JP2012524727A - 幹細胞を調節するための組成物および方法ならびにその使用 - Google Patents

幹細胞を調節するための組成物および方法ならびにその使用 Download PDF

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Abstract

幹細胞の分裂決定、特に分裂対称性を調節するための組成物および方法が提供される。ｗｎｔ７ａは、平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路を活性化し、それによって幹細胞の対称的な増大を促進するために、成体幹細胞、たとえばサテライト幹細胞の表面上に発現されるｆｒｉｚｚｌｅｄ−７受容体を通して作用することが実証された。本発明の組成物および方法は、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて幹細胞分裂対称性を調節する際に、幹細胞プールを補充し、かつ増大させる際に、ならびに組織の形成、維持、修復、および再生を促進する際に有用である。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００９年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／１７２，８３２号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、一般に、幹細胞、特に幹細胞の分裂対称性を調節するための組成物および方法ならびにその使用に関する。
発明の背景
幹細胞は、多数の特殊化した細胞型の、最終的に最終分化細胞の元となることができる未分化のまたは未成熟の細胞である。ほとんどの成体幹細胞は、系列限定的であり、一般に、それらの組織起源によって称される。他の細胞と異なり、幹細胞は、生物の一生にわたって、必要とされる場合に、成熟細胞型の事実上無限の供給を生み出すことができるように、それら自体を再生することができる。自己再生のためのこの性能により、幹細胞は、組織の形成、再生、修復、および維持に治療上有用である。自己再生を確実にするために、幹細胞は、２つのタイプの細胞分裂を受ける。対称性の分裂は、２つの同一の娘細胞の元となり、両者とも、幹細胞特性を備え、幹細胞集団の増大に至る。他方、非対称性の分裂は、１つの幹細胞および限られた自己再生潜在能力を有する１つの前駆細胞を産生する。前駆体は、最終的に成熟細胞に分化する前に、数回の細胞分裂、つまり増殖を受け得る、一過性の増幅細胞である。成体において、幹細胞および前駆細胞は、体の組織のための修復系として作用し、特殊化した細胞を補充し、血液、皮膚、または腸組織などのような再生器官の正常な代謝回転を維持する。
サテライト細胞は、成熟筋組織において見出される幹細胞および小さな単核前駆細胞から構成される不均質の集団に相当することが最近決定された（非特許文献１）。成体の骨格筋におけるサテライト細胞は、それらの宿主筋線維の筋細胞膜と基底膜の間の小さなくぼみに位置する。サテライト細胞は、筋肉の正常な成長および傷害組織または患部組織の再生に関与する。未損傷筋肉において、大多数のサテライト細胞は、静止状態であり、それらが分化もせず、細胞分裂も受けていないことを意味する。サテライト細胞は、ペアードボックス転写因子Ｐａｘ７を含む、多くの特有の遺伝マーカーを発現し、これは、サテライト細胞の機能および生存において中心的な制御的役割を果たす（非特許文献２；非特許文献３）。Ｐａｘ７は、したがって、サテライト細胞のマーカーとして使用することができる。
物理的な外傷もしくは過労、繰り返しの運動、または疾患におけるなどのような損傷に際して、サテライト細胞は、活性化されるようになり、増殖し、ＭｙｏＤおよびＭｙｆ５などのような筋原性制御因子（ＭＲＦ）を発現する筋原性前駆体細胞（筋芽細胞）である、一過性の増幅前駆体の集団の元となる。再生プロセスの過程において、筋芽細胞は、損傷組織を再構築するために最終分化に運命決定する、宿主線維と融合し、または新しい筋線維を生み出す前に、複数回の分裂を受ける（ＣｈａｒｇｅおよびＲｕｄｎｉｃｋｉ、２００４年）。筋肉を侵すいくつかの疾患および状態において、サテライト細胞の数の減少およびサテライト細胞が骨格筋を修復し、再生し、かつ成長させる能力の低下と関連する筋量の低下が見られる。筋肉を侵す少数の例示的な疾患および状態は、悪液質などのような消耗性疾患、サルコペニア、ＩＣＵ誘発性の衰弱、外科手術誘発性の衰弱（たとえば人工膝関節置換術または人工股関節置換術の後の）、および筋ジストロフィーなどのような筋変性疾患を含む筋肉の減衰または萎縮を含む。筋肉再生のプロセスは、細胞外マトリックスの相当なリモデリングを含み、広範囲な損傷が起こる場合、不完全となる。筋肉内の線維芽細胞は、筋肉機能を害し得、筋ジストロフィーの病態を示す部分となる瘢痕組織を蓄積させる。
筋ジストロフィーは、運動をコントロールする骨格筋または随意筋の進行性の衰弱および変性によって特徴付けられる遺伝病である。心臓および他のいくつかの不随意筋の筋肉もまた、筋ジストロフィーのいくつかの形態において影響を与えられる。多くの場合において、組織学的な像は、線維サイズ、筋細胞の壊死および再生、ならびに多くの場合、結合組織および脂肪組織の増殖における変異を示す。進行性筋ジストロフィーは、少なくとも、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ−ドレフュス型筋ジストロフィー、ランドジー−デジェリーヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー、フォングレーフェ−フックス型（ｖｏｎ Ｇｒａｅｆｅ−Ｆｕｃｈｓ）筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（シュタイネルト病）、および先天性筋ジストロフィーを含む。
現在、これらの疾患のための治療法はないが、ある種の医薬品および療法が有効であることが示されている。たとえば、コルチコステロイドは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）患者において筋肉破壊を遅らせることが示されている。コルチコステロイドは、多くの患者において、疾患の進行を遅延させるのに有効となり得るが、長期的なコルチコステロイドの使用は、望ましくない副作用が生じるため好ましくない。
研究者はまた、ある種の筋肉増強剤の潜在能力をも調査している。１つのそのような手法は、筋肉の成長および発達において役割を果たすことが公知の増殖因子であるタンパク質ミオスタチンをブロックすることである。たとえば、ミオスタチンに特異的なモノクローナル抗体は、おそらくミオスタチンの作用をブロックすることによって、筋ジストロフィーを有するマウスの状態を改善することが示されている。しかしながら、ミオスタチンをブロックする手法は、問題を提示する。たとえば、ミオスタチンのブロックは、傷害筋細胞または死筋細胞を交換するのを助けるサテライト細胞に干渉し得る。ミオスタチンは、静止時のサテライト細胞を、それらが必要とされるまで、保つのを助け、ミオスタチンなしでは、サテライト細胞は、枯渇し得ると考えられている。さらに、筋肉成長を同様に制限する、ミオスタチンに類似する、様々なタンパク質があるので、ミオスタチンブロッカーはまた、筋肉成長を高めるために、標的に向けられてもよいことが提唱された。
特許文献１（Ｒｕｄｎｉｃｋｉら）は、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−サテライト幹細胞の新規な集団を記載する。この群は、サテライト幹細胞が、幹細胞（Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−）および前駆細胞（Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５＋）を含有する異質性の集団であることを最初に確認した。本開示以前に、サテライト細胞が、幹細胞、運命決定された前駆体、または脱分化型筋芽細胞であったかどうかおよびニッチは均質であったかまたは不均質であったかどうかは不明瞭であった。Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系列追跡を使用して、その群は、Ｍｙｆ５を決して発現せず、幹細胞貯蔵所として機能した、サテライト細胞のサブ集団を同定した（非特許文献１もまた参照されたい）。その群は、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−サテライト幹細胞を単離するのに成功し、これは、成体のサテライト細胞プールの約１０％に相当し、非対称性の頂底（ａｐｉｃａｌ−ｂａｓａｌ）細胞分裂を通して、娘サテライト筋原性細胞（Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５＋）の元となることが分かった。Ｍｙｆ５−およびＭｙｆ５＋ＦＡＣＳソートサテライト細胞の両方の移植により、サテライト幹細胞は、成体サテライト細胞ニッチを再配置し、自己再生することができることが実証された（非特許文献１）。骨格筋再生の間に、サテライト細胞集団は、幹細胞サブ集団によって維持され、したがって、個体の寿命の間に組織恒常性の維持および複数回の再生を可能にすることが最近実証された（非特許文献１）。サテライト幹細胞の運命の決定を制御する分子ネットワークについての知識は、不明瞭なままである。
特許文献２（Ｒｕｄｎｉｃｋｉら）は、Ｗｎｔタンパク質の筋原性決定を調節することによって、サテライト幹細胞コンパートメントの外側に位置するＣＤ４５＋Ｓｃａ１＋幹細胞の非定型集団の増殖または系列決定を調節するための方法および組成物を開示する。
Ｗｎｔファミリーの遺伝子は、標的細胞上のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）受容体に結合することによって作用する、２０を超える、システインに富む分泌型Ｗｎｔ糖タンパク質をコードする。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のファミリーである。Ｆｚｄファミリーのある種のメンバーへのＷｎｔファミリーの異なるメンバーの結合は、いくつかの別個の経路のうちの１つによるシグナル伝達を開始することができる。名付けられた標準的な経路において、シグナル伝達分子、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄの活性化は、細胞質セリン−トレオニンキナーゼであるグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３β）の不活性化に至る。ＧＳＫ−３β標的であるβ−カテニンは、それによって安定化され、核に移行し、ここで、それは、特異的なプロモーターのＴＣＦ（Ｔ細胞因子）依存性の転写を活性化する（Ｗｏｄａｒｚ、１９９８年、Ｄｉｅｒｉｃｋ、１９９９年）。非標準的なまたは平面内細胞極性（ｐｌａｎａｒ ｃｅｌｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ）（ＰＣＰ）経路において、ＦｚｄへのＷｎｔの結合はまた、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄを活性化し、これは、この場合、小さなｇタンパク質であるＲｈｏＡを活性化する。ＰＣＰ経路の活性化は、β−カテニンの核移行をもたらさない。
Ｗｎｔシグナル伝達は、胚発生を通して発達プログラムを制御する際におよび成体の組織において幹細胞機能を制御する際に重要な役割を果たす（Ｃｌｅｖｅｒｓ、２００６年）。Ｗｎｔは、沿軸中胚葉における胚の筋原性の誘発に（Ｂｏｒｅｌｌｏら、２００６年；Ｃｈｅｎら、２００５年；Ｔａｊｂａｋｈｓｈら、１９９８年）および筋線維発達の間の分化のコントロールにおいて（Ａｎａｋｗｅら、２００３年）必要であることが実証されている。最近、Ｗｎｔ平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路は、発達中の筋分節において分化しているミオサイトの伸長の制御に結び付けられた（Ｇｒｏｓら、２００９年）。成体において、Ｗｎｔシグナル伝達は、急性の損傷の後の、筋組織における成体ＣＤ４５＋／Ｓｃａ１＋幹細胞の筋原性の運命決定に必要である（Ｐｏｌｅｓｓｋａｙａら、２００３年；Ｔｏｒｒｅｎｔｅら、２００４年）。他の研究は、標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が、貯蔵筋芽細胞の活性化および動員を通して筋原性の分化を制御することを示唆する。さらに、成体の筋肉内のサテライト細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を制限し、したがって分化を促進することによって、筋原性の系列進行をコントロールするように見える。したがって、従来より、Ｗｎｔタンパク質は、幹細胞増殖因子として作用し、幹細胞および／または前駆細胞の増殖および分化を促進すると仮定されている。
国際公開第２００７／０５９６１２号 国際公開第２００４／１１３５１３号
Ｋｕａｎｇら、Ｃｅｌｌ（２００７年）１２９、９９９〜１０１０ Ｋｕａｎｇら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００６年）１７２、１０３〜１１３ Ｓｅａｌｅら、Ｃｅｌｌ（２０００年）１０２、７７７〜７８６
幹細胞および幹細胞を標的とする療法は、様々な臨床設定において利益を提供する潜在能力を有する。多くの潜在的な治療上の適用に対する制限は、十分な数の未分化の幹細胞を得ることおよび幹細胞貯蔵所を枯渇させることなく、成熟した組織特異的な細胞への最終分化を刺激することである。多くの現在の幹細胞研究は、損傷組織を修復または再生するための、幹細胞、特に一過性の増幅前駆体の増殖および分化の指示に注目している。幹細胞枯渇に関する問題に加えて、幹細胞の増殖および分化の刺激に対する他の問題は、異常な組織または十分に形成されない組織である。したがって、当技術分野では、幹細胞の分野における継続的な研究開発ならびに生理学的に幹細胞機能を調節するための新しく改善された方法および組成物が必要とされている。
一般に、本発明は、幹細胞を調節するための組成物および方法ならびにその使用を提供する。さらに特定すると、本発明は、幹細胞の分裂対称性を調節するための組成物および方法を提供する。
本発明の様々な非限定的な態様および実施形態が下記に記載される。
一態様において、活性剤として、幹細胞における平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達の調節因子を含む、幹細胞の分裂対称性を調節するための組成物が提供される。
他の態様では、幹細胞の分裂対称性を調節するための方法であって、活性剤として、幹細胞における平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達の調節因子を含む組成物と幹細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、活性剤は、幹細胞の対称性分裂を促進することができるＰＣＰシグナル伝達の活性化因子である。活性剤は、たとえば、小分子、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、またはその組み合わせを含むまたはそれに由来するものでもよい。
いくつかの実施形態では、活性剤は、
（ａ）Ｆｚｄ７に結合することおよび／もしくはそれを活性化することができるペプチドもしくはポリペプチド；
（ｂ）Ｆｚｄ７に結合することおよび／もしくはそれを活性化することができるペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）Ｆｚｄ７に結合することおよび／もしくはそれを活性化することができる小分子；
（ｄ）幹細胞上のＦｚｄ７の発現を上方制御することができるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド；または
（ｅ）ＰＣＰ経路におけるエフェクター分子の発現を活性化もしくは誘発し、それによって対称性分裂を促進することができるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
の１つまたは複数を含む。
ある実施形態では、活性剤は、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
ある選択される実施形態では、活性剤は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドを含む。
他の実施形態では、活性剤は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、たとえば、発現ベクター中に存在してもよい。
さらに他の実施形態では、活性剤は、ＰＣＰ経路における１つまたは複数のエフェクター分子、たとえばＶａｎｇｌ２、α７−インテグリン、Ｐｒｉｃｋｌｅ１、またはＣｅｌｓｒ２を調節する。
一実施形態では、活性剤は、細胞膜におけるＶａｎｇｌ２の発現または極性化した分布を誘発することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、幹細胞を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、幹細胞における標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害因子を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、幹細胞分裂の速度または幹細胞生存を増加させる調節因子などのような、１つまたは複数の幹細胞調節因子を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、成体幹細胞である。ある実施形態では、成体幹細胞は、サテライト幹細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、組織形成、再生、維持、または修復を促進するために使用される。いくつかの実施形態では、組織は、筋肉である。いくつかの実施形態では、筋肉は、骨格筋である。
一態様では、哺乳動物において、組織形成、再生、維持、または修復を増強するための組成物であって、活性剤として、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。
一態様では、哺乳動物において、組織形成、再生、維持、または修復を増強するための方法であって、活性剤として、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、組成物は、生理学的に許容されるビヒクル、担体、または希釈剤と混合されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、注射用に製剤される。たとえば、組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、心臓内注射、皮下注射、または腹膜腔内注射の１つまたは複数のために製剤されてもよい。
いくつかの態様では、本明細書において記載される組成物および方法は、それを必要とするヒト被験体において、骨格筋の形成、維持、修復、または再生を促進するのに有用である。たとえば、それを必要とする被験体は、筋肉を侵す疾患または状態に罹患した被験体でもよい。
いくつかの実施形態では、被験体は、変性疾患を有する被験体でも、それを有することが疑われる被験体でもよい。いくつかの実施形態では、変性疾患は、筋ジストロフィーであり、これらの例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ−ドレフュス型筋ジストロフィー、ランドジー−デジェリーヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー、フォングレーフェ−フックス型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（シュタイネルト病）、および先天性筋ジストロフィーを含む。
いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。
いくつかの実施形態では、被験体は、傷害または病気と関連する筋消耗または筋萎縮に罹患している。
いくつかの実施形態では、筋肉を侵す疾患または状態は、消耗性疾患（たとえば、癌もしくはＡＩＤＳなどのような病気と関連してもよい悪液質）、筋肉の減衰もしくは萎縮（たとえば、老化と関連してもよいサルコペニア）、ＩＣＵ誘発性の衰弱、長期間の非活動（たとえば昏睡、完全麻痺）、外科手術誘発性の衰弱（たとえば股関節置換術もしくは膝関節置換術の後の）、または筋変性疾患（たとえば筋ジストロフィー）を含んでいてもよい。この列挙は、網羅的なものではない。
他の態様では、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて幹細胞の分裂対称性を調節するための方法であって、幹細胞における平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達の活性化因子または阻害因子から選択される、有効量の活性剤を含む組成物と幹細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、幹細胞における標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害因子と幹細胞を接触させるステップを含んでいてもよい。そのような阻害は、対称性幹細胞分裂をさらに促進してもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、１つまたは複数の幹細胞調節因子、たとえば、幹細胞分裂の速度を増加させ、または細胞生存を増加させる調節因子と幹細胞を接触させるステップを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける方法であり、組成物は、それを必要とする被験体に投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、被験体に幹細胞を投与するステップを含んでいてもよい。幹細胞は、たとえば、組成物と同時にまたは連続的に投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、Ｆｚｄ７または対称性分裂を促進することができるＰＣＰシグナル伝達の調節因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、被験体にヘルパー細胞を投与するステップを含んでいてもよい。ヘルパー細胞は、たとえば、組成物と同時にまたは連続的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、ヘルパー細胞を含んでいてもよい。ヘルパー細胞は、たとえば、ヘルパー細胞から分泌され、Ｆｚｄ７に結合することおよび／またはそれを活性化することができるＷｎｔ７ａタンパク質またはその活性な断片、変異体、類似体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含んでいてもよい。
一態様では、哺乳動物において、筋肉形成、再生、維持、または修復を促進するための方法であって、哺乳動物に、本明細書における治療有効量の組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
一態様では、それを必要とする被験体において、筋肉形成、再生、または修復を促進するための方法であって、活性剤として、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、被験体に投与するステップを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、細胞または組織は、Ｗｎｔ７ａを過剰発現し、それによって対称性幹細胞分裂を誘発するために形質転換される。遺伝子発現は、任意選択で、誘発性のプロモーターのコントロール下にあってもよい。
他の態様では、それを必要とする被験体において、筋消耗、筋萎縮、または筋変性を予防するための方法であって、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、治療有効量の組成物を被験体に投与するステップを含む方法が提供される。
他の態様では、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、サテライト幹細胞の集団を増大させるための方法であって、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物と幹細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、幹細胞、たとえばサテライト幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増大される。いくつかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増大される幹細胞は、続いて、それを必要とする被験体に投与される。
他の態様では、サテライト幹細胞増大を促進するための方法であって、Ｗｎｔ７ａまたはＦｚｄ７を活性化することができるその活性な断片、変異体、類似体、もしくは誘導体と幹細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。
他の態様では、それを必要とする被験体において、筋肉の形成、維持、修復、または再生を促進するための、本明細書において記載される組成物の使用が提供される。
他の態様では、それを必要とする被験体において、筋肉の形成、維持、修復、または再生を促進するための医薬の製造のための、本明細書において記載される組成物の使用が提供される。
他の態様では、静止状態のサテライト細胞のマーカーとしてのＦｘｚ７の使用であって、マーカーは、他の幹細胞マーカーと組み合わせて使用される使用が提供される。
他の態様では、サテライト幹細胞を同定または単離するための方法であって、ＹＦＰ−またはＭｙｆ−と組み合わせてマーカーＰａｘ７＋を選択するステップを含む方法が提供される。
他の態様では、活性剤が、幹細胞の対称性分裂を阻害することができるＰＣＰシグナル伝達の阻害因子である組成物が提供される。阻害因子は、たとえば、Ｗｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、またはＰＣＰ経路におけるエフェクター分子、たとえばＶａｎｇｌ２、α７−インテグリン、Ｐｒｉｃｋｌｅ１、もしくはＣｅｌｓｒ２の阻害を介して、ＰＣＰシグナル伝達を直接または間接的に阻害することができるペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子であってもよい。
いくつかの実施形態では、阻害因子は、Ｗｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、またはＰＣＰ経路におけるエフェクター分子の発現を阻害することができるポリヌクレオチド、たとえばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。一実施形態では、阻害因子は、Ｖａｎｇｌ２ ｓｉＲＮＡである。
他の態様では、筋肉の修復または再生において有用な化合物についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）サテライト幹細胞の集団を提供するステップ；
（ｂ）試験化合物を用いて幹細胞を処理するステップ；および
（ｃ）対照と比較した、処理された幹細胞の非対称性分裂に対する対称性分裂の割合を決定するステップ
を含み、対照と比較した、対称性分裂の割合の増加は、化合物が筋肉の修復または再生において有用であることを示す方法が提供される。
他の態様では、筋肉の修復または再生において有用な化合物についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）サテライト幹細胞の集団を提供するステップ；
（ｂ）試験化合物を用いて幹細胞を処理するステップ；および
（ｃ）化合物が、処理された幹細胞において、ＰＣＰシグナル伝達を活性化し、刺激するかどうかを決定するステップ
を含み、ＰＣＰシグナル伝達の増加は、化合物が筋肉の修復または再生において有用であることを示す方法が提供される。
いくつかの実施形態では、ＰＣＰシグナル伝達の刺激は、Ｆｚｄ７の活性化を介して起こる。
いくつかの実施形態では、増加は、少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれ以上の増加である。
本発明の態様では、活性剤として、Ｆｚｄ７受容体の１つまたは複数の活性化因子を含む、対称性幹細胞分裂を促進するための組成物であって、１つまたは複数の活性化因子は、成体幹細胞においてＦｚｄ７受容体を活性化する、１つまたは複数の小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、高分子、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない組成物が提供される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、サテライト幹細胞である。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、Ｆｚｄ７を過剰発現するように形質転換されてもよい。
他の態様では、サテライト幹細胞枯渇を予防するための方法であって、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドと幹細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。
本発明の他の態様および特徴は、添付の図と共に、本発明の特定の実施形態の以下の記載の検討に際して、当業者らに明らかになるであろう。
本発明の実施形態は、ここで、添付の図に関して、例のみのために記載することとする。
図１は、骨格筋におけるサテライト細胞の発達プログラムを示す図である。サテライト幹細胞の前駆体は、Ｐａｘ３および／またはＰａｘ７発現前駆体として体節中に生じる。サテライト幹細胞は、Ｐａｘ７を発現するのに対して、サテライト筋原細胞は、Ｍｙｆ５−ｌａｃＺおよびＭｙｆ５−ｃｒｅノックイン対立遺伝子の発現によって明らかにされるように、活性化されたＭｙｆ５転写能力をさらに有する。活性化および細胞周期に入った後に、筋原性前駆体細胞は、Ｍｙｆ５およびＭｙｏＤを発現する。Ｍｙｆ５、次いでＭｙｏＤの下方制御と共に、ミオゲニンおよびＭｅｆ２ｃの誘発は、細胞周期からの離脱および最終分化プログラムに入ったことを示す。 図２は、サテライト細胞集団が、不均質であり、サテライト幹細胞およびサテライト筋原細胞から構成されることを示す図である。Ｍｙｆ５−ＣｒｅおよびＲＯＳＡ２６−ＹＦＰ Ｃｒｅ対立遺伝子を使用して、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、層の下の約１０％のＰａｘ７発現サテライト細胞がＭｙｆ５を決して発現したことがないことを発見した。さらに、本発明者らは、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−サテライト細胞が、底部のＰａｘ７＋／Ｍｙｆ５−細胞および頂端部のＰａｘ７＋／Ｍｙｆ５＋細胞を非対称的に生成する頂底に方向付けられた分裂を通して、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５＋サテライト細胞の元となることを発見した。予期される単離および筋肉の中への移植は、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５＋細胞が早発性の分化を示したのに対して、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−細胞が、注射された筋肉を通じて、サテライト細胞貯蔵所に広範囲に寄与したことを明らかにした。そのため、サテライト細胞は、幹細胞および運命決定された前駆体から構成される不均質の集団である。 図３は、サテライト幹細胞の対称性の増大が、幹細胞分裂の軸のＰＣＰ媒介性の方向付けに起因することを示す図である。その受容体Ｆｚｄ７の結合を通して、Ｗｎｔ７ａは、Ｒａｃ／ＲｈｏＡの活性化を通して、Ｖａｎｇｌ２およびそのコレセプターＳｙｎ４の極性化した分布を誘発した。このシグナル伝達は、Ｆｚｄ７およびＶａｎｇｌ２を通してのＰＣＰシグナル伝達の結果として、その随伴性の極性化と共に、α７／β１−インテグリン受容体の活性化に至る。結果として生じる、α７／β１−インテグリンが上方制御され、極性化された局所化は、両方の娘細胞が基底膜に付着し続けることを可能にする。 図４は、サテライト幹細胞が、Ｗｎｔ受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７を発現することを示す図である。（Ａ）Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰマウスから単離された単一の筋線維。９０％のＰａｘ７＋細胞は、ＹＦＰを発現し、１０％のＰａｘ７＋細胞は、ＹＦＰ−であった。サテライト細胞は、幹細胞マーカーＣＸＣＲ４を一様に発現した。（Ｂ）休止肢骨格筋から抽出された、ゲーティングされたサテライト細胞（α７−インテグリン＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ３１−、ＣＤ１１ｂ−、Ｓｃａ１−）は、Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ活性化ＹＦＰ蛍光に基づいて分離した。（Ｃ）ＹＦＰ−ソート細胞におけるＭｙｆ５およびＹＦＰの転写物の不在ならびにＦｚｄ７転写物の発現を示す、ソート細胞のリアルタイムＰＣＲ分析（ｎ＝３）。（Ｄ）Ｆｚｄ７は、新たに単離されたＭｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰ筋線維において、Ｐａｘ７＋／ＹＦＰ＋サテライト筋原細胞（右）においてではなく、静止状態のＰａｘ７＋／ＹＦＰ−サテライト幹細胞（左）において特異的に発現された。（Ｅ）増殖するサテライト細胞および筋原性前駆体細胞は、Ｆｚｄ７を発現する。再生ＥＤＬ筋線維は、ＴＡ筋傷害の４日後に単離された。Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−（左）およびＰａｘ７＋／Ｍｙｆ５＋（右）分裂サテライト細胞の両方がＦｚｄ７を発現した。バーは１０μｍである。誤差バーはＳＥＭを示す。 図５は、Ｗｎｔ７ａが、筋肉再生の間に高度に上方制御されることを示す図である。（Ａ）休止（上）ＴＡ筋ならびに傷害の３（中央）および６（下）日後に分析された凍結傷害ＴＡ筋の凍結切片。筋線維の基底膜は、ラミニンα２鎖染色によって明らかにされ、サテライト細胞核は、Ｐａｘ７染色によって視覚化された。（Ｂ）凍結傷害の６日間後の再生ＴＡ筋のリアルタイムＰＣＲアレイ分析は、サテライト細胞が静止状態に戻る時のＷｎｔ７ａ ｍＲＮＡの上方制御を明らかにした（ｎ＝３）。（Ｃ）組換えＷｎｔ７ａタンパク質は、筋原細胞の表面のＦｒｉｚｚｌｅｄ７に結合し、この結合は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のノックダウンの後に消失する。（Ｄ）Ｗｎｔ７ａではなくＷｎｔ３ａがβ−カテニン／ＴＣＦ標的遺伝子を活性化する。ＢＳＡ（コントロール）および組換えＷｎｔタンパク質を用いる刺激後の培養筋原細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。Ｗｎｔ３ａのみが、β−カテニン／ＴＣＦ標的遺伝子Ｔｃｆ７およびＡｘｉｎ２の転写を誘発した（ｎ＝５）。（Ｅ）Ｗｎｔ７ａタンパク質は、血管内皮細胞によってではなく再生筋線維によって発現される。