JP2010520286A - Wnt組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Wntタンパク質は、胚形成の間に細胞間相互作用を調節する、高度に保存された分泌型シグナル伝達分子のファミリーを構成している。Wnt遺伝子およびWntシグナル伝達は癌とも関係づけられている。Wntの作用機序についての洞察が、いくつかの系から浮かび上がってきている:ショウジョウバエ(Drosophila)および線虫セノラブディティス-エレガンス(Caenorhabditis elegans)における遺伝学;細胞培養物における生化学およびアフリカツメガエル(Xenopus)胚における異所性遺伝子発現。マウスでは多くのWnt遺伝子が突然変異を受けて、非常に特異的な発達異常を招いている。現在の理解によれば、Wntタンパク質は細胞表面上のFrizzledファミリーの受容体と結合する。いくつかの細胞質中リレー要素を通じて、このシグナルはβ-カテニンに伝達され、続いてそれが核内に入ってTCFと複合体を形成して、Wnt標的遺伝子の転写を活性化する。
可溶性winglessタンパク質の生物活性は、Leeuwen et al. (1994) Nature 24:368(6469):342-4(非特許文献2)に記載されている。可溶性で生物活性のある脊椎動物Wntタンパク質を用いたWnt-frizzled相互作用の生化学的特性決定が、Hsieh et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(7):3546-51(非特許文献3)に記載されている。Bradley et al. (1995) Mol Cell Biol 15(8):4616-22(非特許文献4)は、マイトジェン活性を有する可溶型のwntタンパク質を記載している。
Wntタンパク質の治療的使用のための方法および組成物が提供される。本発明のいくつかの態様においては、Wntタンパク質の治療的有効量を含む、インビボ投与のための薬学的組成物が提供され、ここでWntタンパク質は、脂質構造物の非水相中に、例えばリポソーム、ミセル、脂質ラフトなどの表面内、エマルション中などに挿入される。いくつかの態様において、Wntタンパク質はリポソーム外膜またはミセル上にその活性立体構造で提示される。本発明の薬学的組成物は、動物に対して治療目的で投与することができる。本発明のいくつかの態様において、組成物は、例えば損傷部位における注射により、局所的に投与される。
本方法を説明する前に、本発明が、説明される特定の方法には限定されず、それらは当然ながら変更されてもよいことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は特定の態様のみを説明することを目的としていて、本発明の範囲を限定することは意図していないことも理解されるべきである。
Wntタンパク質は、胚形成の間に細胞間相互作用を調節する、高度に保存された分泌型シグナル伝達分子のファミリーを構成している。「Wnt」または「Wnt遺伝子産物」または「Wntポリペプチド」という用語は、本明細書で用いる場合、ネイティブ配列Wntポリペプチド、Wntポリペプチド変異体、Wntポリペプチド断片およびキメラWntポリペプチドを範囲に含む。本発明のいくつかの態様において、Wntタンパク質は、システイン残基と共有結合したパルミチン酸を含む。
本発明の方法は、動物、例えば哺乳動物に対してインビボで投与された場合に活性のあるWnt組成物を提供する。組成物中のWntタンパク質の比活性は、例えば骨再生の加速、幹細胞増殖の上方制御などのようなインビボ投与後の機能的アッセイにおいて活性レベルを決定すること、例えば免疫染色、ELISA、クーマシーまたは銀で染色したゲル上での定量などのような非機能的アッセイにおいて存在するWntタンパク質の量を定量すること、およびインビボの生物活性のあるWntとWnt全体との比を決定することによって決定しうる。
本発明の方法で用いているように、脂質構造物は、インビボ投与後のwntタンパク質の活性を維持する上で重要であることが見いだされている。wntタンパク質はこれらの構造物の水相中に封入されるのではなく脂質膜の中に組み込まれており、図5に示されているように、膜の外膜中に挿入することもできる。そのような構造物は、タンパク質を例えばリポソーム中に存在する形で製剤化する従来の方法からは予想されない。
