TW202400227A

TW202400227A - 用於膜修復的方法

Info

Publication number: TW202400227A
Application number: TW112105850A
Authority: TW
Inventors: 俞立; 黃雨薇
Original assignee: 清華大學
Priority date: 2022-02-18
Filing date: 2023-02-17
Publication date: 2024-01-01
Also published as: WO2023155880A1

Abstract

本揭露提供了一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能，從而可幫助細胞減輕由激光、洗滌劑、細胞焦亡和自然殺傷細胞造成的損傷。

Description

用於膜修復的方法

本發明提供一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能，從而可幫助細胞減輕損傷。

細胞質膜是圍繞細胞的屏障。可為物理、化學或生物性質的各類損傷可導致細胞膜喪失完整性；如果不進行修復，則不可避免地會導致細胞消亡。包括胞吐作用、內吞作用、SYX-2-EFF-1修復機制和ESCRT機制等在內的不同機制均已被證明在膜修復中發揮了重要作用。^1-8在ESCRT介導的膜修復過程中，ESCRT組分被募集到損傷位點，以鈣離子依賴的方式藉由擠出受損膜而促進質膜的修復。⁹ESCRT介導的膜修復在包括激光、洗滌劑、細胞壞死和細胞焦亡導致的不同類型損傷後，在維持細胞存活率方面發揮重要作用。^10-12ESCRT能夠修復100nm左右的小塊膜損傷；然而，更大的傷口如何修復尚不清楚。

四跨膜蛋白4(Tspan4)是一種包含4個跨膜結構域的跨膜蛋白。它是四跨膜蛋白族(Tetraspanin)的成員。四跨膜蛋白族成員將膜組織成富含膽固醇的膜域，該富含膽固醇的膜域稱為富含四跨膜蛋白的微結構域(TEMs)，並且四跨膜蛋白被認為會影響膜的特性。^{13-1615,17-19}TEMs可組裝成作為形成遷移體必要條件的微米級富含四跨膜蛋白的宏結構域(TEMAs)。²⁰目前尚不清楚TEMAs的組裝除了介導遷移體的形成外，是否還有其它功能。

本申請揭露了在膜損傷後不久，富含四跨膜蛋白的宏結構域(TEMAs)在損傷位點周圍進行組裝。TEMAs處於液態有序相，並且在損傷位點周圍形成剛性環。這限制了損傷的擴散，防止了膜解體，從而有利於藉由其它機制進行膜修復。

本申請揭露了Tspan4在藉由介導富含四跨膜蛋白的宏結構域的組裝在膜修復中發揮重要作用，該富含四跨膜蛋白的宏結構域封閉損傷位點以防止其擴大，從而促進膜修復(圖4j)。這種機制可被視為一種平行、可能是間接的機制，在與ESCRT機制和直接修復小於100nm的傷口的其他機制協同的作用下，於損傷後保持膜的完整性。

在一個方面中，本揭露提供了一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該膜修復相關生物過程包括傷口癒合和/或細胞損傷調節。

在一些實施例中，其中，該細胞損傷包括細胞死亡。

在一些實施例中，其中，該細胞死亡包括細胞凋亡、細胞壞死和/或細胞焦亡。

在一些實施例中，其中，該細胞損傷是由物理因素、化學因素和/或生物因素引起的。

在一些實施例中，其中，該細胞損傷是由激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞引起的。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

在一些實施例中，其中，該膜包含直徑為至少約100nm的損傷區。

在一些實施例中，該方法包括調節待修復膜中的該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該膜來源於生物材料和/或為人工膜。

在一些實施例中，其中，該膜為細胞膜，並且該方法包括調節該細胞表達或包含的TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該TSPAN4為人TSPAN4。

在一些實施例中，其中，該TSPAN4包含如SEQ ID NO：1-2中任一項所示的胺基酸序列。

在一些實施例中，其中，該膜修復包括抑制膜損傷擴大和/或促進膜癒合。

在一些實施例中，該方法增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷。

在一些實施例中，該方法包括增加該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，該方法包括過表達TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。

