例中，异源核酸由选自由以下组成的群的启动子序列控制：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶(PGK)-1启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、甲状腺素运载蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒强化子/鸡β-肌动蛋白/兔.β.-血球蛋白启动子(CAG)启动子、延长因子1-α启动子(EF1-α)启动子、人类.β.-葡糖苷酸酶启动子、鸡.β.-肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和β-肌动蛋白启动子。在一些实施例中，异源核酸以可操作方式连接至适用于在CNS的一或多种细胞中表达治疗性多肽或治疗性核酸的启动子。
在另一实施例中，将使用转录因子的原生启动子或其片段。当需要转录因子的表达模拟原生表达时可使用原生启动子。当必须在时间上或发育上，或以组织特异性方式，或响应于特异性转录刺激调节转录因子的表达时，可使用原生启动子。在另一实施例中，其它原生表达控制元件，例如强化子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列，还可用于模拟原生表达。
诱导型启动子允许基因表达的调节且可由以下调节：外源提供的化合物；环境因素，例如温度；或特定生理状态(例如急性期，细胞的特定分化状态)的存在，或仅在复制细胞中调节。诱导型启动子和诱导型系统可自许多商业来源获得，包括(但不限于)Invitrogen、Clontech和Ariad。已描述许多其它系统且其可由所属领域技术人员容易地选择。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(dexamethasone)(Dex)诱导型小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(诺(No)等人，美国国家科学研究院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),93:3346-3351(1996))、四环素可抑制型系统(戈森(Gossen)等人，美国国家科学研究院学报,89:5547-5551(1992))、四环素诱导型系统(戈森(Gossen)等人，科学(Science),268:1766-1769(1995),还参见Harvey等人，生物化学当代观点(Curr.Opin.Chem.Biol.),2:512-518(1998))、RU486诱导型系统(王(Wang)等人，自然生物技术(Nat.Biotech.),15:239-243(1997)和王等人，基因疗法(Gene Ther.),4:432-441(1997))和雷帕霉素(rapamycin)诱导型系统(马加里(Magari)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.),100:2865-2872(1997))。可适用于此上下文的其它类型的诱导型启动子由特定生理学状态(例如温度、急性期)、细胞的特定分化状态调节或仅在复制细胞中调节的启动子。
在一些实施例中，异源核酸由在CEC谱系的一或多种细胞中表达的启动子序列控制。CEC特异性启动子可包括用于任何以下基因的启动子：ATP6V1G1(递送V1子单元G1的ATP酶H+，C4orf49(MGARP)(定位富含谷氨酸的蛋白质的线粒体)、CA12(碳酸酐酶12)、COL4A3(IV型胶原蛋白α3链)、COL8A1(VIII型胶原蛋白α1链)、COL8A2(VIII型胶原蛋白α2蛋白质)、DNAC6(DNAJ热休克蛋白质家族(HSP40)成员C6)、ENO1(烯醇酶1)、ENO1P1(烯醇酶1假基因1)、ENST00000354541、ENST00000357401、ERG(ETS转录因子)、FGF10(成纤维细胞生长因子10)、FGF7(成纤维细胞生长因子7)、IGFBP2(胰岛素生长因子样结合蛋白质2)、ITGBL1(整合素子单元β样1)、LMX1B(LIM同源框转录因子1β)、MIR184(微型RNA 184)、MSMP(微精浆蛋白，前列腺相关)、PITX2(成对样同源结构域2)、POU6F2(POU类别6同源框2)、PTGDS(前列腺素D2合成酶)、SHC4(SHC转接蛋白质4)、SLC4A11(溶质载体家族4成员11)、SLC4A4(溶质载体家族4成员4)以及TFAP2B(转录因子AP-2β)和ZFHX4(锌指同源框4)(吉原(Yoshihara)等人,2017,生物医学(EBio Medicine),25(2017),第175-186页)。在一些实施例中，启动子序列可广泛地表达于生物体中，且因此可通过将其递送至细胞而表达于细胞中，例如多能干细胞、神经脊干细胞、角膜内皮祖细胞或CEC，例如成熟CEC。在其它实施例中，可使用特异性表达于CEC谱系的细胞(例如，神经脊干细胞、角膜内皮祖细胞或CEC，例如成熟CEC)中的启动子序列。
此外，任何启动子/强化子组合(根据例如真核启动子数据库EPDB，经由万维网epd.isb-sib.ch/)还可用于驱动表达。启动子的非限制性实例包括组成性EF1α启动子；早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子、GADPH启动子、金属硫蛋白启动子；和串联反应元件启动子，例如环状AMP反应元件启动子(cre)、血清反应元件启动子(sre)、佛波醇酯启动子(TPA)和靠近最小TATA盒的反应元件启动子(tre)。
2.起始信号和内部核糖体结合位点
特定起始信号还可用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供包括ATG起始密码子的外源性翻译控制信号。所属领域的一般技术人员将容易地能够确定此情形且提供必需信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框架“同框”，以确保整个插入物的翻译。外源性翻译控制信号和起始密码子可为天然或合成的。表达效率可通过包括适当转录强化子元件来提高。
在本发明的某些实施例中，使用内部核糖体入口位点(IRES)元件以用于产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5'甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型且在内部位点开始翻译。IRES元件可连接至异源开放阅读框架。多个开放阅读框架可共同转录，各自通过IRES分离，产生多顺反子信息。借助于IRES元件，各开放阅读框架可接近核糖体以便有效翻译。使用单一启动子/强化子转录单一信息可有效表达多个基因(参见美国专利案第5,925,565号和第5,935,819号；其各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，自我裂解序列可用于共同表达基因。如本文中所使用，术语“自我裂解序列”是指连接开放阅读框架以形成单一顺反子且在翻译期间诱导核糖体跳跃的序列。核糖体跳跃引起由自我裂解序列连接的两个编码序列翻译成两个独立的肽。举例来说，2A自我裂解序列可用于在本发明中所提供的构建体中产生基因的连锁表达或共同表达。示范性自我裂解序列包括(但不限于)T2A、P2A、E2A和F2A，如表2中所描述。
表2.示范性2A序列
在一些实施例中，T2A包含与SEQ ID NO:182的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列或编码此类氨基酸序列的核酸。
在一些实施例中，P2A包含与SEQ ID NO:183的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列或编码此类氨基酸序列的核酸。
在一些实施例中，E2A包含与SEQ ID NO:184的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列或编码此类氨基酸序列的核酸。
在一些实施例中，F2A包含与SEQ ID NO:185的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列或编码此类氨基酸序列的核酸。
3.复制起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，其可含有一或多个复制起点位点(通常称为“ori”)，例如对应于如上文所描述的EBV的oriP或经基因工程改造以在编程中具有类似或升高的功能的oriP的核酸序列，其为启动复制的特定核酸序列。或者，可使用如上文所描述的其它超染色体复制病毒或自主复制序列(ARS)的复制起点。
4.选择和可筛选标记物
在本发明的某些实施例中，含有本发明的核酸构建体的细胞可通过在表达载体中包括标记物而在体外或体内鉴别。此类标记物将赋予细胞可鉴别的变化，允许容易地鉴别含有表达载体的细胞。通常，选择标记物为赋予允许选择的特性的标记物。阳性选择标记物为标记物的存在允许其选择的标记物，而阴性选择标记物为其存在阻止其选择的标记物。阳性选择标记物的实例为耐药性标记物。
通常，包括药物选择标记物有助于克隆和鉴别转形体，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、吉欧霉素(zeocin)和组织醇的抗性的基因为适用的选择标记物。除了赋予允许基于条件的实施来鉴别转形体的表型的标记物以外，还涵盖其它类型的标记物，包括基于比色分析的可筛选标记物，例如GFP。
或者，可使用可筛选酶作为阴性选择标记物。在某些实施例中，阴性选择标记物包含一或多种自杀基因，其在施用前药后实现基因产物转变为杀伤其宿主细胞的化合物。本发明的示范性自杀基因包括(但不限于)诱导型凋亡蛋白酶9(或凋亡蛋白酶3或7)、CD20、CD52、EGFR、胸苷激酶、胞嘧啶脱胺酶、HER1和其任何组合。所属领域中已知的可用于本发明的其它自杀基因包括嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧基肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基还原酶(NTR)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶和胸苷磷酸化酶(TP)。
所属领域技术人员还将知晓如何使用免疫标记物，可能与FACS分析相结合。认为所使用的标记物并不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标记物的其它实例为所属领域技术人员所熟知的。本发明的一个特征包括在转录因子在角膜内皮细胞中实现所需变化后，使用选择和可筛选标记物选择这些细胞。
在本发明的某些实施例中，含有本发明的核酸构建体的细胞可通过在表达载体中包括标记物而在体外或体内鉴别。此类标记物将赋予细胞可鉴别的变化，允许容易地鉴别含有表达载体的细胞。通常，选择标记物为赋予允许选择的特性的标记物。阳性选择标记物为标记物的存在允许其选择的标记物，而阴性选择标记物为其存在阻止其选择的标记物。阳性选择标记物的实例为耐药性标记物。
通常，包括药物选择标记物有助于克隆和鉴别转形体，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、吉欧霉素和组织醇的抗性的基因为适用的选择标记物。除了赋予允许基于条件的实施来鉴别转形体的表型的标记物以外，还涵盖其它类型的标记物，包括基于比色分析的可筛选标记物，例如GFP。
C.核酸递送
在某些实施例中，增加角膜内皮祖细胞中的至少一种转录因子的表达包含使细胞，例如角膜内皮祖细胞或多能干细胞与至少一种转录因子接触。在一些实施例中，细胞，例如角膜内皮祖细胞或多能干细胞包含表达载体，其包含编码至少一种转录因子的核酸。
将核酸(例如DNA、RNA、经修饰的DNA或经修饰的RNA)引入本发明的细胞(例如，角膜内皮祖细胞或多能干细胞)中可使用任何适用于细胞的转化的核酸递送的方法，如本文中所描述或如所属领域的一般技术人员已知。所述方法包括(但不限于)直接递送DNA，例如通过离体转染(威尔逊(Wilson)等人,1989,诺贝尔(Nabel)等人,1989；其各自以全文引用的方式并入本文中)、通过注射(美国专利案第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号和第5,580,859号；其各自以全文引用的方式并入本文中)，包括显微注射(哈兰德(Harland)和温特劳布(Weintraub),1985；美国专利案第5,789,215号；其各自以全文引用的方式并入本文中)；通过电穿孔(美国专利案第5,384,253号；图尔·卡斯帕(Tur-Kaspa)等人,1986；波特(Potter)等人,1984；其各自以全文引用的方式并入本文中)；通过磷酸钙沉淀(格拉汉姆(Graham)和范德艾布(Van Der Eb),1973；陈(Chen)和冈山(Okayama),1987；里普(Rippe)等人,1990；其各自以全文引用的方式并入本文中)；通过使用DEAE-聚葡萄糖，接着使用聚乙二醇；通过直接声波加载(费切海默(Fechheimer)等人,1987；其以全文引用的方式并入本文中)；通过脂质体介导的转染(尼克劳(Nicolau)和塞恩(Sene),1982；弗雷利(Fraley)等人,1979；尼克劳等人,1987；王(Wong)等人,1980；金田(Kaneda)等人,1989；加藤(Kato)等人,1991；其各自以全文引用的方式并入本文中)和受体介导的转染(吴(Wu)和吴(Wu),1987；吴和吴,1988；其各自以全文引用的方式并入本文中)；通过微弹轰击(PCT申请案第WO94/09699号和第WO 95/06128号；美国专利案第5,610,042号、第5,322,783号、第5,563,055号、第5,550,318号、第5,538,877号和第5,538,880号；其各自以全文引用的方式并入本文中)；通过与碳化硅纤维一起搅拌(凯普勒(Kaeppler)等人,1990；美国专利案第5,302,523号和第5,464,765号；其各自以全文引用的方式并入本文中)；通过农杆菌介导的转化(美国专利案第5,591,616号和第5,563,055号；其各自以全文引用的方式并入本文中)；通过干化/抑制介导的DNA吸收(波特里库斯(Potrykus)等人,1985；其以全文引用的方式并入本文中)，和此类方法的任何组合。经由应用例如这些方法的技术，可稳定或暂时地转化细胞器、细胞、组织或生物体。
在本发明的某一实施例中，核酸可包埋于脂质复合物(例如脂质体)中。脂质体为以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。其在磷脂悬浮于过量的水性溶液中时自发地形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排，且在脂质双层之间截留水和溶解的溶质。还考虑与Lipofectamine(赛默飞世尔科技BRL)或Superfect(凯杰(Qiagen))复合的核酸。脂质体的使用量可根据脂质体的性质以及所使用的细胞而变化，例如可考虑每1至1000万个细胞使用约5至约20μg载体DNA。
在本发明的某些实施例中，经由电穿孔将核酸引入细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔涉及将细胞和DNA的悬浮液暴露于高压放电。可使得受体细胞更易于通过机械创伤转形。此外，载体的使用量可根据所使用的细胞的性质而变化，例如，可考虑每1至1000万个细胞使用约5至约20μg载体DNA。
在本发明的其它实施例中，使用磷酸钙沉淀将核酸引入细胞中。
在另一实施例中，使用DEAE-聚葡萄糖，接着使用聚乙二醇将核酸递送至细胞中。
本发明的其它实施例包括通过直接声波加载来引入核酸。
微弹轰击技术还可用于将核酸引入至少一个细胞器、细胞、组织或生物体中(美国专利案第5,550,318号；第5,538,880号；第5,610,042号；和PCT申请案WO 94/09699；其各自以引用的方式并入本文中)。此方法取决于将DNA包覆的微弹加速至高速度，使其能够刺穿细胞膜且进入细胞而不将其杀伤的能力(克莱恩(Klein)等人,1987；其以全文引用的方式并入本文中)。所属领域中已知多种适用于本发明的方法的微弹轰击技术。
D.基因开关
在一些实施例中，本发明的细胞(例如，多能干细胞或角膜内皮祖细胞)经工程改造以包含编码本发明的转录因子的基因开关构建体。基因开关构建体提供用于构建复杂的基因回路的基本构建嵌段，所述基因回路将细胞转形为适用的基于细胞的机器，以用于生物医学应用。配位体反应性基因开关构建体为细胞传感器，其能够处理特定信号以产生基因产物反应。其参与复杂的基因回路，产生复杂的电路拓扑结构，使人联想到电子装置且能够为经工程改造的细胞提供记忆事件、振荡蛋白质生产和执行复杂的信息处理任务(参见奥斯兰德等人,2016；冷泉港生物学观点(Cold Spring Harb PerspectBiol.)；8(7):a023895；其以全文引用的方式并入本文中)。基于基因开关构建体设计策略，本发明的细胞(例如，多能干细胞或角膜内皮祖细胞)可经工程改造以包含编码本发明的转录因子的基因开关构建体以及各种合成系统，由此感测不同的配位体输入，其又介导编码本发明的转录因子的基因开关构建体的表达。
1.转录基因开关
在一些实施例中，基因开关构建体为转录基因开关构建体。在一些实施例中，转录基因开关构建体包含使用与转录调节因子蛋白融合的原核或真核调节因子蛋白，其与DNA操纵子序列结合，以配体反应性方式控制基因开关构建体的表达。在一些实施例中，转录基因开关构建体包含使用将原核调节因子蛋白与配位体或光诱发性二聚化系统(DS)组合，从而能够实现转录调节因子蛋白的信号依赖性募集。在一些实施例中，转录基因开关构建体包含使用位于细胞表面的G蛋白偶联受体(GPCR)，所述受体感测胞外信号且经由信号传导途径触发信号转导以控制基因开关构建体的表达。在一些实施例中，转录基因开关构建体包含使用经工程改造的二鸟苷酸环化酶(DGCL)，其以红光反应性方式合成第二信使环状二-GMP，触发下游信号传导途径且引起基因开关构建体的转录活化。在一些实施例中，转录基因开关构建体包含使用奥斯兰德等人,2016中所描述的任何合成系统；其以全文引用的方式并入本文中。
2.转录后基因开关
在一些实施例中，基因开关构建体为转录后基因开关构建体。在一些实施例中，转录后基因开关构建体包含使用与初级微型RNA(pri-miRNA)分子融合的适体酶，从而能够实现对pri-miRNA处理的配位体反应性控制和转录后目标基因控制。在一些实施例中，转录后基因开关构建体包含使用整合至信使RNA(mRNA)中的蛋白质反应性适体酶来调节其稳定性，此取决于存在或不存在蛋白配位体。在一些实施例中，转录后基因开关构建体包含使用与蛋白质结合适体结合的蛋白质，所述适体整合至小型发夹RNA(shRNA)中且抑制shRNA处理，且允许蛋白质控制的基因开关构建体的表达。在一些实施例中，转录后基因开关构建体包含使用整合至mRNA的5'非翻译区(UTR)中的蛋白质结合适体，以蛋白质依赖性方式控制翻译起始。在一些实施例中，转录后基因开关构建体包含将蛋白质结合适体整合至剪接位点附近，以允许蛋白质反应性替代性剪接调节。在一些实施例中，转录后基因开关构建体包含使用ATetR结合适体与茶碱反应性适体的组合，从而能够实现TetR结合适体的茶碱依赖性折迭。当与同源适体结合时，TetR蛋白失去其DNA操纵子结合能力且在转录层面上影响基因表达。
整合酶还可充当功能性基因开关控制器，活化编码序列或经设计以在真核细胞中启动的启动子开关。整合酶在其位点识别和重组过程中展示准确性，且不具有细胞毒性。在一些实施例中，基因开关构建体包含使用由丝氨酸整合酶控制的基因开关，如戈米德(Gomide)等人,2020,通讯-生物(Commun Biol.)；3(1):255中所描述；其以全文引用的方式并入本文中。
E.蛋白质转导
在某些实施例中，可以足以产生成熟角膜内皮细胞的量使本发明的细胞(例如，角膜内皮祖细胞)与包含多肽的转录因子接触。蛋白质转导已用作增强大分子递送至细胞中的方法。蛋白质转导结构域可用于将转录因子多肽或其功能片段直接引入细胞中。
“蛋白质转导结构域”或“PTD”为可穿过生物膜，尤其细胞膜的氨基酸序列。当连接至异源多肽时，PTD可增强异源多肽跨越生物膜的易位。PTD典型地共价连接(例如，通过肽键)至异源DNA结合结构域。举例来说，PTD和异源DNA结合结构域可由单一核酸编码，例如在共同开放阅读框架中或在共同基因的一或多个外显子中。示范性PTD可包括10-30个氨基酸且可形成两性螺旋。许多PTD的特征为碱性。举例来说，碱性PTD可包括至少4、5、6或8个碱性残基(例如，精氨酸或赖氨酸)。PTD可能够增强多肽易位至缺乏细胞壁的细胞或特定物种的细胞，例如哺乳动物细胞，例如人类、猿猴、鼠类、牛类、马类、猫类或绵羊细胞中。
PTD可连接至人工转录因子，例如使用可挠性连接子。可挠性连接子可包括一或多个甘氨酸残基以允许自由旋转。举例来说，PTD可与转录因子的DNA结合结构域间隔至少10、20或50个氨基酸。PTD可相对于DNA结合结构域位于N端或C端。位于特定结构域的N端或C端并不需要与所述特定结构域相邻。举例来说，位于DNA结合结构域的N端的PTD可通过间隔子和/或其它类型的结构域与DNA结合结构域分开。PTD可以化学方式合成，随后在存在或不存在连接子肽的情况下以化学方式与单独制备的DNA结合结构域结合。人工转录因子还可包括多个PTD，例如多个不同PTD或一个PTD的至少两个复本。
若干蛋白质和小型肽具有独立于经典受体或胞吞作用介导的途径转导或穿过生物膜的能力。这些蛋白质的实例包括HIV-1TAT蛋白、单纯疱疹病毒1(HSV-1)DNA结合蛋白VP22和果蝇触角足(Drosophila Antennapedia；Antp)同源转录因子。这些蛋白质的小型蛋白质转导结构域(PTD)可与其它大分子、肽或蛋白质融合，以成功地将其转运至细胞中。这些蛋白质的转导结构域的序列比对展示高碱性氨基酸含量(Lys和Arg)，其可有助于这些区域与膜中带负电荷的脂质的相互作用。二级结构分析证实所有三个结构域之间不存在一致的结构。