本方法は、予防および治療の両方の目的に有用である。したがって、本明細書で用いる場合、「処置する」という用語は、疾患の予防および既存の容態の処置の両方を指して用いられる。罹患体の臨床症状を安定化または改善するための、進行中の疾患の処置は、本発明によって提供される特に重要な利点である。そのような処置は、罹患組織における機能喪失の前に行われることが望ましい;その結果として、本発明によって提供される予防的治療上の利点も重要である。治療効果の証拠は、疾患の重症度の何らかの軽減であってよい。治療効果は臨床的アウトカムの点で測定してもよく、または免疫学的もしくは生化学的な検査によって決定することもできる。処置の対象となる罹患体は、哺乳動物、例えばヒトを含む霊長動物であってもよく、特に治療法の評価のためには、ウサギ、ラット、マウスなどの実験動物であってもよく、ウマ、イヌ、ネコ、家畜などであってもよい。
実施例1
Wnt3aリポソームを介した骨再生の強化
いくつかの成体組織は再生する能力を有しており、これらの中でも骨は最も顕著なものの一つである。骨は、損傷後に再形成するという永続的で生涯にわたる能力を有しており、絶え間ない骨再生は骨量および骨密度を維持するための必須条件である。骨再生の擾乱はたとえわずかであっても、骨粗鬆症および骨格修復遅延などの容態によって例示されるように重大な帰結をもたらす。今回、本発明者らの目標は、成体骨形成におけるWntの役割を明らかにし、続いて、この情報を、新規試薬も加味した上で、骨再生を刺激するための治療戦略に利用することであった。TOPgalレポーターマウスを用いて、本発明者らは、骨格に対する障害が、特に損傷の部位でのWntシグナル伝達の誘因になることを見いだした。本発明者らは、Wnt阻害が骨前駆細胞の分化を妨げるか否かを明らかにするために骨格損傷モデルを用いたところ、その結果、損傷により誘導される骨再生は84%低下した。Wnt経路の恒常的活性化は高い骨量をもたらしたが、この同じ点突然変異は、骨前駆細胞が増殖状態に維持されたために骨再生の遅延を引き起こした。骨再生を強化するための治療戦略において、本発明者らは、損傷部位でのWntシグナル伝達を一過性に活性化した。これは、Wnt3aタンパク質を、創傷環境でそのタンパク質の生物活性を保持させるリポソームベシクル内にパッケージングすることによって達成した。本発明者らは、Wnt3aリポソームの単回注射が、対照と比較して骨再生を350%に増加させることを見いだした。これらのデータは、骨再生が望まれる臨床的状態を処置するための有用なアプローチを示している。
損傷部位でのWntシグナル伝達を上方制御する、骨格に対する障害
骨再生の過程におけるWntの関与に関してより良い理解を得るために、本発明者らは、Wnt経路の構成要素に関するインサイチューハイブリダイゼーションを基にしたスクリーニングに着手した。本発明者らはまず、無傷の成体骨格における遺伝子発現について検討し、この経路のほとんどの構成要素が成長板および骨膜において低レベルで検出されることを見いだした(例えば、図1a〜c)。例えば、骨細胞はWnt 3a、5a、5b、11、Frizzled 4(Fzd4)およびDickkopf2(Dkk2)を発現したが、一方、骨内膜および骨髄内の細胞はWnt 2b、3a、5a、11、Dkk2およびWnt阻害因子を発現した(図1a〜c、表1にまとめられている)。これらのデータは、成体骨量の維持および種々の骨疾患におけるWntシグナル伝達の役割と合致した。本発明者らはまた、TOPgalおよびBATgalトランスジェニックマウスの無傷骨格についても検討した。これらのマウスは、Tcf/Lef結合部位の多数のコピーの制御下にあるβ-ガラクトシダーゼレポーターを保有している;このため、Xgal染色の空間的時間的パターンはWnt応答性の反映である。成体成長板では、肥大軟骨細胞が列を構成して海綿骨骨芽細胞と隣接しており、それが血管と交錯している(図1d)。TOPgal成長板における肥大軟骨細胞および海綿骨骨芽細胞はいずれもXgal陽性であった(図1e)。骨皮質に組み込まれた骨細胞もXgalに関して染色され(図1f)、骨髄内の細胞のわずかなパーセンテージについても同様であった(図1g)。これらのデータから、Wntシグナル伝達が成体骨格において機能を有することが指し示された。
本発明者らのデータにより、Wntシグナル伝達が骨格に対する障害から24時間以内に上方制御されること;およびWnt応答性細胞が損傷部位に局在することから、Wnt経路の構成要素が骨再生において役割を果たすのに適切な時間および場所で発現されることが示された(図1)。これらのデータを考慮した上で、本発明者らは、Wntシグナル伝達における擾乱が骨格修復プログラムに影響を及ぼすか否かを検証した。