在一些實施例中，其中，該膜為細胞膜，並且該方法包括增加該細胞中的該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，該方法包括促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

在一些實施例中，該方法進一步包括增加能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該第二製劑包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。

在一些實施例中，其中，該ESCRT的一個或多個組分包括Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3。

在一些實施例中，該方法抑制該膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷。

在一些實施例中，該方法包括減少該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該膜為細胞膜，並且該方法包括減少該細胞中的該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，該方法包括減弱或剔除編碼跨膜蛋白4的基因表達。

在一些實施例中，該方法包括抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

在一些實施例中，該方法包括施用TSPAN4抑制劑。

在一些實施例中，該方法進一步包括減少能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。

在一些實施例中，該方法進一步包括施用能夠抑制膜修復和/或導致細胞損傷的外加劑。

在一些實施例中，其中，該外加劑包括物理製劑、化學製劑和/或生物製劑。

在一些實施例中，其中，該外加劑包括激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

在一些實施例中，該方法是一種體內方法。

在一些實施例中，該方法是一種體外方法或離體方法。

在一個方面中，本揭露提供了一種能夠調節TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程。

在一些實施例中，其中，該細胞損傷包括細胞死亡。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

在一些實施例中，能夠調節該膜中該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該膜為細胞膜，並且該製劑能夠調節該細胞表達或包含的該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該TSPAN4為人TSPAN4。

在一些實施例中，該製劑用於增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷。

在一些實施例中，該製劑能夠增加該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，該製劑能夠導致TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子的過表達。

在一些實施例中，該製劑包括TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。

在一些實施例中，其中該膜是細胞膜，並且該製劑能夠增加該細胞中該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，該製劑能夠促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

在一些實施例中，該製劑用於與能夠增加膜修復、減輕細胞損傷和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑結合使用。

在一些實施例中，該製劑用於抑制該膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷。

在一些實施例中，該製劑能夠減少該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該膜是細胞膜，並且該製劑能夠減少該細胞中該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，該製劑能夠減弱或剔除編碼跨膜蛋白4的基因表達。

在一些實施例中，該製劑能夠抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

在一些實施例中，該製劑包括TSPAN4抑制劑。

在一些實施例中，該製劑用於與第二製劑結合使用，該第二製劑能夠減少可增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的製劑的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該第二製劑能夠減少以下物質的數量和/或功能：內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。

在一些實施例中，該製劑用於與能夠抑制膜修復和/或導致細胞損傷的外加劑結合使用。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

在一個方面中，本揭露提供了一種工程細胞，該工程細胞與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該工程細胞已被修飾以改變該工程細胞中的TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該細胞損傷包括細胞死亡。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

在一些實施例中，該工程細胞已被修飾用來增加該膜中的該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該TSPAN4為人TSPAN4。

在一些實施例中，該工程細胞具有增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的能力。

在一些實施例中，該工程細胞已被修飾用來增加該工程細胞中該TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，該工程細胞過表達TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。

在一些實施例中，該工程細胞已被修飾用來促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

在一些實施例中，該工程細胞已被進一步修飾用來增加能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。

在一些實施例中，該工程細胞具有降低膜修復的能力和/或提高促進細胞損傷的能力。

在一些實施例中，該工程細胞與未修飾的相應細胞相比，包括數量和/或功能減少的該TSPAN4。

在一些實施例中，其中，編碼四跨膜蛋白4的基因表達已經被減弱或剔除

在一些實施例中，該工程細胞已被修飾用來抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

在一些實施例中，該工程細胞已被TSPAN4抑制劑處理。

在一些實施例中，該工程細胞已被進一步修飾用來減少能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該ESCRT一個或多個組分包括Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3。