４日目の心臓毒誘発性の再生ＴＡ筋（左）および休止している反対側のＴＡ筋（右）の凍結切片。切片は、ミオゲニン（分化筋原細胞）、ＣＤ１４４（内皮細胞）、およびＷｎｔ７ａタンパク質の発現について検査した。バーは２５μｍである。誤差バーはＳＥＭを示す。 図６は、Ｗｎｔ７ａ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７シグナル伝達が、サテライト幹細胞増大を駆動することを示す図である。（Ａ）浮遊条件において培養された、Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰマウスからのＥＤＬ単一筋線維の単離の４２時間後のＰａｘ７＋／ＹＦＰ−サテライト幹細胞の第１分裂。サテライト幹細胞は、非対称性の細胞分裂を介して、１つのＹＦＰ−幹細胞および１つのＹＦＰ＋運命決定細胞の元となる（左）またはその代わりに、対称性の細胞分裂によって２つのＹＦＰ−娘細胞の元となる（右）。（Ｂ）Ｗｎｔ３ａではなくＷｎｔ７ａ刺激が、対称性の細胞分裂の割合を著しく増加させ、サテライト幹細胞増大をもたらした（ｎ＝３、＊ｐ＝０．００９）。（Ｃ）単離の４２時間後に培養筋線維上の活性化サテライト細胞は、非サイレンシング条件における細胞（上）と比較して、ｓｉＲＮＡを用いるＦｚｄ７のノックダウンの後にＦｚｄ７を発現しない（下）。（Ｄ）対称性のサテライト幹細胞分裂の速度におけるＷｎｔ７ａ誘発性の増加は、培養の４２時間後に、筋線維に対するＦｚｄ７のサイレンシングの後に抑止された（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０２）。（Ｅ）Ｗｎｔ７ａによって誘発された対称性のサテライト幹細胞数における増加は、培養の５２時間後に、筋線維に対するＦｚｄ７のサイレンシングによってブロックされた（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０３）。バーは１０μｍである。誤差バーはＳＥＭを示す。 図７は、ＰＣＰ構成成分が、筋原細胞によって発現されることを示す図である。（Ａ）定量的リアルタイムＰＣＲ分析は、ＹＦＰ＋およびＹＦＰ−サテライト細胞由来の筋芽細胞によるＰＣＰコア構成成分転写物の発現を示した（ｎ＝３）。（Ｂ）免疫染色は、培養筋線維上で、２４時間までに、Ｐａｘ７＋サテライト細胞の活性化の間に、Ｖａｎｇｌ２が上方制御されることを示した。（Ｃ）Ｗｎｔ７ａは、培養筋線維上の分裂しているＰａｘ７＋サテライト細胞の両極上に極性化されたＶａｎｇｌ２の細胞局所化を誘発する。ＥＤＬ筋線維は、対照培地またはＷｎｔ７ａを補足した培地中で培養し、単離の４２時間後に固定した。（Ｄ）最初の分裂の間のＶａｎｇｌ２極性化に対するＷｎｔ処理の効果。Ｗｎｔ３ａではなくＷｎｔ７ａシグナル伝達が、サテライト細胞分裂の間にＶａｎｇｌ２およびＦｚｄ７の極性化された局所化を誘発する（ｎ＝３、＊ｐ＝０．００６）。（Ｅ）Ｗｎｔ７ａ処理筋線維は、Ｖａｎｇｌ２および膜マーカーα７−インテグリンについて免疫局在性であった。Ｖａｎｇｌ２は、平面分裂サテライト細胞において膜に対して極性化され、共存する（矢）。α７−インテグリンの極性化され、上方制御された発現に注目されたい。これは、両方の娘細胞の基底膜への接着を容易にする。バーは１０μｍである。誤差バーはＳＥＭを示す。 図８は、Ｖａｎｇｌ２が、サテライト幹細胞の対称性の増大に必要とされることを示す図である。Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰマウスからのＥＤＬ単一筋線維は、浮遊条件において培養され、非サイレンシングまたはＶａｎｇｌ２ ｓｉＲＮＡトランスフェクションにかけた。（Ａ）４２時間での、Ｐａｘ７＋／シンデカン４＋サテライト細胞第１細胞分裂の方向付け。分裂は、平面（上）または頂底（下）としてスコア化された。筋線維培養において、サテライト細胞は基底膜の外面に移行し、頂底細胞分裂は培地の中に向けられることに注目されたい。（Ｂ）Ｗｎｔ７ａは、培養の４２時間の後に頂底細胞分裂の割合において有意な減少を誘発し、幹細胞増大を刺激する際のその機能を支持する。Ｖａｎｇｌ２のノックダウンは、Ｗｎｔ７ａが平面細胞分裂を刺激する能力を阻害する（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０２）。（Ｃ）対称性のサテライト幹細胞分裂におけるＷｎｔ７ａ誘発性の増加は、培養の４２時間の後に、筋線維に対するＶａｎｇｌ２のサイレンシングの後に抑止された（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０２）。（Ｄ）培養の５２時間の後にＶａｎｇｌ２についてノックダウンされた筋線維上の活性化サテライト細胞は、非サイレンシング条件における細胞（上）と比較して、Ｖａｎｇｌ２を発現しない（下）。（Ｅ）Ｖａｎｇｌ２のノックダウンは、頂底分裂の率を増加させた（ｎ＝５、＊ｐ＝０．００１）。（Ｆ）Ｖａｎｇｌ２のノックダウンは、Ｐａｘ７＋／ＹＦＰ−幹細胞の割合を減少させた（ｎ＝３、＊ｐ＝０．０３）。（Ｇ）Ｖａｎｇｌ２のノックダウンは、線維当たりの細胞の数を減少させた（ｎ＝５、＊ｐ＝０．００１）。（ＨおよびＩ）Ｖａｎｇｌ２のサイレンシングは、培養の３日後に、分化ミオゲニン＋／Ｐａｘ７−細胞筋線維の割合を増加させた（ｎ＝４、＊ｐ＝１０−５）。（Ｊ）Ｖａｎｇｌ２のサイレンシングは、サテライト細胞プールを枯渇させた（ｎ＝４、＊ｐ＝０．００１）。（Ｋ）Ｖａｎｇｌ２サイレンシングは、サテライト細胞由来筋芽細胞における遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析によって明らかにされるように筋原性の分化を促進する（ｎ＝４）。バーは１０μｍである。誤差バーはＳＥＭを示す。 図９は、異所性のＷｎｔ７ａが、筋肉再生を増強することを示す図である。（Ａ）エレクトロトランスファー（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）誘発性の傷害の８日後の、３月齢マウスの再生ＴＡ筋の代表的な組織学的検査。再生筋線維は、中心に位置する核を示す。バーは２５μｍである。（Ｂ）ＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａプラスミドを用いるエレクトロポレーションの３週間後のＴＡ筋の代表的な凍結切片は、質量ならびに線維の数および径の増加によって証明されるように、再生の加速を示す。ＣＭＶ−Ｗｎｔ３ａを用いるエレクトロポレーションは、マトリックスの異常な蓄積を有する奇形の筋肉をもたらした。筋線維の基底膜は、ラミニンα２鎖免疫染色によって検出された。バーは２００μｍである。（Ｃ）エレクトロポレーションの３週間後の、反対側の肢と比較した、生理食塩水またはＷｎｔ７ａ／Ｗｎｔ３ａ発現プラスミドを用いてエレクトロポレーションされたＴＡ筋における筋線維径の定量化（ｎ＝４、＊ｐ≦０．００８）。Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ３ａは、筋線維径に対して相違する効果を有する。（Ｄ）エレクトロポレーションの３週間後の、反対側の肢と比較した、生理食塩水またはＷｎｔ７ａ／Ｗｎｔ３ａ発現プラスミドを用いてエレクトロポレーションされたＴＡ筋における筋線維数の定量化（ｎ＝４、＊ｐ≦０．０３）。誤差バーはＳＥＭを示す。 図１０は、Ｗｎｔ７ａが、サテライト幹細胞増大を駆動することを示す図である。（Ａ）３月齢マウスのＴＡ筋は、生理食塩水またはＷｎｔ７ａ／Ｗｎｔ３ａ発現プラスミドを用いてエレクトロポレーションされ、３週間後に解剖された。層の下のＰａｘ７＋サテライト細胞は、エレクトロポレーションされた筋肉の凍結切片上でスコア化された。ＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａプラスミドを用いるエレクトロポレーションの後の、Ｐａｘ７＋サテライト細胞の数の増加に注目されたい。バーは２５μｍである。（Ｂ）サテライト細胞集団は、生理食塩水またはＷｎｔ３ａをエレクトロポレーションされた試料と比較して、ＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａプラスミドのエレクトロポレーションの後に２倍増加した（ｎ＝４、＊ｐ≦０．０３）。（Ｃ）サテライト細胞は、エレクトロポレーションの３週間後に、エレクトロポレーションされたＭｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰ ＴＡ筋からＦＡＣＳソートされ、２４時間、培養において平板培養し、固定し、Ｐａｘ７およびＹＦＰについて染色した。バーは１０μｍである。（Ｄ）Ｐａｘ７＋／ＹＦＰ−サテライト幹細胞の割合は、エレクトロポレーションされたＴＡ筋においてＷｎｔ７ａの過剰発現の後に有意に増加した（ｎ＝５、＊ｐ≦０．０００１）（Ｅ）Ｗｎｔ７ａ−／−筋線維は、ＥＤＬ筋から単離された筋線維上のＰａｘ７＋サテライト細胞の集団の低下を示した（ｎ＝４、＊ｐ＝０．０３）。（Ｆ）傷害の３週間後に分析された３月齢Ｗｎｔ７ａ−／−ヌルマウスおよびそれらの同腹仔対照の凍結傷害ＴＡ筋の凍結切片。構造または断面積の点からの有意差は、再生筋肉において観察されなかった。バーは２０μｍである。（ｎ＝３）。（Ｇ）サテライト細胞の数の減少は、再生されたＷｎｔ７ａ−／−ＴＡ筋において観察され、断面積における筋線維の数および反対側の肢に対して標準化された。（ｎ＝３、＊ｐ＝０．０３）。誤差バーはＳＥＭを示す。 図１１は、筋肉サテライト細胞のＦＡＣＳ精製を示す図である。（Ａ）前および後肢骨格筋からの生サテライト細胞の選別についてのＦＡＣＳプロファイル。細胞は、ＣＤ３４（ＡＰＣ−Ｃｙ７）およびα７−インテグリン（ＡＰＣ）について陽性選択し、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１、ＣＤ４５、およびＳｃａ１について陰性選択した（すべてＰＥにおいて）。次いで、Ｍｙｆ５＋およびＭｙｆ５−サテライト細胞は、ＹＦＰ蛍光に基づいて分離した。（Ｂ）新たに単離された｛ＣＤ３４＋、α７−インテグリン＋、Ｌｉｎ−｝サテライト細胞のｃｙｔｏｓｐｉｎ。ソートされた細胞は、サテライト細胞マーカーＰａｘ７（左）およびシンデカン４（右）を発現する。（Ｃ）ソートされた｛ＣＤ３４＋、α７−インテグリン＋、Ｌｉｎ−｝サテライト細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける発達。培養における１週間後に、ソートされた細胞の９８％はＰａｘ７を発現する（不等なレベルのＰａｘ７染色は、個々の筋芽細胞細胞周期における差異を説明する）。分化培地における４日後に、ソートされた細胞は、ミオゲニンおよびミオシン重鎖を発現する多核筋管を形成する。 図１２は、ＹＦＰ−サテライト細胞由来の筋芽細胞が、Ｍｙｆ５タンパク質を発現しないことを示す図である。ＦＡＣＳソートＹＦＰ＋およびＹＦＰ−サテライト細胞は、２週間、高分裂促進培地において培養された。ＹＦＰ−細胞の筋原性の運命決定を回避するために、細胞は１０％未満のコンフルエンスで維持された。循環ＹＦＰ＋筋芽細胞は、高レベルのＭｙｆ５タンパク質を発現するが、ＹＦＰ−筋芽細胞は、免疫染色（Ａ）およびウエスタン（Ｂ）分析によって明らかにされるように、いかなる検出可能なＭｙｆ５タンパク質発現をも示さない。１０Ｔ１／２細胞は、陰性非筋原性対照として使用した（ｎ＝３）。 図１３は、Ｗｎｔ７ａが、活性化された筋肉サテライト細胞において、β−カテニンの安定化および核局所化を誘発しないことを示す図である。単一ＥＤＬ筋線維は、対照培地においてまたはＷｎｔ３ａもしくはＷｎｔ７ａを補足された培地により、２日間、懸濁液中で培養された。筋線維は、β−カテニンの活性形態を認識する抗体を用いて染色された。Ｗｎｔ３ａ処理は、β−カテニンの安定化およびサテライト細胞の核の中への移行を引き起こす。Ｗｎｔ７ａは、分裂サテライト細胞においてＷｎｔ標準的シグナル伝達を活性化しない。 図１４は、Ｗｎｔ７ａが、サテライト幹細胞自己再生を増加させるが、サテライト細胞増殖反応速度を修飾しないことを示す図である。（Ａ）対照（非サイレンシング）およびＦｚｄ７サイレンシング条件において培養された筋原細胞におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ転写物のリアルタイムＰＣＲ分析。Ｆｚｄ７転写は、８０％低下した（ｎ＝３、ｐ＝０．０１、ｎ＝３）。Ｆｚｄ７のノックダウンは、特異的であり、筋原細胞において発現される他のＦｒｉｚｚｌｅｄ転写物の発現を引き起こさない。（Ｂ）Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰマウスからのＥＤＬ単一筋線維は、５２時間、浮遊条件において培養された。サテライト幹細胞数におけるＷｎｔ７ａ誘発性の増加は、筋線維に対するＦｚｄ７のサイレンシングの後に抑止された（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０３）。（Ｃ）Ｗｎｔ７ａ処理は、筋線維当たりのＰａｘ７＋細胞の総数に対して影響を及ぼさなかった（ｎ＝３）。誤差バーはＳＥＭを示す。 図１５は、成体ＴＡ筋におけるプラスミドの効率的なエレクトロポレーションを示す図である。（Ａ）大多数のＴＡ筋線維は、ＣＭＶ−ＬａｃＺ発現プラスミドを用いてトランスフェクトされた。ホールマウント像（左）および凍結切片上の組織学的検査（右）におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を明らかにするＸ−Ｇａｌ染色。（Ｂ）エレクトロポレーションの１週間後のトランスフェクト筋肉の代表的な組織学的検査。対照プラスミド（左）を用いるエレクトロポレーションは、生理食塩水エレクトロポレーション（右）と比較して、再生プロセスにおける有意差をもたらさなかった。（Ｃ）ＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａ発現プラスミドを用いるＴＡ筋のエレクトロポレーションの８日後の線維の大多数のによるＷｎｔ７ａの異所性の発現。α２−ラミニンおよびＷｎｔ７ａと反応性の特異的な抗体を用いて染色された凍結切片の免疫組織化学的検査。 図１６は、Ｗｎｔ７ａが、筋原性の増殖または分化に対して効果を有していないことを示す図である。（Ａ）サテライト細胞由来の筋芽細胞は、対照またはＷｎｔ補足増殖培地中でｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて成長した。Ｗｎｔ７ａ処理は、運命決定された筋原性の前駆体の反応速度を改変しなかった。Ｗｎｔ３ａ処理は、細胞増殖の低下をもたらした（ｎ＝３、ｐ＝０．０１）。（Ｂ）２４時間分化培地において培養されたサテライト細胞由来の筋芽細胞は、Ｗｎｔ３ａまたはＷｎｔ７ａ組換えタンパク質を用いて２４時間処理された。Ｗｎｔ処理は、ＭｙｏＤまたはＰａｘ７転写を活性化しなかった（ｎ＝５）。Ｗｎｔ３ａ処理は、Ａｘｉｎ２転写を活性化した。（Ｃ）サテライト細胞由来の筋芽細胞は、６０％のコンフルエンスまで成長させ、４日間、対照分化培地またはＷｎｔ７ａを補足した分化培地に移した。分化した細胞は、ミオシン重鎖について免疫染色した。分化した筋管の形態またはサイズにおける差異は、対照およびＷｎｔ７ａ処理培養物の間で観察されなかった。（Ｄ）融合指数定量化は、対照およびＷｎｔ７ａ処理培養物の間で有意差を示さなかった（ｎ＝３）。（Ｅ）２４時間、分化培地において培養された筋芽細胞は、Ｗｎｔ３ａまたはＷｎｔ７ａ組換えタンパク質を用いて６時間処理された。Ｗｎｔ７ａではなくＷｎｔ３ａは、Ａｘｉｎ２などのようなＷｎｔ−β−カテニン標的遺伝子の転写を活性化した（１０倍の増加、ｎ＝３）。誤差バーはＳＥＭを示す。 図１７は、成体ｗｔマウスのＴＡ筋の中へのＷｎｔ７ａ ｃＤＮＡのエレクトロポレーションは、サテライト細胞数の数の増加に至ることを示す図である。ＴＡ筋の中へのＷｎｔ７ａ ｃＤＮＡのエレクトロポレーションは、サテライト細胞の数およびサテライト幹細胞の数の増加をもたらした（ｍｙｆ５陰性、Ｐａｘ７陽性）。 図１８は、Ｗｎｔ７ａ含有プラスミドを用いるエレクトロポレーション後のｍｄｘマウスにおけるサテライト細胞の数を示す図である。ｍｄｘマウスのＴＡ筋は、対照（ｌａｃＺ）プラスミドまたはＣＭＶプロモーターのコントロール下にＷｎｔ７ａのコード領域を含有するプラスミドの注射の後にエレクトロポレーションした。サテライト細胞（すべてＰａｘ７陽性細胞）およびサテライト幹細胞（ｍｙｆ５陰性サテライト細胞）の総数をカウントした。サテライト細胞の総数は、Ｗｎｔ７ａ含有プラスミドを用いてエレクトロポレーションされたｍｄｘマウスにおいて有意に増加した（ｐ＝０．００５）。 図１９は、Ｗｎｔ７ａ含有プラスミドのエレクトロポレーションが、ｍｄｘおよびｗｔマウスにおける線維直径を増加させることを示す図である。ｍｄｘマウスおよび年齢が一致するｗｔマウス（３月齢、オス）を、Ｗｎｔ７ａ含有プラスミドまたはｌａｃＺ対照プラスミドを用いてエレクトロポレーションした。Ｗｎｔ７ａ ｃＤＮＡのエレクトロポレーションは、ｍｄｘおよびｗｔマウスにおいて筋線維直径における有意な増加に至る（ｐ＜０．００１）。 図２０は、Ｗｎｔ７ａ組換えタンパク質の投与が、Ｗｎｔ７ａプラスミドを用いるエレクトロポレーションに類似する効果をもたらすことを示す図である。ヒトＷｎｔ７ａタンパク質は、ＴＡ筋の中に注射し、注射の２週間後に筋線維サイズを有意に増強することが分かった（ｐ＜０．００１）。観察された効果は、ＣＭＶ駆動マウスＷｎｔ７ａプラスミドのエレクトロポレーションによってもたらされたものに類似した。 図２１は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｗｎｔ７ａ ｃＤＮＡ配列を示す図である。下線を引いたコード領域を有するＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｗｎｔ７ａ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）。 図２２は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｗｎｔ７ａアミノ酸配列を示す図である。下線を引いた推定上の成熟ペプチドを有するＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｗｎｔ７ａアミノ酸配列（配列番号２）。 図２３は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｗｎｔ７ａ ｃＤＮＡ配列を示す図である。下線を引いたコード領域を有するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｗｎｔ７ａ ｃＤＮＡ配列（配列番号３）。 図２４は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｗｎｔ７ａアミノ酸配列を示す図である。下線を引いた成熟ペプチドを有するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｗｎｔ７ａアミノ酸配列（配列番号４）。 図２５は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｆｚｄ７ ｃＤＮＡ配列を示す図である。下線を引いたコード領域を有するＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｆｚｄ７ ｃＤＮＡ配列（配列番号５）。 図２６は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｌｕｌｕｓ） Ｆｚｄ７アミノ酸配列を示す図である。下線を引かれた推定上のシステインに富むＷｎｔ結合ドメイン、太字の推定上のＷｎｔ結合部位を決定する残基、および二重線を引かれた推定上のＰＤＺドメイン結合モチーフを有するＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｆｚｄ７アミノ酸配列（配列番号６）。 図２７は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｆｚｄ７ ｃＤＮＡ配列を示す図である。下線を引いたコード領域を有するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｆｚｄ７ ｃＤＮＡ配列（配列番号７）。 図２８は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｆｚｄ７アミノ酸配列を示す図である。下線を引かれた推定上のシステインに富むＷｎｔ結合ドメイン、太字の推定上のＷｎｔ結合部位を決定する残基、および二重線を引かれた推定上のＰＤＺドメイン結合モチーフを有するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｆｚｄ７アミノ酸配列（配列番号８）。 図２９は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｖａｎｇｌ２ ｃＤＮＡ配列を示す図である。下線を引いたコード領域を有するＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｖａｎｇｌ２ ｃＤＮＡ配列（配列番号９）。 図３０は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｖａｎｇｌ２アミノ酸配列を示す図である。下線を引いた推定上のリン酸化部位および太字の推定上のＰＤＺドメイン結合モチーフを有するＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｖａｎｇｌ２アミノ酸配列（配列番号１０）。 図３１は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｖａｎｇｌ２ ｃＤＮＡ配列を示す図である。下線を引いたコード領域を有するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｖａｎｇｌ２ ｃＤＮＡ配列（配列番号１１）。 図３２は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｖａｎｇｌ２アミノ酸配列を示す図である。下線を引いた推定上のリン酸化部位および太字の推定上のＰＤＺドメイン結合モチーフを有するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｖａｎｇｌ２アミノ酸配列（配列番号１２）。
一般に、本発明は、幹細胞、特に成体幹細胞を調節するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、幹細胞分裂決定を調節するための組成物および方法を提供する。
たとえば、組織形成、再生、修復、または維持を促進するための、治療上の使用を含む、本明細書において記載される組成物および方法の様々な使用もまた提供される。
以下の記載は、発明者らによって企図される本発明の様々な態様および実施形態を詳述する。本発明の範囲が、本明細書において記載される例示的な実施形態に限定されないことが理解される。
幹細胞、たとえば成体幹細胞において平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路の活性化が、対称性幹細胞分裂を促進することがここで実証された。対称性分裂は、２つの娘細胞の元となり、幹細胞プールの増大をもたらす。反対に、幹細胞におけるＰＣＰシグナル伝達の阻害は、対称性分裂を阻害して、非対称性（頂底）細胞分裂の増加をもたらし、これは幹細胞プールを増大させない。興味深いことに、ＰＣＰ経路の活性化を介しての対称性幹細胞分裂の促進は、細胞分裂の率に対する影響を有していない。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７（Ｆｚｄ７）受容体を介して作用するＷｎｔ７ａが、成体幹細胞、たとえばサテライト幹細胞におけるＰＣＰシグナル伝達を活性化することがここで実証された。サテライト幹細胞は、筋細胞の元となる成体幹細胞である。ＰＣＰ経路における受容体またはエフェクター分子、たとえばＦｚｄ７またはＶａｎｇｌ２の阻害が、Ｗｎｔ７ａの効果を抑止したことがさらに実証された。Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてサテライト幹細胞数を有意に増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて組織形成を促進して、傷害および患部筋組織における修復および再生の増強に至ったことがさらに実証された。
したがって、Ｗｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、およびＰＣＰシグナル伝達経路の他の構成成分は、幹細胞分裂決定ならびに組織形成、再生、維持、および修復の促進の調節のための新規な標的となる。
定義
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明に関連する当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書において使用される用語「幹細胞」は、多くの最終分化細胞型に分化することができる未分化細胞を指す。異なる幹細胞は、異なる潜在能を有していてもよい。下記の定義は現在の理解を反映しているが、幹細胞についての発明者らの知識および理解は絶えず進化している。全能性幹細胞は、典型的に、あらゆる細胞型に発達する性能を有し、起源が普通、胚性のものである。多能性幹細胞は、典型的に、いくつかの分化細胞型に分化することができる幹細胞系における細胞である。多能性幹細胞は、多くの細胞にではあるが、密接に関係するファミリーのものにのみ分化することができる。単能性幹細胞は、それら自体の１つの細胞型のみを産生することができるが、それらと非幹細胞を区別する自己再生の特性を有する。筋肉幹細胞は、単能性であり、筋細胞のみの元となると従来より考えられている幹細胞の例である。
「成体幹細胞」は、発達した生物において見出される幹細胞である。成体幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内皮幹細胞、および筋肉幹細胞を含むが、これらに限定されない。
「サテライト幹細胞」は、筋細胞の元となる成体幹細胞の例である。
本明細書において使用される用語「前駆細胞」は、特定の細胞系列に運命決定され、限られた一連の細胞分裂によってこの系列の細胞の元となる細胞を指す。筋芽細胞は、１つのみの型の細胞に分化することができるが、それ自体、完全には成熟していないまたは完全には分化していない前駆細胞の例である。
幹細胞に関して本明細書において使用される用語「対称性分裂」は、同じ型の細胞の数を増加させる細胞分裂を指す。用語「平面分裂（ｐｌａｎａｒ ｄｉｖｉｓｉｏｎ）」もまた、使用されてもよい。対称性幹細胞分裂は、２つの娘幹細胞の元となり、それによって、幹細胞プールを増大させる。したがって、用語「増大」は、対称性分裂の結果としての、特定の型の細胞の数の増加を指す。
幹細胞に関して本明細書において使用される用語「非対称性分裂」は、幹細胞数の増加を伴わずに、１つの娘幹細胞および１つの前駆細胞の元となる細胞分裂を指す。用語「頂底分裂」もまた、使用されてもよい。
対称性幹細胞分裂を「促進する」、「増強する」、または「増加させる」によって、非対称性細胞分裂に対する対称性細胞分裂の比が、正常または対照、たとえば特定の活性剤、組成物、または治療方法の非存在下における比と比較して増加することを意味する。たとえば、非対称性細胞分裂に対する対称性細胞分裂の比は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、またはそれ以上、増加してもよい。
本明細書において使用される用語「分化」は、それによって細胞が特定の機能に特殊化したようになる、たとえば、細胞が、最初の細胞型と異なる１つまたは複数の形態学的特質および／または機能を獲得する発達プロセスを指す。用語「分化」は、系列決定および最終分化プロセスの両方を含む。たとえば、未分化または分化の状態は、免疫組織化学的検査または当業者に公知の他の手順を使用して、バイオマーカーの存在または不在を評価またはモニターすることによって評価されてもよい。
本明細書において使用される用語「系列決定」は、幹細胞が特定の限られた範囲の分化細胞型の形成に運命決定されるようになるプロセスを指す。たとえば、幹細胞が、頂底分裂の間に前駆細胞の元となる場合、系列決定は起こる。運命決定された前駆細胞は、多くの場合、自己再生または細胞分裂ができる。
本明細書において使用される用語「最終分化」は、成熟して、完全に分化した細胞への細胞の最終の分化を指す。普通、最終分化は、細胞周期からの離脱および増殖の休止と関連する。
用語「Ｗｎｔ」は、関係する遺伝子およびタンパク質のファミリーを指す。Ｗｎｔ遺伝子は、標的細胞上のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）受容体に結合することによって作用する、２０を超える、システインに富む分泌型Ｗｎｔタンパク質（糖タンパク質）をコードする。ヒトＷｎｔ：Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、およびＷｎｔ７ｂならびにマウスＷｎｔ：Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ３ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ ｌｅａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１２を含む、多くのＷｎｔポリペプチドは、当技術分野において公知である。他の種からの相同体もまた公知であり、当業者に入手可能である。Ｗｎｔファミリーのメンバーは、顕著な進化的保存を示し、したがって、高度の相同性が種の間で観察される。
「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ」（Ｆｚｄ）受容体は、Ｗｎｔ分子が結合することが公知のＧタンパク質共役型受容体タンパク質のファミリーである。様々なＦｚｄ受容体の配列は、当業者らに入手可能である。Ｆｚｄ７は、サテライト幹細胞上に発現されることが本明細書において示される。Ｆｚｄ７を発現する他の幹細胞は、ｈＥＳＣおよびＮＳＣを含む。
特異的な細胞上のＦｚｄファミリーのある種のメンバーへのＷｎｔファミリーの異なるメンバーの結合は、標準的および非標準的なＷｎｔシグナル伝達経路を含むいくつかの別個の経路のうちの１つによるシグナル伝達を開始することができる。
名付けられた「標準的な経路」において、シグナル伝達分子、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄの活性化は、細胞質セリン−トレオニンキナーゼであるグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３β）の不活性化に至る。ＧＳＫ−３β標的であるβ−カテニンは、それによって安定化され、核に移行し、ここで、それは、特異的なプロモーターのＴＣＦ（Ｔ細胞因子）依存性の転写を活性化する。この経路はまた、本明細書において「Ｗｎｔ／β−カテニン」経路としても記載される。標準的なＷｎｔシグナル伝達は、筋原性の成長および分化を制御する際に十分に立証された役割を果たす。
「平面内細胞極性」（ＰＣＰ）経路とも称される、名付けられた「非標準的な」Ｗｎｔシグナル伝達経路において、ＦｚｄへのＷｎｔの結合はまた、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（ＤｖＩ）を活性化し、これは、この場合、小さなｇタンパク質であるＲｈｏＡを活性化して、標準的な経路から特有のカスケードを引き起こす。たとえば標準的な経路とは対照的に、ＰＣＰ経路の活性化または刺激は、β−カテニンの核移行をもたらさない。
本明細書において使用されるように、「エフェクター」分子は、「下流エフェクター」分子とも称される、受容体シグナル伝達後分子を指す。エフェクター分子は、たとえば、細胞質ゾルシグナル伝達分子もしくは核シグナル伝達分子および転写因子または受容体もしくはコレセプターなどのような細胞膜中の分子を含んでいてもよい。エフェクターは、たとえば、タンパク質、ポリヌクレオチド、およびペプチドを含んでいてもよい。ＰＣＰ経路における例示的なエフェクター分子は、Ｃｅｌｓｒ１、Ｃｅｌｓｒ２、Ｃｅｌｓｒ３、Ｄｖｌ１、Ｄｖｌ２、Ｄｖｌ３、Ｐｋ１、Ｐｋ２、Ｐｋ３、Ｐｋ４、Ｒａｃ／ＲｈｏＡ、Ｖａｎｇｌ１、Ｖａｎｇｌ２、シンデカン４（Ｓｙｎ４）、およびα７−β１−インテグリンを含む。
シグナル伝達経路との関連において、「活性化」は、たとえば、細胞または細胞膜内の分子のリン酸化、コンホメーンョン、極性化、局在化、または分布における１つまたは複数の変化を含んでいてもよい。活性化は、シグナル伝達経路の活性化構成成分の活性化、刺激、もしくは上方制御を介して直接起こってもよく、または阻害性構成成分を阻害することによって間接的に起こってもよい。「阻害」が直接または間接的に起こってもよい場合、逆もまた真である。
本明細書において使用される用語「調節因子」は、シグナル伝達事象または経路の「活性化因子」および「阻害因子」の両方、たとえばＷｎｔ７ａシグナル伝達経路の調節因子を指す。Ｗｎｔ７ａシグナル伝達経路の調節因子は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＦｒｉｚｚｌｅｄ７（Ｆｚｄ７）受容体の調節因子を含む、Ｗｎｔ７ａシグナル伝達経路における上流（活性化因子）分子もしくは下流（エフェクター）分子の活性または発現を刺激または阻害する化合物または分子であってもよい。Ｗｎｔ７ａシグナル伝達経路の候補調節因子は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドの活性を直接または間接的に刺激しても阻害してもよい。直接的な調節因子は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ａポリペプチドをコードする遺伝子に作用してもよいのに対して、間接的な調節因子は、Ｗｎｔ７ａシグナル伝達経路においてＷｎｔ７ａポリペプチドの上流（「活性化因子」）または下流（「エフェクター」）で作用する１つもしくは複数のタンパク質またはタンパク質をコードする遺伝子に作用してもよい。調節因子は、たとえば、Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ａシグナル伝達の活性化因子もしくはエフェクターをコードする遺伝子の発現を上方制御または下方制御するように遺伝子レベルで、またはＷｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ａシグナル伝達の活性化因子もしくはエフェクターの活性に干渉するようにタンパク質レベルで作用することができる。調節因子は、それら自体、Ｗｎｔポリペプチドまたはその活性な断片、誘導体、もしくは変異体であってもよい。調節因子は、たとえば、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、抗体もしくは抗体断片、または小分子活性化因子もしくは阻害因子とすることができる。小分子調節因子は、有機であっても無機であってもよい。
「幹細胞調節因子」は、幹細胞の機能を活性化または阻害する調節因子である。たとえば、幹細胞調節因子は、幹細胞分裂、増殖、分化、または生存を修飾してもよい。たとえば、Ｗｎｔ７ａは、幹細胞分裂決定の調節因子である。
幹細胞に関して本明細書において使用される用語「Ｗｎｔ７ａシグナル伝達経路」は、ＰＣＰシグナル伝達を活性化することが示された、成体幹細胞、たとえばサテライト幹細胞におけるＷｎｔ７ａ−Ｆｚｄ７シグナル伝達経路を指す。Ｗｎｔ７ａシグナル伝達は、ＰＣＰ経路における２つの公知のエフェクター分子であるＶａｎｇｌ２およびα７−インテグリンの極性化した分布を誘発し、それによって、対称性幹細胞分裂を促進することが示された。したがって、本明細書において指されるＷｎｔ７ａシグナル伝達経路は、ＰＣＰシグナル伝達経路である。ある種の他の細胞型では、Ｗｎｔ７ａは、他のＷｎｔシグナル伝達経路を活性化してもよい。