使用这些转导结构域的融合物的优点为蛋白质进入速度快、依赖于浓度且似乎对困难的细胞类型有效。PTD进一步描述于U.S.2003/0082561；U.S.2002/0102265；U.S.2003/0040038中；其各自以全文引用的方式并入本文中。
除PTD以外，还可使用细胞吸收信号。此类信号包括由细胞受体或其它表面蛋白特异性识别的氨基酸序列。细胞吸收信号与细胞之间的相互作用引起包括细胞吸收信号的人工转录因子的内化。一些PTD还可通过与细胞受体或其它表面蛋白的相互作用而发挥作用。
细胞培养
通常，在培养基中培养本发明的细胞，培养基为能够维持细胞生长的富含营养物的缓冲溶液。
可通过在培养基中，在使本文中所描述的转录因子的细胞内含量增加达到足以促进产生CEC，例如成熟CEC的条件下培养多能干细胞或其它细胞(例如，角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞)，来制备本发明的CEC。培养基还可含有一或多种CEC分化剂，如各种生长因子。这些药剂可帮助诱导细胞进入更成熟的表型，或优先促进成熟细胞的存活，或具有这些作用的组合。
本发明中说明的CEC分化剂可包括能够促进CEC谱系的细胞生长的可溶性生长因子(肽激素、细胞因子、配位体-受体复合物、和其它化合物，例如硫酸软骨素A、垂体提取物和抗坏血酸)。此类制剂的非限制性实例包括(但不限于)诺金、SB431542、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、Rock抑制剂、和神经生长因子(NGF)。其它因子可包括白血病抑制因子(LIF)、GSK3抑制剂、视黄酸、γ分泌酶抑制剂、TGFβ/活化素(Activin)/Nodal的BMP抑制剂(包括多索吗啡(dorsomorphin)、脊索发生素(chordin)和卵泡抑素(follistatin))、IL-1、胰岛素、TGF-α、TGF-β、肝素、胰岛素样生长因子I和II(IGF-I、IGF-2)、血小板衍生的生长因子B(PDGFB)和PDGFB促效剂、DKK2和DKK2促效剂、血管生成素样蛋白质7(ANGPL7)、B27补充剂和升糖素。
多能细胞或其它细胞(例如，角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞)可在诺金(例如人类诺金多肽，例如NP_005441.1或其中所含的成熟多肽)和/或SB431542或衍生物(统称为“双重SMAD抑制剂”)的存在下分化。多能细胞或其它细胞(例如，角膜祖细胞或神经脊细胞)可在天然分泌的BMP抑制剂脊索发生素和卵泡抑素以及其类似物或模拟物、会与BMP2、BMP4和/或BMP7螯合的显性负向受体或阻断抗体、和/或多索吗啡(或化合物C)的存在下分化。SMAD蛋白质的抑制还可使用可溶性抑制剂执行，例如SIS3(6,7-二甲氧基-2-((2E)-3-(1-甲基-2-苯基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基-丙-2-烯酰基))-1,2,3,4-四氢异喹啉；Smad3的特异性抑制剂SIS3；抑制剂SMAD(例如SMAD6、SMAD7、SMAD10)中的一或多个或受体SMAD中的一者(SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、SMAD8/9)的RNAi的过度表达。其它用于多能细胞或其它细胞(例如，角膜祖细胞或神经脊干细胞)的分化的试剂可为白血病抑制因子(LIF)、GSK3抑制剂(CHIR 99021)、化合物E(γ分泌酶抑制剂XXI)和/或TGFβ抑制剂SB431542(李(Li)等人,美国国家科学研究院学报.2011年5月17日；108(20):8299-304)。
经历角膜祖细胞或神经脊诱导的多能干细胞可在SB431542的存在下培养，培养基中的SB431542浓度可以低达10nM、20nM、50nM、0.1μM或更低，或高达20μM、50μM、100μM或更高(例如10nM至100μM、0.1μM至50μM、0.1-20μM或1-20μM，或约10μM)。
多能细胞，例如经历角膜祖细胞或神经脊诱导的多能细胞可在存在诺金的情况下培养，诺金可以低至10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml或更低或高达700ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml、3000ng/ml、4000ng/ml、5000ng/ml或更高(例如10ng/ml至5,000ng/ml、100ng/ml至700ng/ml，或400ng/ml至600ng/ml，优选约500ng/ml)的浓度存在于培养基中。多能细胞还可与SB431542和诺金的组合(例如，前述浓度的组合)一起培养。
碱性FGF可存在于多能细胞的培养物中，例如在角膜祖细胞或神经脊诱导期间，其可以低至1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml或更低，或高达10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml或1μg/ml(例如1ng/ml-1μg/ml、1ng/ml-100ng/ml、2ng/ml-10ng/ml、6ng/ml-100ng/ml，或约6ng/ml)的浓度存在于培养基中。
碱性FGF可存在于角膜祖细胞、神经脊干细胞或CEC的培养物(例如在自角膜祖细胞或神经脊干细胞的CEC分化期间)或包含CEC的培养物中，其可以低至0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml或更低，或高达10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml或1μg/ml(例如0.1ng/ml-1μg/ml、0.1ng/ml-400ng/ml、0.1ng/ml-100ng/ml、0.1ng/ml-10ng/ml、1ng/ml-100ng/ml，或约6ng/ml)的浓度存在于培养基中。
EGF可存在于角膜祖细胞、神经脊干细胞或CEC的培养物(例如在自角膜祖细胞或神经脊干细胞的CEC分化期间)或包含CEC的培养物中，其可以低至0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml或更低，或高达10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml或1μg/ml(例如0.1ng/ml-1μg/ml、0.1ng/ml-400ng/ml、0.1ng/ml-100ng/ml、0.1ng/ml-10ng/ml、1ng/ml-100ng/ml，或约5μg/ml)的浓度存在于培养基中。
NGF可存在于角膜祖细胞、神经脊干细胞或CEC的培养物(例如在自角膜祖细胞或神经脊干细胞的CEC分化期间)或包含CEC的培养物中，其可以低至0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml或更低，或高达10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml或1μg/ml(例如0.1ng/ml-1μg/ml、0.1ng/ml-400ng/ml、0.1ng/ml-100ng/ml、0.1ng/ml-10ng/ml、1ng/ml-100ng/ml，或约20ng/ml)的浓度存在于培养基中。
ROCK抑制剂可存在于多能干细胞的培养物中，或在CEC分化期间存在。“ROCK抑制剂”是指抑制或减少细胞中的Rho相关激酶或其信号传导途径的功能的任何物质，例如小分子、siRNA、miRNA、反义RNA等。如本文中所使用，“ROCK信号传导途径”可包括涉及细胞中的ROCK相关信号传导途径，例如Rho-ROCK-肌凝蛋白II信号传导途径、其上游信号传导途径或其下游信号传导途径的任何信号处理器。可使用的示范性ROCK抑制剂为Stemgent公司的Stemolecule Y-27632、rho相关蛋白质激酶(ROCK)抑制剂(参见渡辺(Watanabe)等人,自然生物技术(Nat Biotechnol).2007年6月；25(6):681-6)。其它ROCK抑制剂包括例如H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A和SB-772077-B。土江(Doe)等人,药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.),32:89-98,2007；石崎(Ishizaki)等人,分子药理学杂志(Mol.Pharmacol.),57:976-983,2000；中岛(Nakajima)等人,癌症化疗与药理学(Cancer Chemother.Pharmacol.),52:319-324,2003；和佐佐木(Sasaki)等人,药理学与治疗学(Pharmacol.Ther.),93:225-232,2002，其各自以引用的方式并入本文中如同以其全文所阐述一般。ROCK抑制剂可以如所属领域中已知的浓度和/或培养条件使用，例如美国公开案第2012/0276063号中所描述，其以全文引用的方式并入本文中。Rho相关激酶抑制剂的其它实例包括以下参考文献中所公开的化合物：美国专利案第4,678,783号、美国专利案第3,421,217号、WO99/20620、WO99/61403、WO02076976、WO02/076977、WO02/100833、WO03/059913、WO03/062227、WO2004/009555、WO2004/022541、WO2004/108724、WO2005/003101、WO2005/039564、WO2005/034866、WO2005/037197、WO2005/037198、WO2005/035501、WO2005/035503、WO2005/035506、WO2005/080394、WO2005/103050、WO2006/057270、WO2007/026664等。此类化合物可根据对应的参考文献中的每一者中所描述的方法制备。特定实例包括1-(5-异喹啉磺酰基)高吡嗪(法舒地尔(fasudil))、(+)-反-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基胺甲酰基)环己烷(Y-27632)和其类似物，以及其盐，优选药学上可接受的盐，例如盐酸盐。在示范性实施例中，ROCK抑制剂的浓度可为约0.05至约50μM，例如至少或约0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45或50μM，包括任何可自其中衍生的范围，或任何可有效促进细胞生长或存活的浓度。
角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞可在存在PDGFB(例如，人类PDGFB多肽，例如NP_002599.1或其中所含的成熟多肽)的情况下培养，且培养基包含PDGFB，和/或PDGFAA或PDGFAB，佛波醇(Phorbol)12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或血管内皮生长因子(VEGF)。包含角膜内皮祖细胞或神经脊干细胞的培养物(例如在包含多能细胞(在开始神经脊诱导之后或在神经脊诱导期间)或角膜内皮祖细胞的培养物中)可在存在PDGFB的情况下培养，PDGFB可以低至0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml或更低，或高达10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml或更高(例如0.1ng/ml至250ng/ml、0.5ng/ml至150ng/ml、1-50ng/ml、2-20ng/ml，或优选约10ng/ml)的浓度存在于培养基中。
多能细胞或其它细胞(例如，角膜祖细胞或神经脊细胞)可在存在DKK2(例如，人类DKK2多肽，例如NP_055236.1或其中所含的成熟多肽)的情况下培养，且培养基包含DKK2。在预期产生神经脊干细胞(例如，在存在双重SMAD抑制剂的情况下培养)或角膜内皮祖细胞的条件下培养的神经脊干细胞(无论自分化多能细胞或其它来源获得)和/或分化多能细胞可在存在DKK2或DKK2促效剂的情况下培养。DKK2促效剂可包括任何可在功能上替代CEC的分化中的DKK2的Wnt途径活化剂和/或抑制剂。除DKK2以外或替代DKK2，可使用靶向和减弱LRP5/6或Kremen的表达的RNAi。除DKK2以外或替代DKK2，还可使用Wnt途径抑制剂(例如DKK1、3、4以及Soggy)、分泌型卷曲相关蛋白(Frzb)以及Wnt抑制剂因子(WIF)或酪蛋白激酶1-7或其它使β-连环蛋白稳定或去稳定的因子。此外，除DKK2以外或替代DKK2，可使用调节LEF/TCF转录因子成员。示范性Wnt途径活化剂包括Wnt蛋白质、编码Wnt蛋白质的核酸、LiCl、Wnt途径的负调节子的抑制剂(例如，RNAi或其它靶向轴蛋白和/或APC的抑制剂)、norrin、R-脊椎蛋白2。小分子Wnt途径活化剂包括：(杂)芳基嘧啶、IQ1、BIO(6-溴靛玉红-3'-肟)、2-氨基-4-[3,4-(亚甲二氧基)苯甲基-氨基]-6-(3-甲氧苯基)嘧啶-e、WAY-316606、QS11、SB-216763、SB-216763和DCA。小分子Wnt途径抑制剂包括：IWR、吡维氯铵(pyrvinium)、ICG-001、PKF115-584(和若干其它化合物)、IWP、Ant1.4Br/Ant 1.4Cl、氯硝柳胺(Niclosamide)、阿匹拉伦(apicularen)和巴弗洛霉素(bafilomycin)、XAV939、NSC668036、2,4-二氨基-喹唑啉和槲皮素(Quercetin)。可使用的其它示范性WNT途径抑制剂包括ID8(长谷川(Hasagawa)等人,干细胞转化医学(Stem Cells Transl Med.)2012年1月；1(1):18-28)、Wnt C59(普罗菲特(Proffitt),癌症研究(Cancer Res)，2012年11月27日首次线上公开,2012；DOI:10.1158/0008-5472.CAN-12-2258)、CGK062(郭(Gwak)等人,公共科学图书馆综合(PLoS ONE).2012；7(10):e46697)、IWP2(布劳坎普(Blauwkamp)等人,自然通讯(NatCommun.)2012；3:1070)、FH535(饭田(Iida)等人,公共科学图书馆综合.2012；7(9):e44418)和利鲁唑(Riluzole)(赵(Zhao)等人,生物分子筛选杂志(J Biomol Screen.)2012年10月；17(9):1252-63)。除DKK2以外或替代DKK2，还可使用前述因子的组合，例如包含超过一种Wnt途径活化剂、超过一种Wnt途径抑制剂或至少一种Wnt途径活化剂和至少一种Wnt途径抑制剂的组合。
在开始神经脊诱导之后或在神经脊诱导期间，角膜祖细胞或神经脊干细胞(例如在包含多能细胞的培养物中)可在存在DKK2的情况下培养，DKK2可以低至1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml或更低，或高达10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml或更高(例如1ng/ml-15μg/ml、10ng/ml-15μg/ml、1ng/ml-1μg/ml、1ng/ml-100ng/ml、2ng/ml-20ng/ml或5ng/ml-20ng/ml，或优选约10ng/ml)的浓度存在于培养基中。
多能细胞或其它细胞(例如，角膜祖细胞或神经脊细胞)可与一或多种促进CEC增殖的因子一起培养。此类因子可在角膜内皮细胞的形成期间和/或之后包括于细胞的培养物中，且可包括含有胰岛素和/或运铁蛋白的EGF、NGF和ITS补充剂。
在一些实施例中，本发明的方法包含增加角膜内皮祖细胞中的至少一种选自由以下组成的群的转录因子的表达：ATF4、ATMIN、BHLHE40、CEBPD、CSRNP1、DRAP1、EGR1、ELF2、EMX2、ESRRA、ETS2、FOS、FOSB、FOSL2、GTF3A、HIF1A、JUN、JUNB、JUND、KLF10、KLF9、MBD3、NFE2L1、NME2、NR1D1、NR4A1、PA2G4、POU3F3、RELA、TBX2、TFAP 2B、TFDP1、TSC22D1、USF2、YBX1、ZNF207、ZNF358和ZNF395，和在培养基中培养角膜祖细胞。
在一些实施例中，本发明的方法包含增加多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞或胚胎干细胞)中的至少一种选自由以下组成的群的转录因子的表达：ATF4、ATMIN、BHLHE40、CEBPD、CSRNP1、DRAP1、EGR1、ELF2、EMX2、ESRRA、ETS2、FOS、FOSB、FOSL2、GTF3A、HIF1A、JUN、JUNB、JUND、KLF10、KLF9、MBD3、NFE2L1、NME2、NR1D1、NR4A1、PA2G4、POU3F3、RELA、TBX2、TFAP2B、TFDP1、TSC22D1、USF2、YBX1、ZNF207、ZNF358和ZNF395，和在培养基中培养多能干细胞。
在一些实施例中，在增加本文中所公开的至少一种转录因子的表达之前，将角膜祖细胞培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天或更长时间。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前，将角膜祖细胞培养至少8天。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前，将角膜祖细胞培养至少10天。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前，将角膜祖细胞培养至少12天。
在一些实施例中，在增加本文中所公开的至少一种转录因子的表达之后，将角膜祖细胞培养至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24天或更长时间。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之后，将角膜祖细胞培养至少2天。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之后，将角膜祖细胞培养至少4天、至少10天、至少18天或至少24天。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之后，将角膜祖细胞培养至少18天。
在一些实施例中，角膜祖细胞衍生自多能干细胞。适用于根据本文中所描述的方法将多能干细胞分离、扩增和分化成角膜祖细胞的培养基包括(但不限于)StemFitBasic03培养基(味之素(Ajinomoto))、mTeSR1培养基、高葡萄糖达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)、DMEM/F-15(赛默飞世尔(ThermoFisher)#11330-032)、Liebovitz L-15、RPMI 1640、伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基(Iscove's modified Dubelcco's media；IMDM)和Opti-MEM SFM(英杰公司(InvitrogenInc.))。化学成分确定的培养基包含最低必需培养基，例如补充有人类血清白蛋白、人类ExCyte脂蛋白、运铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和有丝分裂诱致剂的伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)(赛默飞世尔科技)还为适合的。如本文中所使用，有丝分裂原是指刺激细胞的细胞分裂的试剂。试剂可为化学物质，通常为某种形式的蛋白质，其促使细胞开始细胞分裂，从而触发有丝分裂。在一个实施例中，考虑将无血清培养基(美国申请案第08/464,599号和PCT公开案第WO96/39487号；其各自以全文引用的方式并入本文中)和完全培养基(美国专利案第5,486,359号，其以全文引用的方式并入本文中)与本文中所描述的方法一起使用。在一些实施例中，培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、人类自体血清、人类AB血清或补充有肝素(2U/ml)的富含血小板的血浆。可将细胞培养物维持在CO2气氛(例如，5％至12％)中以维持培养液的pH值，在潮湿气氛中在37℃下培育，且在角膜内皮祖细胞分化期间传代以维持100％汇合。
可在足以维持多能性的培养基中培养待分化成角膜祖细胞或神经脊干细胞的多能干细胞。培养在本发明的某些方面中产生的诱导性多能干(iPS)细胞可使用为培养灵长类动物多能干细胞，更特别地，胚胎干细胞而开发的各种培养基和技术(美国专利申请案第20070238170号和美国专利申请案第20030211603号；其各自以全文引用的方式并入本文中)。举例来说，PSC可在存在或不存在ROCK抑制剂的情况下维持于StemFit培养基或mTeSR1培养基中。与人类胚胎干(hES)细胞相同，iPS细胞可维持在80％ DMEM(赛默飞世尔科技#10829-018或#11965-092)、20％未热灭活的确定胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇中。或者，ES细胞可维持在用80％Knock-Out DMEM(赛默飞世尔科技#10829-018)、20％血清替代物(赛默飞世尔科技#10828-028)、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇制备的无血清培养基中。