在一些實施例中，該工程細胞已被能夠抑制膜修復和/或導致細胞損傷的外加劑進一步處理。

在一些實施例中，該外加劑包括物理製劑、化學製劑和/或生物製劑。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

在一個方面中，本揭露提供了一種根據本揭露的製劑和/或根據本揭露的工程細胞在製備該膜修復和/或該膜修復相關生物過程的調節劑中的用途。

在一個方面中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包括根據本揭露的製劑和/或根據本揭露的工程細胞。

在一些實施例中，該組成物為醫藥組成物，並且可選地包括藥學上可接受的賦形劑。

在一個方面中，本揭露提供一種試劑盒，該試劑盒包括根據本揭露所述製劑、根據本揭露所述工程細胞、和/或根據本揭露所述組成物。

在一些實施例中，該試劑盒進一步包括該第二製劑。

在一些實施例中，其中，該第二製劑包含在單獨容器或隔室中。

本揭露的其他方面和優點對於所屬技術領域具有通常知識者來說，將從以下詳細描述中變得顯而易見，其中僅顯示和描述了本揭露的說明性實施例。正如將意識到的那樣，本揭露能夠包含其它和不同的實施例，並且可以在多個明顯的方面對它的若干細節進行改進，但所有這些改變不背離本發明。因此，附圖和說明僅僅是說明性的，而不是對本發明的限制。

援引併入

本說明書中所提到的所有出版物、專利和專利申請均藉由引用以同樣的程度併入本文，猶如每個單獨的出版物、專利或專利申請被特別地和單獨地指出藉由引用而併入。

在所附申請專範圍中具體闡述本發明的新穎特徵。藉由參考以下對利用了本發明原理的說明性實施例進行闡述的詳細描述和附圖(本文中也有“FIG.”、“Fig.”和“FIG.”的形式)，可以更好地理解本發明的特徵和優點，在圖式中：

圖1A示出了光損傷試驗。

圖1B示出了對過表達Tspan4-GFP的NRK細胞進行如圖1A所示的光損傷處理的延時成像。用共聚焦顯微鏡進行延時成像。比例尺，5μm。

圖1C示出了如何藉由微量移液針使用洗滌劑處理細胞。

圖1D示出了藉由圖1C所示的玻璃微量移液針使用洗滌劑處理過表達Tspan4-GFP的NRK細胞的延時成像。用共聚焦顯微鏡進行延時成像。綠色，Tspan4；紅色，PI；黃色，融合。比例尺，10μm。

圖1E示出了YTS NK細胞和表達Tspan4-BFP的MGC803細胞被共培養並且藉由共聚焦顯微鏡成像。YTS細胞由CD56-APC標記。黃色，BFP；青色，APC。比例尺，10μm。

圖1F示出了NRK Tspan4-GFP細胞經過光損傷處理的延時成像。PI(碘化鈉)表示膜通透性。綠色，Tspan4；紅色，PI；黃色，融合。比例尺，10μm。

圖1G示出了根據7個獨立實驗，對位於損傷位點的Tspan4-GFP和PI的標準化螢光強度進行的統計分析，其中f.平均值±s.e.m，N=21。

圖2A示出了在第一組實驗對象中，在NRK細胞中共表達Chmp4b-GFP與Tspan4-mCherry；在最後兩組實驗對象中，在NRK Tspan4-GFP細胞中表達Vps4a-mCherry和Chmp3-mCherry。光損傷後藉由共聚焦顯微鏡進行成像。綠色，GFP；紅色，mCherry；黃色，融合。比例尺，5μm。

圖2B示出了共表達Tspan4-GFP和Chmp4b-mCherry的NRK細胞遭受光損傷，然後藉由共聚焦顯微鏡採集延時成像。比例尺，10μm。

圖2C示出了光損傷處理後對位於損傷位點的Tspan4-GFP和Chmp4b-mCherry的標準化螢光強度進行的統計分析。根據7個獨立實驗，平均值±s.e.m，N=36。