Ｗｎｔ７ａシグナル伝達経路の構成成分メンバーは、たとえば脊椎動物および哺乳動物において顕著な進化的保存を示す。ヒトおよびマウスのＷｎｔ７ａタンパク質は、約９８％の配列同一性を共有するが、対応するＦｚｄ７相同体は約９６％同一であり、Ｖａｎｇｌ２相同体は約９９％同一である。そのような高度の相同性は、多くの場合、異種間の活性をもたらす。たとえば、ヒトＷｎｔ７ａは、マウス系において活性であることが本明細書において実証された（実施例２）。そのため、実験結果は、多くの場合、種にわたって推定することができる。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって相互に連結されるアミノ酸残基の配列を指す。典型的に、ポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸長であり、ペプチドは、少なくとも３アミノ酸長である。ポリペプチドまたはペプチドは、天然に存在する、組換え、合成、またはこれらの組み合わせのものとすることができる。ポリペプチドまたはペプチドは、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドの断片とすることができる。ポリペプチドおよびペプチドという用語はまた、類似体、誘導体、およびペプチド模倣化合物をも包含する。そのような化合物は、当技術分野において周知であり、たとえば、より大きな化学的安定性、タンパク分解性の分解に対する抵抗性の増加、薬理学的特性の増強（半減期、吸収、潜在能、および効能など）、特異性の改変（たとえば、生物学的活性の広域スペクトル）、または抗原性の低下を含む、天然に存在するペプチドに対する有意な利点を有していてもよい。
本明細書において指される特異的なタンパク質またはポリペプチド（たとえばＷｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、またはＶａｎｇｌ２など）は、天然に存在する配列に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質およびポリペプチドならびに野生型タンパク質と少なくとも実質的に同一の活性を有する変異体または相同性のポリペプチド配列、断片、および誘導体を包含する。同様に、特異的な遺伝子（たとえばＷｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、またはＶａｎｇｌ２など）は、天然に存在する配列に対応するポリペプチド配列ならびに野生型タンパク質と少なくとも実質的に同一の活性を有する変異体または相同性のポリペプチド配列、断片、アナロジー（ａｎａｌｏｇｙ）、および誘導体を有するタンパク質をコードする核酸配列または部分配列を包含する。野生型ポリペプチドと比較して、増加した活性を有するその変異体、断片、類似体、および誘導体を含むポリペプチドもまた企図される。
ポリペプチドまたは遺伝子またはその部分に関して本明細書において使用される機能的な「活性」は、天然に存在するタンパク質または遺伝子と関連する１つまたは複数の活性を示すポリペプチド、遺伝子、またはその部分を指す。ポリペプチドまたはその部分に関する機能的な活性は、たとえば、ポリペプチドについての、受容体またはリガンドに特異的に結合する能力および／またはそれを活性化する能力を含んでいてもよい。
物体に関して本明細書において使用される「天然に存在する」は、自然界において物体を見出すことができることを示す。たとえば、天然に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、生物中に存在し、生物から単離することができ、研究室において人によって故意に修飾されていないものとなるであろう。用語「野生型」は、多くの場合、天然に存在する、と区別なく使用される。
本発明との関連において、ポリペプチドまたはその断片、変異体、類似体、もしくは誘導体は、それが、野生型タンパク質の活性の約５０％、好ましくは、野生型タンパク質の活性の少なくとも６０％、７５％、または８０％を示す場合、野生型タンパク質と少なくとも実質的に同じ活性を有すると考えられる。好ましい実施形態では、ポリペプチド、変異体、断片、類似体、または誘導体は、野生型タンパク質の活性の少なくとも約８５％、たとえば８８％、９０％、９５％、９９％、１００％を示す。ある実施形態では、野生型活性よりも大きな活性が達成されてもよい。Ｗｎｔ７ａポリペプチド、変異体、断片、類似体、または誘導体の活性は、たとえば、対称性幹細胞増大を促進するためのその能力を測定し、野生型タンパク質と比較することによって決定することができる。幹細胞分裂を測定し、特徴付けるための方法は、当技術分野において公知である。
ポリペプチドの「断片」は、１つまたは複数のアミノ酸が野生型配列または他の参照配列と比較して欠失しているアミノ酸配列を含むが、これらに限定されない。たとえば、限定的なものとして考えられるものではないが、アミノ末端、カルボキシ末端、またはその両方から１つまたは複数のアミノ酸が除去される場合、断片は、存在する。さらに、ポリペプチドの内部の１つまたは複数のアミノ酸が欠失していてもよい。活性な断片は、たとえば本来の配列または他の参照配列の機能的な特質を保持する断片である。典型的に、活性な断片は、野生型タンパク質と実質的に同じ活性を保持する断片である。断片は、たとえば、受容体またはリガンド結合にとって重要なドメインなどのような、機能的に重要なドメインを含有していてもよい。
「変異体」ポリペプチドまたは変異体断片は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、欠失している、追加された、または野生型配列もしくは他の参照配列のアミノ酸配列中にあるものと置換されたものである。本発明との関連において、変異体は、好ましくは、野生型配列もしくは他の参照配列と実質的に同じ活性を保持するか、または野生型タンパク質よりも良好な活性を有する。
変異体は、「保存的」または「非保存的」置換であってもよい、１つまたは複数のアミノ酸置換を含有していてもよい。当技術分野において公知のように、２０の天然に存在するアミノ酸は、それらの側鎖の物理化学的な特性に従って分類することができる。適した分類は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン（極性で無電荷の側鎖）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性の側鎖）、ならびにリシン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性の側鎖）を含む。アミノ酸の他の分類は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、同じ分類からの他のアミノ酸とのアミノ酸の置換を含むが、非保存的置換は、異なる分類からの他のアミノ酸とのアミノ酸の置換を含む。
典型的に、変異体アミノ酸配列は、野生型または参照配列に対して、約７０％よりも大きな、より好ましくは、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％よりも大きな同一性を含む。同一性の程度はまた、上記に列挙される値のうちの任意の２つによって定義される範囲またはその間の任意の値によって示されてもよい。変異体は、参照配列が野生型配列である「突然変異体」を含む。
「誘導体」は、通常、天然に存在する分子の一部ではないさらなる化学または生化学成分を含有するペプチドまたはポリヌクレオチドである。ペプチド誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸側鎖ならびに／またはアミノ末端および／もしくはカルボキシ末端が適した化学的な置換基を用いて誘導体化されたペプチドならびに環状ペプチド、二重ペプチド、ペプチドの多量体、他のタンパク質または担体に融合されたペプチド、グリコシル化ペプチド、リン酸化ペプチド、親油性成分（たとえばカプロイル、ラウリル、ステアロイル成分）にコンジュゲートされたペプチド、および抗体または他の生物学的リガンドにコンジュゲートされたペプチドを含む。ペプチドを誘導体化するために使用されてもよい化学的な置換基の例は、アルキル基、シクロアルキル基、およびアリール基；アルカノイル基およびアロイル基を含むアシル基；エステル；アミド；ハロゲン；ヒドロキシル；カルバミル、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない。置換基はまた、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチル−Ｏ−−ＣＯ−−）、カルボベンゾキシ（ベンジル−−ＣＯ−−）、モノメトキシスクシニルナフチル−ＮＨ−−ＣＯ−−、アセチルアミノ−カプロイル、およびアダマンチル−ＮＨ−−ＣＯ−−などのような保護基であってもよい。他の誘導体は、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、Ｏ修飾誘導体（たとえばＣ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、ならびにアルキルアミドおよびヒドラジドなどのような置換アミドを含むＮ末端修飾誘導体を含む。
「類似体」は、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸を含むポリペプチドまたはペプチドである。当技術分野において公知であるように、ペプチド内のすべてのＬ−アミノ酸のすべてのＤ−アミノ酸への置換は、両方とも本発明との関連において類似体であると考えられる「逆の」ペプチドまたは「ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ」ペプチドをもたらすことができる（Ｇｏｏｄｍａｎら「Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」２８３〜２９４頁（１９８１年）；米国特許第４，５４４，７５２号を参照されたい）。「逆の」ペプチドは、配列のＬ−アミノ酸がすべてＤ−アミノ酸と交換されたものであり、「ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ」ペプチドは、アミノ酸の配列が逆にされ（「ｒｅｔｒｏ」）、すべてのＬ−アミノ酸がＤ−アミノ酸と交換されたものである。
「ペプチド模倣薬」は、ペプチドに構造上類似し、本発明のポリペプチドまたはペプチドの機能を模倣する化学成分を含有する化合物である。たとえば、ポリペプチドが機能的な活性を有する２つの荷電化学成分を含有する場合、模倣薬は、荷電した化学的な機能が三次元空間において維持されるように、空間的な配向および制約を受けた構造に２つの荷電した化学成分を配置する。ペプチド模倣薬という用語は、したがって、アイソスターを含むように意図される。用語「アイソスター」は、化学構造の立体コンホメーンョンがペプチドまたはポリペプチドの立体コンホメーンョンに類似する、たとえば、構造がポリペプチドまたはペプチドに特異的な結合部位に適合するといった理由で、ポリペプチドまたはペプチドの代わりに用いることができる化学構造を指す。
当業者は、ペプチドまたはポリペプチドにおけるすべてのアミノ酸を修飾する必要があるとは限らないことを十分に理解するであろう。同様に、すべてのアミノ酸を同じ方法で修飾する必要があるとは限らない。本発明のペプチド誘導体、類似体、およびペプチド模倣薬は、それぞれの領域が少なくとも１つのアミノ酸またはその修飾バージョンを含む２つ以上の化学的に別個の領域を含有するキメラ分子を含む。
本明細書において使用される「Ｗｎｔ７ａポリペプチド」は、野生型Ｗｎｔ７ａ配列に対応するポリペプチド配列を有する、または天然に存在するＷｎｔ７ａ配列に対して少なくとも約７０％、より好ましくは約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％同一な配列を有するＷｎｔ７ａタンパク質を包含する。同一性は、少なくとも約５０、１００、２００、３００、もしくはそれ以上の隣接アミノ酸に対して評価されてもよいまたは完全長の配列に対して評価されてもよい。同一性％または相同性％を決定するための方法は、当技術分野において公知であり、任意の適した方法が、この目的のために使用されてもよい。Ｗｎｔ７ａポリペプチドはまた、野生型Ｗｎｔ７ａポリペプチドと実質的に同一の活性を有する、たとえばＦｚｄ７に結合する変異体、断片、類似体、および誘導体をも含む。米国特許第６，２９７，０３０号は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびに組換え技術によってそのようなポリペプチドを産生するための方法を記載する。例示的なＷｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号２（マウス）または配列番号４（ヒト）において示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびその活性な断片、変異体、または誘導体を含む。
本発明のポリペプチドは、細胞抽出物からの精製または組換え技術の使用などのような、当技術分野において公知の方法によって調製することができる。本明細書において記載されるポリペプチドは、好ましくは、精製または単離ポリペプチド調製物を含むであろう。ある実施形態では、ポリペプチドの精製は、当技術分野において周知の組換え発現方法を利用してもよく、標的ポリペプチドのアフィニティー精製を可能にするために発現構築物の中へのアフィニティータグの組み込みを含んでいてもよい。
より短い配列もまた、排他的な固相合成、部分的な固相合成、フラグメント縮合、または古典的溶液合成を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の方法によって化学的に合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｅｌｄ（１９６３年）Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．８５巻：２１４９頁；Ｍｅｒｒｉｆｅｌｄ（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２巻：３４１頁）。本発明のポリペプチドは、クロマトグラフィー（たとえばイオン交換、アフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフイーもしくは高速液体クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差異などのような標準の技術を使用してまたは当業者によく知られている他の技術によって精製することができる。ポリペプチドはまた、組換え技術によって産生することもできる。典型的に、これは、タンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いる適した宿主細胞の形質転換（トランスフェクション、形質導入、または感染を含む）を含む。ヒトおよびマウスのｗｎｔ７ａ遺伝子およびＰＣＰシグナル伝達経路の様々な他の構成成分についての核酸配列は、当技術分野において公知であり（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｏ００７５５、Ｐ２４３８３、ＮＰ＿００４６１６、Ｇ３６４７０、ＰＦ６７０６、Ｐ２８０４７、Ｈ３６４７０、ＮＭ＿００４６２５、Ｍ８９８０１を参照されたい）、本発明のポリヌクレオチドの基本として使用されてもよい。
本発明のポリペプチドおよびペプチドはまた、融合タンパク質として産生することもできる。そのような融合タンパク質の１つの使用は、ポリペプチドまたはペプチドの精製または検出を改善するためのものである。たとえば、ポリペプチドまたはペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメインに融合することができ、結果として生ずる融合タンパク質は、プロテインＡカラムを使用して容易に精製することができる。融合タンパク質の他の例は、ヒスチジンタグ（Ｎｉｅ＋樹脂カラム上での精製を可能にする）、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（グルタチオンカラム上での精製を可能にする）、またはビオチン（ストレプトアビジンカラム上でのもしくはストレプトアビジン標識１９磁気ビーズを用いる精製を可能にする）に融合されたポリペプチドまたはペプチドを含む。一旦融合タンパク質が精製されたら、タグは、当技術分野において公知の化学的なまたは酵素による方法を使用して、部位特異的な切断によって除去されてもよい。
用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域を包含し、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、両端上で約１ｋｂの距離の、５’端および３’端の両方にコード領域に近接して位置する配列を含む。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と名付けられる非コード配列により中断される「エクソン」または「発現領域」または「発現配列」と名付けられるコード領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサーなどのような制御エレメントを含有していてもよい。イントロンは、核転写物または一次転写物から除去されまたは「スプライスアウトされ」、そのため、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物において不在である。ｍＲＮＡは、新生のポリペプチドにおいてアミノ酸の配列または順序を指定するために翻訳の間に機能する。イントロンを含有していることに加えて、遺伝子のゲノム形態はまた、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’端および３’端の両方に位置する配列を含んでいてもよい。これらの配列は、「フランキング」配列または領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列の５’または３’に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写をコントロールし、またはそれに影響を及ぼす、プロモーターおよびエンハンサーなどのような制御配列を含有していてもよい。３’フランキング領域は、転写の停止、転写後の切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含有していてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「ポリヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、任意のヌクレオチド配列（たとえばＲＮＡまたはＤＮＡ）を指し、これらの操作は、当業者によって、あらゆる理由（たとえば、細胞機能を調節する、疾患を治療するなど）で望ましいと考えられてもよい。そのようなヌクレオチド配列は、遺伝子のコード配列（たとえばレポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、耐病性遺伝子、増殖因子など）およびｍＲＮＡをコードしていなくてもよい非コード制御配列（たとえばプロモーター配列、ポリアデニル化配列、終止配列、エンハンサー配列など）を含むが、これらに限定されない。
用語「オリゴヌクレオチド」は、好ましくは３を超える、普通１０を超える、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子を指す。正確なサイズは、多くの因子に依存するであろう、これは、さらには、オリゴヌクレオチドの根本的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはその組み合わせを含む任意の方法において生成されてもよい。
用語「制御配列」、「制御領域」、「制御エレメント」によって、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されてもよい、常にではないが、典型的に、ヌクレオチド配列のタンパク質コード領域またはポリペプチドコード領域の上流の、核酸の部分を意味する。制御領域が活性であり、目的のヌクレオチド配列と作動可能に関連している場合、これは、目的のヌクレオチド配列の発現をもたらしてもよい。制御エレメントは、器官特異性を媒介することができてもよく、または発達的もしくは一時的なヌクレオチド配列活性化をコントロールすることができてもよい。「制御領域」は、プロモーターエレメント、基本的なプロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、刺激に応じて誘発性のエレメント、陰性制御エレメントまたは転写エンハンサーなどのような、プロモーター活性を媒介するエレメントを含む。本明細書において使用される「制御領域」はまた、翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性決定因子（ｍＲＮＡ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）などのような、転写の後に活性となるエレメント、たとえば、ヌクレオチド配列発現を調節する制御エレメントをも含む。これらの後者のエレメントのいくつかは、コード領域の近位に位置してもよい。
用語「相補的な」および「相補性」は、塩基対合則によって関係するポリヌクレオチド（つまりヌクレオチドの配列）を指す。たとえば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に対して相補的である。相補性は、「部分的」であってもよく、核酸の塩基のうちのいくつかのみが塩基対合則に従って一致する。または、核酸の間に「完全な」もしくは「全体にわたる」相補性があってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しい影響を有する。これは、核酸の間の結合に依存する増幅反応および検出方法において特に重要である。
核酸分子に関してなされる場合の用語「組換え」は、分子生物学的技術の手段によって相互につながれる核酸のセグメントから構成される核酸分子を指す。タンパク質またはポリペプチドに関してなされる場合の用語「組換え」は、組換え核酸分子を使用して発現されるタンパク質分子を指す。
ポリヌクレオチドに関して使用される場合の用語「単離された」は、同定され、それがその自然の供給源において通常関連している少なくとも１つの混入物の核酸から分離される核酸配列を指す。単離された核酸分子は、それが自然界において見出されるものとは異なる形態または設定で存在する。対照的に、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのような単離されていない核酸は、それらが自然界において存在する状態で見出される。たとえば、所与のＤＮＡ配列（たとえば遺伝子）は、隣の遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に見出され、特異的なタンパク質をコードする特異的なｍＲＮＡ配列などのようなＲＮＡ配列は、多くのタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡと共に、混合物として細胞中に見出される。しかしながら、特定のタンパク質をコードする、単離された核酸分子は、例として、核酸が、自然の細胞と異なる、染色体上の位置にあるまたは他の場合には、それが自然界において見出されるものとは異なる核酸配列が側面に位置するタンパク質を通常発現する細胞におけるそのような核酸である。単離された核酸は、単鎖または二重鎖形態で存在してもよい。単離された核酸がタンパク質を発現するために利用されることになっている場合、ポリヌクレオチドは、最低限、センス鎖またはコード鎖を含有するであろう（つまり、ポリヌクレオチドは単鎖であってもよい）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有していてもよい（つまり、ポリヌクレオチドは二重鎖であってもよい）。
用語は「精製された」は、単離されるまたは分離されるそれらの自然環境から取り出される核酸配列またはアミノ酸配列を含む分子を指す。そのため、「単離された核酸配列」は、精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、それらが自然に関連する他の構成成分が少なくとも６０％ない、少なくとも７５％ない、または典型的に少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％ない。本明細書において使用されるように、用語「精製された」および「精製すること」はまた、試料からの混入物の除去をも指す。タンパク質を含む、混入分子の除去は、試料中の目的のポリペプチドのパーセントの増加をもたらす。他の実施例では、組換えポリペプチドは、細菌、酵母、または哺乳動物の宿主細胞において発現され、ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去によって精製され、それによって、組換えポリペプチドのパーセントは、試料中で増加する。
本発明に関する遺伝子に対応する、またはポリペプチドをコードする核酸配列は、容易に購入することができるまたは標準の技術によって適した供給源から精製することができるまたは化学的に合成することができる。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、単離されたｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ、または標準の技術によって天然に存在する核酸配列から増幅されたＤＮＡとすることができる。その代わりに、公知の配列は、標準の技術を使用して、様々な供給源からＷｎｔ７ａポリペプチドをコードする他の核酸配列を得るためのプローブを調製するために使用されてもよい。核酸を得るのに適した供給源は、骨格筋組織および測定可能なＷｎｔ７ａ転写物を有する他の組織などのような、目的のタンパク質を発現することが公知である、それらの細胞または組織である。適した細胞の例は、Ｗｎｔ７ａを発現する筋芽細胞となるであろう。
天然に存在するＷｎｔ７ａタンパク質の断片または変異体をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発技術などのような標準の技術を使用して、コード配列内の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、追加、および／または置換によって構築することができる。
特異的な開始シグナルは、クローニングされたポリヌクレオチドの効率的な翻訳に必要とされてもよい。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび近接する配列を含む。それ自体の開始コドンおよび近接する配列を含む野生型遺伝子またはｃＤＮＡの全体が、適切な発現ベクターの中に挿入される場合では、さらなる翻訳コントロールシグナルは必要とされなくてもよい。他の場合では、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳コントロールシグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。外因性翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、自然または合成のものであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントおよび／または転写ターミネーターの包含によって増強されてもよい（Ｂｉｔｔｎｅｒら（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３巻、５１６頁）。
いくつかの実例では、発現されたタンパク質の検出または精製を容易にするために、望ましくは、特定の遺伝子のコード配列をアミノ末端またはカルボキシル末端エピトープタグに連結してもよい。適したエピトープタグは、赤血球凝集素（ｈａｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、６ＸＨｉｓ、Ｖ５、グルタチオン−Ｓ−転移酵素など（ＧＳＴ）を含むが、これらに限定されない。
発現構築物としても公知である「発現ベクター」は、標的細胞に特異的な遺伝子を導入するために使用される。一旦発現ベクターが細胞の内側にあれば、遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞の転写および翻訳機構によって産生される。ベクターは、エンハンサー領域およびプロモーター領域として作用し、発現ベクター上で運搬される遺伝子の効率的な転写に至る制御配列を含有するように頻繁に遺伝子操作される。上手く設計された発現ベクターの目的は、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡの産生である。
適した発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス粒子およびベクター、ファージ、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない。発現ベクター全体またはその一部は、宿主細胞ゲノムの中に統合することができる。いくつかの状況では、当技術分野において公知のように、誘発性の発現ベクターを使用することは望ましい（たとえばＬＡＣＳＷＩＴＣＨ誘発性発現系）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）。適した発現ベクターは、特定の宿主細胞において発現を駆動するためにプロモーターを含んでいてもよい。いくつかの発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターを含んでいてもよい。発現ベクターは、たとえば、ｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６であってもよい。
分子生物学の分野における技術者らは、組換えポリペプチドまたはペプチドを提供するために種々様々の発現系を使用することができることを理解するであろう。ポリペプチドまたはペプチドは、原核生物宿主（たとえばＥ．ｃｏｌｄもしくＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてまたは真核生物宿主（たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓもしくはＰｉｃｈｉａ；ＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、もしくはＨｅＬａ細胞などのような哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞）において産生することができる。発現ベクターの形質転換またはトランスフェクションおよび選択の方法は、選択される宿主系に依存し、当業者によって容易に決定することができる。たとえば、形質転換およびトランスフェクションの方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて記載されており、様々な発現ベクターは、たとえば、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｏｎｗｅｌｓら、１９８５年、補足 １９８７年）においておよび様々な民間の供給者によって提供されるものから選ばれてもよい。
さらに、挿入された配列の発現を調節し、または特異的な所望の方法において遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞が、選ばれてもよい。そのような修飾（たとえばグリコシル化）およびタンパク質産物のプロセシング（たとえば切断）は、タンパク質の活性にとって重要であり得る。様々な宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的で特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系は、発現された異種タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実にするために当業者によって選ぶことができる。発現ビヒクルを持つ宿主細胞は、公知の手順に従って、選ばれた遺伝子の活性化、選ばれた遺伝子の抑制、形質転換体の選別、または選ばれた遺伝子の増幅に必要とされるように、適した従来の培養液中で培養することができる。
本発明との関連において、「オリゴヌクレオチド調節因子」は、Ｗｎｔ７ａ−ＰＣＰシグナル伝達経路遺伝子またはＰＣＰ経路の活性化因子もしくはエフェクターをコードする遺伝子の１つまたは複数の構成成分を標的とする、オリゴヌクレオチドベースの阻害因子または活性化因子である。オリゴヌクレオチド調節因子は、たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、リボザイム、および三重らせん形成オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。ｓｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉は、転写後遺伝子サイレンシングにおいて重要な役割を果たすことが当技術分野において公知である［Ｚａｍｏｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ． Ｂｉｏｌ．、８巻：７４６〜７５０頁（２００１年）］。自然界において、ｓｉＲＮＡ分子は、典型的に、長さが２１〜２２の塩基対であり、長い二重鎖ＲＮＡ分子が内因性のリボヌクレアーゼの作用によって切断される場合に生成される。最近、標的遺伝子の一部と同一の配列を有する合成ｓｉＲＮＡ分子を用いる哺乳動物細胞のトランスフェクションが、標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルの低下に至ることが実証された。たとえば、Ｖａｎｇｌ２発現は、ｓｉＲＮＡにより阻害され、それによって、これは、対称性の細胞分裂を阻害し、非対称性の分裂の増加をもたらす。オリゴヌクレオチド調節因子は、当業者らに周知の従来の技術によって調製することができる。たとえば、オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｃａｎａｄａ）から入手可能な装置などのような、市販で入手可能な装置を使用して、固相合成を使用して調製することができる。その代わりに、オリゴヌクレオチド調節因子は、当技術分野において公知の標準の技術を使用して、天然に存在する標的遺伝子もしくはｍＲＮＡのまたはｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡの酵素による消化および／または増幅によって調製することができる。オリゴヌクレオチド阻害因子がＲＮＡを含む場合、それらは、当技術分野において公知でもあるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写方法によって調製することができる。上記に示されるように、ｓｉＲＮＡ分子もまた、市販で入手可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットを使用して好都合に調製することができる。オリゴヌクレオチドはまた、組換えＤＮＡ技術を使用して調製することもできる。
本明細書において使用されるように、「プライマー」は、典型的に３を超える、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを指し、これから、プライマー伸長産物の合成を開始することができる。合成の助けとなる実験条件は、ヌクレオシド三リン酸ならびにＤＮＡポリメラーゼなどのような重合および伸長のための作用物質ならびに適したバッファーの存在、温度、ならびにｐＨを含む。