在一些实施例中，培养多能干细胞和诱导角膜祖细胞或神经脊干细胞形成的方法包含在包含碱性FGF、SB431542和诺金的分化培养基中培养多能干细胞，从而产生角膜内皮祖细胞，例如神经脊细胞。
在一些实施例中，培养多能干细胞的方法包括在适合的基质，例如iMatrix 511(宝日医生物技术(Takara Bio),T304)上培养。
在一些实施例中，将多能干细胞培养至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12天。
在一些实施例中，在增加本文中所公开的至少一种转录因子的表达之前，将角膜祖细胞培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前，将角膜祖细胞培养至少8天。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前，将角膜祖细胞培养至少10天。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前，将角膜祖细胞培养至少12天。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前，在包含ROCK抑制剂(例如，Y27632)、人类FGF-碱性SB431542、诺金、EGF和/或NGF的培养基中培养角膜内皮祖细胞。
在一些实施例中，在增加本文中所公开的至少一种转录因子的表达之后，将角膜祖细胞培养至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24天或更长时间。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之后，将角膜祖细胞培养至少2天。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之后，将角膜祖细胞培养至少4天、至少10天、至少18天或至少24天。在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之后，将角膜祖细胞培养至少18天。
在一些实施例中，在增加至少一种转录因子的表达之前或之后，在包含EGF和/或NGF的培养基中培养角膜内皮祖细胞。
为了产生多能干细胞衍生的角膜内皮祖细胞，在一些实施例中，收集多能细胞的单层且以例如2×105个细胞/cm2的密度涂布。通过将多能干细胞在存在或不存在ROCK抑制剂(如果存在，那么会存在1、2或3天或更长时间)的情况下在培养基中培养至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天来起始分化过程的步骤1。接着进行步骤2，将步骤1中获得的细胞在具有FGF-2、SB431542和诺金中的一或多个的培养基中培养至少4、6、8或10天。接着进行步骤3，将步骤2中获得的细胞在存在或不存在ROCK抑制剂的情况下，在包含EGF的培养基中培养至少1、2、3、4或5天。接着将细胞在包含一种EGF和NGF的培养基中培养至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
适用于制备多能干细胞衍生的角膜内皮祖细胞的培养基包括：
表3：成熟培养基1
表4：成熟培养基2
表5：成熟培养基3
角膜内皮细胞标记物
可根据多种表型准则来表征CEC，例如成熟CEC。准则包括(但不限于)检测或定量经表达的细胞标记物、泵活性、关于角膜修复的体内功效和体内角膜功能的改进，以及体外和体内移植后形态特性的表征。
本发明的某些方面中获得的CEC，例如成熟CEC具有形态特性，其特征在于CEC的性质，例如衍生自角膜。所述特性可由所属领域技术人员容易地理解且包括以下中的任一者或全部：在角膜之后表面上排列且面向眼睛的前房的富含线粒体的细胞(在活有机体中)；形成具有明显的六边形形状的大小均匀的细胞的单层的能力；形成允许溶质和营养物自眼房液渗漏至角膜的更浅的表层，同时以相反方向(自基质至眼房液)主动泵送水的“渗漏泵”的能力；和对氧化应力的抗性。单一细胞中存在的许多这些特性与所述细胞为CEC谱系的成员一致。
本发明的CEC，例如成熟CEC还可根据其是否表达作为CEC谱系的细胞的特征的表型标记物来表征。示范性角膜内皮细胞标记物包括(但不限于)：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B、LMX1B、AQP1、ATP1A1、TJP1、NCAM1、CDH2、SLC4A4、CD166、POU6F2、CD248、MRGPRX3、KLF13、CA2、NBC1、N-钙粘素Na+/K+ATP酶、ZO-1、KLF13、胶原蛋白VIII、SLC16A3、CFTR、NBC1、CA2、AE2、SCL4A2、SCL16A1、CA12和CA4。CEC，例如成熟CEC可不表达NGFR、SOX10、HNK1、SSEA4、NANOG、OCT4、vWF和CD31(后者存在于血管内皮细胞中)。CEC，例如成熟CEC可表达一或多种角膜内皮泵标记物(其包括：AQP1、CA2、CA4、CA12、SCL14A2、SLC16A1、SLC16A3、SLC16A7、CFTR、NHE1、ADCY10、电压依赖性阴离子通道VDAC2和VDAC3、氯离子通道蛋白质CLCN2和CLC)、眼周神经脊标记物(其包括：PITX2和FOXC1)和/或细胞粘附和基质蛋白(其包括：紧连蛋白、连结蛋白43、9.3E抗原、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、N钙粘素、VE钙粘素、E钙粘素、β连环蛋白、p120、p190层粘连蛋白α4、巢蛋白-2和轴突引导因子4)。CEC，例如成熟CEC可表达至少一种角膜内皮泵标记物、至少一种眼周神经脊标记物以及至少一种细胞粘附和基质蛋白。
CEC标记物可包括表6中所提供的标记物中的任一者(mRNA序列提供为SEQ ID NO:98-140且氨基酸序列提供为SEQ ID NO:141-181)。
表6
CEC，例如成熟CEC还可显示指示CEC成熟的整体基因表达图谱。整体基因表达图谱可与初生CEC或已知的成熟CEC的基因表达图谱进行比较，且可通过所属领域中已知的任何方法获得，例如转录组学分析或微阵列分析。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组向CEC，例如成熟CEC的转录组偏移至少1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组向CEC，例如成熟CEC的转录组偏移至少1％。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组向CEC，例如成熟CEC的转录组偏移至少5％。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组向CEC，例如成熟CEC的转录组偏移至少10％。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组向CEC，例如成熟CEC的转录组偏移至少20％。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组向CEC，例如成熟CEC的转录组偏移至少30％。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组向CEC，例如成熟CEC的转录组偏移至少40％。在一些实施例中，增加至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的转录组向CEC，例如成熟CEC的转录组偏移至少50％。
可测定此类标记物在CEC，例如成熟CEC中的表达量的评估且与其它细胞(例如，初生CEC、角膜内皮祖细胞、神经脊细胞和血管内皮细胞)进行比较。CEC，例如成熟CEC的标记物的阳性对照物包括感兴趣的物种的成年角膜内皮细胞，例如初生人类角膜内皮细胞。
本发明中列举的组织特异性(例如，角膜内皮细胞特异性)蛋白质和寡糖决定子可使用任何适合的免疫技术检测，例如用于细胞表面标记物的流动式免疫细胞化学、用于细胞内或细胞表面标记物的免疫组织化学(例如，用于固定细胞或组织切片)、细胞提取物的西方墨点分析以及用于分泌至培养基中的细胞提取物或产物的酶联免疫分析法。如果在标准免疫细胞化学或流动式细胞测量术分析法中，任选地在固定细胞后且任选地使用经标记的二级抗体或其它结合物(例如生物素-抗生物素蛋白结合物)扩增标记，显著可检测的量的抗体将与抗原结合，那么细胞的抗原表达称为“抗体可检测”。
还可在标准扩增方法中使用序列特异性引物，通过北方墨点分析、点渍墨法杂交分析或实时聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA层面上检测组织特异性(例如CEC，例如成熟CEC特异性)标记物的表达(美国专利案第5,843,780号)。本发明中列举的特定标记物的序列数据可自公共数据库，例如GenBank获得。如果在典型受控实验中根据标准程序对细胞样品进行的分析法在标准时间窗内产生明显可辨别的杂交或扩增产物，那么根据本发明中所描述的分析法中的一者，在mRNA层面上的表达称为“可检测”。除非另有要求，否则如果可通过RT-PCR检测到相应mRNA，那么指示特定标记物的表达。如果水平比对照细胞，例如未分化的多能干细胞、成纤维细胞或其它非相关细胞类型高至少2倍且优选高超过10倍或50倍，那么在蛋白质或mRNA层面上检测到的组织特异性标记物的表达视为阳性的。
CEC，例如成熟CEC还可根据其是否显示形成“渗漏泵”的能力来表征，所述渗漏泵允许溶质和营养物自眼房液渗漏至角膜的更浅的表层，同时以相反方向(自基质至眼房液)主动泵送水。可通过所属领域中已知的方法评估CEC的泵送功能，例如米木拉(Mimuara)等人,2004,眼科研究与视力学(Investigative Opthamology and Visual Science),45:9,第2992-2997页中所描述。为了测定衍生自多能干细胞(例如诱导性多能干细胞或胚胎干细胞)或角膜内皮祖细胞的表达本发明的转录因子的CEC，例如成熟CEC中的泵送功能的变化，可将泵送功能与所培养的初生CEC(例如，人类)、未经修饰的角膜内皮祖细胞和/或未分化的细胞(多能干细胞、神经脊干细胞等)进行比较。添加乌本苷(ouabain)(Na/K ATP酶抑制剂)将消除泵送功能，且允许评估存在/不存在泵送功能。
还可通过对氧化应力的抗性的水平来表征CEC，例如成熟CEC。对氧化应力的抗性可通过qPCR来测量，以测定氧化应力途径基因(NRF2、NOS2等)的表达量，和使用ROS生物标记物(例如硝基酪氨酸和CellRox(CellROXTMReagent Variety Pack，用于氧化应力检测，赛默飞世尔科技C1044)通过测量细胞中的反应性氧物质(ROS)含量来测量。可通过所属领域中已知的方法评估对氧化应力的反应，例如古哈(Guha)等人,2017,自然科学报告(NatureScientific Reports),4:4074(∣DOI:10.1038/s41598-017-03654-4)中所描述。为了测定衍生自多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞或胚胎干细胞)或角膜内皮祖细胞的表达本发明的转录因子的CEC的对氧化应力的抗性的变化，可将对氧化应力的抗性水平与所培养的初生CEC(例如，人类)、未经修饰的角膜内皮祖细胞和/或未分化的细胞(多能干细胞、神经脊干细胞等)进行比较。
CEC，例如成熟CEC的另一特性为其明显的多边形或六边形形状。
在另一方面中，可评估CEC，例如成熟CEC在个体中移植和/或呈现长期存活的能力。在一个实施例中，为了测定CEC，例如成熟CEC是否在体内存活且维持其表型，向适当动物的角膜施用CEC(如本文中所描述)。在数天至数周或更长时间的时段之后收集角膜组织，以评估所施用的细胞的存在和表型，例如使用人类特异性抗体通过免疫组织化学或ELISA，或通过RT-PCR分析。本发明中提供适用于在mRNA或蛋白质层面上评估基因表达的标记物。还可通过评估泵送功能或紧密接合区的标记物来测定对角膜功能的作用。
在一些实施例中，将CEC，例如成熟CEC移植至受体个体的角膜中。在一些实施例中，CEC，例如成熟CEC包含CEC，例如成熟CEC的群体，其中至少0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的CEC，例如成熟CEC移植至受体个体的角膜中。
II.本发明的细胞和组合物
本发明的另一方面提供一种组合物，其包含例如根据本文中所描述的任何方法制备的CEC，例如成熟CEC的群体。本发明还提供包含CEC，例如成熟CEC的群体的组合物，所述CEC包含外源性转录因子或编码转录因子的核酸。本发明还提供包含多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞或胚胎干细胞)群体、神经脊干细胞群体或角膜内皮祖细胞群体的组合物，所述细胞包含外源性转录因子或编码转录因子的核酸。
在一些实施例中，组合物为经富集、纯化或分离的CEC、神经脊干细胞、角膜内皮祖细胞或多能干细胞的群体，例如根据本文中所描述的任何方法制备。经富集、纯化或分离的CEC、神经脊干细胞、角膜内皮祖细胞或多能干细胞的群体可为单一细胞悬浮液、聚集体、嵌合聚集体和/或结构，包括支链结构和/或包囊。
在一些实施例中，CEC，例如成熟CEC的群体包含相对于CEC，例如成熟CEC的群体中的转录因子的内源性表达量增加的至少一种选自由以下组成的群的转录因子的表达量：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少500倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少1,000倍。在一些实施例中，增加的PITX2的表达包含相对于CEC群体中的PITX2的内源性表达量增加至少10,000倍。在任何以上实施例中，CEC可为成熟CEC。
在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少500倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少1,000倍。在一些实施例中，增加的FOXC1的表达包含相对于CEC群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少10,000倍。在任何以上实施例中，CEC可为成熟CEC。
在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少500倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少1,000倍。在一些实施例中，增加的TFAP2B的表达包含相对于CEC群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少10,000倍。在任何以上实施例中，CEC可为成熟CEC。
在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少500倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少1,000倍。在一些实施例中，增加的LMX1B的表达包含相对于CEC群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少10,000倍。在任何以上实施例中，CEC可为成熟CEC。
在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.1倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.2倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.5倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少1倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少2倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少5倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少10倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少20倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少50倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少100倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少200倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少500倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少1,000倍。在一些实施例中，增加的POU6F2的表达包含相对于CEC群体中的POU6F2的内源性表达量增加至少10,000倍。在任何以上实施例中，CEC可为成熟CEC。
在一些实施例中，CEC，例如成熟CEC的群体进一步包含相对于CEC，例如成熟CEC的群体中的一或多种转录因子的内源性表达量增加的一或多种选自由以下组成的群的转录因子的表达量：ERG、ATF4、ATMIN、BHLHE40、CEBPD、CSRNP1、DRAP1、EGR1、ELF2、EMX2、ESRRA、ETS2、FOS、FOSB、FOSL2、GTF3A、HIF1A、JUN、JUN B、JUN D、KLF10、KLF9、MBD3、NFE2L1、NME2、NR1D1、NR4A1、PA2G4、POU3F3、RELA、TBX2、TFDP1、TSC22D1、USF2、YBX1、ZNF207、ZNF358和ZNF395。在一些实施例中，一或多种转录因子为ERG。在一些实施例中，一或多种转录因子为BHLHE40。在一些实施例中，一或多种转录因子为CEBPD。在一些实施例中，一或多种转录因子为CSRNP1。在一些实施例中，一或多种转录因子为EGR1。在一些实施例中，一或多种转录因子为ESRRA。在一些实施例中，一或多种转录因子为ETS2。在一些实施例中，一或多种转录因子为FOS。在一些实施例中，一或多种转录因子为FOSB。在一些实施例中，一或多种转录因子为FOSL2。在一些实施例中，一或多种转录因子为JUN。在一些实施例中，一或多种转录因子为JUNB。在一些实施例中，一或多种转录因子为JUND。在一些实施例中，一或多种转录因子为KLF10。在一些实施例中，一或多种转录因子为KLF9。在一些实施例中，一或多种转录因子为NR1D1。在一些实施例中，一或多种转录因子为NR4A1。在一些实施例中，一或多种转录因子为TSC22D1。
在一些实施例中，CEC群体为角膜内皮祖细胞群体。在一些实施例中，CEC群体为成熟CEC群体。在一些实施例中，CEC群体包含成熟CEC和角膜内皮祖细胞。
在一些实施例中，CEC群体的组合物包含约1×106个CEC至约1×1012个CEC。在一些实施例中，CEC群体的组合物包含至少1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011或1×1012个CEC。
本文中还提供医药组合物和调配物，其包含CEC，例如成熟CEC或角膜内皮祖细胞和药学上可接受的载剂。
在一些实施例中，医药组合物包含在约1×106个CEC至约1×1012个CEC范围内的剂量。在一些实施例中，剂量为约1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011或1×1012个CEC。在一些实施例中，医药组合物包含在约1×106个CEC至约1×1012个CEC范围内的剂量。
本发明的另一方面提供一种包含多能干细胞群体的组合物，所述多能干细胞群体包含表达载体，其中所述表达载体包含编码至少一种本发明的转录因子的核酸。
在一些实施例中，转录因子为PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2中的一或多个。在一些实施例中，转录因子为PITX2。在一些实施例中，转录因子为FOXC1。在一些实施例中，转录因子为TFAP2B。在一些实施例中，转录因子为LMX1B。在一些实施例中，转录因子为POU6F2。
在一些实施例中，多能干细胞群体进一步包含表达载体，其包含编码一或多种选自由以下组成的群的转录因子的核酸：ERG、ATF4、ATMIN、BHLHE40、CEBPD、CSRNP1、DRAP1、EGR1、ELF2、EMX2、ESRRA、ETS2、FOS、FOSB、FOSL2、GTF3A、HIF1A、JUN、JUNB、JUND、KLF10、KLF9、MBD3、NFE2L1、NME2、NR1D1、NR4A1、PA2G4、POU3F3、RELA、TBX2、TFDP1、TSC22D1、USF2、YBX1、ZNF207、ZNF358和ZNF395。
在一些实施例中，包含多能干细胞群体的组合物包含约1×106个多能干细胞至约1×1012个多能干细胞。在一些实施例中，包含多能干细胞群体的组合物包含至少1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011或1×1012个多能干细胞。
在一些实施例中，多能干细胞为胚胎干细胞。在一些实施例中，多能干细胞为诱导性多能干细胞。
本发明的另一方面提供包含角膜内皮祖细胞群体的组合物，所述角膜内皮祖细胞群体包含表达载体，其中所述表达载体包含编码至少一种本发明的转录因子的核酸。
在一些实施例中，转录因子为PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2中的一或多个。在一些实施例中，转录因子为PITX2。在一些实施例中，转录因子为FOXC1。在一些实施例中，转录因子为TFAP2B。在一些实施例中，转录因子为LMX1B。在一些实施例中，转录因子为POU6F2。