圖2D示出了光損傷後，藉由SIM分析Tspan4-GFP和Chmp4b-mCherry的定位情況。綠色，Tspan4；紅色，Chmp4b-mCherry。白色箭頭，重疊位點。比例尺，5μm；放大，1μm。

圖2E示出了在共表達Tspan4-GFP和Vps4a-mCherry或Vps4aE228Q-mCherry的細胞發生光損傷中，藉由共聚焦顯微鏡進行分析的Tspan4和Vps4a位於損傷位點的定位情況。比例尺，10μm。

圖2F示出了在光損傷處理後從WT NRK細胞或Chmp4b-KO NRK細胞採集的位於損傷位點的Tspan4-GFP圖像。比例尺，10μm

圖2G示出了分析細胞底部Chmp4b-mCherry信號陽性面積的方法。上圖為光損傷時的細胞；下圖為後續時間點的細胞。

圖2H示出了在過表達Tspan4的NRK細胞(NRK Tspan4-OE)、NRK WT細胞和具有Tspan4基因剔除的NRK細胞(NRK Tspan4-KO細胞)中表達Chmp4b-mCherry。細胞被光損傷，然後藉由延時成像進行監測。比例尺，10μm。

圖2I示出了h個來自h.Chmp4b-mCherry陽性區的圖像中的Chmp4b-mCherry陽性信號覆蓋面積的統計分析，以根據4個獨立實驗藉由總細胞面積標準化為g.平均值±s.e.m，N=19。

圖2J示出了細胞底部的Chmp4b-mCherry陽性信號的總強度統計分析。根據4個獨立實驗，平均值±s.e.m，N=19。

圖3A示出了光損傷後Tspan4-GFP NRK細胞中的整合素α5-mCherry、CD63-mCherry和CD151-mCherry。比例尺，5μm

圖3B示出了在不同膽固醇耗竭條件下的Tspan4-GFP NRK細胞(包括10%全膽固醇培養基(FBS)、膽固醇耗竭培養基(LPDS)和含有30μM普伐他汀的膽固醇耗竭培養基)在光損傷前後藉由共聚焦顯微鏡觀察。比例尺，10μm。

圖3C示出了在不同的膽固醇耗竭條件下，Tspan4-GFP在損傷位點的募集水平的統計分析。根據3個獨立實驗，平均值±s.e.m，FBS的N=19，LPDS的N=20，LPDS+Prava的N=22。

圖3示出了光損傷前後Laurdan標記的Tspan4-mCherry NRK細胞的雙光子螢光顯微鏡分析。示出了通道1(400-460nm)、通道2(470-500nm)的強度圖像和相應的GP圖像。比例尺，10μm。

圖3E示出了位於損傷位點或周圍區域的GP值隨時間變化的統計分析。根據3個獨立實驗，平均值±s.e.m，N=17。

圖3F示出了Tspan4-GFP NRK細胞被模擬處理或暴露於紅海海綿素A(500nM)或紅海海綿素A(500nM)+諾考達唑(10μM)中。細胞被光損傷，然藉由用共聚焦顯微鏡觀察。比例尺，10μm。

圖3G示出了體外塌陷試驗的各個階段。

圖3H示出了在體外塌陷試驗中使用Tspan4-OE GPMV。固定後，用共聚焦顯微鏡進行免疫螢光成像。黃色，抗GFP；灰色，Rho-PE；青色，抗Na/K ATPase。比例尺，5μm。

圖3I示出了採用與圖8B相同的方法，對損傷膜邊緣相對於非損傷膜的螢光富集情況進行的統計分析。根據3個獨立實驗，在h.N=48中捕獲原始圖像。平均值±s.e.m.，非配對t檢驗。

圖3J示出了每個隨機視圖中破裂的餅狀膜結構百分比的統計分析。根據3個獨立實驗，Tspan4-OE的N=61，NRK的N=57，Tspan4-KO的N=40。平均值±s.e.m.，非配對t檢驗。