本明細書において定義されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列に関して、配列同一性に関する用語「実質的に同一の」は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を意味する。「同一性」によって、それぞれの供給者によって確立されたデフォルトパラメーターと共に使用される、当技術分野において公知の標準の配列アルゴリズムまたはプログラムによって決定される保存アミノ酸または保存ヌクレオチドの数を意味する。同一性の程度は、上記に列挙される値のうちの任意の２つによって定義される範囲またはその間の任意の値によって示されてもよいことが理解されるであろう。同一性は、たとえば、少なくとも約５０、１００、２００、３００、もしくはそれ以上の隣接アミノ酸または少なくとも約５０、１００、２００、３００、５００、７５０、１０００、もしくはそれ以上のヌクレオチドに対して評価されてもよく、または完全長の配列に対して評価されてもよい。用語「相同性」および「同一性」は、多くの場合、区別なく使用される。同一性％または相同性％を決定するための方法は、当技術分野において公知であり、任意の適した方法が、この目的のために使用されてもよい。一般に、配列は、最適化されたマッチが得られるようにアライメントされる。当業者らに周知のように、配列同一性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムなどのようなアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して公的に入手可能である。他の市販でまたは公的に入手可能なプログラムは、ＤＮＡＳｔａｒ ＭｅｇＡｌｉｇｎプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）Ｇａｐプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｌ）を含む。
本明細書において使用されるように、用語「少なくとも９０％同一の」は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに比べた、９０〜９９．９９％の同一性パーセントを指すであろう。９０％またはそれ以上のレベルの同一性は、例示目的であることを仮定して、１００ヌクレオチド長またはアミノ酸長の試験および参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが比較され、試験ポリペプチドにおけるそれぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸の高々１０％が、参照ヌクレオチド／ポリペプチドの対応するアライメント位置と異なるであろう、という事実を示す。差異は、ポリヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布する点突然変異として示されてもよく、または許容できる最大値まで変動する長さの１つまたは複数の位置において密集してもよく、たとえば、上記の「少なくとも９０％の同一性」の例については１００ヌクレオチド／アミノ酸のうちの１０の差異であってもよい。差異は、核酸またはアミノ酸の置換または欠失として定義されてもよい。
実質的に同一の核酸分子は、核酸の全長に沿ってまたは目的の完全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％に沿って、中程度のストリンジェンシー条件または高度なストリンジェンシー条件で典型的にハイブリダイズするであろう。コード配列の場合には、ハイブリダイズしている核酸分子におけるコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子もまた企図される。
本明細書において使用されるように、「ドメイン」は、分子、たとえば、構造上および／または機能的に分子の他の部分とは異なる、ポリペプチドまたはコードポリヌクレオチドの部分を指す。たとえば、Ｆｚｄ７は、配列番号６（マウス）および配列番号８（ヒト）として示されるポリペプチドの残基４５〜１６９を含む推定上のシステインに富むＷｎｔ結合ドメインを含む。ヒト／マウスＦｚｄ７ならびにマウスＦｚｄ８およびＦｚｄ３の間で示される相同性に基づいて（これらについては、それぞれのＷｎｔ結合ドメインの結晶構造が報告されている）、ヒト／マウスＦｚｄ７の残基５６、５８〜６０、および６２〜６４は、Ｗｎｔ７ａとの相互作用にとって特に重要であり得る。他の例として、配列番号６および８のそれぞれの最終の４残基は、推定上のＰＤＺ結合モチーフをコードする（特に配列番号６の残基５６９〜５７２および配列番号８の残基５７１〜５７４）（たとえばＤａｎｎら Ｎａｔｕｒｅ、４１２巻、２００１年７月５日、８６〜９０頁を参照されたい）。
本明細書において使用されるように、「遺伝子療法」は、ｅｘ ｖｉｖｏ技術およびｉｎ ｖｉｖｏ技術を含む。したがって、宿主細胞は、ポリヌクレオチドを用いてｅｘ ｖｉｖｏにおいて遺伝的に遺伝子操作することができ、遺伝子操作された細胞は、次いで、治療されることとなる患者に提供される。ｉｎ ｖｉｖｏにおける活性剤の送達は、目的の分子（たとえばＷｎｔ７ＡポリペプチドまたはＰＣＰシグナル伝達の他の活性化因子）を治療されている細胞または組織の中に有効に導入するプロセスを含んでいてもよい。ポリペプチドベースの活性剤の場合には、これは、直接またはその代わりに、活性ポリペプチドコード配列が発現され、ポリペプチドが細胞の機構によって産生されるように転写活性ＤＮＡを生細胞の中にトランスフェクトすることによって達成することができる。転写活性ＤＮＡは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストランによって容易にされるトランスフェクション、カチオン性リポソーム、およびレトロウイルスを含むが、これらに限定されないトランスフェクション方法を使用して、治療されている細胞または組織、たとえば筋肉の中に送達されてもよい。ある実施形態では、トランスフェクトされることとなるＤＮＡは、ベクターの中にクローニングされる。そのようなベクターは、宿主細胞内のＤＮＡの送達および発現に有効なプラスミドを含んでいてもよい。そのようなベクターは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）に由来するプラスミドまたはｈＰＧＫ−１もしくはｈＡＣＴなどのような他の適したプロモーターを含んでいてもよいが、これらに限定されない。
その代わりに、細胞は、当技術分野において公知の技術を使用するポリヌクレオチドの投与によってｉｎ ｖｉｖｏにおいて遺伝子操作することができる。たとえば、「ネイキッド」ポリヌクレオチド（ＦｅｉｇｎｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ３４９巻：３５１〜３５２頁；米国特許第５，６７９，６４７号）またはサポニンなどのような、細胞によるポリヌクレオチドの取り込みを容易にする１つもしくは複数の他の作用物質を有する組成物において製剤されたポリヌクレオチド（たとえば米国特許第５，７３９，１１８号を参照されたい）またはカチオン性ポリアミド（たとえば米国特許第５，８３７，５３３号を参照されたい）の直接的な注射によって；微粒子銃（たとえば「遺伝子銃」、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔの使用を通して）によって；脂質、細胞表面受容体、もしくはトランスフェクト作用物質を用いてポリヌクレオチドをコーティングすることによって；リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセルにおけるポリヌクレオチドのカプセル化によって；核に入ることが公知のペプチドに連結されたポリヌクレオチドの投与によって；または受容体を特異的に発現する細胞型を標的にするために使用することができる、受容体媒介性のエンドサイトーシスを受けやすいリガンドに連結されたポリヌクレオチドの投与によって（たとえばＷｕおよびＷｕ、（１９８７年）Ｊ： Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６２巻：４４２９〜４４３２頁を参照されたい）。
その代わりに、エンドソームを破壊して、ポリヌクレオチドがリソソーム分解を回避することを可能にするために、リガンドが融合性ウイルスペプチドを含むポリヌクレオチド−リガンド複合体を形成することができる；またはポリヌクレオチドは、特異的な受容体を標的とすることによってｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞特異的な取り込みおよび発現を標的とすることができる（たとえば、国際特許出願ＷＯ９２／０６１８０、ＷＯ９２／２２６３５、ＷＯ９２／２０３１６７ ＷＯ９３／１４１８８、およびＷＯ９３／２０２２１を参照されたい）。本発明はまた、相同組換えによる発現のための、ポリヌクレオチドの細胞内導入および宿主細胞ＤＮＡ内への続く組み込みをも企図する（たとえばＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ（１９８９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６巻：８９３２〜８９３５頁；Ｚｉｊｌｓｔｒａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ３４２巻：４３５〜４３８頁を参照されたい）。
ポリヌクレオチドは、適した発現ベクターの中に組み込むことができる。遺伝子療法の適用に適した多くのベクターは、当技術分野において公知であり（たとえばＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（２０００年）を参照されたい）、使用されてもよい。発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよい。プラスミドＤＮＡを生成および精製するための方法は迅速であり、簡単である。さらに、プラスミドＤＮＡは、典型的に、宿主細胞のゲノムの中に統合しないが、染色体統合が起こる可能性がある遺伝毒性の問題点を排除する、孤立性の要素として、エピソームの位置に維持される。様々なプラスミドは、現在、容易に、市販で入手可能であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｄおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｚｌｂｔｉｌｉｓに由来するものを含み、多くは、特に哺乳動物系における使用のために設計されている。本発明において使用されてもよいプラスミドの例は、発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡｄ／ＣＭＶ、およびｐＡｄ／ＴＲ５／ＧＦＰｑ（Ｍａｓｓｉｅら、（１９９８年）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８巻：５３〜６４頁）を含むが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、プラスミドは、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡｄＣＭＶ５（ＩＲＢ−ＮＲＣ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡｄＭＬＰ５（ＩＲＢ−ＮＲＣ）、またはｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
その代わりに、発現ベクターは、ウイルスベースのベクターとすることができる。ウイルスベースのベクターの例は、複製欠損レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、現在、特にヒトの中への、ｉｎ ｖｉｖｏにおける外因性遺伝子の移入のための最適な組換え遺伝子送達系である。これらのベクターは、細胞の中への遺伝子の効率的な送達を提供し、移入されたポリヌクレオチドは、宿主の染色体ＤＮＡの中に安定して統合される。レトロウイルスの使用についての主な前提条件は、特に細胞集団における野生型ウイルスの伝播の可能性に関する、それらの使用の安全性を確実にすることである。レトロウイルスベクターが由来してもよいレトロウイルスは、モロニーマウス白血病（Ｌｅｕｌｃｅｍｉａ）ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ニワトリ肉腫ウイルスなどのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病（ｌｅｕｌｃｏｓｉｓ）ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスを含むが、これらに限定されない。特異的なレトロウイルスは、当業者らに周知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭを含む。
ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるコードポリペプチドの発現を可能にする、適したプロモーターのコントロール下でベクターの中に普通組み込まれる。使用されてもよい、適したプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーター、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、および関連するリーダー配列またはＥ３プロモーターなどのようなアデノウイルスプロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどのような誘発性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ、ヒストン、ｐｏｔＩＩＩ、およびペクチンプロモーター；Ｂ １９パルボウイルスプロモーター；ＳＶ４０プロモーター；ならびにヒト成長ホルモンプロモーターを含むが、これらに限定されない。プロモーターはまた、目的の遺伝子についての本来のプロモーターであってもよい。適したプロモーターの選別は、ベクター、宿主細胞、およびコードタンパク質に依存性となるであろう、また、当業者の通常の技術の範囲内にあると考えられる。
複製欠陥レトロウイルスのみを産生する特殊化した細胞系（「パッケージング細胞」と名付けられる）の開発により、遺伝子療法のためのレトロウイルスの有用性が増加し、欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法の目的のための遺伝子移入における使用のために十分に特徴付けられている（検討のために、Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ． Ｄ．；１９９０年）Ｂｌｏｏｄ７６巻：２７１頁を参照されたい）。したがって、レトロウイルスコード配列（ｇａｇ、ｐｏｔ、ｅｎｖ）の一部が対象ポリヌクレオチドと交換され、レトロウイルス複製を欠陥させた組換えレトロウイルスを構築することができる。次いで、複製欠陥レトロウイルスは、標準の技術によってヘルパーウィルスの使用を通して、標的細胞を感染させるために使用することができるビリオンの中にパッケージされる。組換えレトロウイルスを産生するためのおよびそのようなウイルスを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞を感染させるためのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ． Ｍ．ら（編）、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、（１９８９年）、９．１０章〜９．１４章および他の標準の実験マニュアルにおいて見出すことができる。エコトロピックおよびアンホトロピックレトロウイルス系を調製するのに適したパッケージウイルス系の例は、Ｃｒｉｐ、Ｃｒｅ、２、およびＡｍを含む。パッケージ細胞の他の例は、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１巻、ｐａｓ．５−１４（１９９０年）において記載されるように、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｉ−２、ｙｒ− −３Ｓ ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１ ９−１４Ｘ、ＶＴ−１ ９− １ ７−Ｈ２、ＡＣＲＥ、ＳＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２、およびＤＡＮ細胞系を含むが、これらに限定されない。
さらに、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージタンパク質を修飾することによって、レトロウイルス、そして結果的にレトロウイルスベースのベクターの感染スペクトルを制限することが可能であることが示された（たとえばＰＣＴ公開Ｗ０９３／２５２３４およびＷ０９４／０６９２０を参照されたい）。たとえば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルの修飾のための戦略は、ウイルスｅｎｖタンパク質への、細胞表面抗原に特異的な抗体のカップリング（Ｒｏｕｘら（１９８９年）ＰＮＡＳ８６巻：９０７９〜９０８３頁；Ｊｕｌａｎら（１９９２年）Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ７３巻：３２５１〜３２５５頁；およびＧｏｕｄら（１９８３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６３巻：２５１〜２５４頁）；またはウイルスｅｎｖタンパク質への、細胞表面受容体リガンドのカップリング（Ｎｅｄａら（１９９１年）Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６６巻：１４１４３〜１４１４６頁）を含む。カップリングは、タンパク質または他の種類（たとえばｅｎｖタンパク質をアシアログリコプロテインに変換するためのラクトース）との化学的な架橋の形態とすることができる。同様にカップリングは、融合タンパク質（たとえば一本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）を生成することによるものとすることもできる。この技術はまた、感染をある種の組織型に制限し、または他の場合には指示するのに有用であるが、エコトロピックベクターをアンホトロピックベクターに変換するために使用することもできる。
さらに、レトロウイルス遺伝子送達の使用は、ベクター中に含有されるポリヌクレオチドの発現をコントロールする組織または細胞特異的な転写制御配列の使用によってさらに増強することができる。
遺伝子療法技術において有用な他のウイルスベクターは、アデノウイルス由来のベクターである。アデノウイルスのゲノムは、それが目的の遺伝子産物をコードし、発現するが、正常な溶菌性のウイルスライフサイクルにおいて複製するためのその能力の点から不活性化されるように操作することができる。たとえばＢｅｒｌｎｅｒら（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６巻：６１６頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２巻：４３１〜４３４頁；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２年）Ｃｅｌｌ６８巻：１４３〜１５５頁を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ型５ ｄｌ ３２４またはアデノウイルスの他の株（たとえばＡｄｚ、Ａｄ３、Ａｄｚなど）に由来する適したアデノウイルスベクターは、当業者らに周知である。組換えアデノウイルスは、末梢神経細胞を含む種々様々の細胞型を感染させるためにそれらを使用することができるという点で、ある種の状況において有利となり得る。さらに、ウイルス粒子は、精製および濃縮に対して比較的安定しており、適用可能であり、上記のように、感染性のスペクトルに影響を与えるように修飾することができる。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含有される外来性ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムの中に統合されないが、エピソームのままであり、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノムの中に統合される（たとえばレトロウイルスＤＮＡ）状況において挿入突然変異誘発の結果として起こり得る潜在的な問題を回避する。さらに、外来性ＤＮＡについてのアデノウイルスゲノムの運搬能は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（８キロベースまで）（Ｂｅｒｌｉｎｅｒら 前に記載；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．５７巻：２６７）。現在使用されており、かつ本発明によって企図されるほとんどの複製欠陥アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ２およびＥ３遺伝子のすべてまたは一部が欠失しているが、８０％ものアデノウイルス遺伝物質を保持している（たとえばＪｏｎｅｓら（１９７９年）Ｃｅｌｌ１６巻：６８３頁；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、前掲；およびＧｒａｈａｍら ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅ． Ｊ． Ｍｕｒｒａｙ編（Ｈｕｍａｎｅ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、１９９１年）第７巻１０９〜１２７頁を参照されたい）。複製欠陥ヒトアデノウイルスベクターの生成および増殖は、特有のヘルパー細胞系を必要とする。ヘルパー細胞系は、ヒト胎児由来腎臓細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉系細胞もしくはヒト胎児上皮細胞などのようなヒト細胞に由来してもよい。その代わりに、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容性である、つまり、複製欠損ウイルスの複製を可能にするのに必要な配列をトランスで提供する他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。そのような細胞は、たとえば、２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、または他のサル胎児間葉系細胞もしくはサル胎児上皮細胞を含む。豚またはウシアデノウイルスベクターなどのような非ヒトアデノウイルスベクターの使用もまた、企図される。適切なウイルスベクターおよびヘルパー細胞系の選別は、当業者の通常の技術の範囲内にある。
本明細書において使用されるように、「被験体」は、哺乳動物被験体であってもよく、たとえば、マウス、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、霊長類、またはヒトに限定されない。
組成物と多くの場合、区別なく使用される「医薬組成物」は、所望の効果を果たすための少なくとも１つの活性剤を含む。医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤をさらに含む。医薬組成物および医薬組成物を調製するための方法は、当技術分野において公知であり、たとえば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（旧名「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ（２０００年）において記載されている。
「細胞組成物」は、１つまたは複数の生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と一緒に細胞を含有する組成物である。細胞組成物は、１つまたは複数の活性剤をさらに含んでいてもよい。いくつかの場合では、細胞は、目的の遺伝子またはタンパク質を発現するように形質転換されてもよい。
「幹細胞組成物」は、１つまたは複数の生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と一緒に幹細胞を含有する組成物である。幹細胞組成物は、幹細胞調節因子などのような１つまたは複数の活性剤を含んでいてもよい。いくつかの場合では、幹細胞は、目的の遺伝子またはタンパク質を発現するように形質転換されてもよい。
「有効量」は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける有効量であってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、有効量はまた、「治療有効量」と称されてもよく、これは、１回または複数回の用量で患者に投与することができる。疾患または損傷の治療の点では、有効量は、疾患または損傷の進行を軽減する、回復させる、安定化する、逆転させる、または遅らせるのに十分な量であってもよい。有効量は、ケースバイケースで医師によって一般に決定され、当業者の技術の範囲内にある。有効量を達成するのに適切な投薬量を決定する場合、いくつかの因子が典型的に考慮に入れられる。これらの因子は、患者の年齢、性別、および体重、治療されている状態、状態および形態の重症度、ならびに投与される抗原結合断片の有効濃度を含む。
本明細書において使用されるように、用語「約」は、公称値からの＋／−５％の変動を指す。そのような変動は、それが明確に指示されるまたは指示されないに関わらず、本明細書において提供される任意の所定の値において常に含まれることが理解されたい。
本発明の実施形態は上記の定義の範囲内に含まれ、本発明を定義するためにそれに依存してもよい。
一態様において、活性剤として、幹細胞における平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達の調節因子を含む、幹細胞の分裂対称性を調節するための組成物が提供される。好ましくは、幹細胞は、成体幹細胞、たとえばサテライト幹細胞である。
いくつかの実施形態では、活性剤は、幹細胞の対称性分裂を促進することができるＰＣＰシグナル伝達の活性化因子である。活性化因子は、１つの分子または分子の組み合わせを含んでいてもよい。ＰＣＰシグナル伝達経路のポリペプチドおよびペプチドの活性化因子は、直接的な活性化因子およびＷｎｔ７ａシグナル伝達を阻害するタンパク質の活性または発現を阻害することによって、それらの活性化効果を及ぼす活性化因子、つまり間接的な活性化因子を含む。
本明細書において記載される組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて幹細胞増大を促進するのに有用である。サテライト幹細胞におけるＰＣＰ経路またはその構成成分の活性化が、細胞分裂の率に影響を与えることなく、対称性幹細胞分裂を促進して、主として幹細胞プールを増大させることが実証された。
活性剤は、たとえば、小分子、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、高分子、またはその組み合わせを含んでいてもよい。
Ｗｎｔ７ａおよびＦｚｄ７を含むＰＣＰ経路の構成成分は、種にわたって高度に保存される傾向がある。そのため、様々な種に由来するポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それらが所望の特質および活性を有する限り、本発明の範囲内に企図される。
いくつかの実施形態では、活性剤は、幹細胞上のＦｚｄ７に結合することおよび／またはそれを活性化することができるペプチドまたはポリペプチドを含む。Ｆｚｄ７は、配列番号６（マウス）および配列番号８（ヒト）として示されるポリペプチドの残基４５〜１６９を含む推定上のシステインに富むＷｎｔ結合ドメインを含む。ヒト／マウスＦｚｄ７ならびにマウスＦｚｄ８およびＦｚｄ３の間で示される相同性に基づいて（これらについては、それぞれのＷｎｔ結合ドメインの結晶構造が報告されている）、ヒト／マウスＦｚｄ７の残基５６、５８〜６０、および６２〜６４は、Ｗｎｔ７ａとの相互作用にとって特に重要であり得る。したがって、Ｆｚｄ７を活性化することができるポリペプチドは、Ｆｚｄ７のＷｎｔ結合ドメインに結合することができるポリペプチドを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、活性剤は、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な類似体、変異体、断片、もしくは誘導体である。例示的なＷｎｔ７ａポリペプチドは、図２２（配列番号２）および２４（配列番号４）において示され、これらは、それぞれ、ヒトまたはマウス配列である。
いくつかの実施形態では、活性剤は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドの配列またはＷｎｔ７ａポリペプチドと少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ７ａポリペプチドの配列は、配列番号２または配列番号４を含む。
いくつかの実施形態では、活性剤は、配列番号２もしくは配列番号４または配列番号２もしくは配列番号４と少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むアミノ酸配列を有するＷｎｔ７ａポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、同一性％は、少なくとも約５０、１００、２００、３００、またはそれ以上の隣接アミノ酸に対して評価される。いくつかの実施形態では、同一性％は、完全長の成熟ペプチド配列に対して評価される。
ある実施形態では、活性剤は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、ヒトＷｎｔ７ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、マウスＷｎｔ７ａポリペプチドである。他の種もまた、企図される。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号２または配列番号４を含むまたはそれから成るアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、活性剤は、Ｆｚｄ７に結合することおよび／またはそれを活性化することができるペプチドまたはポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド含む。Ｆｚｄ７に結合することおよび／またはそれを活性化することができるペプチドまたはポリペプチドは、上記に記載されるとおりであってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な類似体、変異体、断片、もしくは誘導体をコードする。
例示的なＷｎｔ７ａポリヌクレオチドは、図２１（配列番号１）および２３（配列番号３）において示され、これらは、それぞれ、マウス、ヒト配列である。
いくつかの実施形態では、活性剤は、配列番号２もしくは配列番号４または配列番号２もしくは配列番号４と少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、活性剤は、配列番号１もしくは配列番号３または配列番号１もしくは配列番号３と少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、同一性％は、少なくとも約５０、１００、２００、３００、５００、７５０、もしくは１００またはそれ以上の隣接ヌクレオチドに対して評価される。いくつかの実施形態では、同一性％は、完全長のポリヌクレオチドに対して評価される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号３を含むまたはそれから成るＷｎｔ７ａポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、活性剤は、Ｆｚｄ７に結合することおよび／またはそれを活性化することができる小分子である。
いくつかの実施形態では、活性剤は、幹細胞上のＦｚｄ７の発現を増加させることができるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、活性剤は、Ｆｚｄ７ポリヌクレオチドを含む。例示的なＦｚｄ７ポリヌクレオチドは、図２５（配列番号５）および２７（配列番号７）において示される。いくつかの実施形態では、活性剤は、配列番号６もしくは配列番号８または配列番号６もしくは配列番号８と少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｗｎｔ７ａシグナル伝達の調節因子、たとえば、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ３、Ｃｅｌｓｒ１、Ｃｅｌｓｒ２、Ｃｅｌｓｒ３、Ｄｖｌ１、Ｄｖｌ２、Ｄｖｌ３、Ｐｋ１、Ｐｋ２、Ｐｋ３、Ｐｋ４、Ｒａｃ／ＲｈｏＡ、Ｖａｎｇｌ１、Ｖａｎｇｌ２、シンデカン４（Ｓｙｎ４）、およびα７−β１−インテグリン、またはその活性な断片、変異体、もしくは誘導体に相当する。
いくつかの実施形態では、活性剤は、ＰＣＰ経路における下流エフェクター分子を調節し、それによって対称性細胞分裂を促進または阻害することができるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。成体幹細胞における細胞分裂決定に影響を与えるように調節されてもよい例示的な極性エフェクターは、Ｐｒｉｃｋｌｅ、Ｆｌａｍｉｎｇｏ（Ｃｅｌｓｒ２）、Ｄｉｓｈｅｖｌｅｄ（Ｄｓｈ）、またはＰＴＫ７を含む。ＰＣＰ経路における調節の例示的な標的は、Ｆｚｄ７、Ｖａｎｇｌ１、Ｖａｎｇｌ２、Ｄｖｌ２、Ｄｖｌ３、Ｐｋ１、Ｐｋ２、Ｃｅｌｓｒ２、およびα７−インテグリンを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、活性剤は、ＰＣＰ経路における下流エフェクター分子を活性化し、それによって対称性幹細胞分裂を促進することができるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。下流エフェクター分子は、たとえば、Ｖａｎｇｌ２、α７−インテグリン、Ｐｒｉｃｋｌｅ１、またはＣｅｌｓｒ２であってもよい。
一実施形態では、エフェクター分子は、Ｖａｎｇｌ２である。活性剤は、たとえば、細胞膜におけるＶａｎｇｌ２の発現または極性化した再分布を誘発することができるポリペプチドまたはポリヌクレオチドであってもよい。
いくつかの実施形態では、活性剤は、Ｖａｎｇｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。例示的なＶａｎｇｌ２ポリペプチドは、図３０（配列番号１０）および３２（配列番号１２）において示される。いくつかの実施形態では、Ｖａｎｇｌ２ポリペプチドは、野生型タンパク質と実質的に同一の活性を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、１つまたは複数の幹細胞調節因子をさらに含む。幹細胞調節因子は、たとえば、幹細胞増殖、分化、系列決定、または、運命決定された前駆細胞の最終分化の１つまたは複数を促進してもよい。