在一些实施例中，角膜内皮祖细胞群体进一步包含表达载体，其包含编码一或多种选自由以下组成的群的转录因子的核酸：ERG、ATF4、ATMIN、BHLHE40、CEBPD、CSRNP1、DRAP1、EGR1、ELF2、EMX2、ESRRA、ETS2、FOS、FOSB、FOSL2、GTF3A、HIF1A、JUN、JUNB、JUND、KLF10、KLF9、MBD3、NFE2L1、NME2、NR1D1、NR4A1、PA2G4、POU3F3、RELA、TBX2、TFDP1、TSC22D1、USF2、YBX1、ZNF207、ZNF358和ZNF395。
在一些实施例中，包含角膜内皮祖细胞群体的组合物包含约1×106个角膜内皮祖细胞至约1×1012个角膜内皮祖细胞。在一些实施例中，包含角膜内皮祖细胞群体的组合物包含至少1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011或1×1012个角膜内皮祖细胞。
本文中还提供医药组合物和调配物，其包含角膜内皮祖细胞和药学上可接受的载剂。
在一些实施例中，医药组合物包含在约1×106个角膜内皮祖细胞至约1×1012个角膜内皮祖细胞范围内的剂量。在一些实施例中，剂量为约1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011或1×1012个角膜内皮祖细胞。在一些实施例中，医药组合物包含在约1×106个角膜内皮祖细胞至约1×1012个角膜内皮祖细胞范围内的剂量。
如本文中所描述的医药组合物和调配物可通过以水性溶液形式混合CEC，例如成熟CEC与一或多种任选的药学上可接受的载剂(雷明顿氏医药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences),第22版,2012；其以全文引用的方式并入本文中)来制备。药学上可接受的载剂通常在使用剂量和浓度下对受体无毒性，且包括(但不限于)：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相对离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子性表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文中的示范性药学上可接受的载剂进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(百特国际有限公司(Baxter International,Inc.))。某些示范性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开案第2005/0260186号和第2006/0104968号中；其各自以全文引用的方式并入本文中。在一个方面中，sHASEGP与一或多种其它葡萄糖胺聚糖酶(例如软骨素酶)组合。
在某些实施例中，包含CEC的组合物和医药组合物包含大体上纯化的CEC群体。举例来说，CEC的组合物可含有小于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％的除CEC以外的细胞。在一些实施例中，CEC的组合物含有小于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％的多能干细胞。在另一实施例中，CEC的组合物中不含或检测不到多能干细胞。在一些实施例中，CEC的组合物含有小于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％的角膜内皮祖细胞。在另一实施例中，CEC的组合物中不含或检测不到角膜内皮祖细胞。在一些实施例中，包含大体上纯化的CEC群体的组合物为其中CEC占组合物中的细胞的至少约75％的组合物。在其它实施例中，大体上纯化的CEC群体为其中CEC占所述群体中的细胞的至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、99％或甚至超过99％的群体。在任何实施例中，大体上纯化的CEC群体可为大体上纯化的成熟CEC群体。
III.角膜内皮细胞的使用方法
通过本文中所描述的方法产生的CEC，例如成熟CEC和医药组合物可用于眼部病症(包括角膜病症)的基于细胞的治疗(其中需要角膜内皮细胞或将改进治疗)。本文中描述使用由本发明提供的CEC，例如成熟CEC治疗可受益于基于角膜内皮细胞的疗法的各种病状的方法。特定治疗方案、施用途径和任何辅助疗法将基于特定病状、病状的严重程度和患者的整体健康状况来定制。此外，在某些实施例中，CEC，例如成熟CEC的施用可有效地完全恢复角膜功能的损失或其它症状。在其它实施例中，CEC，例如成熟CEC的施用可有效地减轻症状的严重程度和/或防止患者的病状进一步恶化。本发明涵盖包含CEC，例如成熟CEC的组合物的施用可用于治疗本文中所描述的任何病状(包括完全或部分减轻症状的严重程度)。
本发明涵盖使用本文中所描述的任何方法获得的CEC，例如成熟CEC(包括包含CEC，例如成熟CEC的组合物)可用于治疗本文中所描述的任何适应症。此外，本发明涵盖本文中所描述的任何包含CEC，例如成熟CEC的组合物可用于治疗本文中所描述的任何适应症。
在一个实施例中，本发明提供用于预防和/或治疗疾病，优选影响角膜内皮细胞或可由角膜内皮细胞的移植或施用治疗的疾病的治疗方法，所述疾病包括例如原发性疾病，例如富克斯氏营养不良、虹膜角膜内皮综合征、后部多形性营养不良和先天性遗传性内皮营养不良，和其中可使用更换角膜内皮作为有效治疗为的继发性疾病，包括角膜营养不良，或其中个体呈现引起大疱性角膜病变的角膜水肿的症状、其中个体患有由使用隐形眼镜或白内障手术引起的眼部损伤或其中个体正在考虑角膜移植和患有角膜移植中的晚期内皮衰竭。
在另一实施例中，本发明的CEC，例如成熟CEC可与其它治疗性细胞或药剂一起施用。CEC，例如成熟CEC可在组合或独立调配物中同时施用，或依序施用。治疗方法可包括施用免疫抑制剂。可使用的免疫抑制剂包括(但不限于)抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、(抗IL-2R.α.受体抗体)、环孢素(环孢素A)、/>(抗IL-2R.α.受体抗体)、依维莫司(everolimus)、霉酚酸、/>(抗CD20抗体)、西罗莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)、霉酚酸酯(mycophemolate mofetil)、皮质类固醇和间质干细胞。免疫抵制剂可以至少约1、2、4、5、6、7、8、9或10mg/kg给药。当使用免疫抵制剂时，其可全身性或局部施用，且其可在CEC，例如成熟CEC的施用之前、同时或之后施用。在施用细胞后，免疫抑制性疗法可持续数周、数月、数年或无限期。举例来说，在施用CEC，例如成熟CEC后，可向患者施用5mg/kg的环孢素持续6周。此外，CEC，例如成熟CEC的组合物可包含免疫抑制剂，例如任何前述免疫抑制剂。
本发明的CEC，例如成熟CEC可与促进细胞粘附、移植和/或存活的药剂一起施用。本发明的CEC可与ROCK抑制剂(例如，Y27632)和细胞外基质蛋白(例如，纤维结合蛋白)一起施用。本发明的CEC，例如成熟CEC可与一或多种抗细胞凋亡剂、消炎剂、抗氧化剂和细胞外基质蛋白(例如，纤维结合蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白的经截短的E8片段(例如，iMatrix511)、胶原蛋白(I、II、III、IV、VIII型等)等一起施用。
由本发明的方法和组合物提供的CEC，例如成熟CEC还可用于各种应用。这些应用包括(但不限于)体内移植或植入角膜内皮细胞；体外筛选细胞毒性化合物、致癌物、诱变剂生长/调节因子或医药化合物；阐明角膜疾病和感染的机制；研究药物和/或生长因子的作用机制；诊断和监测患者的癌症；基因疗法；和制备生物活性产物。在一些实施例中，角膜内皮细胞包含成熟角膜内皮细胞、神经脊干细胞、角膜内皮祖细胞或其组合。
测试化合物筛选
本发明的CEC，例如成熟CEC可用于筛选将影响本文中所提供的角膜内皮细胞的特征的因子(例如，溶剂、小分子药物、肽和多核苷酸)或环境条件(例如，培养条件或操作)。
在一些应用中，使用干细胞(分化或未分化)筛选将促进细胞沿角膜内皮细胞谱系成熟或促进此类细胞在长期培养物中增殖和维持的因子。举例来说，候选角膜内皮细胞成熟因子或生长因子通过将其添加至不同孔中的干细胞中，且接着根据细胞的进一步培养和使用的所需准则测定所引起的任何表型变化来测试。
本发明的特定筛选应用涉及药物研究中的医药化合物的测试，例如药物研究中的体外方法(In vitro Methods in Pharmaceutical Research),美国学术出版社(AcademicPress),1997和美国专利案第5,030,015号中所描述；其各自以全文引用的方式并入本文中。候选医药学化合物的活性的评估通常涉及将本发明的某些方面中所提供的CEC，例如成熟CEC与候选化合物组合，测定可由化合物引起的细胞的形态、标记物表型或代谢活性的任何变化(与未经处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)，且接着将化合物的作用与所观测的变化相关联。进行筛选可能是因为所述化合物经设计以对角膜内皮细胞具有药理学作用，或因为经设计以在别处具有作用的化合物可能具有不希望的角膜副作用。可组合测试两种或更多种药物(通过同时或依序与细胞组合)，以检测可能的药物-药物相互作用效果。
角膜疗法和移植
本发明还提供本文中所描述的CEC，例如成熟CEC的用途，其用于恢复有需要的个体的眼睛功能的水平。
为了确定本文中所提供的CEC，例如成熟CEC对治疗性应用的适用性，可首先在适合的动物模型中测试细胞。适合的动物包括兔CEC刮擦模型(奥村(Okumura)等人,2017,美国病理学杂志(Am.J.Pathol.),2012,181(1):268-277)或猴CEC刮擦模型(奥村等人,2016,自然科学报告,6:26113,DOI:10.1038/srep26113)。其它适用于本发明的模型包括啮齿动物模型，例如费氏角膜内皮营养不良(Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy)的L450W和Q455K Col8a2基因嵌入小鼠模型(孟(Meng)等人,2013,眼科研究与视力学(Invest.Opthamol.Vis.Sci.)54(3):1887-189)和小鼠SLC4A11基因剔除模型(格罗格(Groger)等人,2010,生物化学杂志(J.Biol.Chem.),285(19):14467)。此类模型适用于评估CEC，例如成熟CEC在体内存活和维持其表型的能力。可向动物施用本文中所提供的CEC，例如成熟CEC。在数天至数周或更长时间的时段之后收集组织且进行评估。此可通过向所施用的细胞提供可检测标记(例如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)；或通过测量对所施用的细胞具有特异性的组成性标记物来进行。可使用人类特异性抗体通过免疫组织化学或ELISA，或使用引物和引起对人类多核苷酸序列具有特异性的扩增的杂交条件通过RT-PCR分析来评估施用啮齿动物的人类CEC，例如成熟CEC的存在和表型。本文中提供适用于在mRNA或蛋白质层面上评估基因表达的标记物。
本发明的说明本文中所描述的所需功能特性或动物模型中的功效的某些方面中所提供的CEC，例如成熟CEC还适用于直接施用患有角膜损伤的人类个体。在一个方面中，本发明提供一种治疗方法，其包含将经培养的CEC(例如，成熟CEC)或其前体的片状物或单层或球状物移植至有需要的个体的眼睛中，例如罹患角膜内皮细胞疾病的个体。举例来说，可通过去除后弹力膜来对个体的眼睛进行准备，且可将所述经培养的CEC，例如成熟CEC的片状物或单层或球状物放置于所述眼睛的前房中，例如与角膜后基质接触(且优选连接或附接)。任选地，可在载体上提供CEC(例如，成熟CEC)或其前体的片状物或单层或球状物且施用患者的眼睛。
当仅角膜内皮受损时，一种临床上优选的治疗为后弹力膜剥除伴内皮角膜成形术(DSEK)，其包括去除患病的后弹力膜和角膜内皮且随后移植供体组织。已研发出用于更换整个角膜(穿透性角膜移植或PK)或保留患者的后弹力膜和内皮且用供给组织更换其余层(板层角膜移植)的程序。通常参见美国专利案第5,755,785号、美国专利案第5,649,944号、美国专利案第7,147,648号、美国专利案第7,300,653号、美国专利案第5,584,881号、美国专利案第5,686,414号、美国专利案第7,300,654号、美国专利申请案第10/525,391号，其各自以全文引用的方式并入本文中。正在研发角膜内皮手术更换的其它方法，包括后弹力膜内皮角膜成形术(DMEK)，其中供体组织仅由后弹力膜和角膜内皮组成。可使用适当动物模型，例如本文中所描述的任何模型评估角膜内皮手术替代疗法。本发明的某些方面中提供的CEC，例如成熟CEC可用于角膜内皮重构，其中在移植之前在体外培养CEC，例如成熟CEC。举例来说，在聚合物上培养所供给的人类角膜细胞，释放至生物粘着性明胶盘上，且接着成功地整合至经剥离的兔角膜中，其中明胶盘在移植之后溶解(薛等人,移植.2006年2月,15；81(3):473-6，其以全文引用的方式并入本文中)。然而，利用所培养的细胞的方法需要具有所述细胞的来源，且因此受如上文所描述的缺乏适合的供给组织的影响。此外，由于供给细胞的差异，发现难以产生具有恒定的质量和功效的角膜内皮细胞培养物。由于可能需要对自各供体获得的细胞进行广泛的安全性和/或功效测试，因此监管障碍还可能使此类方法在后勤方面难以大规模进行。这些和其它治疗方法进一步描述于托马斯·约翰(ThomasJohn),角膜内皮移植：DSAEK、DMEK和DLEK(Corneal Endothelial Transplant:DSAEK,DMEK&DLEK)(Jp医药有限公司出版社(JP Medical Ltd),2010)中，其以全文引用的方式并入本文中。
本发明的某些方面中提供的CEC，例如成熟CEC可用于任何需要恢复或补充眼睛功能的个体的疗法。适于此类疗法的人类病状包括原发性疾病，例如富克斯氏营养不良、虹膜角膜内皮综合征、后部多形性营养不良和先天性遗传性内皮营养不良，和其中可使用更换角膜内皮作为有效治疗为的继发性疾病，包括角膜营养不良，或其中个体呈现引起大疱性角膜病变的角膜水肿的症状、其中个体患有由使用隐形眼镜或白内障手术引起的眼部损伤或其中个体正在考虑角膜移植。
对于人类疗法，剂量通常在约109与1012个细胞之间，且典型地在约5×109与5×1010个细胞之间，根据个体的体重、病痛的性质和严重程度以及所施用的细胞的复制能力进行调节。
本发明还提供本文中所公开的CEC，例如成熟CEC的使用方法，例如与其它细胞类型组合作为类器官。类器官可自CEC建立且生长多个月，同时保留关键的形态、功能和基因表达特征。
此外，出于制造、分配和使用目的，本发明的CEC，例如成熟CEC可以于等张赋形剂或培养基中的细胞培养物或悬浮液形式提供，任选地冷冻以有助于运输或存储。
本发明的组合物可呈适用于治疗人类患者的调配物(例如无热原质或大体上无热原质且无病原体)形式。当施用时，用于本发明的医药制剂可呈无热原质、无病原体、生理学上可接受的形式。本发明的组合物可呈适于施用非人类兽医哺乳动物(例如犬、猫或马)的调配物形式。
本发明还包括不同的试剂系统，其包含在制造、分配或使用期间在任何时间存在的细胞的集合或组合。细胞集合包含两种或更多种本发明中描述的细胞群体(例如，CEC，例如成熟CEC)、其前体和亚型的任何组合以及未分化的干细胞、体细胞衍生的角膜内皮细胞或其它分化细胞类型。集合中的细胞群体有时共有相同的基因组或其经基因修饰的形式。
本发明涵盖例如自人类多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞、人类胚胎干细胞或其它多能干细胞)获得的CEC，例如成熟CEC的组合物可用于治疗任何前述疾病或病状。这些疾病可用包含不同成熟程度的CEC的CEC(例如，成熟CEC)的组合物以及富整合熟CEC的CEC的组合物治疗。
IV.角膜内皮细胞的施用方法
本发明的CEC，例如成熟CEC可通过任何适用于所治疗的疾病或病症的施用途径施用。在一个实施例中，本发明的CEC，例如成熟CEC可体表、全身或局部施用，例如通过注射，或作为装置或植入物(例如，持续释放型植入物)的一部分施用。举例来说，当治疗患有病症或疾病的患者时，可使用手术将本发明的CEC，例如成熟CEC移植至眼睛中，所述病症或疾病例如富克斯氏营养不良、虹膜角膜内皮综合征、后部多形性营养不良和先天性遗传性内皮营养不良，和可使用更换角膜内皮作为有效治疗的继发性疾病，包括角膜营养不良，或其中个体呈现引起大疱性角膜病变的角膜水肿的症状、其中个体患有由使用隐形眼镜或白内障手术引起的眼部损伤或其中个体考虑角膜移植，或黄斑变性、斯特格氏病(Stargardt'sdisease)和色素性视网膜炎。所属领域技术人员将能够确定用于所治疗的疾病或病症的施用途径。
本发明的CEC，例如成熟CEC可在药学上可接受的调配物中通过注射来递送。视本文中所描述的因素而定，用于注射的浓度可为有效且无毒的任何量。在一个实施例中，可向有需要的患者施用至少1×106、2×106、5×106、1×107、1×108或1×1010个CEC，例如成熟CEC。
包含本发明的药剂的产品和系统，例如递送媒剂，尤其调配为医药组合物的产品和系统，以及包含此类递送媒剂和/或系统的试剂盒，还设想为本发明的一部分。
在某些实施例中，本发明的治疗方法包括通过植入物或装置来施用本发明的CEC，例如成熟CEC的步骤。在某些实施例中，所述装置为用于治疗本文中所描述的疾病或病状的生物可侵蚀性植入物。
根据本文中所描述的方法施用的组合物的体积还取决于例如施用模式、角膜内皮细胞的数目、患者的年龄以及所治疗的疾病的类型和严重程度的因素。
通常将CEC，例如成熟CEC一次性递送至患者。在患者的整个寿命期间，可递送CEC，例如成熟CEC超过一次。在某些实施例中，在施用CEC，例如成熟CEC之前、同时或之后，还向患者施用免疫抑制疗法。在患者的整个生命中或在较短时段内，免疫抑制疗法可能为必需的。免疫抑制疗法的实例包括(但不限于)以下中的一或多个：抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、(抗IL-2Ra受体抗体)、环孢素(环孢素A)、/>(抗IL-2Ra受体抗体)、依维莫司、霉酚酸、(抗CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司(PrografTM)和霉酚酸酯(MMF)。
某些实施例中，将本发明的CEC，例如成熟CEC与药学上可接受的载剂一起调配。举例来说，CEC可单独或作为医药调配物的组分施用。CEC，例如成熟CEC可经调配以用于以人类医学的任何便利的方式施用。在某些实施例中，适用于肠胃外施用的医药组合物可包含CEC，例如成熟CEC与以下的组合：一或多种药学上可接受的无菌等张水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，或可在临用前复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、使调配物与所欲受体的血液等张的溶质或悬浮剂或增稠剂。可用于本发明的医药组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇和其类似物)和其适合的混合物。可例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
V.试剂盒
本文中还提供一种制品或试剂盒，其包含本发明的CEC，例如成熟CEC的群体(例如，成熟CEC群体)和/或医药组合物。制品或试剂盒可进一步包含药品说明书，其包含使用本发明的角膜内皮细胞群体或医药组合物例如治疗或延缓本文中所公开的任何疾病的进程的说明。制品或试剂盒可进一步包括自商业和用户观点来看所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的药品说明书。在一些实施例中，制品进一步包括一或多种其它药剂(例如，化学治疗剂)。本发明的角膜内皮细胞可与促进细胞粘附、移植和/或存活的药剂一起施用。本发明的CEC，例如成熟CEC可与ROCK抑制剂(例如，Y27632)和细胞外基质蛋白(例如，纤维结合蛋白)一起施用。本发明的CEC，例如成熟CEC可与一或多种抗细胞凋亡剂、消炎剂、抗氧化剂和细胞外基质蛋白(例如，纤维结合蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白的经截短的E8片段(例如，iMatrix 511)、胶原蛋白(I、II、III、IV、VIII型等)等一起施用。本发明的CEC，例如成熟CEC可与磁性珠粒或纳米粒子组合施用以促进CEC，例如成熟CEC的递送。
用于一或多种药剂的适合的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。
本文中所提及的所有公开案、专利申请案、专利案和其它参考文献皆以全文引用的方式并入本文中。在存在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅为说明性且不旨在为限制性。
实例
实例1：材料和方法
慢病毒制备：
使用pReceiver-Lv156(GeneCopoeia)作为慢病毒载体以在EF1α启动子下表达感兴趣的基因。慢病毒粒子使用宝日医生物技术(TakaraBio)(www.takarabio.com)研发的一系列产品产生。病毒的封装使用第四代慢病毒封装系统进行，所述系统由Lenti-X 293TCells(宝日医生物技术，目录号632180)和Lenti-X Packaging Single Shots(宝日医生物技术，目录号631275和631276)组成。病毒浓度和数量分别使用Lenti-XTMConcentrator(宝日医生物技术，目录号631231和631232)和Lenti-X qRT-PCR Titration Kit(宝日医生物技术，目录号631235)测定。Lenti-XTMConcentrator为一种试剂，将其与病毒混合以在离心之后制备经浓缩的病毒原料，随后使用Lenti-X qRT-PCR试剂盒测定实际复本数目慢病毒基因组(数量)，由此实际复本数目慢病毒基因组计算浓度。所有程序皆使用制造商推荐的方案进行。将病毒等分且存储在-80℃下直至使用。