圖3K示出了將包含或不包含Tspan4-GFP的GPMV置於微吸管系統中，然後用磷酸膽鹼十二酯洗滌劑進行處理。藉由共聚焦顯微鏡進行延時成像。綠色，Tspan4；紅色，羅丹明-PE；灰色，DIC。比例尺，5μm。

圖3L示出了根據3個獨立實驗，在k.N=39時，經洗滌劑處理的包含或不包含Tspan4-GFP的GPMV(例如，在k中)的壽命定量。平均值±s.e.m.，非配對t檢驗。

圖3M示出了在常規冷凍電鏡樣本製備後，用冷凍電子顯微鏡觀察包埋Tspan4或未包埋Tspan4的脂蛋白體。比例尺，100nm。

圖3N示出了模擬脂質體或Tspan4脂蛋白體組中部分開放結構的百分比定量情況。根據3個獨立實驗，模擬組的N=34，Tspan4脂蛋白體組的N=41。平均值±s.e.m.。

圖3O示出了Tspan4脂蛋白體中部分開放結構的重構冷凍電鏡斷層掃描Z堆棧多層廣切(Z-stack)圖像。黃色箭頭，部分開放位點。比例尺，10nm。

圖4A示出了光損傷後的NRK Tspan4-OE、NRK WT和NRK Tspan4-KO細胞圖像。PI流用於表示細胞死亡。綠色，Tspan4-GFP；紅色，PI。比例尺，10μm。

圖4B示出了光損傷後的細胞PI強度的量化。根據3個獨立實驗，平均值±s.e.m，每組的N=23。

圖4C示出了光損傷處理後NRK、NRK Tspan4-KO和NRK Tspan4/Tspan5雙基因剔除細胞的PI進入信號的熱圖圖像。藉由共聚焦顯微鏡進行延時成像。比例尺，5μm。

圖4D示出了光損傷後的細胞PI強度的量化。根據4個獨立實驗，平均值±s.e.m，NRK組的N=21，Tspan4-KO組的N=16，Tspan4/Tspan5雙KO組的N=30。

圖4E示出了洗滌劑處理後每組(NRK TSpan4-OE、NRK WT、NRK Tspan4-KO、NRK Tspan4/Tspan5雙基因剔除細胞)中細胞存活率的統計分析。平均值±s.e.m.，6個獨立實驗或8個獨立實驗的總結。使用非配對t檢驗。

圖4F示出了評估Tspan4對LPS電穿孔後的細胞存活率產生影響的實驗示意圖。

圖4G示出了PBS或LPS電穿孔處理後每組(NRK Tspan4-OE、NRK WT和NRK Tspan4-KO)中細胞存活率的統計分析。平均值±s.e.m.，8個獨立實驗的總結。使用非配對t檢驗。

圖4H示出了NK殺傷實驗的示意圖。NK細胞(YTS)與癌細胞(MGC803)進行共培養，然後對MGC803細胞進行分類並對其存活率進行分析。

圖4I示出了NK細胞殺傷實驗中的Tspan4-OE、WT和Tspan4-KO細胞存活率的統計分析。平均值±s.e.m.，4個獨立實驗的總結。使用非配對t檢驗。

圖4J示出了表示Tspan4在修復膜損傷中作用的模型。

圖5A示出了L929 Tspan4-mCherry和MGC803 Tspan4-GFP細胞進行光損傷處理，並且藉由共聚焦顯微鏡觀察位於損傷位點的Tspan4分佈。比例尺，5μm。

圖5B示出了共表達Tspan4-GFP和Na/K ATPase-mCherry的NRK細胞遭受光損傷，然後用共聚焦顯微鏡採集延時圖像。比例尺，5μm。

圖5C示出了在細胞遭受光損傷後，於不同時間點(0min、1min、2min和2.5min)將PI加入系統中，並且追蹤PI強度。示出代表性圖像。綠色，Tspan4-GFP；紅色，PI。比例尺，5μm。