Wntシグナル伝達の阻害が骨再生に有害であることが示されたことを受けて、本発明者らは次に、Wntシグナル伝達の活性化が骨治癒のために有益であるか否かを探った。Wnt共受容体Lrp5における機能獲得型突然変異は高骨量表現型と関連があり、このため、本発明者らはこれと同じ突然変異を有するトランスジェニックマウス(すなわち、Lrp5-G171Vマウス)における骨再生を評価した。
これらの実験を始めた時の本発明者らの目的は、成体骨形成およびリモデリングにおけるWntシグナル伝達の役割についての洞察を得て、続いてその情報を用いて、骨再生を強化するための処置戦略を開発することであった。本発明者らは、Lrp5-G171VマウスにおけるWnt依存性増殖効果を本発明者らに有利なように利用しうることを認識しており、このため、骨再生に対する外因性Wntタンパク質の効果を検討するための一連の実験に着手した。本発明者らが直面した最も困難な技術的障害は、Wntタンパク質のために適切な送達媒体を考案することであった。本発明者らの最初の試みにおいて、本発明者らは、損傷部位に直接注射されたWnt3aタンパク質は、PBS注射と比較して骨再生に何ら影響を及ぼさないことを見いだした。本発明者らはまた、Wnt3aタンパク質をフィブリン糊に組み入れ、それを損傷部位に移植してもみた。タンパク質の直接注射の場合と同じく、本発明者らは骨再生の開始、速度または程度のいずれに関しても差を検出することができなかった。
骨格に対する障害は体内での修復応答を誘発し、本発明者らのデータは、その修復応答に関与する1つの経路はWntによって媒介されることを指し示している(図1および表1)。骨格障害に応答して、損傷部位の前駆細胞は増殖し始める。損傷により誘導されるこの増殖に関与する経路のうち少なくとも1つはWntシグナル伝達によって媒介されるという本発明者らのデータ(図4)。ひとたび十分な量の集団が生成されると、骨格前駆細胞は骨芽細胞に分化し始める。本発明者らは、増殖と分化との間のこの推移がいかにして起こったかについての手がかりを得てはいないが、本発明者らのデータは、Wntシグナル伝達が損傷部位における骨芽細胞分化の決定的なメディエーターであることを示している(図3、4)。本発明者らはさらに、新規なリポソームパッケージング法を介して送達された外因性Wnt3aが骨再生の劇的な強化を導くことも示している。これは少なくとも2つの機序を通じて達成される。第1に、Wnt3aリポソームは、骨形成性遺伝子およびアルカリホスファターゼ活性の初期誘導によって示されるように、創傷部位での骨芽細胞分化のプログラムを早める(図5)。第2に、Wnt3aで処置した損傷部位はより多くのPECAM陽性内皮細胞を有していた(図5)。
Wntレポーターマウス
BATgalおよびTOPgalトランスジェニックマウスを、Wnt応答性のインビボレポーターとして用いた。BATgalレポーターマウスは、7つのTCF結合モチーフおよびアフリカツメガエルsiamoisプロモーターを含む導入遺伝子を保有している。TOPgalレポーターカセットは、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を推進させる最小c-Fosプロモーター上流に、TCFモチーフCCTTTGATCの3つのコピーを含む。本発明者らは、損傷部位におけるWnt応答細胞を同定するために、この両方の系統を用いた。
本発明者らは、脛骨の一方の皮質を貫通させて開けた1.0mmの孔からなる単純な経皮質的欠損を作製することにより、骨折治癒を構成するすべての段階が再現されることを見いだした。この欠損における治癒応答は安定化された骨折と同等であり、閉鎖骨折および開放骨折の他のモデルを上回る数多くの利点を有する;第1に、骨格損傷の範囲を限定することによって動物の病的状態がかなり軽減される。第2に、修復カルスがはるかに小さく、空間的により組織化されており、このために組織形態計測的な分析が容易になる。第3に、この骨格組織再生モデルでは、周囲組織に対する外傷および感染症が最小限に抑えられる。手順はすべて、Stanford動物研究委員会(Stanford Committee on Animal Research)による承認を得た。
RNアーゼ非含有条件下で、脛骨カルス組織を収集し、皮膚および筋外膜を除去して、組織を1×PBS、4℃中で洗浄した後に、4%パラホルムアルデヒド中で固定した。組織の脱灰処理を19% EDTA中で10〜14日間行い、続いてパラフィン包埋用に調製した。パラフィン包埋は本発明者らの標準的なプロトコールに従って行い、8μm厚の切片を作製した。