干细胞培养物：
在涂布有iMatrix 511(宝日医T304)的6孔板上，将人类iPSC维持于StemFitBasic03培养基(味之素)中。将细胞在20％ O2/5％ CO2的条件下培养且通过用TrypLE-Select Enzyme(1x)(赛默飞世尔科技公司12563011)解离成单细胞来每4-7天传代一次。
角膜内皮细胞(CEC)分化方案：
以三个步骤自培养皿获得多能干细胞衍生的角膜内皮细胞。在第一步骤中，使用TrypLE-Select Enzyme(1x)(赛默飞世尔科技公司12563011)收集人类iPSC且以2×105个细胞/孔的密度涂布于预涂有iMatrix511的6孔板中。细胞用补充有10μM Y27632的StemFitBasic03培养基培养24小时，接着在不存在Y27632的情况下在StemFit Basic03培养基中再培养2天。在第二步骤中，通过在包含以下的培养基中培养来诱导神经脊细胞：DMEM/F-12(赛默飞世尔科技公司11330-032)、20％ KnockOutTMSerum Replacement(赛默飞世尔科技公司10828-028)、1％ MEM非必需氨基酸溶液(赛默飞世尔科技公司11140-050)、1％ L-谷氨酰胺(赛默飞世尔科技公司25030-081)、6ng/ml的重组人类FGF-碱性(派普泰克生物科技100-18B)、0.007％2-巯基乙醇、1mM SB431542(Stemgent公司04-0010-10)、0.5μg/ml的重组人类诺金(派普泰克生物科技120-10C-100UG)和1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔科技公司15140-122)。每隔一天补充培养基持续6天。在第三步骤中，将细胞在包含以下的成熟培养基中培养24小时：Opti-MEM I还原血清培养基(赛默飞世尔科技公司31985-070)、8％胎牛血清(海克隆SH30070.03)、200mg/L的氯化钙(西格玛-奥德里奇C5670-100G)、0.08％硫酸软骨素A(西格玛-奥德里奇C9819-5G)、10％牛垂体提取物(阿法埃莎公司J64417)、5ng/ml的表皮生长因子(西格玛-奥德里奇E9644-.2MG)、20μg/ml的抗坏血酸(西格玛-奥德里奇A4403-100MG)、10μM Y27632和1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔科技公司15140-122)。通过在相同培养基中用IV型胶原蛋白酶(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies)07909)处理来使细胞以1:9的比率传代。在传代之后24小时，将培养基更换成包含以下的培养基(成熟培养基3)：Opti-MEM I还原血清培养基(赛默飞世尔科技公司31985-070)、ITS补充剂(西格玛-奥德里奇I3146)、200mg/L的氯化钙(西格玛-奥德里奇C5670-100G)、0.08％硫酸软骨素A(西格玛-奥德里奇C9819-5G)、5ng/ml的表皮生长因子(西格玛-奥德里奇E9644-.2MG)、20μg/ml的NGF(派普泰克生物科技450-01)、20μg/ml的抗坏血酸(西格玛-奥德里奇A4403-100MG)和1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔科技公司15140-122)。每隔一天更换培养基持续21天以形成iPSC衍生的CEC。图1为分化方案的示意图。在d10进行角膜内皮祖细胞的慢病毒感染，接着在如本文中和例如图1中所描述的不同时间点获得样品以用于qPCR分析。D10时的细胞为诱导神经脊细胞分化后的细胞。不希望受理论约束，认为转导不限于在d10时进行。因此，可在替代性时间点进行转导。作为非限制性实例，可在D7与D20之间的时间点，例如D7、D8、D9、D10、D11、D12、D13、D14、D15、D16、D17、D18、D19和D20，或D7与D18之间，或D7与D17之间，或D7与D16之间，或D7与D15之间，D7与D14之间，D7与D13之间，或D7与D12之间，或D7与D11之间，D7与D10之间，或D7与D9之间，或在D7之前，例如D0、D1、D2、D3、D4、D5或D6进行转导，以成功地驱动CEC分化和成熟。
iPSC衍生的角膜内皮祖细胞的转导：
在分化过程中的d10，在成熟培养基3中，在存在聚凝胺(6μg/μl)的情况下，进行用编码转录因子的慢病毒粒子转导iPSC衍生的角膜内皮祖细胞。在转导之后两天，将培养基更换成具有或不具有嘌呤霉素(0.5μg/μl)的培养基。每隔一天更换培养基直至收集细胞溶解物以用于总RNA分离。
成熟角膜内皮细胞标记物的实时PCR分析：
使用RNeasy Micro试剂盒(凯杰，目录号#74004)分离来自iPSC衍生的CEC的总RNA，且用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔科技公司11754050)产生cDNA。使用Taqman探针(表7)和TaqMan Fast Advanced Master Mix(赛默飞世尔科技公司A44360)，用QuantStudio 7Flex机器(赛默飞世尔科技)进行实时定量PCR反应。通过deltaCt方法计算表达量，针对Pgk1(2-ΔCt)标准化。
表7
基因 标记物 TaqMan ID
SLC4A11 成熟CEC Hs00984689_g1
COL8A1 未成熟/成熟CEC(在未成熟和成熟CEC上表达) Hs00156669_m1
PITX2 前段发育中的TF(自POM阶段至成熟CEC期间表达) Hs04234069_Mh
FOXC1 前段发育中的TF(自POM阶段至成熟CEC期间表达) Hs00559473_s1
TFAP2B 前段发育中的TF(自POM阶段至成熟CEC期间表达) Hs01560931_m1
LMX1B 前段发育中的TF(自POM阶段至成熟CEC期间表达) Hs00158750_m1
眼周间质(POM)为对Pitx2和FoxC1呈阳性的神经脊细胞的亚群。
实例2：初生人类CEC中富集的转录因子同种型的鉴别
为了鉴别初生人类CEC中富集的转录因子特定同种型，自高通量基因表达数据(GSE41416)的综合基因表达(Gene Expression Omnibus；GEO)数据存储库下载由转录体分析产生的主体RNAseq数据。在DolphinNext服务器上针对人类基因组hg19比对FastQ文件。使用STAR-RSEM流水线，用生物信息方案进行读数的比对和列表。STAR映射器可在参考基因组上比对读数且RSEM可定量基因和转录物的表达量。获得各同种型的所预期的序列计数以及每百万转录物(transcripts per million；tpm)且获得同种型含量。接着，请求针对转录因子的表达量来查询样品。
在使用EBSeq软件进行的第二分析中，在将所有成人样品和所有胎儿样品分别分组至“成人”和“胎儿”组中之后和在针对测序深度标准化之后分析同种型。图5提供初生人类CEC中富集的本发明的特定转录因子的所有已知的同种型(主体RNAseq)。各细胞中的淡蓝色条柱的长度指示表达量。
实例3：分化iPSC衍生的CEC中的所引入的转录因子的表达
在分化的d10，用慢病毒(以与培养基呈1:10或1:50的体积比添加)转导如以上实例1中所描述产生的iPSC-CEC以用于所选择的转录因子同种型。PITX2(P)：NM_001204398和/或NM_000325，FOXC1(F)：NM_001453，TFAP2B(T)：NM_003221，LMX1B(L)：NM_002316。自分化的d12(在转导之后2天)进行嘌呤霉素(Puro)选择。通常在iPSC衍生的CEC分化的d21进行qPCR分析；然而，可自约d14至约d28，例如d14、d15、d16、d17、d18、d19、d20或d21进行分析。与在不存在所添加的转录因子的情况下用GFP和聚凝胺处理的对照细胞相比，所引入的转录因子(PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B)上调。所述上调在存在嘌呤霉素的情况下更显著(参见图2)。
实例4：在转录因子引入之后中期/晚期CEC标记物的诱导
在分化的d10，用如实例1中所描述的慢病毒转导如以上实例1中所描述产生的iPSC衍生的角膜内皮细胞以用于所选择的转录因子同种型。在iPSC衍生的CEC分化的d21进行qPCR分析；然而，可自约d14至约d28进行分析。与在不存在所添加的转录因子的情况下用GFP和聚凝胺处理的对照细胞相比，存在于未成熟(例如，角膜内皮祖细胞)和成熟CEC上的标记物Col8a1以及成熟CEC的标记物Slc4a11上调，且在存在嘌呤霉素的情况下发生上调的增加(图3)。与转录因子的组合无关地观测到类似的上调。PITX2为唯一的包括于所有所测试的转录因子组合中的转录因子，表明PITX2为上调中期至晚期CEC标记物(例如Col8a1和Slc4a11)以促进CEC成熟的关键转录因子。
实例5：多能干细胞衍生的包含增加的转录因子的表达的角膜内皮细胞的功能和形态分析
如实例1中详细描述，使用分化过程产生多能干细胞衍生的角膜内皮祖细胞。在针对成熟CEC分化的第10天，如实例1中所描述用慢病毒粒子转导多能干细胞衍生的CEC。接着，将细胞在成熟培养基中培养10天，如以上实例1中所描述。在细胞培养的第14天和第21天以及任选地，第28天收集细胞。根据如本文中所描述的所属领域中已知的方法进行泵送功能、屏障功能和对氧化应力的抗性的功能活性分析法。
可通过所属领域中已知的方法评估CEC(例如，成熟CEC)的泵送功能，例如米木拉等人,2004,眼科研究与视力学,45:9,第2992-2997页中所描述。为了测定衍生自多能干细胞或角膜内皮祖细胞的各自表达本发明的转录因子的成熟CEC的泵送功能的变化，与所培养的初生CEC(例如，人类)、未经修饰的角膜内皮祖细胞和/或未分化的细胞(多能干细胞、神经脊干细胞等)比较泵送功能。添加乌本苷(Na/K ATP酶抑制剂)将消除泵送功能，且允许评估存在/不存在泵送功能。
还可通过对氧化应力的抗性的水平来表征成熟CEC。可通过测量以下中的一或多个的数量来检测氧化应力和/或DNA损伤的水平：核DNA损伤病灶；p21Cip1的表达量、p16INK4a的表达量；细胞球蛋白的表达量、GPX-1蛋白质的表达量，和8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量。
对氧化应力的抗性还通过qPCR来测量，以测定氧化应力途径基因(NRF2、NOS2等)的表达量，和使用ROS生物标记物(例如硝基酪氨酸和CellRox(CellROXTMReagent VarietyPack，用于氧化应力检测，赛默飞世尔科技C1044)通过测量细胞中的反应性氧物质(ROS)含量来测量。通过所属领域中已知的方法评估对氧化应力的反应，例如古哈等人,2017,自然科学报告,4:4074(DOI:10.1038/s41598 -017-03654-4)中所描述。为了测定衍生自多能干细胞或角膜内皮祖细胞的各自表达本发明的转录因子的CEC(例如，成熟CEC)的对氧化应力的抗性的变化，与所培养的初生CEC(例如，人类)、未经修饰的角膜内皮祖细胞和/或未分化的细胞(多能干细胞、神经脊干细胞等)比较对氧化应力的抗性的水平。
此外，通过qPCR和免疫染色进行分析以确定CEC(例如，成熟CEC)是否表达指示角膜内皮细胞的标记物，包括Na+K+ATP酶泵、ZO-1和KLF13。此外，可分析使用如实例1中所描述的方法产生的CEC的血管内皮细胞标记物vWF和PECAM-1(CD31)的表达(通过qPCR和免疫染色来分析)，以区分CEC细胞与血管内皮细胞。如图6中所示，仅存在微量的vWF和CD31的RNA。
通过使用特征CEC形态(六边形或多边形形状和彼此紧密粘附)的相差显微图进行观测，分析使用如实例1和上文中所描述的方法产生的CEC。
实例6：成熟CEC的体内功效
本实例描述用于确定经移植的PSC衍生的成熟角膜内皮细胞的体内功效的实验。由符合GMP的临床生产设施产生临床级成熟多能干细胞衍生的角膜内皮细胞。在最终释放用于移植的成熟CEC悬浮液之前，对成熟CEC进行严格验证和质量控制。每批成熟CEC经历一系列质量控制安全性测试，包括针对无菌性、是否存在霉浆菌、是否存在内毒素、不存在多能干细胞和核型分析的测试。通过DNA指纹识别、适当的内皮形态和与CEC一致的标记物表达来确认一致性。关于包括特异性蛋白质的成熟CEC标记物(包括Na+K+ATP酶泵、ZO-1和KLF13)的可接受的水平和分布，通过免疫组织化学染色来测定纯度。此外，根据经验证的标准，通过qRT-PCR来表征各批料以说明hESC标记物(OCT-4、NANOG和SOX2)的下调以及成熟细胞标记基因(例如，PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B、LMX1B和MRGPRX3)的上调。
在非人类动物模型中使用根据本文中所描述的方法制备的成熟角膜内皮细胞，例如以确定用于人类用途的潜在安全性和/或功效。在非人类动物模型中使用细胞的医药组合物以评估CEC功能。适合的动物模型包括兔CEC刮擦模型(奥村等人,美国病理学杂志(Am.J.Pathol.),2012,181(1):268-277)或猴CEC刮擦模型(奥村等人,2016,科学报告(Scientific Reports),6:26113,DOI:10.1038/srep26113)。其它适用于本发明的模型包括啮齿动物模型，例如费氏角膜内皮营养不良的L450W和Q455K Col8a2基因嵌入小鼠模型(孟(Meng)等人,2013,眼科研究与视力学(Invest.Opthamol.Vis.Sci.)54(3):1887-189)和小鼠SLC4A11基因剔除模型(格罗格等人,2010,生物化学杂志(J.Biol.Chem.),285(19):14467)。
可以手术方式向非人类动物的眼睛施用细胞(例如，以片状物或悬浮液形式)。细胞还可呈球状物形式且以球状物形式施用。举例来说，成熟CEC组合物可用于兔模型中，如以下中的一或多个中所描述：本田(Honda)等人,眼科学文献(Arch Ophthalmol.)2009年10月；127(10):1321-6；比谷(Hitani)等人,分子视觉(Mol Vis.)2008年1月3日；14:1-9；三村(Mimura)等人,眼科研究与视力学(Invest Ophthalmol Vis Sci.)2005；46:3637-3644；Hsuie等人,移植2006；81:473-476；来(Lai)等人,移植2007；84:1222-1232；新村(Shimmura)等人,英国眼科学杂志(Br J Ophthalmol)2005；89:134-137；陈等人,分子视觉(Molecular Vision)2011；17:2148-2156；和戈斯波德罗维奇(Gospodrowicz)等人,美国国家科学研究院学报,第76卷,第1号,第464-468页,1979年1月；和/或可用于啮齿动物(例如，小鼠/大鼠)模型中，如上文和以下中所描述：林(Hayashi)等人,眼科研究与视力学(Investigative Ophthalmology&Visual Science),2009年7月,第50卷,第7号,第3151-3158页；三村等人,实验性眼研究(Experimental Eye Research)79(2004)231-237；查(Tchah),韩国医学科学杂志(J Korean Med Sci.)1992年12月；7(4):337-42；和/或可用于非人类灵长类动物模型中，如以下中所描述：小泉等人,眼科研究与视力学.2007；48:4519-4526)；小泉(Koizumi)等人,角膜(Cornea)2008；27(增刊1):S48-S55；和/或用于人类或非人类中，如佩(Peh)等人,移植.2011年4月27日；91(8):811-9中所描述。各前述公开案以全文引用的方式并入本文中。
针对移植至受体角膜上来评估以手术方式施用的经转导以表达可检测的标记物蛋白质(例如，GFP)的成熟人类CEC的体内功效，例如通过确认GFP表达和针对人类细胞核标记物进行免疫染色。评估在移植之后，供体成熟CEC的紧密连接区形成的功能标记物，例如ZO-1。可使用超声波测厚计(SP-3000；日本名古屋多美公司(Tomey,Nagoya,Japan))通过所属领域中已知的方法评估在施用成熟CEC后的角膜厚度(参见夏(Xia)等人,眼科研究与视力学)。可通过检测泵送功能的标记物(例如，SLC4A11、NA+/K+ATP酶和SLC4A4)来评估泵送功能。角膜内皮细胞(例如，成熟角膜内皮细胞)中可表达的其它与泵送功能相关的标记物包括Na+/K+ATP酶、AQP1、CA2、CA4、CA12、SCL14A2、SLC16A1、SLC16A3、SLC16A7、CFTR、NHE1、ADCY10、电压依赖性阴离子通道VDAC2和VDAC3、氯离子通道蛋白质CLCN2和CLC。还可通过所属领域中已知的方法评估CEC(例如，成熟CEC)的泵送功能，例如米木拉等人,2004,眼科研究与视力学,45:9,第2992-2997页中所描述。
将根据本文中所描述的方法制备的成熟角膜内皮细胞用于患者疗法中，例如以如下方式：(i)患者最初接受免疫抑制治疗(例如，类固醇)；(ii)将患者任选地分配至治疗组(例如，四个组，每组三名患者)；(iii)向各组施用递增剂量的细胞(优选以单侧方式，即，向各患者的一只眼睛)。在移植后监测各患者的临床过程，例如在移植后前6周内，且任选地在其它(先前或随后)的时间点进行监测，优选持续至少一年。患者的主要评估包括监测不良事件(AE)和剂量限制性毒性(DTL)，包括用于检测免疫介导的病理学、畸胎瘤形成和/或异常血管生长的分析法。还评估患者的次要终点，包括关于眼内压(IOP)、视力和/或移植物的内皮细胞计数的功效。长期随访优选持续长达15年或更长时间以评估长期作用。由于自初始患者群组获得令人满意的安全性数据，进行其它患者的单侧或双侧治疗。此外，可向初始单侧群组中的患者提供在先前未经治疗的角膜中接受疗法的机会。

Claims (224)

1.一种用于产生角膜内皮细胞的方法，所述方法包含增加角膜内皮祖细胞中的至少一种选自由PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2组成的群组的转录因子的表达，借此产生角膜内皮细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述角膜内皮细胞为成熟角膜内皮细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述转录因子为PITX2。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中PITX2为至少一种选自由以下组成的群组的PITX2的同种型：PITX2，同种型1；PITX2，同种型2；PITX2，同种型3；PITX2，同种型4；和PITX2，同种型5。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述转录因子为FOXC1。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述转录因子为TFAP2B。
7.根据权利要求1、2或6中任一权利要求所述的方法，其中TFAP2B为至少一种选自由以下组成的群组的TFAP2B的同种型：TFAP2B，同种型1；和TFAP2B，同种型2。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述转录因子为LMX1B。
9.根据权利要求1、2或8中任一权利要求所述的方法，其中LMX1B为至少一种选自由以下组成的群组的LMX1B的同种型：LMX1B，同种型1；LMX1B，同种型2；和LMX1B，同种型3。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述转录因子为POU6F2。
11.根据权利要求1、2或9中任一权利要求所述的方法，其中POU6F2为至少一种选自由以下组成的群组的POU6F2的同种型：POU6F2，同种型1；和POU6F2，同种型2。
12.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其进一步包含增加角膜内皮祖细胞中的一或多种选自由以下组成的群组的转录因子的表达：ATF4、ATMIN、BHLHE40、CEBPD、CSRNP1、DRAP1、EGR1、ELF2、EMX2、ESRRA、ETS2、FOS、FOSB、FOSL2、GTF3A、HIF1A、JUN、JUN B、JUN D、KLF10、KLF9、MBD3、NFE2L1、NME2、NR1D1、NR4A1、PA2G4、POU3F3、RELA、TBX2、TFDP1、TSC22D1、USF2、YBX1、ZNF207、ZNF358和ZNF395。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的方法，其中增加所述角膜内皮祖细胞中的所述至少一种转录因子的表达包含使所述角膜内皮祖细胞与所述至少一种转录因子接触。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮祖细胞包含表达载体，其包含编码所述至少一种转录因子的核酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达载体为病毒载体。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达载体为非病毒载体。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达载体为诱导型表达载体。