圖5D示出了對各時間點PI進入的細胞百分比進行的統計分析。根據3個獨立實驗，平均值±s.e.m，0min組的N=12，1min組的N=22，2min組的N=24，2.5min組的N=50。

圖6A示出了共表達Tspan4-GFP和Chmp4b-mCheny的NRK細胞經洗滌劑(25μM洋地黃皂苷)處理。藉由3D-SIM採集Z軸投影圖像。黃色，Tspan4；青色，Chmp4b-mCherry。比例尺，5μm。

圖6B示出了用DMSO(作為對照品)或10μM BAPTA-AM處理的Tspan4-GFP過表達細胞遭受光損傷。藉由共聚焦顯微鏡採集延時圖像。比例尺，5μm。

圖6C示出了在共表達Tspan4-GFP和Chmp3-mCherry或Chmp3 1-179-mCherry的細胞遭受光損傷後，用共聚焦顯微鏡分析Tspan4和Chmp3位於損傷位點的定位情況。比例尺，10μm。

圖6D示出了藉由PCR驗證NRK Chmp4b剔除細胞系。

圖7A至圖7C示出了用共聚焦顯微鏡觀察在不同膽固醇耗竭條件(包括10%全膽固醇培養基(FBS)、膽固醇耗竭培養基(LPDS)和包含30μM普伐他汀的膽固醇耗竭培養基)下，Tspan4-GFP NRK細胞在光損傷前後發生的變化。PI流用於表示細胞死亡。比例尺，5μm。

圖7D示出了在光損傷處理前後，對不同膽固醇耗竭條件下的細胞PI強度進行的統計分析。根據3個獨立實驗，平均值±s.e.m，FBS的N=17，LPDS的N=15，LPDS+Prava的N=15。

圖8A示出了Tspan4-GFP GPMV或GFP-CAAX(作為對照品)GPMV在體外塌陷試驗中的延時圖像。綠色，GFP；紅色，Rho-PE；黃色，融合。比例尺，5μm。

圖8B示出了用於測量螢光富集的方法。

圖8C示出了在Tspan4-OE GPMV、NRK GPMV和NRK Tspan4-KO GPMV用於體外塌陷試驗後，用共聚焦顯微鏡採集圖像。比例尺，10μm；放大，2μm。

圖8D示出了Tspan4-GFP GPMV經過洗滌劑處理後的破裂事件延時成像。黃色箭頭，破裂位點。比例尺，5μm。

圖9A示出了在NRK Tspan4-OE、NRK WT和NRK Tspan4-KO細胞經過洗滌劑處理後，藉由PI通透性分析細胞死亡情況。細胞藉由共聚焦顯微鏡進行成像。比例尺，10μm

圖9B示出了NRK Tspan4-OE、NRK WT和NRK Tspan4-KO細胞經過洗滌劑處理後的絕對PI強度的統計分析。根據3個獨立實驗，平均值±s.e.m，Tspan4-OE的N=29，WT的N=42和Tspan4-KO的N=33。

圖9C示出了藉由PCR驗證Tspan4-KO Tspan5剔除細胞系。

圖9D示出了由FM1-43(5μM)預染色的Tspan4-OE(Tspan4-過表達)、WT和Tspan4/Tspan5-KO細胞接受光損傷處理，並且FM1-43信號被監測。延時圖像藉由共聚焦顯微鏡採集，並且顯示為熱圖圖像。比例尺，10μm。

圖9E示出了光損傷處理期間和之後總細胞基質的FM1-43螢光強度的統計分析。根據3個獨立實驗，平均值±s.e.m.，Tspan4-OE的N=19，WT的 N=30，Tspan4/Tspan5-KO的N=32，Tspan4-OE無損傷的N=17，WT無損傷的N=21，和Tspan4/Tspan5-KO無損傷的N=9。