いくつかの実施形態では、調節因子は、幹細胞分裂の速度を増加させる。適した増殖因子などのような、幹細胞分裂率の任意の適した活性化因子もまた、使用することができる。公知の増殖因子は、ＦＧＦ、ＨＧＦ、およびＳＤＦを含む。いくつかの実施形態では、分化を促進することなく、幹細胞分裂率を増加させる増殖因子が選択される。
いくつかの実施形態では、調節因子は、増大している幹細胞の集団において増殖を増加させるものまたはＷｎｔ７ａを用いる処理によってあらかじめ増大させた幹細胞の集団において分化を促進するものである。
いくつかの実施形態では、幹細胞調節因子は、幹細胞生存を促進する。幹細胞の生存を増強する例示的な化合物は、たとえば、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）タンパク質を含むであろう。
いくつかの実施形態では、幹細胞調節因子は、標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害因子である。
一実施形態では、哺乳動物において、組織形成、再生、維持、または修復を増強するための組成物であって、活性剤として、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。
本発明の他の実施形態では、活性剤として、Ｆｚｄ７受容体の１つまたは複数の活性化因子を含む、対称性幹細胞分裂を促進するための組成物であって、１つまたは複数の活性化因子は、成体幹細胞においてＦｚｄ７受容体を活性化する、１つまたは複数の小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、高分子、抗体、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、サテライト幹細胞である。
本明細書において記載される組成物は、細胞または組織の中に目的のポリヌクレオチドを送達するために使用されてもよい。組成物は、たとえば、幹細胞の集団を増大させるためにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてまたはたとえば、遺伝子療法の方法においてｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与されてもよい。
目的のポリヌクレオチドは、細胞または組織の中に直接送達されてもよい（たとえばネイキッド）。より典型的には、ポリヌクレオチドは、コードポリペプチドを発現することができる発現ベクターの中にクローニングされるであろう。そのため、細胞または組織は、目的のポリペプチドを発現するように形質転換されてもよい。当技術分野において公知の任意の適した形質転換方法もまた、使用されてもよい。
様々な発現系は、当技術分野において公知であり、多くの供給源（たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を通して公に入手可能である。任意の適した発現ベクターを使用してもよい。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、プラスミドは、ウイルス由来のプラスミドである。いくつかの実施形態では、プラスミドは、ＣＭＶプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、ｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６を含む。一実施形態では、プラスミドは、Ｗｎｔ７ａ−ＣＭＶである。
遺伝子発現は、任意選択で、誘発性のプロモーターのコントロール下にあってもよい。いくつかの誘発性のプロモーターは、当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態では、組成物は、幹細胞におけるＰＣＰシグナル伝達を活性化し、それによって対称的な幹細胞増大を促進することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを運搬する発現ベクターを含む。
いくつかの実施形態では、細胞または組織は、幹細胞におけるＰＣＰシグナル伝達の調節因子を発現するように形質転換される。多くの例示的な調節因子は、上記に記載されている。
いくつかの実施形態では、細胞または組織は、Ｗｎｔ７ａを過剰発現するように形質転換され、それによって幹細胞の対称性分裂を誘発する。Ｗｎｔ７ａは、形質転換細胞から分泌されてもよく、それが分泌される細胞に作用してもよく、または近くの幹細胞に作用してもよい。いくつかの実施形態では、形質転換細胞は、幹細胞と同時培養されてもよいまたは同時投与されてもよいヘルパー細胞である。ヘルパー細胞はまた、Ｗｎｔ７ａまたは目的の他のタンパク質を過剰発現するように形質転換される組織における常在性の細胞であってもよい。
いくつかの実施形態では、ヘルパー細胞は、Ｗｎｔ７ａを過剰発現するように形質転換された筋芽細胞または筋細胞である。
いくつかの実施形態では、筋組織は、Ｗｎｔ７ａを過剰発現するように形質転換される。いくつかの実施形態では、筋組織は、骨格筋である。Ｗｎｔ７ａの過剰発現は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてサテライト幹細胞プールを増大させ、サテライト細胞数を増加させ、筋肉再生および修復を促進する。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、Ｆｚｄ７、Ｖａｎｇｌ２、α７−インテグリン、または幹細胞におけるＰＣＰシグナル伝達の他のエフェクターを過剰発現するように形質転換される。
いくつかの実施形態では、組成物は、細胞を含み、そのため、細胞組成物であってもよい。たとえば、組成物は、ヘルパー細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ヘルパー細胞は、Ｗｎｔ７ａを発現し、分泌するように形質転換される。いくつかの実施形態では、ヘルパー細胞は、筋芽細胞または筋細胞である。
いくつかの実施形態では、組成物は、幹細胞を含み、そのため、幹細胞組成物である。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、本発明による方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増大させてもよく、続いて、幹細胞組成物を形成するように本発明の組成物に追加されてもよい。たとえば、幹細胞は、本発明の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養し、増大させることができ、次いで、当業者らに公知の方法に従って治療用幹細胞組成物として被験体に投与することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、幹細胞および幹細胞におけるＰＣＰシグナル伝達の活性化因子を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、サテライト幹細胞である。
いくつかの実施形態では、組成物は、目的のポリヌクレオチドを発現するように形質転換された幹細胞を含む。当技術分野において公知の任意の適した形質転換方法もまた、使用されてもよい。
一実施形態では、組織再生または修復を増強するための組成物であって、幹細胞およびＰＣＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化因子またはエフェクターを含む組成物が提供される。ＰＣＰシグナル伝達の様々な活性化因子およびエフェクターは、上記に記載されている。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＣＰ経路の活性化因子またはエフェクター、たとえばＷｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、Ｖａｎｇｌ２を過剰発現するように形質転換された幹細胞を含む。
組成物は、生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含んでいてもよい。投与の様々なルートのための様々な医薬組成物を作製するための方法は、当技術分野において公知であり、後のセクションにおいてさらに記載される。
いくつかの実施形態では、組成物は、注射用に製剤される。たとえば、組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、心臓内注射、皮下注射、または腹膜腔内注射の１つまたは複数のために製剤されてもよい。一実施形態では、組成物は、全身性の注射のためのものである。一実施形態では、組成物は、筋肉内注射のためのものである。
いくつかの実施形態では、幹細胞増大を促進するための医薬の製造のための、本明細書において記載される組成物の使用が提供される。いくつかの実施形態では、幹細胞増大を促進するための医薬の製造における使用のための、本明細書において記載される組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、それを必要とする被験体において、筋肉の筋肉形成、維持、修復、または再生を促進するための医薬の製造のための、本明細書において記載される組成物の使用が提供される。他の態様では、それを必要とする被験体において、筋肉の筋肉形成、維持、修復、または再生を促進するための医薬の製造における使用のための、本明細書において記載される組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、組成物は、筋肉再生または修復の促進のためのものである。
組成物は、治療有効量などのような有効量で投与されてもよい。
本発明は、幹細胞を調節するための方法、特に、サテライト幹細胞などのような成体幹細胞の分裂対称性を調節するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて幹細胞の分裂対称性を調節するための方法であって、本明細書において記載されるような組成物と幹細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。
上記の実施形態において記載されるように、組成物は、活性剤として、幹細胞における平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達の調節因子を含む。
いくつかの実施形態では、活性剤は、幹細胞におけるＰＣＰシグナル伝達の活性化因子であり、方法は、それによって、幹細胞増大を促進する。そのような方法は、たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて幹細胞の集団における非対称性細胞分裂に対する対称性細胞分裂の相対的な割合を増加させるのに有用である。そのため、そのような方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて幹細胞の集団を増大させるのに有用である。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、幹細胞分裂の速度を改変することなく、対称性幹細胞分裂を促進することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、幹細胞の集団の生存を促進するのに有用であってもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与される。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏおける方法は、それを必要とする被験体に組成物を投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、サテライト幹細胞の集団を増大させるための方法であって、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物と幹細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、活性剤は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはその類似体、誘導体、変異体、もしくは活性な断片である。
いくつかの実施形態では、サテライト幹細胞増大を促進するための方法であって、Ｗｎｔ７ａまたはＦｚｄ７を活性化することができるその活性な断片、変異体、類似体、もしくは誘導体とサテライト幹細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。
他の実施形態では、組織におけるサテライト細胞の数を増加させ、それによって、組織の再生潜在能力の増強がもたらされる方法であって、本明細書において記載される組成物と幹細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、組織における常在性の幹細胞、たとえば筋組織における常在性のサテライト幹細胞の処理のためにｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用される。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ７ａを活性化し、内因性のＷｎｔ７ａの増加または内因性のＷｎｔ７ａ活性の増加をもたらす化合物を使用して、幹細胞増大を促進するための方法が提供される。Ｗｎｔ７ａ活性化因子は、Ｗｎｔ７ａの発現または活性を上方制御するためにｉｎ ｖｉｖｏにおいてＷｎｔ７ａの上流で作用するポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする遺伝子であってもよく、またはそれらは、小分子活性化因子であってもよい。Ｗｎｔ７ａ活性化因子は、たとえば、Ｗｎｔ７ａをコードする遺伝子の発現を上方制御するために遺伝子レベルで作用してもよく、またはそれらは、Ｗｎｔ７ａポリペプチドの活性を増加させるためにまたはＷｎｔ７ａの阻害因子の活性を減少させるために、タンパク質レベルで作用してもよい。Ｗｎｔ７ａ活性化因子は、たとえば、ポリペプチドおよびペプチド（または上記に記載されるように、ポリペプチドに対応する類似体、誘導体、変異体、もしくはペプチド模倣化合物）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、抗体もしくは抗体断片、または有機もしくは無機小分子とすることができる。
いくつかの実施形態では、方法は、１つまたは複数の幹細胞調節因子、たとえば、幹細胞分裂の速度を増加させるまたは幹細胞生存を増加させる調節因子と幹細胞を接触させるステップをさらに含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、被験体に細胞を投与するステップを含む。細胞は、たとえば、本明細書において記載される組成物と同時にまたは連続的に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、被験体に幹細胞を投与するステップを含む。幹細胞は、たとえば、幹細胞増大を促進する、本明細書において記載される組成物と同時にまたは連続的に投与されてもよい。たとえば、幹細胞は、組成物の投与に先立って投与されてもよい（つまり、組成物は所望の期間の後に投与されてもよい）。いくつかの実施形態では、組成物は、それ自体、投与されることとなる幹細胞を含んでいてもよい。
幹細胞は、続く実験用のまたは治療上の使用のためにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて維持され、増大させてもよい。いくつかの実施形態では、幹細胞、たとえばサテライト幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増大させ、続いて、それを必要とする被験体に投与される。たとえば、幹細胞は、本発明の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養し、増大させることができ、次いで、当業者らに公知の方法に従って治療用幹細胞組成物として患者に投与することができる。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、個体から得られ、培養において維持されてもよい。培養幹細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて対称的な増大を促進するために、Ｗｎｔ７ａまたはＰＣＰシグナル伝達の他の活性化因子を用いて処理されてもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、被験体にヘルパー細胞を投与するステップを含んでいてもよい。ヘルパー細胞は、たとえば、組成物と同時にまたは連続的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、それ自体、ヘルパー細胞を含んでいてもよい。
本発明はまた、Ｗｎｔ７ａ、その変異体もしくは活性な断片、またはＰＣＰシグナル伝達の他の活性化因子および任意選択で幹細胞調節因子をコードするポリヌクレオチドの投与を企図し、これらは、次いで、当技術分野において公知の様々な遺伝子療法の方法によってｉｎ ｖｉｖｏにおいてコード産物を発現する。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞または組織を形質転換するステップを含む。いくつかの例示的な方法は、上記に先に記載されている。形質転換の様々な方法は、当業者らに公知である。
いくつかの実施形態では、細胞または組織は、Ｗｎｔ７ａまたはその活性な断片もしくは変異体を発現するように形質転換され、これは、次いで、分泌され、Ｆｚｄ７受容体に結合することによって幹細胞の表面で作用する。
いくつかの実施形態では、ヘルパー細胞は、Ｗｎｔ７ａまたはその活性な断片もしくは変異体を過剰発現するように形質転換される。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、Ｆｚｄ７またはＶａｎｇｌ２などのようなＰＣＰシグナル伝達のエフェクターを発現するように形質転換される。
いくつかの実施形態では、サテライト幹細胞は、Ｗｎｔ７ａまたはその活性な断片もしくは変異体またはＰＣＰシグナル伝達の他の活性化因子を過剰発現するように形質転換される。一実施形態では、サテライト幹細胞は、Ｖａｎｇｌ２を過剰発現するように形質転換される。他の実施形態では、サテライト幹細胞は、Ｆｚｄ７を過剰発現するように形質転換される。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔ７ａまたは幹細胞におけるＰＣＰシグナル伝達の他の刺激因子、たとえば、Ｆｚｄ７の活性化因子を過剰発現し、分泌するように形質転換された、分化した細胞と共に同時培養される。
一実施形態では、サテライト幹細胞は、Ｗｎｔ７ａを過剰発現し、分泌するように、ＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａを用いて形質転換された筋細胞と共に同時培養される。
任意の適した発現ベクターは、先に記載されるものを含むが、これらに限定されない。ｉｎ ｖｉｖｏにおける方法が実行される場合、細胞または組織特異的なベクターまたはプロモーターもまた、使用されてもよい。一実施形態では、ベクターは、筋肉に特異的なＡＡＶベクターである。誘発性のプロモーターは、任意選択で使用されてもよい。
ＰＣＰシグナル伝達のポリペプチド活性化因子またはエフェクターは、細胞の中に直接導入され、ＤＮＡトランスフェクションステップを迂回してもよい。細胞の中にポリペプチドを直接送達するための手段は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、カチオン性脂質、およびウイルス融合タンパク質の構築を含むが、これらに限定されない。典型的に、ポリヌクレオチドを運搬する適した発現系のトランスフェクションが使用されるであろう。
幹細胞増大を促進するための方法は、幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増大を刺激し、それによって、それを必要とする被験体への移植または投与に適した細胞の集団を提供するために使用することができる。
投与されることとなる幹細胞は、幹細胞調節因子、たとえば幹細胞の生存を促進する調節因子を用いて処理されてもよい。幹細胞の増大、その後に続く増殖および／または分化を促進する連続的な方法もまた企図される。たとえば、幹細胞集団は、Ｗｎｔ７ａまたはＰＣＰシグナル伝達の他の活性化因子と、直接または間接的に、細胞を接触させることによってｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増大させてもよい。細胞の増大した集団は、次いで、たとえば、幹細胞の増殖および／もしくは分化をｉｎ ｓｉｔｕにおいて促進し、または幹細胞生存を促進する１つまたは複数の幹細胞調節因子を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて処理されてもよい。その代わりに、両方のステップは、被験体への細胞の投与に先立ってｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて行われてもよい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏは、時に、ｅｘ ｖｉｖｏと区別なく本明細書において使用される。ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ移植方法については、幹細胞は、自己、同種、または異種のものとすることができる。ドナー被験体からの幹細胞がそれを必要とするレシピエント被験体の中に移植される実施形態では、好ましくは、ドナーおよびレシピエントは、免疫適合性（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）が一致する。たとえば、限定することを望むものではないが、ドナーおよびレシピエントが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ））−クラスＩ（たとえば遺伝子座Ａ、Ｂ、Ｃ）および−クラスＩＩ（たとえば遺伝子座ＤＲ、ＤＱ、ＤＲＷ）抗原に対する適合性について一致していることが好ましい。ドナーおよびレシピエントの間の免疫適合性は、当技術分野において一般に公知の方法に従って決定されてもよい（たとえばＣｈａｒｒｏｎ， Ｄ． Ｊ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ．、３巻：４１６〜４２２頁（１９９６年）；Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｊ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ．、５巻：４１７〜４１８頁（１９９８年）；およびＢｏｉｓｊｏｌｙ， Ｈ． Ｍ．ら、Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、９３巻：１２９０〜１２９７頁（１９８６年）を参照されたい）。
本発明の一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、アデノウイルス由来のベクターである。
一実施形態では、Ｗｎｔ７ａ−ＣＭＶは、筋肉に特異的なプロモーターまたはベクターのコントロール下で患者に投与される。
いくつかの実施形態では、被験体は、ヒトである。
本明細書において記載される方法は、多くの適用を有する。たとえば、方法は、幹細胞の増大を促進するためにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて使用することができ、細胞は、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用のための、たとえば、研究または診断目的のためのものとなる。方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて幹細胞培養物を維持するために使用することができ、また、薬剤試験またはスクリーニングのための新しいｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるモデルの開発において潜在的な適用をも有する。
本明細書において記載される組成物および方法はまた、様々な治療上の適用にも有用である。特に、本明細書において記載される組成物および方法は、それを必要とする被験体において、組織形成、再生、修復、または維持を促進するのに有用である。いくつかの実施形態では、組織は、筋肉である。いくつかの実施形態では、筋肉は、骨格筋である。
関連する治療上の適用は、たとえば化学療法もしくは放射線療法の後に、筋肉傷害の後に、または筋肉を侵す疾患および状態の治療もしくは管理において、失ったまたは損傷した筋組織を再生する必要性がある状況に関係してもよい。いくつかの実施形態では、筋肉を侵す疾患または状態は、消耗性疾患（たとえば、癌もしくはＡＩＤＳなどのような病気と関連してもよい悪液質）、筋肉の減衰もしくは萎縮（たとえば、老化と関連してもよいサルコペニア）、ＩＣＵ誘発性の衰弱、長期間の非活動（たとえば昏睡、完全麻痺）、外科手術誘発性の衰弱（たとえば股関節置換術もしくは膝関節置換術の後の）、または筋変性疾患（たとえば筋ジストロフィー）を含んでいてもよい。この列挙は、網羅的なものではない。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される組成物および方法は、消耗性疾患または萎縮におけるように、組織の損失を予防する必要性がある場合に使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される組成物および方法は、特に、筋ジストロフィー、神経筋疾患および神経変性疾患、筋消耗疾患および状態、萎縮、心血管疾患、卒中、心不全、心筋梗塞、癌、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ならびにその他同種のものなどのような疾患および障害に関して、たとえば、損傷もしくは欠陥組織を交換するためにまたは筋萎縮もしくは筋量の損失を予防するために、筋組織において常在性の幹細胞または運命決定された前駆体細胞の割合を増加させる必要性があるまたはそれが望まれる場合に、使用される。
いくつかの実施形態では、方法は、変性筋障害の治療、管理、または予防においてサテライト幹細胞と共に使用することができる。
いくつかの実施形態では、組成物および方法は、たとえば筋変性疾患を有する被験体において、筋細胞形成を促進する、たとえば、機能障害性骨格筋を修復または再生するのに有用である。
そのため、被験体は、骨格筋損傷、変性または萎縮を有する、有することが疑われる、または有するリスクがある被験体であってもよい。骨格筋損傷は、疾患に関係するものでも疾患に関係しないものでもよい。ヒト被験体は、筋変性または筋消耗を示すヒト被験体でも、示すリスクがあるヒト被験体でもよい。筋変性または筋消耗は、疾患、たとえばエイズ、癌、筋肉変性疾患、またはその組み合わせによって、全体的にまたは部分的に引き起こされてもよい。
筋変性は、筋ジストロフィーなどのような筋変性疾患によるものであってもよい。
筋ジストロフィーの例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（シュタイネルト病としても公知）、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、およびエメリ−ドレフュス型筋ジストロフィーを含むが、これらに限定されない。たとえばＨｏｆｆｍａｎら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ、３１８巻．１３６３〜１３６８頁（１９８８年）；Ｂｏｎｎｅｍａｎｎ， Ｃ． Ｇ．ら、Ｃｕｒｅ Ｏｐｉｎ． Ｐｅｄ．、８巻：５６９〜５８２頁（１９９６年）；Ｗｏｒｔｏｎ， Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：７５５〜７５６頁（１９９５年）；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ， Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ． Ｄｉｓｏｒｄ．、９巻（２号）：１０８〜１１４頁（１９９９年）；Ｌｉｍ， Ｌ． Ｅ．およびＣａｍｐｂｅｌｌ， Ｋ． Ｐ．、Ｃｕｒｅ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．、１１巻（５号）：４４３〜４５２頁（１９９８年）；Ｖｏｉｔ， Ｔ．、Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ．、２０巻（２号）：６５〜７４頁（１９９８年）；Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｈ．、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ．、４８巻：４５７〜４６６頁（１９９７年）；Ｆｉｓｈｅｒ， Ｊ．およびＵｐａｄｈｙａｙａ， Ｍ．、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ． Ｄｉｓｏｒｄ．、７巻（１号）：５５〜６２頁（１９９７年）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。
尿禁制のいくつかの形態では、原因となる筋肉は、たとえば、筋肉のエレクトロポレーションによって、本発明の組成物または方法を用いて治療することができる。したがって、一実施形態では、方法は、尿失禁を治療するのに有用である。
一態様では、それを必要とする被験体において、筋肉形成、再生、または修復を促進するための方法であって、活性剤として、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を哺乳動物に投与するステップを含む方法が提供される。
他の態様では、それを必要とする被験体において、筋消耗、萎縮、または変性を予防するための方法であって、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、治療有効量の組成物を哺乳動物に投与するステップを含む方法が提供される。
いくつかの態様では、本明細書において記載される組成物および方法は、それを必要とするヒト被験体において、骨格筋の形成、維持、修復、または再生を促進するのに有用である。一態様では、哺乳動物において、組織形成、再生、維持、または修復を増強するための方法であって、活性剤として、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む方法が提供される。
筋細胞形成の促進は、さらに、一実施形態では、被験体の、たとえば非活動性萎縮またはサルコペニアの被験体における筋肉破壊または萎縮を予防または治療するためのものとすることができる。いくつかの実施形態では、組成物は、萎縮を治療または予防し、筋量を維持するために使用される。
筋細胞形成の促進はまた、一実施形態では、損傷筋組織を修復するためのものとすることができる。代替の実施形態では、筋細胞形成の促進は、被験体において筋量を増加させるためのものとすることができる。
さらなる実施形態では、損傷または機能障害性筋組織は、虚血性の事象によって引き起こされてもよい。たとえば、損傷筋組織は、心筋梗塞症または心不全などのような心血管の事象によって損傷した心筋であってもよい。
さらなる実施形態では、損傷または機能障害性筋組織は、心筋であってもよい。たとえば、損傷筋組織は、心筋梗塞症または心不全などのような心血管の事象によって損傷した心筋であってもよく、標的幹細胞は、心筋幹細胞となるであろう。本発明の他の態様に従って、哺乳動物において心筋幹細胞増大を促進するための方法であって、上述の哺乳動物に、本明細書において記載される、有効量の組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
本明細書において記載される組成物および方法は、所与の疾患、傷害、または状態のための他の公知の治療またはケアの基準と組み合わせて使用されてもよい。たとえば、筋ジストロフィーとの関連において、対称的な幹細胞増大を促進するための本発明の組成物は、ＣＴ−１、プレドニソン（ｐｒｅｇｎｉｓｏｎｅ）、またはミオスタチンのような化合物と共に投与することができる。治療は、一緒に、別々に、または連続的に施されてもよい。
本発明はまた、たとえば、ＰＣＰシグナル伝達経路の構成成分を阻害する化合物を使用して、対称的な幹細胞増大を阻害するための方法を企図する。他の態様では、非対称性幹細胞分裂を促進するための方法であって、ＰＣＰシグナル伝達の阻害因子と幹細胞または幹細胞の集団を接触させるステップを含む方法が提供される。
一態様では、活性剤が、幹細胞の対称性分裂を阻害することができるＰＣＰシグナル伝達の阻害因子である組成物が提供される。阻害因子は、たとえば、Ｗｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、またはＰＣＰ経路におけるエフェクター分子、たとえばＶａｎｇｌ２、α７−インテグリン、Ｐｒｉｃｋｌｅ１、もしくはＣｅｌｓｒ２の阻害を介して、ＰＣＰシグナル伝達を直接または間接的に阻害することができるペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子であってもよい。
いくつかの実施形態では、阻害因子は、Ｗｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、またはＰＣＰ経路におけるエフェクター分子の発現を阻害することができるポリヌクレオチド、たとえばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。一実施形態では、阻害因子は、Ｖａｎｇｌ２ ｓｉＲＮＡまたはＦｚｄ７ ｓｉＲＮＡである。
幹細胞におけるＰＣＰシグナル伝達の阻害は、たとえば、筋腫瘍である横紋筋肉腫の場合などのように癌の治療においてまたは進行性骨化性線維形成異常症などのような疾患を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、幹細胞における標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害因子と幹細胞を接触させるステップを含んでいてもよい。そのような阻害は、対称性幹細胞分裂をさらに促進してもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、幹細胞における標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のポリヌクレオチド阻害因子またはポリペプチド阻害因子を含んでいてもよい。
本発明は、Ｗｎｔ７ａ、その類似体、誘導体、変異体、または活性な断片、ＰＣＰシグナル伝達の他の活性化因子またはエフェクター、および薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。医薬組成物は、任意選択で、１つまたは複数の幹細胞調節因子、１つまたは複数の幹細胞、またはその組み合わせをさらに含んでいてもよい。医薬組成物の投与は、局所的なまたは全身性の治療が所望されるかどうかおよび治療されることとなるエリアに依存して多くのルートを介するものであってもよい。典型的に、組成物は、治療されることとなるエリアに全身的にまたは局所的に投与される。
投与は、局部（点眼用のならびに膣および直腸の送達を含む粘膜への、を含む）、肺（たとえば、ネブライザーによるものを含む、散剤またはエアロゾルの吸入または通気によって）、気管内、鼻腔内、表皮、および経皮的、経口、または非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射を含み、たとえば、心臓内注射もしくは注入または頭蓋内、たとえば鞘内もしくは脳室内投与を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組成物は、注射または注入によって投与される。