該当するジゴキシン標識mRNAアンチセンスプローブを、wnt3a、dkk2、wnt2b、runx2、コラーゲンI型、コラーゲンII型、sox9およびオステオカルシン用のcDNAテンプレートから調製した。切片の脱蝋処理を行い、プロテイナーゼKで処理した上で、リボプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中でインキュベートした。プローブはおよそ25μg/mlの濃度で添加した。食塩水クエン酸ナトリウム溶液でのストリンジェンシー洗浄を52℃で行い、さらに1% Tween20を含むマレイン酸緩衝液で洗浄した。続いてスライドを抗ジゴキシゲニン抗体(Roche)で処理した。色の検出のためには、スライドをニトロブルー塩化テトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(Roche)中でインキュベートした。呈色させた後に、スライドを水性マウント用媒質とともにカバーグラスで覆った。
一般に、組織切片は脱蝋処理を行った後にH2O2/PBS中に浸漬し、PBSで洗浄して、フィシン(Zymed)中でインキュベートし、0.1Mグリシンで処理して、さらに洗浄した上で、卵白アルブミン(Worthington)および1%全長ロバIgG(Jackson Immunoresearch)中でブロックした。適切な一次抗体を添加し、4℃で一晩インキュベートした後に、PBSで洗浄した。試料をペルオキシダーゼ結合二次抗体(Jackson Immunoresearch)とともに1時間インキュベートし、DAB基質キット(Vector Laboratories)を用いて呈色反応を起こさせた。いくつかの一般的に用いられる抗体には、増殖細胞核抗原(PCNA)および血小板内皮細胞接着分子1(PECAM-1)が含まれる。DNA鎖切断のターミナルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(TUNEL)染色のためには、切片をプロテイナーゼK緩衝液(20μg/mL、10mM Tris pH 7.5中)中で、続いてTUNEL反応混合物(インサイチュー細胞死検出キット、Roche)中でインキュベートした。スライドを蛍光顕微鏡で観察した。酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(TRAP)染色のためには、組織切片を脱蝋処理し、続いてTRAP染色キット(Sigma)で処理した。
PCNA陽性細胞の定量は、NIH Image Jソフトウエアを用いて行った。Ad-FcまたはAd-Dkk1処置の各条件につき動物4匹を用い、各条件につき10個ずつのランダムなPCNA染色組織切片を評価した。
ペンタクロムおよびアニリンブルー染色を記載の通りに行った。スライドは、一連のエタノールおよびキシレンによる脱水後にPermountにマウントした。
Wntシグナル伝達に応答する細胞はβ-ガラクトシダーゼを発現し、これをXgal染色によって検出することができる。Xgal染色のためには、組織を0.2%グルタルアルデヒドにより15分間かけて固定し、Xgalにより37℃で一晩かけて染色した。アデノウイルス処置試料におけるXgal陽性細胞を検出するためには、ホールマウントXgal染色組織をパラフィンブロックに加工処理して切片化した。リポソーム処置試料に関しては、組織をOCT中に包埋し、その後に凍結切片を作製した。凍結切片に対するXgal染色はホールマウントと同様の様式で行った。
欠損領域における新生骨および軟骨を評価するために、脛骨を術後第4日または第6日に採取した。脛骨をパラフィン中に包埋し、長軸方向に切片化して、アニリンブルーで染色した。各条件(すなわち、Ad-Fc、Ad-Dkk1、PBSリポソームまたはWnt3aリポソーム;詳細については本文参照)につき、合計4〜7匹の動物を用いた。1.0mmの円形の単皮質欠損が、それぞれ8μm厚であるおよそ40個の組織切片にわたって示された。それらの40個の切片のうち、6〜8個の組織切片を組織形態計測的な測定のために用いた。各切片をアニリンブルーを用いて鉱化組織に関して染色した上で、Leicaデジタル画像化システム(対物レンズ5倍)を用いて写真撮影した。これらのデジタル画像をAdobe Photoshop CS2に取り込んだ。関心対象の領域は106個のピクセルを含んでおり、アニリンブルー染色されたピクセルの数を、単盲検下の検査員がmagic wandツール(公差設定;60、ヒストグラムピクセル設定;キャッシュレベル1)を用いて求めた。