18.根据权利要求14至17中任一权利要求所述的方法，其中所述表达载体包含以可操作方式连接至编码所述至少一种转录因子的核酸的启动子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述启动子为内源性启动子。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述启动子为人工启动子。
21.根据权利要求18至20中任一权利要求所述的方法，其中所述启动子为诱导型启动子。
22.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的方法，其中增加所述角膜内皮祖细胞中的所述至少一种转录因子的表达包含用编码所述至少一种转录因子的病毒载体转导角膜内皮祖细胞。
23.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的方法，其中增加所述角膜内皮祖细胞中的所述至少一种转录因子的表达包含用编码所述至少一种转录因子的表达载体转染角膜内皮祖细胞。
24.根据权利要求1至23中任一权利要求所述的方法，其中在增加所述至少一种转录因子的表达之前，由所述角膜内皮祖细胞培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天。
25.根据权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中在增加所述至少一种转录因子的表达之后，将所述角膜内皮祖细胞培养至少10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
26.根据权利要求1至4或12至25中任一权利要求所述的方法，其中增加所述PITX2的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。
27.根据权利要求1、2、5或12至25中任一权利要求所述的方法，其中增加所述FOXC1的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
28.根据权利要求1、2、6、7或12至25中任一权利要求所述的方法，其中增加所述TFAP2B的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
29.根据权利要求1、2、8、9或12至25中任一权利要求所述的方法，其中增加所述LMX1B的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
30.根据权利要求1、2、10、11或12至25中任一权利要求所述的方法，其中增加所述POU6F2的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
31.根据权利要求1至30中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群组的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B、LMX1B和MRGPRX3。
32.根据权利要求1至31中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群组的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B和LMX1B。
33.根据权利要求1至32中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加的一或多种选自由以下组成的群组的标记物的表达：COL8A1、COL8A2、SLC4A11和MRGPRX3。
34.根据权利要求31至33中任一权利要求所述的方法，其中所述增加的一或多种标记物的表达包含相对于角膜内皮祖细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。
35.根据权利要求1至34中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现降低的NGFR、SOX10、HNK1、SSEA4、NANOG、OCT4、vWF和/或CD31的表达。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述降低的NGFR、SOX10、HNK1、SSEA4、NANOG、OCT4、vWF和/或CD31的表达包含相对于角膜内皮祖细胞降低至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍或4倍。
37.根据权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现以下各项中的一或多者：增加的泵送功能、增强的紧密接合区形成、增加的对氧化应力的抗性和增加的多边形形态。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述增加的泵送功能、增强的紧密接合区形成、增加的对氧化应力的抗性和增加的多边形形态包含相对于角膜内皮祖细胞增加至少5％、10％、15％、20％或25％。
39.根据权利要求1至38中任一权利要求所述的方法，其中增加所述至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的总转录本朝向角膜内皮细胞的总转录本偏移至少1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。
40.根据权利要求1至39中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮祖细胞衍生自多能干细胞。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
42.根据权利要求1至41中任一权利要求所述的方法，其中诱导所述角膜内皮祖细胞中的所述至少一种转录因子的表达包含使用编码所述至少一种转录因子的基因开关构建体。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述基因开关构建体为转录基因开关构建体。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述基因开关构建体为转录后基因开关构建体。
45.一种产生多能干细胞衍生的角膜内皮细胞的方法，所述方法包含：
(a)培养多能干细胞和诱导角膜内皮祖细胞的形成，其中所述多能干细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码至少一种选自由以下组成的群组的转录因子的核酸：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2，和
(b)增加所述角膜内皮祖细胞中来自所述表达载体的所述至少一种转录因子的表达，借此产生角膜内皮细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述角膜内皮细胞为成熟角膜内皮细胞。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述多能干细胞为胚胎干细胞。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述多能干细胞为诱导性多能干细胞。
49.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述转录因子为PITX2。
50.根据权利要求45、46或49中任一权利要求所述的方法，其中所述PITX2为至少一种选自由以下组成的群组的PITX2的同种型：PITX2，同种型1；PITX2，同种型2；PITX2，同种型3；PITX2，同种型4；和PITX2，同种型5。
51.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述转录因子为FOXC1。
52.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述转录因子为TFAP2B。
53.根据权利要求45、46或52中任一权利要求所述的方法，其中TFAP2B为至少一种选自由以下组成的群组的TFAP2B的同种型：TFAP2B，同种型1；和TFAP2B，同种型2。
54.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述转录因子为LMX1B。
55.根据权利要求45、46或54中任一权利要求所述的方法，其中LMX1B为至少一种选自由以下组成的群组的LMX1B的同种型：LMX1B，同种型1；LMX1B，同种型2；和LMX1B，同种型3。
56.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述转录因子为POU6F2。
57.根据权利要求45、46或56中任一权利要求所述的方法，其中POU6F2为至少一种选自由以下组成的群组的POU6F2的同种型：POU6F2，同种型1；和POU6F2，同种型2。
58.根据权利要求45至57中任一权利要求所述的方法，其进一步包含增加一或多种选自由以下组成的群组的转录因子的表达：ERG、ATF4、ATMIN、BHLHE40、CEBPD、CSRNP1、DRAP1、EGR1、ELF2、EMX2、ESRRA、ETS2、FOS、FOSB、FOSL2、GTF3A、HIF1A、JUN、JUNB、JUND、KLF10、KLF9、MBD3、NFE2L1、NME2、NR1D1、NR4A1、PA2G4、POU3F3、RELA、TBX2、TFDP1、TSC22D1、USF2、YBX1、ZNF207、ZNF358和ZNF395。
59.根据权利要求45至48中任一权利要求所述的方法，其中所述表达载体为病毒载体。
60.根据权利要求45至48中任一权利要求所述的方法，其中所述表达载体为非病毒载体。
61.根据权利要求45至60中任一权利要求所述的方法，其中所述表达载体为诱导型表达载体。
62.根据权利要求45至61中任一权利要求所述的方法，其中所述表达载体包含以可操作方式连接至编码所述至少一种转录因子的核酸的启动子。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述启动子为内源性启动子。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述启动子为人工启动子。
65.根据权利要求62至64中任一权利要求所述的方法，其中所述启动子为诱导型启动子。
66.根据权利要求45至65中任一权利要求所述的方法，其中增加所述角膜内皮祖细胞中所述至少一种转录因子的表达包含诱导所述角膜内皮祖细胞中所述至少一种转录因子的表达。
67.根据权利要求66所述的方法，其中诱导所述角膜内皮祖细胞中所述至少一种转录因子的表达包含使用编码所述至少一种转录因子的基因开关构建体。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述基因开关构建体为转录基因开关构建体。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述基因开关构建体为转录后基因开关构建体。
70.根据权利要求45至59和61至69中任一权利要求所述的方法，其中用编码所述至少一种转录因子的病毒载体转导所述多能干细胞。
71.根据权利要求45至58和60至69中任一权利要求所述的方法，其中用编码所述至少一种转录因子的表达载体转染所述多能干细胞。
72.根据权利要求45所述的方法，其中步骤(a)包含由所述多能干细胞与小型/母体抗果蝇皮肤生长因子(SMAD)蛋白质信号传导的至少一种抑制剂一起培养以诱导所述多能干细胞分化成角膜内皮祖细胞。
73.根据权利要求42至68中任一权利要求所述的方法，其中在增加所述至少一种转录因子的表达之前，将所述角膜内皮祖细胞培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天。
74.根据权利要求45至72中任一权利要求所述的方法，其中在增加所述至少一种转录因子的表达之后，将所述角膜内皮祖细胞培养至少8、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
75.根据权利要求45至50和58至74中任一权利要求所述的方法，其中增加所述PITX2的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
76.根据权利要求45至48、51和58至74中任一权利要求所述的方法，其中增加所述FOXC1的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
77.根据权利要求45至48、52、53和58至74中任一权利要求所述的方法，其中增加所述TFAP2B的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
78.根据权利要求45至48、54至55和58至74中任一权利要求所述的方法，其中增加所述LMX1B的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
79.根据权利要求45至48和56至74中任一权利要求所述的方法，其中增加所述POU6F2的表达包含相对于所述角膜内皮祖细胞中的POU6F2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
80.根据权利要求45至79中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加一或多种选自由以下组成的群组的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B、LMX1B和MRGPRX3。
81.根据权利要求45至80中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加一或多种选自由以下组成的群组的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B和LMX1B。
82.根据权利要求45至81中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加一或多种选自由以下组成的群组的标记物的表达：COL8A1、COL8A2、SLC4A11和MRGPRX3。
83.根据权利要求80至82中任一权利要求所述的方法，其中所述增加的一或多种标记物的表达包含相对于角膜内皮祖细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。
84.根据权利要求45至83中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现降低的NGFR、SOX10、HNK1、SSEA4、NANOG、OCT4、vWF和/或CD31的表达。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述降低的NGFR、SOX10、HNK1、SSEA4、NANOG、OCT4、vWF和/或CD31的表达包含相对于角膜内皮祖细胞降低至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍或4倍。
86.根据权利要求45至85中任一权利要求所述的方法，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现以下各项中的一或多者：增加的泵送功能、增强的紧密接合区形成、增加对氧化应力的抗性和增加的多边形形态。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述增加的泵送功能、增强的紧密接合区形成、增加对氧化应力的抗性和增加的多边形形态包含相对于角膜内皮祖细胞增加至少5％、10％、15％、20％或25％。
88.根据权利要求45至87中任一权利要求所述的方法，其中增加所述至少一种转录因子的表达使角膜内皮祖细胞的总转录本朝向角膜内皮细胞的总转录本偏移至少1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。
89.一种角膜内皮细胞群体，其通过根据权利要求45至88中任一权利要求所述的方法产生。
90.一种医药组合物，其包含通过根据权利要求1至89中任一权利要求所述的方法产生的角膜内皮细胞群体和药学上可接受的载剂。
91.一种角膜内皮细胞群体，其包含相对于所述角膜内皮细胞群体中的转录因子的内源性表达量增加至少一种选自由以下组成的群组的转录因子的表达量；PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
92.根据权利要求91所述的角膜内皮细胞群体，其中所述角膜内皮细胞为成熟角膜内皮细胞。
93.根据权利要求91或92所述的角膜内皮细胞群体，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加一或多种选自由以下组成的群组的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B、LMX1B和MRGPRX3。
94.根据权利要求91至93中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加一或多种选自由以下组成的群组的标记物的表达：PITX2、SLC4A11、FOXC1、COL8A1、COL8A2、TFAP2B和LMX1B。
95.根据权利要求91至94中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述角膜内皮细胞相对于角膜内皮祖细胞呈现增加一或多种选自由以下组成的群组的标记物的表达：COL8A1、COL8A2、SLC4A11和MRGPRX3。
96.根据权利要求91至95中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述增加的表达包含所述至少一种转录因子的外源性表达。
97.根据权利要求91至96中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述角膜内皮细胞包含表达载体，其包含编码所述至少一种转录因子的核酸。
98.根据权利要求97所述的角膜内皮细胞群体，其中所述表达载体为病毒载体。
99.根据权利要求98所述的角膜内皮细胞群体，其中所述病毒载体选自由以下组成的群组：腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、仙台病毒载体和逆转录病毒载体。
100.根据权利要求97所述的角膜内皮细胞群体，其中所述表达载体为非病毒载体。
101.根据权利要求100所述的角膜内皮细胞群体，其中所述非病毒载体选自由以下组成的群组：质粒DNA、线性双链DNA(dsDNA)、线性单链DNA(ssDNA)、纳米质粒、微型环DNA、单链寡脱氧核苷酸(ssODN)、DDNA寡核苷酸、单链mRNA(ssRNA)、和双链mRNA(dsRNA)。
102.根据权利要求100至101中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述非病毒载体包含裸核酸、脂质体、树枝状聚合物、纳米粒子、脂质-聚合物系统、固体脂质纳米粒子、和/或脂质体鱼精蛋白/DNA脂质复合物(LPD)。
103.根据权利要求97所述的角膜内皮细胞群体，其中所述表达载体为诱导型表达载体。
104.根据权利要求97至103中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述表达载体包含以可操作方式连接至编码所述至少一种转录因子的核酸的启动子。
105.根据权利要求104所述的角膜内皮细胞群体，其中所述启动子为内源性启动子。
106.根据权利要求104所述的角膜内皮细胞群体，其中所述启动子为人工启动子。
107.根据权利要求104至106中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述启动子为诱导型启动子。
108.根据权利要求91至107中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述转录因子为PITX2。
109.根据权利要求108所述的角膜内皮细胞群体，其中所述增加的PITX2的表达包含相对于所述角膜内皮细胞群体中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
110.根据权利要求91至107中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述转录因子为FOXC1。
111.根据权利要求110所述的角膜内皮细胞群体，其中所述增加的FOXC1的表达包含相对于所述角膜内皮细胞群体中的FOXC1的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
112.根据权利要求91至107中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述转录因子为TFAP2B。
113.根据权利要求112所述的角膜内皮细胞群体，其中所述增加的TFAP2B的表达包含相对于所述角膜内皮细胞群体中的TFAP2B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
114.根据权利要求91至107中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述转录因子为LMX1B。