本発明の組成物は、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて送達されてもよい。好ましくは、そのようなビヒクルは、安定性および／または送達特性を増強するであろう。例として、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルを含む。本発明の様々な実施形態では、そのようなビヒクルの使用は、活性な構成成分の徐放を達成するのに有益であってもよい。非経口注射用に製剤される場合、医薬組成物は、好ましくは、他の溶質、たとえば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコースを含有する滅菌溶液の形態で使用される。
吸入または通気による投与については、医薬組成物は、水性または部分的に水性の溶液の中に製剤することができ、これは、次いで、エアロゾルの形態で利用することができる。局部の使用については、調節因子または調節因子を含む医薬組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中で、粉剤、クリーム剤、またはローション剤として製剤することができ、これらは、皮膚の患部に適用される。
いくつかの実施形態において、組成物が、Ｗｎｔ７ａなどのようなパルミトイル化タンパク質を含む場合、脂質担体は、使用されてもよい。
医薬組成物についての投薬条件は、使用される特定の組成物、投与のルート、および治療されている特定の被験体により変動する。投薬条件は、当業者に公知の標準の臨床技術によって決定することができる。治療は、それぞれの化合物の最適用量未満の低投薬量で一般に開始されるであろう。その後、このような状況下での最適の効果が到達されるまで、投薬量は増加する。一般に、医薬組成物は、あらゆる有害なまたは有毒性の副作用を引き起こすことなく、有効な結果を一般にもたらす濃度で投与される。投与は、１回のユニット用量とすることができるまたは所望の場合、投薬量は、１日を通じて適した時間に投与される好都合なサブユニットに分割することができる。
幹細胞を処理するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法が使用される場合、幹細胞は、様々な手順によって被験体に投与することができる。典型的に、幹細胞の投与は、局所化される。幹細胞は、薬学的に許容される液体培地中の細胞懸濁液として注射によって投与することができる。その代わりに、幹細胞は、ｉｎ ｓｉｔｅにおいて半固体または固体マトリックスであるか、またはそれになる生体適合性の培地中で投与することができる。たとえば、マトリックスは、組織損傷または変性の部位で、コラーゲンおよび／もしくはその誘導体、ポリ乳酸、またはポリグリコール酸を含むマトリックスなどのような半固体ゲルを形成する注射可能な液体であってもよく、または浸透性繊維マトリックスなどのようなその最終形態で植え込まれる、１つまたは複数の層の軟性固体マトリックスを含んでいてもよい。そのようなマトリックスは、当技術分野において公知であり（たとえば、Ｕｐｊｏｈｎ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、Ｍｉｃｈ．から入手可能なＧｅｌｆｏａｍ）、傷害の部位の適所に細胞を保持するように機能し、これにより、投与された細胞が増大し、それによって、幹細胞の貯蔵所が発達する可能性を増強する。
幹細胞は、いくつかの時点で凍結保存されてもよいまたはされなくてもよい。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、移植の後に、幹細胞枯渇の危険性を最小限にするために幹細胞増大を促進するための化合物が投与される。いくつかの実施形態では、移植された幹細胞は、Ｆｚｄ７またはＶａｎｇｌ２などのようなＰＣＰシグナル伝達の活性化因子を過剰発現するように形質転換されている。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔ７ａを過剰発現し、分泌するように形質転換された筋細胞または他のサテライト細胞と共に同時投与される。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、筋肉内に注射される。
好ましい実施形態では、サテライト幹細胞またはサテライト幹細胞を含む組成物は、筋組織の中に、好ましくは、患部、傷害、または損傷組織に近位のエリアに注射される。しかしながら、循環へのまたは遠位の部位での注射もまた、企図される。心臓内投与もまた、企図される。
本発明は、幹細胞増大を促進し、または組織（たとえば筋肉）形成、修復、再生、もしくは維持を促進する際の使用のための、１つまたは複数の説明書と一緒に本明細書において記載される組成物を含むキットをさらに提供する。
本発明は、医薬組成物中に、幹細胞におけるＰＣＰ経路の１つまたは複数の調節因子を含有する治療用キットをさらに提供する。
本発明は、医薬組成物中に、Ｗｎｔ７ａ、その類似体、誘導体、変異体、もしくは活性な断片、またはＰＣＰシグナル伝達の他の活性化因子および任意選択で１つまたは複数の幹細胞調節因子を含有する治療用または診断キットをさらに提供する。
キットの個々の構成成分は、別々の容器中にパッケージされるであろう、また、そのような容器と関連して、薬または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって決められた形態での通知とすることができ、この通知は、ヒトまたは動物への投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を表わす。
キットの構成成分が１つまたは複数の液体溶液中に提供されてもよい場合、液体溶液は、水溶液、たとえば滅菌水溶液とすることができる。この場合、容器手段は、それ自体、組成物がそれから患者に投与されてもよい吸入器、注射器、ピペット、点眼びん、または他のそのような同様な器具であってもよい。
キットの構成成分はまた、乾燥または凍結乾燥形態で提供されてもよく、キットは、凍結乾燥された構成成分の還元に適した溶媒をさらに含有することができる。容器の数またはタイプに関係なく、本発明のキットはまた、患者への組成物の投与を支援する機器を含んでいてもよい。そのような機器は、吸入器、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼びん、または任意のそのような医学的に承認された送達ビヒクルであってもよい。
さらに、移植における幹細胞の使用に加えて、幹細胞または幹細胞を含む組成物は、研究ツールおよび／または診断アッセイまたはキットの一部として使用されてもよい。限定することを望むものではないが、キットは、筋肉幹細胞、Ｗｎｔ ７ａシグナル伝達のプロモーター、培養液または増殖培地、細胞凍結保存培地、１つまたは複数の薬学的に許容される送達培地、１つまたは複数のヌクレオチド配列または遺伝子構築物、それを必要とする被験体への細胞の植え込みまたは送達のための１つまたは複数のデバイス、本明細書において記載される細胞を使用する、送達する、植え込む、培養する、凍結保存する、またはその任意の組み合わせのための説明書を含んでいてもよい。
単独でのまたは他の幹細胞調節因子と組み合わせたＷｎｔ７ａ、その類似体、誘導体、変異体、および活性な断片またはＰＣＰの活性化因子もしくはエフェクターの、幹細胞増大を促進するための能力は、本明細書において記載されるものを含むが、これらに限定されない標準の技術を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験することができる。１つまたは複数の阻害因子による幹細胞増大の阻害もまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて測定することができる。
幹細胞増大の候補活性化因子および阻害因子もまた、当業者らに公知のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を使用して、試験し、同定することができる。培養中の幹細胞を維持するための方法は、当技術分野において公知である（たとえばＭａｄｌａｍｂａｙａｎ， Ｇ．Ｊ．ら、（２００１年）Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ． Ｓｔｅｍ ＣｅｌｌＲｅｓ．１０号、４８１〜４９２頁；Ｈｉｅｒｌｉｈｙ， Ａ．Ｍ．ら、（２００２年）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５３０号、２３９〜２４３頁；Ａｓａｋｕｒａ， Ａ．ら、（２００２年）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５９号、１２３〜１３４頁を参照されたい）。幹細胞は、単一培養物（ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ）として単独で培養することができ、またはそれらは、エデュケーター細胞（ｅｄｕｃａｔｏｒ ｃｅｌｌ）と同時培養することができる。細胞集団を同定するもしくは単離するためのまたは他の場合にはアッセイの成功に寄与するステップなどのようなさらなるステップは、培養期間の前に、その間、またはその後に、スクリーニング方法において含まれていてもよい。たとえば、増殖因子または他の化合物は、幹細胞集団を単離し、増大させるために使用されてもよい。ＥＧＦおよびＦＧＦは、Ｇｒｉｔｔｉらによって記載されるように、神経幹細胞と共にこの目的のために使用されており（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９９年）１９号：３２８７〜３２９７頁）、１３ｃ１−２は、「筋肉幹細胞」集団の単離において使用されている（米国特許第６，３３７，１８４号を参照されたい）。一実施形態では、培養液は、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＣＳにおいて使用される。
当技術分野において公知の様々なスクリーニング方法は、Ｗｎｔ７ａまたはＶａｎｇｌ２などのようなＰＣＰ経路の他の構成成分の候補活性化因子を同定するために使用することができる。たとえば、標的遺伝子を上方制御または下方制御する活性化因子は、標的遺伝子の発現の増加または減少のための候補活性化因子を用いて処理された細胞をモニターすることによって同定することができる。ノーザンブロット分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、またはマイクロアレイ分析などのような方法は、この目的のために使用することができる。その代わりに、対応するタンパク質レベルの増加または減少は、たとえば、ウエスタンブロット分析によってモニターすることができる。
特異的なタンパク質、たとえばＦｚｄ７に結合するポリペプチド活性化因子またはペプチド活性化因子（またはポリペプチドに対応する類似体、誘導体、変異体、もしくはペプチド模倣化合物）については、結合能力は、当技術分野において公知の様々な結合アッセイのうちの１つを使用して決定することができる（たとえばＣｏｌｉｇａｎら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい）。
抗体または抗体断片活性化因子については、様々なイムノアッセイを使用することができる。
対称性幹細胞分裂の潜在的なエンハンサーを同定するために、幹細胞の集団を培養し、様々な試験化合物に曝露することができる。さらに、幹細胞は、目的の様々な試験遺伝子を発現させるためにトランスフェクトすることができる。その代わりに、幹細胞は、「エデュケーター」細胞と共に同時培養することができ、エデュケーター細胞は、試験化合物（複数可）に曝露され、増大の少なくとも１つの指標は、続いて、幹細胞においてモニターされる。エデュケーター細胞は、同時培養に先立ってまたはその間に試験化合物（複数可）に曝露されてもよい。様々な組織に由来する成体幹細胞を使用することができる。例として、心筋または骨格筋、膵臓組織、神経組織、肝臓組織、または骨髄、造血性細胞、筋芽細胞、肝細胞、胸腺細胞、心筋細胞、およびその他同種のものからの幹細胞を含むが、これらに限定されない。胚性幹細胞もまた、使用されてもよい。
一般に、化合物は、一連の濃度、典型的に約１０００倍の範囲にわたって試験され、適した曝露プロトコールは、当業者によって容易に確立することができる。同時培養が使用される場合、化合物への幹細胞曝露は、エデュケーター細胞への幹細胞の最初の曝露の前に、その間に、またはその後に行うことができる。
その代わりに、試験化合物が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドもしくはペプチドなどのような、ポリヌクレオチドによってコードされる化合物である場合、幹細胞は、試験化合物が内因的に産生されるように、本明細書においておよび他のところで記載される標準の方法を使用して、核酸またはポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトすることができる。さらに、幹細胞は、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされ、試験化合物を発現する他の細胞系との幹細胞の同時培養によって試験化合物に曝露することができる。
上記に示されるように、幹細胞が化合物に直接曝露されなくてもよいことがさらに企図される。たとえば、エデュケーター細胞集団または第３の細胞型は、化合物を用いて最初に処理し、続いて、幹細胞と共に同時培養することができる。その代わりに、幹細胞は、それ自体は同時培養において含まれない、そのような細胞集団によって調節された培地の追加によって間接的に曝露することができる。さらに、幹細胞は、培養の非液体培地、たとえば、寒天、ポリマー骨格、マトリックス、または他の構築物などのような固体、ゲル、または半固体成長支持体の中に組み込まれた化合物に曝露されてもよいことが企図される。
幹細胞増大の指標は、質的にまたは定量的にモニターされてもよく、たとえば、全体の形態、総細胞数、組織学的検査、組織化学、もしくは免疫組織化学的検査における変化または特異的な細胞マーカーの存在、不在、もしくは相対的なレベルを含む。細胞マーカーの存在、不在、または相対的なレベルは、たとえば組織化学的技術、免疫学的技術、電気泳動、ウエスタンブロット分析、ＦＡＣＳ分析、フローサイトメトリー、およびその他同種のものによって分析することができる。その代わりに、細胞マーカータンパク質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの存在は、たとえば、ＰＣＲ技術、ノーザンブロット分析、適したオリゴヌクレオチドプローブの使用、およびその他同種のものを使用して検出することができる。
Ｗｎｔ７ａ（または他のＰＣＰ活性化因子もしくはエフェクター）および幹細胞調節因子の両方を用いて処理される細胞については、分化の１つまたは複数の指標はまた、調節因子を用いる処理の後に幹細胞集団においてモニターされてもよい。典型的に、分化は、上記に記載されるように、全体の形態における変化によって、または上記に示されるように多くの標準の技術を使用して分析することができる系列特異的な細胞マーカーの存在によってモニターされる。モニターすることができる適した系列特異的な細胞マーカーは、当技術分野において公知である。
さらなるスクリーニング方法は、幹細胞増大を促進し、または筋肉再生および修復を促進することができる新しい調節因子を同定するために使用されてもよい。
本発明の一態様では、筋肉の修復または再生において有用な化合物についてスクリーニングするための方法が提供される。たとえば、方法は、（ａ）サテライト幹細胞の集団を提供するステップ；（ｂ）試験化合物を用いて幹細胞を処理するステップ；および（ｃ）対照と比較した、処理された幹細胞の非対称性分裂に対する対称性分裂の割合を決定するステップを含み、対照と比較した、対称性分裂の割合の増加は、化合物が筋肉の修復または再生において有用であることを示す方法が提供される。
本発明の他の態様では、筋肉の修復または再生において有用な化合物についてスクリーニングするための方法が提供される。たとえば、方法は、（ａ）サテライト幹細胞の集団を提供するステップ；（ｂ）試験化合物を用いて幹細胞を処理するステップ；および（ｃ）化合物が、処理された幹細胞において、ＰＣＰシグナル伝達を活性化し、刺激するかどうかを決定するステップを含み、ＰＣＰシグナル伝達の増加は、化合物が筋肉の修復または再生において有用であることを示す方法が提供される。
いくつかの実施形態では、ＰＣＰシグナル伝達の刺激は、Ｆｚｄ７の活性化を介して起こる。いくつかの実施形態では、増加は、少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれ以上の増加である。
任意選択で１つまたは複数の幹細胞調節因子と組み合わせた、Ｗｎｔ７ａ、その類似体、誘導体、変異体、および活性な断片または幹細胞増大を促進するための、ＰＣＰシグナル伝達の他の活性化因子もしくはエフェクターの能力は、適切な実験動物における常在性の幹細胞集団に対してｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験されてもよい。同様に、阻害因子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験されてもよい。典型的に、試験化合物（複数可）は、たとえば注射によって、調査されている組織に直接投与される。適した期間の後に、細胞は動物から採取され、幹細胞集団は、上記に記載されるように分析される。
所望の場合、阻害因子、たとえば、標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害因子もまた、試験することができる。化合物および阻害因子は、幹細胞に同時に提供されてもよく、または化合物は、阻害因子の前にまたはその後に提供されてもよい。
一実施形態では、化合物が幹細胞増大を促進する能力は、マウス骨格筋組織においてｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験される。処理されるマウスから単離されるサテライト幹細胞の増加は、モニターされ、未処理のまたはバッファーもしくは食塩水などのようなプラセボを用いて処理される対照マウスのものと比較される。本発明の一実施形態に従って、サテライト幹細胞集団がたとえば対照と比較して少なくとも約１０％増加する場合、化合物は、幹細胞増大を促進すると考えられる。他の尺度は、非対称性分裂に対する対称性分裂の割合の増加である。幹細胞の増加は、少なくとも２４時間以上の時間にわたって、典型的に少なくとも９６時間の期間にわたって測定される。
Ｗｎｔ７ａ、その類似体、誘導体、変異体、および活性な断片または損傷もしくは機能障害性組織を修復するための他のＰＣＰ活性化因子もしくはエフェクターの能力は、適した動物モデルにおいて試験することができる。例示的な動物モデルは、方法のセクションにおいて記載される。たとえば、化合物（複数可）および治療が損傷筋組織を修復する能力は、凍結誘発性のまたは心臓毒誘発性の筋損傷に曝露されたマウスに化合物（複数可）または治療を施し、損傷筋肉の修復をモニターすることによって、試験することができる（Ｍｅｇｅｎｅｙら（１９９６年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１０号：１１７３〜１１８３頁；Ａｓａｋｕｒａら（２０００年）Ｊ： Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５９号：１２３〜１３４頁を参照されたい）。
少なくとも１つの他の幹細胞マーカーと組み合わせて使用された場合に、Ｆｚｄ７が、サテライト幹細胞についてのマーカーとして使用されてもよいことが実証された。この特徴は、続く分析、治療、および／または移植のために幹細胞を同定または単離するために使用することができる。Ｆｚｄ７が静止状態のサテライト幹細胞上に特に発現されたことが分かった。そのため、幹細胞における増殖状態のマーカーとしてＦｚｄ７を使用することができる。
サテライト幹細胞は、ＹＦＰ−またはＭｙｆ−と組み合わせてマーカーＰａｘ７＋について選択することによって、同定されてもよく、または単離されてもよいこともまた実証された。一実施形態では、特質であるＹＦＰ−／Ｐａｘ７＋に基づいてサテライト幹細胞を同定または単離するための方法が提供される。方法は、続く分析、治療、および／または移植のために細胞を同定し、単離するために使用することができる。
実験結果の概要
このセクションは、実施例において下記に記載される研究結果の概要である。本発明の範囲は、本概要の内容または続く実施例に決して限定されない。
本発明者らは、以前に、サテライト幹細胞の小さな集団を同定し、サテライト細胞が、幹細胞および前駆細胞の不均質の集団に相当することを報告した。サテライト幹細胞は、移植の後に、自己再生およびサテライト細胞ニッチの長期的な再構成ができることが示された（Ｋｕａｎｇら、２００７年）。
熱心な研究努力を通して、本発明者らは、非標準的なＷｎｔ受容体Ｆｚｄ７が静止状態のサテライト細胞において特異的に発現されることをここで決定した（図４）。Ｗｎｔ７ａは、Ｆｚｄ７に対する候補リガンドとして検査した。発明者らは、リアルタイムＰＣＲおよび免疫組織化学的検査によって、Ｗｎｔ７ａが、再生の筋形成の間に新しく形成された筋線維において著しく上方制御され（図５Ｂ、５Ｅ）、Ｆｚｄ７受容体が、筋原細胞の表面でのＷｎｔ７ａ結合に必要である（図５Ｃ）ことを発見した。サテライト幹細胞は、頂底非対称性細胞分裂を受けて、Ｍｙｆ５を発現する、運命決定された筋原細胞の元となり、自己再生を通してそれらの集団を維持する。その代わりに、サテライト幹細胞は、平面対称性細胞分裂を受けて、それらの集団の増大を駆動することができる（Ｋｕａｎｇら、２００７）。重要なことには、本発明者らは、組換えＷｎｔ７ａタンパク質が、サテライト幹細胞の対称性の増大を劇的に刺激し、この増大が、共に平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達経路の構成成分であるＦｚｄ７およびＶａｎｇｌ２（図６および８）を必要としたことを発見した。さらに、Ｗｎｔ７ａは、Ｗｎｔ７ａ活性化ＰＣＰシグナル伝達と一致する方法で、対の分裂細胞において、両極に、Ｖａｎｇｌ２の極性化された局所化を誘発した（図７）。筋肉再生の間のＷｎｔ７ａの過剰発現は、再生プロセスの印象的な増強をもたらし、筋芽細胞増殖または分化に対する効果と無関係に、より大きな径の、より多くの線維を生成した（図９）。重要なことには、Ｗｎｔ７ａ過剰発現は、サテライト幹細胞集団の大規模な増大をもたらし、Ｗｎｔ７ａ損失により、サテライト細胞コンパートメントの維持が損なわれた（図１０）。これらの結果は、サテライト細胞自己再生の、分子による制御に対する重要な新しい見識を提供し、Ｗｎｔ非標準的ＰＣＰ経路を成体幹細胞機能の制御に初めて結び付けるものである。
Ｗｎｔ−ＰＣＰ経路は、ショウジョウバエにおける上皮細胞の組織的な方向付けによるなどのような、組織内の細胞の極性を設定することによるパターンニングにおいて役割を果たす（Ｚａｌｌｅｎ、２００７年）。脊椎動物において、ＰＣＰシグナル伝達および特にそのエフェクターＶａｎｇｌ２（Ｓｔｒａｂｉｓｍｕｓとしても公知）は、蝸牛における不動毛束の極性化に（Ｍｏｎｔｃｏｕｑｕｉｏｌら、２００３年）、原腸形成および神経胚形成（Ｔｏｒｂａｎら、２００４年）、神経管閉鎖（Ｔｏｒｂａｎら、２００８年）を制御する収斂伸長（ＣＥ）運動に、ならびに発達中の筋分節におけるミオサイト方向付けを制御する際に（Ｇｒｏｓら、２００９年）必要とされる。ゼブラフィッシュの神経胚形成の間に、Ｖａｎｇｌ２の損失は、神経上皮の中への娘細胞の再インターカレーションを予防することによって、神経竜骨（ｎｅｕｒａｌ ｋｅｅｌ）細胞の極性化を抑止し、異所性の神経前駆体の蓄積がもたらされる（Ｃｉｒｕｎａら、２００６年）。本明細書において提示される発見に基づいて、サテライト幹細胞の対称性の増大は、幹細胞分裂の軸のＰＣＰ媒介性の方向付けに起因することがここで提唱される。ＰＣＰが、エフェクタータンパク質の再分布に依存する位置的なシグナル伝達であるので、娘細胞の両極上のＰＣＰコア分子の極性化は、両方の細胞が基底膜との接触を維持することを可能にし、したがって、ニッチに関するそれらの方向付けを保つ（図７）。特に、Ｗｎｔ７ａは、Ｖａｎｇｌ２およびα７−インテグリンの極性化した分布を誘発した（図７Ｅ）。α７−インテグリンが上方制御され、極性化された局所化は、両方の娘細胞が基底膜に付着し続けることを可能にする。対照的に、α７−インテグリン発現は、頂底に方向付けられた細胞分裂において、低下し、均一に分布する。筋細胞膜の方へ「押され」、したがって基底膜との接触を失う娘細胞は、Ｍｙｆ５転写を活性化し、前駆体状態に運命決定する（Ｋｕａｎｇら、２００７年）。そのため、これらのデータは、ＰＣＰ経路が、頂底細胞分裂および運命決定をコントロールし、基底膜への接着を促進するメカニズムを通して機能するメカニズムと交わることを示唆する。
実験は、対の娘細胞の極でのＶａｎｇｌ２タンパク質の極性化した分布が、両方の細胞が基底膜に付着し続けることを可能にし、そのため、幹細胞状態を維持し、幹細胞集団の増大をもたらすことを示唆する。続く細胞分裂により、正常な増大および分化を行う頂底非対称性分裂を通して、より多くの運命決定された娘細胞を生成するであろう（図９）。発明者らは、以前に、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−サテライト幹細胞の割合が傷害の３週間後に１０％〜約３０％増加したことを述べ（Ｋｕａｎｇら、２００７年）、発明者らは、Ｗｎｔ７ａの過剰発現が５０％までレベルをさらに増加させたことをここで実証した（図１０Ｃ、１０Ｄ）。対照的に、サテライト細胞数は、傷害および再生の後にＷｎｔ７ａ欠損筋肉において３６％減少した（図１０Ｇ）。これらのデータは、Ｗｎｔ７ａが、再生筋形成の間に、サテライト幹細胞増大の増加を調節することによってサテライト幹細胞プールの恒常性の維持を制御し、ＰＣＰシグナル伝達の基本的なレベルでは、正常なレベルのサテライト細胞プールを維持するのに不十分であることを示唆する。
標準的なＷｎｔシグナル伝達は、筋原性の成長および分化を制御する際に十分に立証された役割を果たす。本明細書において記載される実験は、Ｗｎｔ３ａを使用するＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化が、運命決定および対称性の増大の間のサテライト幹細胞選択に干渉しなかったことを示す（図６Ｂ、６Ｄ）。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＷｎｔ３ａの過剰発現は、おそらく、未熟な分化およびサイズが低下した筋線維の形成を促進することによって、再生を損なうように見えた（図９）。実際に、単一の筋線維上のサテライト細胞のＷｎｔ３ａ刺激は、Ｐａｘ７−／ＭｙｏＤ＋細胞の数の著しい増加によって証明されるようにそれらの分化を駆動した（データ示さず）。しかしながら、Ｗｎｔ３ａ発現は、リアルタイムＰＣＲによって未損傷または再生骨格筋において検出されなかった。可能性として、Ｗｎｔ１０ａ（図５Ｂ）などのような他の上方制御されたＷｎｔが、筋原細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化するように機能し得る。さらに、Ｗｎｔ阻害因子ｓＦＲＰの大きな上方制御が、再生のプロセスの早期のステージの間に観察された。これは、筋原性の前駆体の増殖を可能にする標準的なＷｎｔシグナル伝達を阻害する生理学的なフィードバック系を示し得る。したがって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害は、筋肉再生を促進するように作用するであろうということが仮定される。
アフリカツメガエル胚では、Ｖａｎｇｌ２ホモログＳｔｒａｂｉｓｍｕｓは、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄについて競合することによって、Ｗｎｔ／β−カテニンにより活性化される転写を阻害する（ＰａｒｋおよびＭｏｏｎ、２００２年）。したがって、理論によって拘束されることを望むものではないが、ＰＣＰシグナル伝達はまた、標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に拮抗することによって、サテライト幹細胞が運命決定されていない状態に保つように作用し得る。ショウジョウバエの目の発達では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）／ＰＣＰシグナル伝達は、Ｒ４におけるＮｏｔｃｈ活性化の制御を通してＲ３／Ｒ４光受容体の細胞運命特定を誘発する（ｄｅｌ ＡｌａｍｏおよびＭｌｏｄｚｉｋ、２００６年）。これは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＰＣＰならびにＮｏｔｃｈ経路およびＷｎｔ／β−カテニン経路の間の相互干渉が、自己再生／運命決定対増大の間のサテライト幹細胞選択を調節するように作用する可能性を高める。サテライト幹細胞の分子のキャラクタリゼーションは、それらの機能を制御する分子のメカニズムへの重要な洞察をもたらす。Ｗｎｔ７ａ／Ｆｚｄ７／Ｖａｎｇｌ２情報伝達カスケードについての役割の現在の同定は、サテライト幹細胞の対称性の増大を制御する際のＰＣＰ経路についての予期されない役割を明らかにする。この発見は、サテライト細胞の生物学および筋肉再生についての発明者らの理解における有意な進歩を示す。今後の実験は、神経筋疾患における筋肉機能の損失を回復させることに向けて筋肉再生を増すようにＰＣＰ経路を調節する有用性の両方について調査することとする。
（実施例１）
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７は、静止状態のサテライト幹細胞において高度に発現される。
サテライト細胞は、幹細胞および運命決定された前駆体から構成される不均質の集団である。サテライト細胞はすべて、Ｐａｘ７およびＣＸＣＲ４などのようなマーカーを発現するが、本発明者らは、それらの発達歴の間にＭｙｆ５を決して発現したことがない約１０％のＰａｘ７＋細胞のサブセットを同定した（図４Ａ）。Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−サテライトのこのサブセットは、サテライト細胞ニッチ内の幹細胞集団として同定された（Ｋｕａｎｇら、２００７年）。静止状態のサテライト幹細胞の遺伝子発現分析の実行に向けて、本発明者らは、最初に、方法のセクションにおいて記載されるように、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によるサテライト細胞単離のための改善された方法論を開発した。ＦＡＣＳにより精製された細胞（ＣＤ３４＋、α７−インテグリン＋、ＣＤ３１−、ＣＤ４５−、ＣＤ１１ｂ−、Ｓｃａ１−）（図１１Ａ）は、Ｐａｘ７およびシンデカン４発現（図１１Ｂ）によって決定されるように、＞９５％のサテライト細胞であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて強い成長および分化潜在能力を示した（図１１Ｃ）。
ＦＡＣＳにより精製されたサテライト細胞は、Ｍｙｆ５−コンディショナルＹＦＰ蛍光に基づいてさらに分離した（図４Ｂ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ＹＦＰ−サテライト細胞は、低密度で維持された場合、ＹＦＰまたはＭｙｆ５タンパク質ではなくＰａｘ７を発現する増殖細胞の元となり（図１２）、したがって、ＹＦＰ−細胞は、Ｍｙｆ５を発現せず、また、発現したことがないことを検証した。新たにソートされた細胞のリアルタイムＰＣＲ分析により、単離されたＹＦＰ＋およびＹＦＰ−サテライト細胞におけるＰａｘ７発現（図４Ｃ）ならびにｃＭｅｔ、シンデカン４、カベオリン１、およびα７−インテグリンなどのような他のいくつかのサテライト細胞マーカー（示さず）を確認した。さらに、ＹＦＰおよびＭｙｆ５転写物は、ＹＦＰ＋サテライト細胞において検出されたが、事実上、ＹＦＰおよびＭｙｆ５発現（ＲＴ−対照と有意に異ならない）は、ＹＦＰ−サテライト細胞において検出されなかった（図４Ｃ）。ｃＤＮＡのサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＳＨ）（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら、１９９７年）は、静止状態のＰａｘ７＋／Ｍｙｆ５−サテライト幹細胞において特異的に発現される遺伝子を同定するために使用した。特に、特異に発現されたクローンのうちの１つは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７（Ｆｚｄ７）ｍＲＮＡ内からの断片をコードした。Ｆｚｄ７は、複数の遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーに属するＧタンパク質共役型膜貫通Ｗｎｔ受容体である（Ｅｇｇｅｒ−ＡｄａｍおよびＫａｔａｎａｅｖ、２００８年）。リアルタイムＰＣＲ分析により、Ｆｚｄ７転写物がＹＦＰ−サテライト細胞において豊富に発現され、ＹＦＰ＋サテライト細胞においてわずかに検出されたのみであったことを確認した（図４Ｃ）。
リアルタイムＰＣＲによって示唆される特異な発現を確認するために、Ｆｚｄ７タンパク質発現は、長指伸（ＥＤＬ）筋からの単離の後に直ちに固定した筋線維において検査し、免疫組織学的分析により、Ｐａｘ７＋サテライト細胞の１２±３％が、容易に検出可能なレベルのＦｚｄ７を発現することを明らかにした（ｎ＝３マウス、＞１５０細胞／マウス）。Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰ ＥＤＬ筋肉から単離された筋線維の分析により、Ｆｚｄ７が、検出可能なレベルのＹＦＰを含有していないサテライト幹細胞（Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−）において特異的に上方制御されたことが実証された（図４Ｄ）。しかしながら、２日間の懸濁液中での線維の培養は、事実上すべてのサテライト細胞におけるＦｚｄ７の上方制御をもたらした（９９％、ｎ＝３匹のマウス、マウス当たり≧１００細胞）。さらに、前脛骨（ＴＡ）筋の心臓毒（ＣＴＸ）誘発性の損傷の後にＥＤＬ筋から筋線維を再生するための検査は（Ｋｕａｎｇら、２００７）、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−細胞およびＰａｘ７＋／Ｍｙｆ５＋細胞のダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）上でのＦｚｄ７発現を明らかにした（図４Ｅ）。
まとめると、これらの結果は、休止筋では、Ｗｎｔ受容体Ｆｚｄ７が、静止状態のサテライト幹細胞において特異的に発現されることを実証する。しかしながら、Ｆｚｄ７はまた、増殖しているサテライト細胞および筋芽細胞においても上方制御される。したがって、Ｆｚｄ７受容体は、休止筋における静止状態のサテライト幹細胞のマーカーと考えられてもよく、他の幹細胞マーカーと組み合わせて、静止状態のサテライト幹細胞のマーカーとして特に有用であってもよい。Ｆｚｄ７受容体はまた、たとえばＦｚｄ７に反応性の抗体を使用する、静止状態のサテライト幹細胞の精製のための標的として使用されてもよい。
（実施例２）
筋肉再生の間のＷｎｔ発現