アデノウイルス構築物はすべて、以前の通りに作製した35。可溶性WntアンタゴニストDkk1およびマウスIgG2α Fc断片を発現するアデノウイルス(Ad-Fc)を、T175組織培養フラスコ(7.5×106pfu)内で293細胞にMOI 1で感染させた。2日後に細胞を採取し、溶解させて、遠心分離により沈降させた。上清を凍結/解凍サイクルによって加工処理し、細胞片を遠心分離によって除去した。この上清を35,000rpm、20時間のCsCl勾配遠心分離に供し、アデノウイルスバンドを収集した。スクロース透析の後に、精製アデノウイルスをアリコートに分けて-80℃で保存した。Wnt阻害はAd-Dkk1および対照Ad-Fcの尾静脈または局所への皮下注射によって行い、損傷をその直後(尾静脈注射の場合)または48時間後(局所注射の場合)に作製した。
Wnt3a-リポソームは、1、2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC);1-ミリストイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(MPPC);1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-65ポリエチレングリコール)2000](DSPE-PEG2000;Avanti Polar Lipids)を90:10:4の比で用いて作製した。1μgの精製Wnt3aタンパク質をリポソーム中にパッケージングした。単層ベシクルは、2枚の100nmポリカーボネート膜を重ねたものを通してWntタンパク質/リポソーム溶液を40回押し出すことによって作り出した。サイズ排除(size extrusion)の後に、28,000rpm、4℃、30分間の超遠心分離によってWnt3aリポソームを沈降させた。Wnt3aリポソームペレットを、10%ウシ胎仔血清(Hyclone)を加えた500μlのDMEM中に再懸濁させた。対照PBSリポソームも同一の条件を用いて作製した。Wnt3aリポソーム調製物の30μlアリコートを、29.5ゲージ針を用いて各部位に注射した。
術後24時間の時点でカルスを野生型(CD1)およびBATgalマウスから採取し、全RNAを抽出して、1μgのRNAを、β-ガラクトシダーゼプライマーセットを用いるRT-PCRに供した。ウエスタンブロット手順は以前の記載の通りに行った。
Claims (17)
- 以下の段階を含む、動物に対するwntポリペプチドの治療的送達のための方法:
脂質部分を含むwntポリペプチドの有効量を該動物に投与する段階であって、wntタンパク質が脂質構造物の非水相中に挿入されている、段階。 - 脂質構造物がリポソームである、請求項1記載の方法。
- 脂質構造物がミセルである、請求項1記載の方法。
- wntポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドである、請求項1記載の方法。
- wntポリペプチドが局所的に投与される、請求項1記載の方法。
- wntポリペプチドが注射によって投与される、請求項5記載の方法。
- 脂質部分を含むwntポリペプチドの有効量であって、wntタンパク質が脂質構造物の非水相中に挿入されている、wntポリペプチドの有効量と、
薬学的に許容される添加剤と
を含む、薬学的製剤。 - 脂質構造物がリポソームである、請求項7記載の薬学的製剤。
- 脂質構造物がミセルである、請求項7記載の薬学的製剤。
- wntポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドである、請求項7記載の薬学的製剤。
- 以下の段階を含む、哺乳動物における骨修復を加速させる方法:
脂質部分を含むwntポリペプチドの有効量を哺乳動物に投与する段階であって、wntタンパク質が脂質構造物の非水相中に挿入されている、段階。 - wntポリペプチドが、哺乳動物における骨損傷の部位に注射される、請求項11記載の方法。
- wntポリペプチドがwnt 3Aである、請求項12記載の方法。
- wntポリペプチドが損傷から2日のうちに投与される、請求項12記載の方法。
- wntポリペプチドが最長2週間にわたって投与される、請求項14記載の方法。
- 哺乳動物に外因性骨髄細胞が与えられる、請求項11記載の方法。
- 骨髄細胞がエクスビボでwntポリペプチドの有効量により処置される、請求項16記載の方法。
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