115.根据权利要求114所述的角膜内皮细胞群体，其中所述增加的LMX1B的表达包含相对于所述角膜内皮细胞群体中的LMX1B的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
116.根据权利要求91至107中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述转录因子为POU6F2。
117.根据权利要求116所述的角膜内皮细胞群体，其中所述增加的POU6F2的表达包含相对于所述角膜内皮细胞群体中的PITX2的内源性表达量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。
118.根据权利要求91至117中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述角膜内皮细胞群体为成熟角膜内皮细胞群体。
119.根据权利要求91至117中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述角膜内皮细胞衍生自多能干细胞。
120.根据权利要求119所述的角膜内皮细胞群体，其中所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
121.根据权利要求91至120中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体，其中所述角膜内皮细胞群体包含至少106个角膜内皮细胞。
122.一种多能干细胞，其包含表达载体，所述表达载体包含编码至少一种选自由以下组成的群组的转录因子的核酸：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
123.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中所述表达载体为病毒载体。
124.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中所述表达载体为非病毒载体。
125.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中所述表达载体为诱导型表达载体。
126.根据权利要求122至125中任一权利要求所述的多能干细胞，其中所述表达载体包含以可操作方式连接至编码所述至少一种转录因子的核酸的启动子。
127.根据权利要求126所述的多能干细胞，其中所述启动子为内源性启动子。
128.根据权利要求126所述的多能干细胞，其中所述启动子为人工启动子。
129.根据权利要求126至128中任一权利要求所述的多能干细胞，其中所述启动子为诱导型启动子。
130.根据权利要求122至129中任一权利要求所述的多能干细胞，其中所述多能干细胞包含编码所述至少一种转录因子的基因开关构建体。
131.根据权利要求130所述的角膜内皮细胞的多能干细胞，其中所述基因开关构建体为转录基因开关构建体。
132.根据权利要求130所述的多能干细胞，其中所述基因开关构建体为转录后基因开关构建体。
133.一种角膜内皮细胞，其包含表达载体，所述表达载体包含编码至少一种选自由以下组成的群组的转录因子的核酸：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
134.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中所述角膜内皮细胞为成熟角膜内皮细胞。
135.根据权利要求133或134中任一权利要求所述的角膜内皮细胞，其中所述表达载体为病毒载体。
136.根据权利要求133或134中任一权利要求所述的角膜内皮细胞，其中所述表达载体为非病毒载体。
137.根据权利要求133或134中任一权利要求所述的角膜内皮细胞，其中所述表达载体为诱导型表达载体。
138.根据权利要求133至137中任一权利要求所述的角膜内皮细胞，其中所述表达载体包含以可操作方式连接至编码所述至少一种转录因子的核酸的启动子。
139.根据权利要求138所述的角膜内皮细胞，其中所述启动子为内源性启动子。
140.根据权利要求138所述的角膜内皮细胞，其中所述启动子为人工启动子。
141.根据权利要求138至140中任一权利要求所述的角膜内皮细胞，其中所述启动子为诱导型启动子。
142.根据权利要求133至141中任一权利要求所述的角膜内皮细胞，其中所述多能干细胞包含编码所述至少一种转录因子的基因开关构建体。
143.根据权利要求142所述的角膜内皮细胞的角膜内皮细胞，其中所述基因开关构建体为转录基因开关构建体。
144.根据权利要求142所述的角膜内皮细胞，其中所述基因开关构建体为转录后基因开关构建体。
145.一种医药组合物，其包含根据权利要求89所述的角膜内皮细胞群体、根据权利要求91至121中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体、或根据权利要求133至144中任一权利要求所述的角膜内皮细胞和药学上可接受的载剂。
146.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的根据权利要求89所述的角膜内皮细胞群体、根据权利要求91至121中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体、根据权利要求133至144中任一权利要求所述的角膜内皮细胞、或根据权利要求145所述的医药组合物，借此治疗所述个体中的疾病。
147.根据权利要求144所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的群组：富克斯氏营养不良、虹膜角膜内皮综合征、后部多形性营养不良、先天性遗传性内皮营养不良、角膜营养不良、和角膜移植中的晚期内皮衰竭。
148.一种治疗有需要的个体的方法，其中所述个体呈现引起大疱性角膜病变的角膜水肿的症状，其中所述个体患有由使用隐形眼镜或白内障手术引起的眼部损伤或其中所述个体患有持续性手术创伤，所述方法包含向所述个体施用有效量的根据权利要求89所述的成熟角膜内皮细胞群体、根据权利要求92至121中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体、根据权利要求133至144中任一权利要求所述的角膜内皮细胞、或根据权利要求145所述的医药组合物，借此治疗所述个体。
149.一种试剂盒，其包含根据权利要求89所述的成熟角膜内皮细胞群体、根据权利要求91至121中任一权利要求所述的角膜内皮细胞群体、根据权利要求133至144中任一权利要求所述的角膜内皮细胞、或根据权利要求145所述的医药组合物。
150.一种试剂盒，其包含表达载体，所述表达载体包含编码至少一种选自由以下组成的群组的转录因子的核酸：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
151.一种试剂盒，其包含至少一种选自由以下组成的群组的转录因子：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2。
152.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达载体包含自我裂解序列。
153.根据权利要求45所述的方法，其中所述表达载体包含自我裂解序列。
154.一种产生多能干细胞衍生的角膜内皮细胞的方法，所述方法包含：
(a)培养多能干细胞和诱导形成神经脊干细胞，其中所述多能干细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码至少一种选自由以下组成的群组的转录因子的核酸：PITX2、FOXC1、TFAP2B、LMX1B和POU6F2，和
(b)增加神经脊干细胞中来自所述表达载体的至少一种转录因子的表达，借此产生角膜内皮细胞。
155.根据权利要求1所述的方法，其中PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
156.根据权利要求1所述的方法，其中FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
157.根据权利要求1所述的方法，其中TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
158.根据权利要求1所述的方法，其中LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
159.根据权利要求1所述的方法，其中POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
160.根据权利要求45所述的方法，其中PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
161.根据权利要求45所述的方法，其中FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
162.根据权利要求45所述的方法，其中TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
163.根据权利要求45所述的方法，其中LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
164.根据权利要求45所述的方法，其中POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
165.根据权利要求91所述的群体，其中PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
166.根据权利要求91所述的群体，其中FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
167.根据权利要求91所述的群体，其中TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
168.根据权利要求91所述的群体，其中LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
169.根据权利要求91所述的群体，其中POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
170.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
171.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
172.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
173.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQIDNO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
174.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQIDNO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
175.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQIDNO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
176.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
177.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
178.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
179.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
180.根据权利要求150所述的试剂盒，其中PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
181.根据权利要求150所述的试剂盒，其中FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
182.根据权利要求150所述的试剂盒，其中TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
183.根据权利要求150所述的试剂盒，其中LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
184.根据权利要求150所述的试剂盒，其中POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ IDNO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
185.根据权利要求154所述的方法，其中PITX2包含与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
186.根据权利要求154所述的方法，其中FOXC1包含与由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
187.根据权利要求154所述的方法，其中TFAP2B包含与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
188.根据权利要求154所述的方法，其中LMX1B包含与由SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
189.根据权利要求154所述的方法，其中POU6F2包含与由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:13的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
190.根据权利要求1所述的方法，其中PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53.191中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
191.根据权利要求1所述的方法，其中FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
192.根据权利要求1所述的方法，其中TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
193.根据权利要求1所述的方法，其中LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
194.根据权利要求1所述的方法，其中POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
195.根据权利要求45所述的方法，其中PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
196.根据权利要求45所述的方法，其中FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
197.根据权利要求45所述的方法，其中TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
198.根据权利要求45所述的方法，其中LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
199.根据权利要求45所述的方法，其中POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
200.根据权利要求91所述的群体，其中PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:52中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
201.根据权利要求91所述的群体，其中FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
202.根据权利要求91所述的群体，其中TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
203.根据权利要求91所述的群体，其中LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
204.根据权利要求91所述的群体，其中POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
205.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ IDNO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
206.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
207.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
208.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ IDNO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
209.根据权利要求122所述的多能干细胞，其中POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQIDNO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
210.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQIDNO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
211.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
212.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
213.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQIDNO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
214.根据权利要求133所述的角膜内皮细胞，其中POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQIDNO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
215.根据权利要求150所述的试剂盒，其中PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ IDNO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
216.根据权利要求150所述的试剂盒，其中FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
217.根据权利要求150所述的试剂盒，其中TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
218.根据权利要求150所述的试剂盒，其中LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
219.根据权利要求150所述的试剂盒，其中POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
220.根据权利要求154所述的方法，其中PITX2包含与SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:53中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
221.根据权利要求154所述的方法，其中FOXC1包含与SEQ ID NO:54中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
222.根据权利要求154所述的方法，其中TFAP2B包含与SEQ ID NO:55中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
223.根据权利要求154所述的方法，其中LMX1B包含与SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:58中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
224.根据权利要求154所述的方法，其中POU6F2包含与SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:60中所阐述的氨基酸序列中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致的氨基酸序列。
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Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3421217A (en) 1967-06-29 1969-01-14 Schick Electric Inc Hair receptacle for electric shaver