本発明者らは、Ｗｎｔ７ａがＦｚｄ７受容体に対する候補リガンドであることを仮定した。胎児の筋形成の間のＦｚｄ７およびＷｎｔ７ａの同時発現が報告され（ＣｏｓｓｕおよびＢｏｒｅｌｌｏ、１９９９年）、Ｗｎｔ７ａは、胎児および成体の筋形成の制御因子として結び付けられた（Ｃｈｅｎら、２００５年；Ｐｏｌｅｓｓｋａｙａら、２００３年；Ｔａｊｂａｋｈｓｈら、１９９８年）。凍結傷害ＴＡ筋のリアルタイムＰＣＲアレイ分析は、再生筋形成の間のＷｎｔ発現を立証するために使用した。筋肉の凍結傷害は、心臓毒（ＣＴＸ）注射などのような他の方法に比べて有意に低下した炎症反応の理由で選んだ。遺伝子発現の変化は、ほとんどのＰａｘ７＋細胞が増殖している再生の急性期の間の、傷害後の３日目に、およびサテライト細胞が静止状態の層の下の（ｓｕｂ−ｌａｍｉｎａｒ）位置に戻る傷害の６日目に分析した（図５Ａ）。
傷害後の３日目に、複数のＷｎｔ（Ｗｎｔ１、２、５ｂ、８ｂ、１０ａ、１６ａ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、およびｓＦＲＰ阻害因子についてのものを含めて、３１の転写物における著しい増加（反対側の肢と比較して、ｎ＝３匹のマウス、ｐ＜０．０５）が検出された。特に、傷害後の６日目に、著しい増加（ｎ＝３匹のマウス、ｐ＜０．０５）が、Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ１０ａについて転写レベルで検出された（図５Ｂ）。Ｗｎｔ３ａレベルは、再生の３および６日目の両方の分析において検出限界未満であった。そのため、Ｗｎｔ７ａ ｍＲＮＡは、サテライト幹細胞が常在性のサテライト細胞プールを補充する時に著しく上方制御された。
他の筋肉傷害モデルにおける筋肉再生の間のＷｎｔ７ａ上方制御を確認するために、Ｗｎｔ７ａタンパク質発現の免疫組織化学的分析を、ＣＴＸ傷害性のＴＡ（傷害後の４日目に固定した）および反対側の休止ＴＡの凍結切片について実行した。未損傷筋肉において、Ｗｎｔ７ａは、検出可能なレベルで発現されなかった（図５Ｅ、左）。対照的に、Ｗｎｔ７ａは、再生線維（無傷の線維よりも小さなサイズであり、ミオゲニン＋核を含有する）において強力に上方制御され、ＣＤ１４４＋内皮細胞によって発現されなかった（図５Ｅ、右）。
Ｗｎｔ７ａがＦｚｄ７に対するリガンドであるかどうかを決定するために、培養サテライト細胞由来の筋芽細胞を、３０分間、組換えヒトＷｎｔ７ａタンパク質と共にインキュベートし、洗浄し、固定し、抗Ｗｎｔ７ａ抗体を用いて免疫染色した。ＢＳＡと共にインキュベートされた細胞は、Ｗｎｔ７ａタンパク質について膜染色を示さなかった。対照的に、Ｗｎｔ７ａタンパク質と共にインキュベートされた細胞は、細胞膜上で免疫染色を示した（図５Ｃ）。重要なことには、Ｆｚｄ７ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、Ｗｎｔ７ａの結合を抑止した（図２Ｃ）。Ｆｚｄ７サイレンシングは、有効であり、特異的であり、筋芽細胞において発現される他のＦｒｉｚｚｌｅｄ転写物を有意に改変しなかった（図１４Ａ）。まとめると、これらのデータは、Ｆｚｄ７が筋原細胞においてｗｎｔ７ａに対する受容体であることを示す。
Ｗｎｔ７ａは、細胞型および受容体の関連に依存して、標準的な（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら、２００４年）または非標準的なＷｎｔ（Ｋｅｎｇａｋｕら、１９９８年）として記載されてきた。標準的なＷｎｔとしてＷｎｔ７ａの可能な機能を評価するために、サテライト細胞由来の筋芽細胞は、２４時間、Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ３ａタンパク質を用いて刺激した。Ｗｎｔ３ａは、筋原細胞において標準的なＷｎｔ経路を活性化し（Ｂｒａｃｋら、２００８年）、本発明の実験において、Ｗｎｔ３ａ刺激は、β−カテニン／ＴＣＦ標的遺伝子の発現の増加、たとえば、それぞれ、Ｔｃｆ７およびＡｘｉｎ２ ｍＲＮＡの５倍および５０倍の増加（ｎ＝５、ｐ≦０．００１）をもたらした。対照的に、Ｗｎｔ７ａ刺激は、ＢＳＡによって処理された試料に類似して、Ｔｃｆ７およびＡｘｉｎ２レベルにおける有意な変化をもたらさなかった（図５Ｄ）。さらに、Ｗｎｔ７ａではなくＷｎｔ３ａ刺激が、活性化されたβ−カテニンの安定化および核局所化を強く誘発し（図１３）、Ｗｎｔ７ａではなくＷｎｔ３ａが、一過性のトランスフェクション実験においてβ−カテニンルシフェラーゼレポーターＴＯＰ−Ｆｌａｓｈを強く活性化した（示さず）。
まとめると、これらの結果は、Ｗｎｔ７ａが、再生筋形成の間に新しく形成された筋線維によって著しく上方制御され、筋原細胞の表面のＦｚｄ７受容体に結合し、標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を利用しないことを示す。
（実施例３）
サテライト幹細胞分裂の対称性は、Ｗｎｔ７ａ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７によって制御される。
静止状態のサテライト幹細胞におけるＦｚｄ７の発現および筋肉再生の間のＷｎｔ７ａの顕著な上方制御は、Ｗｎｔ７ａ−Ｆｚｄ７シグナル伝達が筋肉幹細胞機能を制御することに関与することを示唆した。さらに、Ｗｎｔ７ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、培養初代筋芽細胞の成長または分化に対する効果を有していなかった（図１６）。そのため、サテライト細胞においてＷｎｔ７ａ−Ｆｚｄ７シグナル伝達の役割を調査するために、サテライト幹細胞の非対称性および対称性の細胞分裂の間の比を改変する組換えＷｎｔ７ａの能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて検査した。筋線維は、Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰ ＥＤＬ筋から単離し、非接着性の条件下で培養した。培養系において、静止状態のサテライト細胞は、筋線維単離の後に直ちに活性化されるようになる。サテライト細胞は、それらのニッチを出て、基底膜をわたって移動し、同調的な方法でそれらの最初の細胞分裂を行う。したがって、第１分裂の結果は、培養の４２時間後に筋線維を固定し、染色することによって視覚化した。重要なことには、実際の画像分析により、サテライト細胞は、分裂前に筋線維上を移動せず、スコア化された細胞ダブレットはクローンの起源のものであることが確認される（Ｋｕａｎｇら、２００７年）。
サテライト幹細胞（ＹＦＰ−）は、２つのＹＦＰ−娘細胞の元となる対称性細胞分裂または１つのＹＦＰ−幹細胞および１つのＹＦＰ＋運命決定前駆体の元となる非対称性の細胞分裂を行った（図６Ａ）。Ｗｎｔ７ａを用いて刺激された場合、３０％〜６７％の対称性の細胞分裂の割合の劇的な増加が観察された（ｎ＝３、ｎ≧１５２の対、ｐ＝０．００９）。対照的に、Ｗｎｔ３ａ処理は、有意な変化を誘発しなかった（図６Ｂ）。そのため、Ｗｎｔ７ａは、対称性のサテライト幹細胞分裂の増加を刺激した。
実験的な分析は、Ｗｎｔ７ａがＦｚｄ７受容体に特異的に結合することを示唆した（図５Ｃ、５Ｄ）。そのため、Ｗｎｔ７ａによる対称性の幹細胞分裂の誘発がＦｚｄ７の存在を必要としたかどうかを決定するために、Ｆｚｄ７ノックダウン実験を単離された筋線維に対して実行した。処理された線維の免疫染色により、４２時間後のＦｚｄ７発現の広範囲なサイレンシングを実証した（図５Ｃ）。重要なことには、Ｆｚｄ７のｓｉＲＮＡ誘発性のノックダウンは、Ｗｎｔ７ａが対称性のサテライト幹細胞分裂を誘発する能力の完全な抑止をもたらした（ｎ＝３、≧１２３の対、ｐ≦０．０２）。対照的に、スクランブルｓｉＲＮＡ処理は、Ｗｎｔ７ａのこの活性に有意に影響を与えなかった（図６Ｄ）。これらの結果と一致して、第２分裂（５０時間）の後のサテライト幹細胞（Ｐａｘ７＋／ＹＦＰ−）の割合は、Ｗｎｔ７ａ処理後に１３％有意に増加し（ｎ＝３、≧１２０３細胞、ｐ≦０．０３）、これは、線維当たりの幹細胞の数の増加をもたらした（図６Ｅ、１４Ｂ）。同様に、Ｆｚｄ７サイレンシングは、Ｗｎｔ７ａ刺激の効果を効率的にブロックした。線維当たりのＰａｘ７＋細胞の総数は、それぞれの条件の間で一定のままであり、Ｗｎｔ７ａが細胞増殖または分化を引き起こさないことを確認した（図１４Ｃ）。
これらの結果は、Ｗｎｔ７ａが、対称性のサテライト幹細胞分裂を刺激し、したがって、サテライト幹細胞プールの増大を駆動するように、Ｆｚｄ７を介してシグナル伝達することを実証する。
（実施例４）
サテライト幹細胞自己再生におけるＰＣＰ構成成分Ｖａｎｇｌ２についての役割
分析は、Ｗｎｔ７ａが、標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化せず（図５Ｄ）、Ｗｎｔ７ａが、サテライト幹細胞対称性分裂を駆動するようにＦｚｄ７受容体を通してシグナル伝達することを示した（図５Ｃ、６Ｂ、６Ｄ）。そのため、Ｗｎｔ７ａが、ＰＣＰ経路を活性化し、サテライト幹細胞増大を駆動するようにＦｚｄ７を通して作用することが仮定された。Ｗｎｔ７ａがＰＣＰ経路を活性化するかどうかを調査するために、コアＰＣＰ構成成分のセットの相対的な転写レベル（ＳｅｉｆｅｒｔおよびＭｌｏｄｚｉｋ、２００７年）を筋原細胞において分析した。興味深いことに、筋芽細胞は、かなりのレベルのＤｖｌ−２および−３、Ｆｚｄ−３および−７、Ｐｋ−１および−２、ならびにＶａｎｇｌ−１および−２、ならびに低レベルのＣｅｌｓｒ２を発現した。試験した他のＰＣＰ構成成分遺伝子は、３０サイクルにわたるカットオフ値により不在と考えられた（図４Ａ）。さらに、培養サテライト幹細胞（ＹＦＰ−）は、有意に高度なレベルのすべてのＰＣＰ構成成分を発現し（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）、サテライト幹細胞機能を制御する際のＰＣＰシグナル伝達についての役割と一致して、Ｖａｎｇｌ２は顕著に上方制御された。
Ｖａｎｇｌ２は、ショウジョウバエおよび脊椎動物において、ＰＣＰおよび非標準的なＷｎｔシグナル伝達の重大な制御因子である（Ｔｏｒｂａｎら、２００４年）。活性なＰＣＰシグナル伝達を有する細胞において、Ｖａｎｇｌ２タンパク質は、極性化の軸の両端の極に分布し、この分布はＰＣＰ突然変異体において失われる（Ｍｏｎｔｃｏｕｑｕｉｏｌら、２００６年）。Ｖａｎｇｌ２タンパク質は、単離された筋線維上の静止状態のサテライト細胞において検出されなかったが、それらが培養中、２４時間までに細胞周期を入ったので、活性化されたサテライト細胞において上方制御した。４８時間後、すべてのＰａｘ７＋活性化サテライト細胞もまた、Ｖａｎｇｌ２について陽性であった（１００％、ｎ＝３匹のマウス、マウス当たり≧１００細胞）（図７Ｂ）。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＶａｎｇｌ２と相互作用するＰｒｉｃｋｌｅ１およびＣｅｌｓｒ２タンパク質のサテライト細胞における発現もまた確認した（示さず）。
重要なことには、Ｗｎｔ７ａの存在下において、培養筋線維上のサテライト細胞の分裂ダブレットの有意な割合（２９±４％、ｎ＝３、≧２４０の対、ｐ≦０．００６）が、娘細胞の両極上にＶａｎｇｌ２の極性化した局所化を示した（図７Ｃ、７Ｄ）。対照的に、ＢＳＡ（対照）またはＷｎｔ３ａ処理の後に、Ｖａｎｇｌ２タンパク質は、サテライト細胞ダブレットにおいて一様に分散した（それぞれ９０±２％および８９±２％）（図７Ｃ、７Ｄ）。さらに、抗Ｖａｎｇｌ２抗体および抗α７−インテグリン抗体を用いる二重染色は、Ｗｎｔ７ａが、Ｖａｎｇｌ２の膜局所化およびα７−インテグリンの極性化した分布の増強を誘発するように見えたことを明らかにした。この再分布は、未処理の細胞においてまたは頂底細胞分裂を行う細胞において起こらなかった（図７Ｅ）。まとめると、これらの観察は、Ｗｎｔ７ａが、極性エフェクターＶａｎｇｌ２およびα７−インテグリンの再分布を誘発し、娘細胞の極のα７−インテグリンの発現の上方制御が、それらを基底膜と接着性のままとし、幹細胞ニッチ中にとどまらせるという主張を強力に支持する。
サテライト幹細胞機能におけるＶａｎｇｌ２の役割を調査するために、Ｖａｎｇｌ２のｓｉＲＮＡサイレンシングを、Ｗｎｔ７ａを用いて刺激した単一のＭｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰ筋線維に対して実行した。筋線維は、線維に関するサテライト細胞分裂の面の視覚化を可能にするためにＰａｘ７およびシンデカン４の抗体を用いて最初に染色し、細胞分裂を、平面または頂底としてスコア化した（図８Ａ）。最初の細胞分裂の４２時間後に、Ｗｎｔ７ａ刺激は、平面分裂を誘発し、したがって、頂底細胞分裂の１２％の減少をもたらした。対照的に、Ｖａｎｇｌ２サイレンシングは、頂底細胞分裂の割合を１５％増加させた（ｎ＝３、≧１５４の対、ｐ≦０．０２）（図８Ｂ）。同じ実験からの筋線維もまた、Ｐａｘ７およびＹＦＰ抗体を用いて染色し、対称性の細胞分裂のパーセンテージをスコア化した。頂底対対称性細胞分裂の割合の間の密接した逆相関を観察した。Ｗｎｔ７ａ刺激は、対称性の細胞分裂の割合を増加させたが、Ｖａｎｇｌ２ノックダウンにより、Ｗｎｔ７ａが対称性細胞分裂を刺激する能力が著しく損なわれた（ｎ＝３、≧６５の対、ｐ≦０．０２）（図８Ｃ）。
対称性のサテライト細胞細胞分裂を制御する際のＶａｎｇｌ２の役割を分析するために、線維を５０時間培養し、免疫染色することによってＶａｎｇｌ２サイレンシングを評価した（図８Ｄ）。この時点で、Ｖａｎｇｌ２ノックダウンは、頂底細胞分裂の率を増加し続けたが（ｎ＝５、≧１５０の対、ｐ＝０．００１）（図８Ｅ）、サテライト幹細胞の集団を枯渇させた（ｎ＝３、≧３３０細胞、ｐ＝０．０３）（図８Ｆ）。これは、線維当たりのサテライト細胞の総数における顕著な減少をもたらした（ｎ＝５、≧５００細胞、ｐ＝０．００１）（図８Ｇ）。Ｖａｎｇｌ２のノックダウンの３日後に（図８Ｈ）、線維上の細胞の半分の損失と共に（ｎ＝４、≧５５０細胞、ｐ＝０．００１）（図８Ｊ）、分化についての早期のマーカーであるミオゲニンを発現する細胞の数の倍加が観察された（ｎ＝４、≧５５０細胞、ｐ＝１０−５）（図８Ｉ）。サテライト細胞由来の筋芽細胞に対するＶａｎｇｌ２サイレンシングは、ミオゲニンのレベルの増加と共に、Ｐａｘ７およびＭｙｆ５転写物のレベルの低下をもたらした（ｎ＝４、ｐ≦０．０５）（図８Ｋ）。共に、これらのデータは、サテライト幹細胞の自己再生および一過性の増幅筋芽細胞の生成の両方にＶａｎｇｌ２が必要とされることを示唆する。
これらのデータは、Ｆｚｄ７を通してのＷｎｔ７ａシグナル伝達が、サテライト幹細胞プールの対称性の増大を誘発するためにＶａｎｇｌ２を必要とすることを実証する。Ｗｎｔ７ａはまた、対称性の平面細胞分裂を行っている細胞の両極でのＶａｎｇｌ２タンパク質の極性化した分布を誘発する。したがって、Ｗｎｔ７ａは、ニッチ内のサテライト細胞分裂の方向付けおよびそれらの運命をコントロールするために平面内細胞極性経路を利用する。
（実施例５）
Ｗｎｔ７ａは、幹細胞プールを増大させることによって筋肉再生を増強する。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、筋肉再生におけるＷｎｔ７ａ−Ｆｚｄ７−Ｖａｎｇｌ２経路の役割を調査するために、Ｗｎｔ７ａは、３月齢マウスのＴＡ筋の中へのＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａ発現プラスミドのエレクトロポレーションによって過剰発現させた。ＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドを用いてエレクトロポレーションされた筋肉の組織学的な分析は、大多数の（＞８０％）筋線維が、β−ガラクトシダーゼを発現し（図１５Ａ）、再生欠損が、対照プラスミドエレクトロポレーションの後に検出されなかったことを明らかにした（図１５Ｂ）。さらに、免疫染色は、ＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａプラスミドを用いてエレクトロポレーションされた筋線維が、容易に検出可能なレベルのＷｎｔ７ａタンパク質を分泌したことを明らかにした（図１５Ｃ）。
特に、ＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａを用いてエレクトロポレーションされたＴＡ筋は、３週間後に質量の１８±４％（ｐ＝０．００９、ｎ＝８）の増加を示した。エレクトロポレーションされた筋肉の連続切片の検査は、筋肉の全体的なサイズの増加ならびに筋肉の大部分を通じての径サイズおよび線維の数の有意な増加を明らかにした（図９）。対照的に、Ｗｎｔ３ａの過剰発現は、筋線維の数のより大きな増加をもたらしたが、これらは、横断面積における劇的な低下を示し、再生効率の低下をもたらした（図９）。筋組織における他の細胞型に対するＷｎｔ７ａ過剰発現の効果は観察されなかった。しかしながら、Ｗｎｔ３ａの過剰発現は、異常なマトリックス沈着をもたらし、線維症の増加をもたらす線維芽細胞／平滑筋前駆体の増殖の増強を示唆した（図９Ｂ）。まとめると、これらの結果は、数が増加したより大きな線維および質量が有意に増加した筋肉の存在によって証明されるように、Ｗｎｔ７ａの過剰発現が筋肉再生を著しく増強することを示す。
先に述べられるように、Ｗｎｔ７ａ処理は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて活性化サテライト細胞または初代筋芽細胞の成長または分化を改変しなかった（図１４Ｃ、１６Ａ、１６Ｃ、１６Ｄ）。さらに、Ｗｎｔ７ａは、分化したミオサイトにおいてＭｙｏＤまたはＷｎｔ／β−カテニン標的遺伝子の発現を誘発しなかった。（図１６Ｂ、１６Ｅ）。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実験は、Ｗｎｔ７ａ−Ｆｚｄ７−Ｖａｎｇｌ２シグナル伝達が、サテライト幹細胞の対称的な増大を刺激し、次いで、これらは、正常な増殖および分化を行う一過性の増幅前駆体の元となるであろうということを確立した。したがって、前駆細胞の増殖および分化の正常な率を伴う、対称性の幹細胞増大の促進は、増殖および分化の刺激と比較した場合、組織再生の改善を示した。これは、著しい発見であり、また、幹細胞枯渇の問題を軽減する。
Ｗｎｔ７ａが、同様に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてサテライト幹細胞の増大を刺激するかどうかを評価するために、再生された筋肉におけるサテライト細胞およびサテライト幹細胞の数を、ＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａのエレクトロポレーションの後に評価した。Ｗｎｔ７ａの過剰発現は、エレクトロポレーション（ｐ＝０．０３、ｎ＝４）の３週間後に、切片上の筋線維当たり、Ｐａｘ７＋サテライト細胞の数において約２倍の増加をもたらした。対照的に、Ｗｎｔ３ａの過剰発現は、サテライト細胞の数を改変しなかった（図１０Ａ、１０Ｂ）。サテライト幹細胞の割合を数えるために、ＦＡＣＳにより単離されたサテライト細胞は、エレクトロポレーションの３週間後にＭｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰ ＴＡ筋から単離し、２４時間培養し、次いで、Ｐａｘ７およびＹＦＰについて免疫染色した（図１０Ｃ）。Ｗｎｔ７ａがｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて対称性サテライト幹細胞分裂を誘発するという観察と一致して、再生筋肉におけるＷｎｔ７ａの過剰発現が、Ｐａｘ７＋／ＹＦＰ−サテライト幹細胞の割合において約２０％の増加（ｎ＝５、ｐ＝０．０００１）をもたらしたことが観察された（図１０Ｃ、１０Ｄ）。そのため、これらのデータは、同様に、Ｗｎｔ７ａが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてサテライト幹細胞コンパートメントに作用することを示す。
Ｗｎｔ７ａの非存在下においてサテライト幹細胞機能を調査するために、３月齢Ｗｎｔ７ａ−／−ヌルマウス（ＭｉｌｌｅｒおよびＳａｓｓｏｏｎ、１９９８年）の再生表現型を検査した。ＥＤＬ筋から新たに単離された筋線維上のＰａｘ７発現サテライト細胞の定量化は、Ｗｎｔ７ａ−／−ヌルマウスが、線維当たりのサテライト細胞の数において約１８％の減少を示すことを実証した（ｐ＝０．０３、ｎ＝４）（図１０Ｅ）。凍結挫滅の３週間後に、再生されたＷｎｔ７ａ−／−ＴＡ筋は、全体的に正常に見えたが（図１０Ｆ）、より詳細な検査に際して、線維は、それほど一様でない、径の分布を示すように見え、基底膜は、再生における欠陥と一致して、不規則な厚さをしていた。重要なことには、再生されたＷｎｔ７ａ−／−ＴＡ筋の切片の検査は、サテライト細胞の数における有意な３６％の減少を明らかにした（ｐ＝０．０３、ｎ＝３）（図１０Ｇ）。この結果は、Ｗｎｔ７ａが、サテライト幹細胞機能を制御する際に、重要な役割を果たすという考えを強力に支持する。
筋肉におけるＷｎｔ７ａの過剰発現は、サテライト幹細胞プールの増大を駆動し、反対に、サテライト細胞コンパートメントは、Ｗｎｔ７ａの非存在下において枯渇するようになる。ともに、これらのデータは、サテライト幹細胞の対称性細胞分裂を刺激して、増大を駆動するための、ＰＣＰ経路を介してのＷｎｔ７ａシグナル伝達についての新規な役割を実証する。そのため、Ｗｎｔ７ａは、サテライト幹細胞コンパートメントの恒常性のレベルを調節し、したがって、成体の骨格筋における再生筋形成の効率を制御する。
（実施例６）
ｍｄｘマウスにおけるＷｎｔ７ａ発現ベクターのエレクトロポレーションは、サテライト細胞の数の増強および線維直径の増加をもたらした。
Ｍｄｘマウスは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーについて周知のマウスモデルである。ｍｄｘマウスは、終止コドンの生成をもたらすジストロフィン遺伝子のエクソン２３における突然変異を持つ。ジストロフィン遺伝子における突然変異は、筋線維の完全性にとって重大なＤＧＣ複合体（ジストロフィン糖タンパク質複合体）の破壊に至る。
図１７を参照すると、成体ｗｔマウスのＴＡ筋の中へのＷｎｔ７ａ ｃＤＮＡのエレクトロポレーションは、サテライト細胞数およびサテライト幹細胞の数の増加に至る（ｍｙｆ５陰性、Ｐａｘ７陽性）。図から分かるように、Ｗｎｔ７ａ群におけるサテライト幹細胞の数は約２倍になった。
図１８を参照すると、ｍｄｘマウスのＴＡ筋は、対照（ｌａｃＺ）プラスミドまたはＣＭＶプロモーターのコントロール下にＷｎｔ７ａのコード領域を含有するプラスミドの注射の後にエレクトロポレーションした。サテライト細胞（すべてＰａｘ７陽性細胞）およびサテライト幹細胞（ｍｙｆ５陰性サテライト細胞）の総数をカウントした。サテライト細胞の総数は、Ｗｎｔ７ａ含有プラスミドを用いてエレクトロポレーションされたｍｄｘマウスにおいて有意に増加した（ｐ＝０．００５）。Ｗｎｔ７ａのコード領域を含有するプラスミドのエレクトロポレーションは、サテライト細胞の総数における有意な増加に至るが、運命決定される前駆細胞に対するサテライト幹細胞の割合は、より多くのサテライト幹細胞が、Ｗｎｔ７ａプラスミドを用いてエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスにおいて存在したという傾向を示した。
図１９を参照すると、ｍｄｘマウスおよび年齢が一致するｗｔマウス（３月齢、オス）を、Ｗｎｔ７ａ含有プラスミドまたはｌａｃＺ対照プラスミドを用いてエレクトロポレーションした。Ｗｎｔ７ａ ｃＤＮＡのエレクトロポレーションは、ｍｄｘおよびｗｔマウスにおいて線維直径における有意な増加に至る（ｐ＜０．００１）。
要約すると、ｗｔおよびｍｄｘマウスのＴＡ筋の中へのＷｎｔ７ａ ｃＤＮＡのエレクトロポレーションは、サテライト細胞の数を増加させた。また、線維直径は、ｗｔおよびｍｄｘマウスにおいて増加した。これらの発見は、Ｗｎｔ７ａが、サテライト細胞の数を増加させ、それによって、サテライト細胞プールが使い尽くされることを予防することによってデュシェンヌ型筋ジストロフィーのための可能な治療となり得るということを示唆する。傷害または手術の後に骨格筋の修復を増加させるためにＷｎｔ７ａの適用を使用することもできる。
（実施例７）
Ｗｎｔ７ａ組換えタンパク質の投与は、Ｗｎｔ７ａ発現ベクターのエレクトロポレーションに類似する効果をもたらす。
図２０を参照すると、ヒトＷｎｔ７ａタンパク質は、ＴＡ筋の中に注射され、注射の２週間後に筋線維サイズを有意に増強することが分かった（ｐ＜０．００１）。観察された効果は、ＣＭＶ駆動マウスＷｎｔ７ａのエレクトロポレーションによってもたらされたものに類似した。
実験手順
マウスおよび動物ケア
成体（８〜１２週齢）Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰマウスは、ノックインＭｙｆ５−Ｃｒｅ（Ｔａｌｌｑｕｉｓｔら、２０００年）ヘテロ接合マウスとＲＯＳＡ２６−ＹＦＰ（Ｓｒｉｎｉｖａｓら、２００１年）ホモ接合レポーターマウスを交差することによって得た。ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰマウスは、野生型対照として使用した。Ｗｎｔ７ａヌルマウスおよびそれらの同腹仔対照は、ヘテロ接合Ｗｎｔ７ａ＋／−マウスを交差することによって得た。マウスはすべて、バリア設備の内部で維持し、実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｈａｎｄｌｉｎｇに従って実行した。
細胞分類
単核の筋肉に由来する細胞は、後肢筋肉から単離し、染色は、先に記載されるよう実行した（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、２００５年；Ｋｕａｎｇら、２００７年）。細胞は、３つのレーザーを装備したＭｏＦｌｏサイトメーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）上で分離した。死細胞および細片は、Ｈｏｅｓｃｈｔ染色によってならびに前方および側方散乱光についてゲーティングすることによって除外した（図１１）。
筋線維の単離、培養、および免疫組織化学的検査
単一の筋線維は、先に記載されるようにＥＤＬ筋から単離した（Ｃｈａｒｇｅら、２００２年）。単離された筋線維は、線維付着を予防するためにウマ血清を用いてコーティングされた６ウェルプレートにおいて懸濁液中で培養した（Ｋｕａｎｇら、２００６年）。線維は、２％Ｌ−グルタミン、４，５％グルコース、および１１０ｍｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ中１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から成る平板培養培地中でインキュベートした。筋芽細胞培養については、サテライト細胞は、ソートし、２０％ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌの塩基性ＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足したハムＦ１０培地中コラーゲンコーティング皿上で平板培養した。Ｗｎｔ刺激については、組換えＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ３ａタンパク質を平板培養培地中に追加した（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。サテライト細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける活性化については、再生は、ＴＡ筋中へのＣＴＸ注射によって誘発し、４日後に、個々の筋線維は、隣のＥＤＬ筋から単離した。凍結切片、筋線維、および細胞の免疫化学標識は、先に報告されるように実行した（Ｋｕａｎｇら、２００６年）。使用する一次抗体は、補足の表１において列挙される。
ｓｉＲＮＡノックダウン
ＥＤＬ筋線維については、トランスフェクションは、メーカーの説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、平板培養培地中で、解剖の４時間および２４時間後に実行した。線維は、翌朝、新鮮な培地中で再供給し、培養の４２時間〜７２時間後に固定した。サテライト細胞由来の筋芽細胞については、細胞は、トランスフェクションの３時間前に再供給し、トランスフェクションは、増殖培地中で実行した。細胞は、洗浄し、トランスフェクションの６時間後にハム完全培地を再供給した。ＲＮＡは、トランスフェクションの４８時間後に採取した。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、Ａｍｂｉｏｎ ｓｉＦｚｄ７（ＩＤ ｓ６６３１４）、ｓｉＶａｎｇｌ２（ＩＤ ｓ９６８０２）からのものであり、それぞれ、１０ｎＭの最終濃度で使用した。トランスフェクション効率は、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡを使用してモニターした。ノックダウン効率は、リアルタイムＰＣＲによって評価した（図１４Ａおよび１３Ｋ）。
リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡは、メーカーの説明書に従って、ＲＮＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、オンカラムＤＮアーゼ消化にかけた。ｃＤＮＡ合成は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素およびランダムヘキサマープライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実行した。リアルタイムＰＣＲは、先に記載されるように実行した（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、２００５年）。転写レベルは、ＧＡＰＤＨ転写レベルに対して標準化した。発現における相対的な倍数変化は、ΔΔＣＴ法（ＣＴ値＜３０）を使用して計算した。相対的な転写物定量化については、それぞれのｃＤＮＡ試料は、≧９５％のＰＣＲ効率を保証するために、５点の検量線について実行した。Ｗｎｔシグナル伝達経路ＰＣＲアレイは、Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＰＡＭＭ−０４３）から購入し、分析は、メーカーの説明書に従って実行した。プライマー配列については、表２を参照されたい。
統計分析
最低３回〜最大５回までの反復実験を、提示された実験について行った。データは、平均値の標準誤差として提示する。結果は、スチューデントＴ検定（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）を使用して、統計的有意差について評価し、差異は、ｐ＜０．０５レベルで統計的に有意であると考えられた。下記の表１は、本発明に関連して実行された様々な実験を実行するのに使用された抗体を列挙する。下記の表２は、本発明に関連して実行された様々な実験を実行するのに使用されたＰＣＲプライマーを列挙する。
筋肉傷害
凍結誘発性の筋肉再生については、麻酔をかけたマウスの皮膚および筋膜を開き、ＴＡ筋は、液体窒素冷却金属棒を適用することによって、凍結融解の３回の連続サイクルにさらし、創傷は、縫合によって閉じた。ＣＴＸ誘発性の筋肉再生については、２５μｌの希釈心臓毒を、皮膚を開くことなく、ＴＡ筋の中に直接注射した。
ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション
０．９％ＮａＣｌ中４０μｇのプラスミドＤＮＡまたは０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）を、皮膚の切開によって曝露させた、麻酔をかけたマウスの左のＴＡ筋の中に直接注射した。注射直後に、電気刺激は、５ｍｍ針電極（ＢＴＸ）を使用し、２０ｍｓの固定期間および２００ｍｓのインターバルで、６パルス、１００〜１５０ボルトのパルス発生器（ＥＣＭ ８３０、ＢＴＸ）によってＴＡに直接適用した。実験用および反対側のＴＡ筋は、単離し、ＯＷＮＴ７Ａ５％スクロース（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中に包埋し、冷窒素によって冷却したイソペンタンを用いて凍結させた。
ｍｄｘマウスのｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション
発明者らは、ＣＭＶプロモーターのコントロール下でＨＡ（赤血球凝集素）エピトープについての配列に接続された、Ｗｎｔ７ａタンパク質のコード領域を含有する４０ｕｇのベクター（ｐＨＡＮｐｕｒｏ−Ｗｎｔ７ａ−ＨＡ）およびコントロールとしてのｐＳＰＯＲＴ６−ｌａｃＺベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｍｄｘマウス（３月齢、オス、群当たり３匹の動物）をエレクトロポレーションした。後者のベクターはまた、エレクトロポレーションの効率を決定するためにも使用した。エレクトロポレーションは、ＬｅＧｒａｎｄら ２００９年によって記載されるように実行し、マウスは、エレクトロポレーションの２週間後に犠牲死させた。エレクトロポレーションは、前脛骨（ＴＡ）筋を使用して実行した。エレクトロポレーションに使用したプラスミドは、０．９％ＮａＣｌ中に溶解し、ＴＡ筋当たりの総容量は、４０ｕｌとした。実験のために、一方のＴＡのみ注射し、エレクトロポレーションし、他方のＴＡは、コントロールとして使用した。
ＴＡ筋の切片（１４ｕｍ）は、すべてのサテライト細胞についてのマーカーであるＰａｘ７および運命決定された前駆細胞についてのマーカーであるｍｙｆ５について染色した。両方のマーカータンパク質について陽性染色された細胞は、運命決定された前駆細胞としてカウントしたのに対して、Ｐａｘ７についてのみ陽性の細胞は、サテライト幹細胞としてカウントした。
組織学的検査および定量化
実験用および反対側の筋肉の横断切片（８μｍ）は、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０）を用いてカットした。全ＴＡ筋は、連続切片上で同じレベルで実験用および反対側の筋肉を比較するために薄片に切った（約４００の切片がそれぞれのＴＡ筋から得られた）。ＬａｃＺ反応については、凍結切片は、０．１％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を用いて固定し、Ｘ−ｇａｌ溶液に曝露した。Ｈ＆Ｅおよび免疫染色については、切片は、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。線維の計数については、ラミニン染色凍結切片の像を集め、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ２でカウントした。筋線維径の定量化は、ＩｍａｇｅＪを用いて実行した。サテライト細胞計数は、すべての線維が中心に位置する核を有した再生エリアにおいて得られたＰａｘ７およびラミニン共免疫染色凍結切片の像についてＰｈｏｔｏｓｈｏｐで実行した。「サテライト細胞含有率」は、線維数当たりにおよび反対側の肢に対して標準化した層の下のＰａｘ７＋ｖｅサテライト細胞の数を示す。
サブトラクティブハイブリダイゼーション
ソートされたＹＦＰ＋およびＹＦＰ−サテライト細胞からのＲＮＡ試料（１０ｎｇ）は、提供されるプロトコールに従ってＳｕｐｅｒ−ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して増幅した。それぞれの試料からの２ｕｇの代表的なｃＤＮＡは、メーカーの説明書に従って、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてサブトラクティブライブラリーを生成するために使用した。ソートされたＹＦＰ−から増幅されたｃＤＮＡは、「テスター」として使用し、ソートされたＹＦＰ＋から増幅されたｃＤＮＡは、「ドライバー」として使用した。ＳＳＨ産物は、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターにおいてクローニングし、ＳＳＨライブラリーからの２００クローンは、メーカーのプロトコールおよびマニュアルに従って、ＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、ネステッドプライマーを用いて配列決定した。