US5166048A (en) 1981-03-02 1992-11-24 Soll David B Protection of human corneal endothelial cells
US4678783B1 (en) 1983-11-04 1995-04-04 Asahi Chemical Ind Substituted isoquinolinesulfonyl compounds
US4959319A (en) 1985-08-01 1990-09-25 Skelnik Debra L Process of corneal enhancement
US5269812A (en) 1986-05-16 1993-12-14 White Thomas C Methods and devices employed in replacement of the corneal endothelium
GB2197915B (en) 1986-11-19 1990-11-14 Rolls Royce Plc Improvements in or relating to fluid bearings
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
WO1992002247A1 (en) 1990-08-01 1992-02-20 Chiron Ophthalmics, Inc. Method for treating corneal endothelial wounds
PL169576B1 (pl) 1990-10-12 1996-08-30 Max Planck Gesellschaft Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej PL PL
US5486359A (en) 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
EP0652965A1 (en) 1992-07-27 1995-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
US5703047A (en) 1992-09-21 1997-12-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and treatments for corneal healing with growth factors
US5589451A (en) 1992-09-21 1996-12-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and treaments for corneal healing with hepatocyte and keratinocyte growth factors
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
US5755785A (en) 1994-08-12 1998-05-26 The University Of South Florida Sutureless corneal transplantation method
US5649944A (en) 1994-08-12 1997-07-22 Collins; Joseph Patrick Apparatus for preparing cornea material for tabbed (sutureless) transplantation
US5584881A (en) 1994-08-12 1996-12-17 Rowsey; J. James Sutureless corneal transplantation apparatus and method
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US7410773B2 (en) 1995-02-02 2008-08-12 Ghazi Jaswinder Dhoot Method of preparing an undifferentiated cell
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US5686414A (en) 1995-11-14 1997-11-11 Xoma Corporation Methods of treating conditions associated with corneal transplantation
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
EP0931158A1 (en) 1996-09-06 1999-07-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
WO1999010376A1 (en) 1997-08-22 1999-03-04 Washington University Inducible regulatory system and use thereof
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
WO1999020620A1 (fr) 1997-10-22 1999-04-29 Nippon Shinyaku Co Ltd Derive d'isoquinoleine et medicament
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
ATE324362T1 (de) 1998-05-25 2006-05-15 Santen Pharmaceutical Co Ltd Neue vinylbenzolderivate
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
PT1137798E (pt) 1998-12-07 2009-02-20 Univ Duke Método de isolamento de células estaminais
AUPQ147799A0 (en) 1999-07-07 1999-07-29 Medvet Science Pty. Ltd. Mesenchymal precursor cell
US7015037B1 (en) 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
WO2002002147A2 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Isolation of a cell-specific internalizing peptide that infiltrates tumor tissue for targeted drug delivery
US20030082561A1 (en) 2000-07-21 2003-05-01 Takashi Sera Zinc finger domain recognition code and uses thereof
AR035792A1 (es) 2001-03-23 2004-07-14 Bayer Corp Compuestos de n-(4-quinazolinil)-n-(1h-indazol-5-il) amina, inhibidor de la rho-quinasa, su uso para la fabricacion de un medicamento y metodo para prepararlo
US20030125344A1 (en) 2001-03-23 2003-07-03 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
WO2002100833A1 (fr) 2001-06-12 2002-12-19 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Inhibiteurs de rho kinase
US20030211603A1 (en) 2001-08-14 2003-11-13 Earp David J. Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells
WO2003059913A1 (en) 2002-01-10 2003-07-24 Bayer Healthcare Ag Roh-kinase inhibitors
ATE381557T1 (de) 2002-01-23 2008-01-15 Bayer Pharmaceuticals Corp Rho-kinase inhibitoren
US20050214259A1 (en) 2002-04-30 2005-09-29 Yoichiro Sano Corneal endothelium-like sheet and method of constructing the same
DE10224242A1 (de) 2002-05-29 2003-12-11 Max Delbrueck Centrum Frog Prince, ein Transposonvektor für den Gentransfer bei Wirbeltieren
EP1541559A4 (en) 2002-07-22 2007-08-22 Asahi Kasei Pharma Corp 5-SUBSTITUTED ISOQUINOLINE DERIVATIVE
US7422736B2 (en) 2002-07-26 2008-09-09 Food Industry Research And Development Institute Somatic pluripotent cells
CA2400996A1 (en) 2002-09-03 2004-03-03 Lisa Mckerracher 1,4-substituted cyclohexane derivatives
US8642338B2 (en) 2003-02-06 2014-02-04 Cellseed Inc. Anterior ocular segment related cell sheets, three-dimensional structures, and processes for producing the same
EP1600177B1 (en) 2003-02-20 2016-05-25 Cellseed Inc. Endothelial cell sheet for cornea regeneration, method of producing the same and method of using the same
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7300654B2 (en) 2003-05-28 2007-11-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating corneal transplant rejection in high risk keratoplasty patients
EP1626989A2 (en) 2003-05-28 2006-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating corneal transplant rejection by using vegf antagonists
US7160894B2 (en) 2003-06-06 2007-01-09 Asahi Kasei Pharma Corporation Tricyclic compound
EP1644365A2 (en) 2003-07-02 2006-04-12 Biofocus Discovery Ltd Pyrazine and pyridine derivatives as rho kinase inhibitors
US7147648B2 (en) 2003-07-08 2006-12-12 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Device for cutting and holding a cornea during a transplant procedure
US20050182061A1 (en) 2003-10-02 2005-08-18 Jeremy Green Phthalimide compounds useful as protein kinase inhibitors
EP1689393A4 (en) 2003-10-06 2008-12-17 Glaxo Group Ltd PREPARATION OF 1,7-DISUBSTITUTED AZABENZIMIDAZOLES AS KINASE INHIBITORS
US7547779B2 (en) 2003-10-06 2009-06-16 Glaxo Group Limited Preparation of 1,6-disubstituted azabenzimidazoles as kinase inhibitors
JP2007507549A (ja) 2003-10-06 2007-03-29 グラクソ　グループ　リミテッド キナーゼ阻害剤としての１，６，７−三置換アザベンゾイミダゾールの調製
JP2007509643A (ja) 2003-10-10 2007-04-19 ゲ・ミン・ルイ 角膜内皮および関連細胞のバイオポリマー上での増殖のための方法および組成物ならびに人工角膜移植片の作成
AU2004282525B2 (en) 2003-10-10 2010-09-23 Cellular Bioengineering, Inc. Human corneal endothelial cells and methods of obtaining and culturing cells for corneal cell transplantation
CN1863779B (zh) 2003-10-15 2010-05-05 宇部兴产株式会社 吲唑衍生物
JP2007008816A (ja) 2003-10-15 2007-01-18 Ube Ind Ltd 新規イソキノリン誘導体
JP2007015928A (ja) 2003-10-15 2007-01-25 Ube Ind Ltd 新規オレフィン誘導体
US7087369B2 (en) 2003-12-17 2006-08-08 The Regents Of The University Of California Cornea preservation medium
JP2007523202A (ja) 2004-02-24 2007-08-16 ビオアクソン・テラプティーク・インコーポレーテッド ４置換ピペリジン誘導体
CN101014597A (zh) 2004-04-02 2007-08-08 沃泰克斯药物股份有限公司 可用作rock和其他蛋白激酶抑制剂的吖吲哚
MX2007002389A (es) 2004-09-08 2009-02-12 Wisconsin Alumni Res Found Cultivo de celulas progenitoras embrionarias humanas.
AU2005304978A1 (en) 2004-11-04 2006-05-18 Advanced Cell Technology, Inc. Derivation of embryonic stem cells
US7893315B2 (en) 2004-11-04 2011-02-22 Advanced Cell Technology, Inc. Derivation of embryonic stem cells and embryo-derived cells
EP1829876A4 (en) 2004-11-26 2009-04-01 Asahi Kasei Pharma Corp NITROGENIC TRICYCLIC COMPOUND
WO2006092894A1 (ja) 2004-12-09 2006-09-08 Shiro Amano ヒト角膜内皮細胞由来の前駆細胞、細胞凝集体及びそれら作製方法、並びに前駆細胞および細胞凝集体の移植方法
US9999497B2 (en) 2005-01-31 2018-06-19 Yichieh Shiuey Corneal implants and methods and systems for placement
JP2008538752A (ja) 2005-04-12 2008-11-06 クレオ コスメティック アンド ファーマスーティカルカンパニー エルエルシー 角膜組織を生体外保存するための組成物および方法
KR101149954B1 (ko) 2005-08-30 2012-06-01 아사히 가세이 파마 가부시키가이샤 술폰아미드 화합물
CN101384704B (zh) 2005-10-12 2012-02-08 细胞生物工程公司 可再吸收的角膜扣状体
JP5255846B2 (ja) 2006-01-19 2013-08-07 千寿製薬株式会社 生体内で細胞増殖可能な角膜内皮製剤
US20080050423A1 (en) 2006-08-23 2008-02-28 National Tsing Hua University Biopolymer-bioengineered cell sheet construct
RU2474434C2 (ru) 2007-08-29 2013-02-10 Сэндзю Фармасьютикал Ко., Лтд. Средство для содействия адгезии роговичных эндотелиальных клеток
WO2009058958A2 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Lipoxin a4 protection for cornea endothelial cells
EP2280676A2 (en) 2008-04-25 2011-02-09 The Regents of the University of California Device to store and inject corneal graft
WO2008155748A2 (en) 2008-09-04 2008-12-24 Massimo Busin A new technique for preparing, storing and transplanting endothelial grafts
US8642334B2 (en) 2009-02-17 2014-02-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
WO2010099310A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Wake Forest University Health Sciences Endothelial scaffolds
CA3205636A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Beta-2 microglobulin-deficient cells
US9752118B2 (en) 2011-12-06 2017-09-05 Astellas Institute For Regenerative Medicine Method of directed differentiation producing corneal endothelial cells from neural crest stem cells by PDGFB and DKK2, compositions thereof, and uses thereof
PL2838548T3 (pl) 2012-04-17 2024-02-05 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Komórki z niedoborem hla klasy ii, komórki z niedoborem hla klasy i, zdolne do ekspresji białek hla klasy ii i ich zastosowania
US20200063105A1 (en) * 2017-05-01 2020-02-27 President And Fellows Of Harvard College Transcription factors controlling differentiation of stem cells
JP6758631B2 (ja) * 2017-06-19 2020-09-23 国立大学法人大阪大学 角膜内皮細胞マーカー及びその利用
IL277914B1 (en) 2018-04-11 2024-03-01 Precise Bio 3D Ltd Corneal implant and biotechnological methods for its preparation

Also Published As

Publication number Publication date
BR112023021993A2 (pt) 2024-02-20
CA3216719A1 (en) 2022-11-10
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