本発明の上記の実施形態は、例にすぎないことが意図される。当業者であれば、本明細書に添付される特許請求の範囲によってもっぱら定義される本発明の範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に対して変更、修飾、および改変を実施することができる。

Claims (96)

  1. 活性剤として、幹細胞における平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達の調節因子を含む、前記幹細胞の分裂対称性を調節するための組成物。
  2. 前記活性剤は、前記幹細胞の対称性分裂を促進することができるＰＣＰシグナル伝達の活性化因子である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記活性剤は、小分子、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、高分子、抗体、またはその組み合わせを含むまたはそれに由来する、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記活性剤は、
    （ａ）Ｆｚｄ７に結合することおよび／もしくはそれを活性化することができるペプチドもしくはポリペプチド；
    （ｂ）Ｆｚｄ７に結合することおよび／もしくはそれを活性化することができるペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）Ｆｚｄ７に結合することおよび／もしくはそれを活性化することができる小分子；
    （ｄ）前記幹細胞上のＦｚｄ７の発現を上方制御することができるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド；または
    （ｅ）前記ＰＣＰ経路におけるエフェクター分子を誘発もしくは活性化し、それによって対称性分裂を促進することができるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
    の１つまたは複数を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記活性剤は、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記活性剤はＷｎｔ７ａポリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記活性剤は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記ポリヌクレオチドは発現ベクター中にある、請求項５に記載の組成物。
  9. 前記エフェクター分子は、Ｖａｎｇｌ２、α７−インテグリン、Ｐｒｉｃｋｌｅ１、またはＣｅｌｓｒ２である、請求項４に記載の組成物。
  10. 前記ＰＣＰ経路を調節することができる前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、細胞膜におけるＶａｎｇｌ２の発現または極性化した分布を誘発する、請求項４に記載の組成物。
  11. 幹細胞または幹細胞の集団をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記幹細胞における標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害因子をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. １つまたは複数の幹細胞調節因子をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記調節因子は、幹細胞分裂の速度を増加させる、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記幹細胞は成体幹細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記成体幹細胞はサテライト幹細胞である、請求項１５に記載の組成物。
  17. 組織形成、再生、維持、または修復を促進するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記組織は筋肉である、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記筋肉は骨格筋である、請求項１７に記載の組成物。
  20. 哺乳動物において組織形成、再生、または修復を増強するための組成物であって、活性剤として、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
  21. 生理学的に許容される担体または希釈剤と混合された、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 注射用に製剤される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 静脈内注射、筋肉内注射、心臓内注射、皮下注射、または腹膜腔内注射の１つまたは複数のために製剤される、請求項２２に記載の組成物。
  24. それを必要とするヒト被験体において、骨格筋の形成、維持、修復、または再生を促進するための、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記被験体は、変性疾患を有する、有することが疑われる、または有するリスクがある、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記変性疾患は筋ジストロフィーである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ−ドレフュス型筋ジストロフィー、ランドジー−デジェリーヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー、フォングレーフェ−フックス型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（シュタイネルト病）、および先天性筋ジストロフィーから選択される、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項２４に記載の組成物。
  29. 前記被験体は、筋肉を侵す疾患または状態を有する、有することが疑われる、または有するリスクがある、請求項２４に記載の組成物。
  30. 前記筋肉を侵す疾患または状態は、消耗性疾患（たとえば、癌もしくはＡＩＤＳなどのような病気と関連してもよい悪液質）、筋肉の減衰もしくは萎縮（たとえば、老化と関連してもよいサルコペニア）、ＩＣＵ誘発性の衰弱、長期間の非活動（たとえば昏睡、傷害、完全麻痺）、外科手術誘発性の衰弱（たとえば股関節置換術もしくは膝関節置換術の後の）、または筋変性疾患（たとえば筋ジストロフィー）である、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記被験体は、傷害または病気と関連する筋消耗または萎縮を有する、有することが疑われる、または発症するリスクがある、請求項２４に記載の組成物。
  32. 幹細胞の分裂対称性を調節するための方法であって、活性剤として、前記幹細胞における平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達の調節因子を含む組成物と前記幹細胞を接触させるステップを含む方法。
  33. 前記活性剤は、前記幹細胞の対称性分裂を促進することができるＰＣＰシグナル伝達の活性化因子である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記活性剤は、小分子、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、またはその組み合わせを含むまたはそれに由来する、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記活性剤は、
    （ａ）Ｆｚｄ７に結合することおよび／もしくはそれを活性化することができるペプチドもしくはポリペプチド；
    （ｂ）Ｆｚｄ７に結合することおよび／もしくはそれを活性化することができるペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）Ｆｚｄ７に結合することおよび／もしくはそれを活性化することができる小分子；
    （ｄ）前記幹細胞上のＦｚｄ７の発現を上方制御することができるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド；または
    （ｅ）前記ＰＣＰ経路におけるエフェクター分子を誘発もしくは活性化し、それによって対称性分裂を促進することができるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
    の１つまたは複数を含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記活性剤は、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記活性剤はＷｎｔ７ａポリペプチドを含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記活性剤は、Ｗｎｔ７ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ポリヌクレオチドは発現ベクター中にある、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記エフェクター分子は、Ｖａｎｇｌ２、α７−インテグリン、Ｐｒｉｃｋｌｅ１、またはＣｅｌｓｒ２を含む、請求項３１に記載の方法。
  41. 前記ＰＣＰ経路を調節することができる前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、細胞膜におけるＶａｎｇｌ２の発現または極性化した分布を誘発する、請求項３５に記載の方法。
  42. 前記幹細胞における標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害因子と前記幹細胞を接触させるステップを含む、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  43. １つまたは複数の幹細胞調節因子と前記幹細胞を接触させるステップをさらに含む、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記調節因子は幹細胞分裂の速度を増加させる、請求項３８に記載の方法。
  45. ｉｎ ｖｉｖｏにおける方法であり、前記組成物はそれを必要とする被験体に投与される、請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記被験体に幹細胞を投与するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記幹細胞は、前記組成物と同時にまたは連続的に投与される、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記組成物は幹細胞を含む、請求項３３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記幹細胞は、Ｆｚｄ７または対称性分裂を促進することができるＰＣＰシグナル伝達の調節因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 被験体にヘルパー細胞を投与するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  51. 前記ヘルパー細胞は、前記組成物と同時にまたは連続的に投与される、請求項５０に記載の方法。
  52. 組成物は前記ヘルパー細胞を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ヘルパー細胞は、前記ヘルパー細胞から分泌され、Ｆｚｄ７に結合することおよび／またはそれを活性化することができるＷｎｔ７ａタンパク質またはその活性な断片、変異体、類似体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記幹細胞は成体幹細胞を含む、請求項３２〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記成体幹細胞はサテライト幹細胞を含む、請求項５１に記載の方法。
  56. 組織形成、再生維持、または修復を促進するための、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記組織は筋肉である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記筋肉は骨格筋である、請求項５７に記載の方法。
  59. 哺乳動物において組織形成、再生、維持、または修復を増強するための方法であって、活性剤として、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を被験体に投与するステップを含む方法。
  60. 前記組成物は、生理学的に許容される担体または希釈剤を含む、請求項３２〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記組成物は注射用に製剤される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、心臓内注射、皮下注射、または腹膜腔内注射の１つまたは複数のために製剤される、請求項６１に記載の方法。
  63. それを必要とするヒト被験体において、骨格筋の形成、維持、修復、または再生を促進するための、請求項３２〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記被験体は変性疾患を有する、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記変性疾患は筋ジストロフィーである、請求項６４に記載の方法。
  66. 筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ−ドレフュス型筋ジストロフィー、ランドジー−デジェリーヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー、フォングレーフェ−フックス型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（シュタイネルト病）、および先天性筋ジストロフィーから選択される、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記被験体は、筋肉を侵す疾患または状態に罹患している、請求項６３に記載の組成物。
  69. 前記筋肉を侵す疾患または状態は、消耗性疾患（たとえば、癌もしくはＡＩＤＳなどのような病気と関連してもよい悪液質）、筋肉の減衰もしくは萎縮（たとえば、老化と関連してもよいサルコペニア）、ＩＣＵ誘発性の衰弱、長期間の非活動（たとえば昏睡、傷害、完全麻痺）、外科手術誘発性の衰弱（たとえば股関節置換術もしくは膝関節置換術の後の）、または筋変性疾患（たとえば筋ジストロフィー）である、請求項６８に記載の組成物。
  70. 前記被験体は、傷害または病気と関連する筋消耗または筋萎縮に罹患している、請求項６３に記載の組成物。
  71. 哺乳動物において、筋肉形成、再生、維持、または修復を促進するための方法であって、前記哺乳動物に、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の治療有効量の組成物を投与するステップを含む方法。
  72. それを必要とする被験体において、筋肉形成、再生、または修復を促進するための方法であって、活性剤として、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を前記被験体に投与するステップを含む方法。
  73. それを必要とする被験体において、筋消耗、萎縮、または変性を予防するための方法であって、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、治療有効量の組成物を前記被験体に投与するステップを含む方法。
  74. ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、サテライト幹細胞の集団を増大させるための方法であって、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物と前記幹細胞を接触させるステップを含む方法。
  75. 前記組成物は、生理学的に許容される担体または希釈剤を含む、請求項７２〜７４に記載の方法。
  76. 前記組成物は注射用に製剤される、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、心臓内注射、皮下注射、または腹膜腔内注射用に製剤される、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記サテライト幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増大される、請求項７４に記載の方法。
  79. 前記サテライト幹細胞は、それを必要とする被験体に続いて投与される、請求項７８に記載の方法。
  80. サテライト幹細胞増大を促進するための方法であって、Ｗｎｔ７ａまたはＦｚｄ７を活性化することができるその活性な断片、変異体、類似体、もしくは誘導体と前記幹細胞を接触させるステップを含む方法。
  81. それを必要とする被験体において、筋肉の形成、維持、修復、または再生を促進するための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  82. それを必要とする被験体において、筋肉の形成、維持、修復、または再生を促進するための、医薬の製造のための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  83. 他の幹細胞マーカーと組み合わせて使用される、静止状態のサテライト細胞のマーカーとしてのＦｘｚ７の使用。
  84. サテライト幹細胞を同定または単離するための方法であって、ＹＦＰ−またはＭｙｆ−と組み合わせてマーカーＰａｘ７＋を選択するステップを含む方法。
  85. 前記活性剤は、前記幹細胞の対称性分裂を阻害することができる、ＰＣＰシグナル伝達の阻害因子である、請求項１に記載の組成物。
  86. 前記阻害因子は、Ｗｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、またはＰＣＰ経路におけるエフェクター分子の阻害を介して、ＰＣＰシグナル伝達を直接または間接的に阻害することができるペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である、請求項８５に記載の組成物。
  87. 前記ＰＣＰ経路における前記エフェクター分子は、Ｖａｎｇｌ２、α７−インテグリン、Ｐｒｉｃｋｌｅ１、またはＣｅｌｓｒ２である、請求項８６に記載の組成物。
  88. 前記阻害因子は、Ｗｎｔ７ａ、Ｆｚｄ７、または前記ＰＣＰ経路におけるエフェクター分子の発現を阻害することができるポリヌクレオチドである、請求項８６に記載の組成物。
  89. 前記阻害因子はｓｉＲＮＡである、請求項８７または８８に記載の組成物。
  90. 活性剤として、Ｆｚｄ７受容体の１つまたは複数の活性化因子を含む、対称性幹細胞分裂を促進するための組成物。
  91. 前記幹細胞はサテライト幹細胞である、請求項９０に記載の組成物。
  92. 筋肉の修復または再生において有用な化合物についてスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）サテライト幹細胞の集団を提供するステップ；
    （ｂ）試験化合物を用いて前記幹細胞を処理するステップ；ならびに
    （ｃ）対照と比較した、前記処理された幹細胞の非対称性分裂に対する対称性分裂の割合を決定するステップ
    を含み、対照と比較した、対称性分裂の割合の増加は、前記化合物が筋肉の修復または再生において有用であることを示す方法。
  93. 筋肉の修復または再生において有用な化合物についてスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）サテライト幹細胞の集団を提供するステップ；
    （ｂ）試験化合物を用いて前記幹細胞を処理するステップ；ならびに
    （ｃ）前記化合物が、前記処理された幹細胞において、ＰＣＰシグナル伝達を活性化し、刺激するかどうかを決定するステップ
    を含み、ＰＣＰシグナル伝達の増加は、前記化合物が筋肉の修復または再生において有用であることを示す方法。
  94. ＰＣＰシグナル伝達の刺激は、Ｆｚｄ７の活性化を介して起こる、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記増加は、少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれを超える増加である、請求項９２または９３に記載の方法。
  96. サテライト幹細胞枯渇を予防するための方法であって、（ａ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体、あるいは（ｂ）Ｗｎｔ７ａポリペプチド、またはＦｚｄ７に結合し、それを活性化することができるその活性な変異体、断片、類似体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドと前記幹細胞を接触させるステップを含む方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020521459A (ja) * 2017-05-24 2020-07-27 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ サテライト細胞および組成物ならびにそれらの生産方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010124365A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Ottawa Hospital Research Institute Compositions and methods for modulating stem cells and uses thereof
CN103476415B (zh) 2010-11-16 2017-09-22 南加州大学 用于增强成体干细胞的不对称分裂的cbp/连环蛋白拮抗剂
BR112013017711A2 (pt) * 2011-01-11 2016-08-23 Fate Therapeutics Inc novas composições de wnt e usos terapêuticos de tais composições
US9732130B2 (en) 2011-09-16 2017-08-15 Ottawa Hospital Research Institute WNT7A compositions and method of using the same
AU2012308476B2 (en) * 2011-09-16 2016-04-14 Fate Therapeutics, Inc. Wnt compositions and therapeutic uses of such compositions
AU2012319069A1 (en) 2011-10-07 2014-05-29 University Of Southern California CBP/catenin antagonists for enhancing asymmetric division of somatic stem cells
EP3057599A4 (en) * 2013-10-17 2017-04-19 University of Maryland, Baltimore Methods of generating mature human muscle fibers
CN105067810B (zh) * 2015-07-16 2017-06-27 上海市第十人民医院 一种检测原代神经干细胞迁移极化的方法及其应用
CN115386539A (zh) * 2021-05-18 2022-11-25 南京大学 胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006509497A (ja) * 2002-09-24 2006-03-23 ニューロ セラピューティクス エービー 神経発生に関する方法および物質
JP2007524611A (ja) * 2003-06-25 2007-08-30 オタワ ヘルス リサーチ インスティテュート 幹細胞の成長及び分化を調節する方法及び組成物
JP2008511662A (ja) * 2004-08-30 2008-04-17 セレゲン，インコーポレーテッド 損傷組織の修復を促進するためのＷｎｔタンパク質を含む馴化培地

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4544752A (en) 1980-09-22 1985-10-01 Eli Lilly And Company 3-Aryl-5-isothiazolecarboxylic acids and related compounds used to lower uric acid levels
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
AU660629B2 (en) 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
CA2103064A1 (en) 1991-05-14 1992-11-15 George Y. Wu Targeted delivery of genes encoding immunogenic proteins
ATE195656T1 (de) 1991-06-05 2000-09-15 Univ Connecticut Zielgerichtete freisetzung von genen, die sekretorische proteine kodieren
WO1993014188A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 The Regents Of The University Of Michigan Targeted virus
CA2133411A1 (en) 1992-04-03 1993-10-14 Alexander T. YOUNG Gene therapy using targeted viral vectors
WO1993025234A1 (en) 1992-06-08 1993-12-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for targeting specific tissue
US5723287A (en) 1992-09-22 1998-03-03 Medical Research Council Recombinant viruses displaying a nonviral polypeptide on their external surface
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
EP0972029A1 (en) 1997-03-07 2000-01-19 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
EP0975781A1 (en) 1997-04-01 2000-02-02 The General Hospital Corporation Molecular marker for muscle stem cells
GB9828419D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
AU2001266787A1 (en) 2000-06-07 2002-01-08 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US20050130181A1 (en) * 2001-05-18 2005-06-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of wingless gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7153832B2 (en) 2003-04-07 2006-12-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions of active Wnt protein
US7374760B2 (en) 2003-05-15 2008-05-20 The University Of Chicago Methods and compositions for nerve regeneration
WO2006036175A2 (en) 2004-09-21 2006-04-06 Rhode Island Hospital, A Lifespan-Partner Wnt proteins and detection and treatment of cancer
US7850960B2 (en) 2004-12-30 2010-12-14 University Of Washington Methods for regulation of stem cells
CA2524619A1 (en) 2005-11-22 2007-05-22 Ottawa Health Research Institute Novel stem cells, nucleotide sequences and proteins therefrom
JP2010520286A (ja) 2007-03-05 2010-06-10 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ Ｗｎｔ組成物およびその使用方法
WO2010014948A1 (en) 2008-08-01 2010-02-04 The University Of Utah Research Foundation Methods of treatment using wnt inhibitors
EP2384116A1 (en) 2008-12-31 2011-11-09 The Regents of the University of California Dominant negative wnt2 compositions and methods of use
WO2010124365A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Ottawa Hospital Research Institute Compositions and methods for modulating stem cells and uses thereof
US20120164731A1 (en) * 2009-07-09 2012-06-28 Kyoto University Method of inducing differentiation from pluripotent stem cells to skeletal muscle progenitor cells
US20130045209A1 (en) 2010-01-12 2013-02-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. WNT-Binding Agents and Uses Thereof
BR112013017711A2 (pt) 2011-01-11 2016-08-23 Fate Therapeutics Inc novas composições de wnt e usos terapêuticos de tais composições
US20140200179A1 (en) 2011-01-28 2014-07-17 The Board Of The Trustees Of The Leland Stanford Junior University Wnt compositions and methods of use thereof
AU2012308476B2 (en) 2011-09-16 2016-04-14 Fate Therapeutics, Inc. Wnt compositions and therapeutic uses of such compositions
US9732130B2 (en) 2011-09-16 2017-08-15 Ottawa Hospital Research Institute WNT7A compositions and method of using the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006509497A (ja) * 2002-09-24 2006-03-23 ニューロ セラピューティクス エービー 神経発生に関する方法および物質
JP2007524611A (ja) * 2003-06-25 2007-08-30 オタワ ヘルス リサーチ インスティテュート 幹細胞の成長及び分化を調節する方法及び組成物
JP2008511662A (ja) * 2004-08-30 2008-04-17 セレゲン，インコーポレーテッド 損傷組織の修復を促進するためのＷｎｔタンパク質を含む馴化培地

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6014016925; Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２８０，　Ｎｏ．２２, 2005, ｐ．２１６５３-２１６６０ *
JPN6014016927; Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．１００, 2000, ｐ．５２５-５３５ *
JPN6014016931; 蛋白質　核酸　酵素 Ｖｏｌ．４９，　Ｎｏ．６, 2004, ｐ．７４１-７４８ *
JPN6014016934; Ａｒｃｈｉｖｅｓ　Ｉｔａｌｉｅｎｎｅｓ　ｄｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅ Ｖｏｌ．１４３，　Ｎｏ．３-４, 2005, ｐ．２４３-２４８ *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020521459A (ja) * 2017-05-24 2020-07-27 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ サテライト細胞および組成物ならびにそれらの生産方法
US11512291B2 (en) 2017-05-24 2022-11-29 President And Fellows Of Harvard College Satellite cells and compositions and methods for producing the same
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