圖9F示出了PBS或LPS電穿孔處理後每組(NRK Tspan4-OE、NRK WT、NRK Tspan4-KO、NRK Tspan4/Tspan5雙基因剔除細胞)中細胞存活率的統計分析。平均值±s.e.m.，4個獨立實驗的總結。使用非配對t檢驗。

圖10A示出了藉由共聚焦顯微鏡觀察YTS NK細胞對MGC803 Tspan4-BFP細胞的殺傷作用。由PI流表示細胞死亡。黃色，BFP；青色，CD56-APC；紅色，PI。比例尺，10μm。

圖10B示出了藉由共聚焦顯微鏡觀察YTS NK細胞對MGC803 MGC803 WT細胞的殺傷作用。由PI流表示細胞死亡。黃色，BFP；青色，CD56-APC；紅色，PI。比例尺，10μm。

圖10C示出了藉由共聚焦顯微鏡觀察YTS NK細胞對MGC803 MGC803 Tspan4-KO細胞的殺傷作用。由PI流表示細胞死亡。黃色，BFP；青色，CD56-APC；紅色，PI。比例尺，10μm。

雖然本文已經顯示和描述了本發明的實施例，但是對所屬技術領域具有通常知識者顯而易見的是，此類實施例僅以舉例方式提供。在不背離本發明的情況下，所屬技術領域具有通常知識者可做出多種變化、改變和替代。應當理解，可將本文所描述的本發明的實施例的各種替代方案應用於本發明的實施例。

如本文所用，術語“跨膜蛋白4(TSPAN4)”一般是指TSPAN4基因和/或由TSPAN4基因編碼的蛋白質。例如，TSPAN4的NCBI Entrez基因可為7106。例如，跨膜蛋白4的UniProtKB/Swiss-Prot編號可為O14817。例如，術語“跨膜蛋白4“可包括跨膜蛋白4的各種異構體、其自然存在等位基因及加工形式。術語還包括偶聯到標簽(例如，組胺酸標簽)、小鼠或人Fc或信號序列等的TSPAN4或其片段。術語TSPAN4包括其功能變體和/或片段，它還包括其同源基因序列和同源物。術語TSPAN4包括來自任何物種的TSPAN4基因或蛋白質，例如人類，或非人類動物(諸如狗、小鼠、大鼠、豬、猴子(例如恆河猴)、牛、貓、雞、斑馬魚等)。

如本文所用，術語“細胞凋亡”一般是指程序性細胞死亡的過程，伴隨細胞形態改變和細胞存活率損失。它可包括半胱天冬酶依賴性細胞死亡，其特點為包含以下任何特性：細胞皺縮、核濃染、DNA裂解或膜起泡。例如，可為一種防止免疫激活的細胞死亡形式。凋亡細胞可具有特定的顯微外觀。細胞激活一種通常處於休眠狀態的蛋白質半胱天冬酶。半胱天冬酶從內部瓦解細胞。凋亡細胞分裂成可被其它細胞吞噬的小包。這可防止細胞內含物從垂死細胞中洩露，並且允許這些組分被回收利用。

如本文所用，術語“細胞損傷”一般是指細胞因外部和/或內部環境變化而遭受的各種壓力變化。除其它原因外，這可能是由於物理因素、化學因素、傳染因素、生物因素、營養因素或免疫因素造成的。細胞損傷可為可逆的或不可逆的。取決於損傷程度，細胞反應可為適應性細胞反應，並且在可能的情況下，恢復內穩態。當損傷的嚴重程度超過了細胞的自我修復能力時，就會發生細胞死亡。細胞死亡與暴露於有害刺激的時間長短和造成損害的嚴重程度有關。

如本文所用，術語“細胞死亡”一般是指生物細胞停止執行其功能的事件。這可能是老細胞死亡並且被新細胞取代的自然過程結果，也可能是疾病、局部損傷或細胞所處的有機體死亡等因素造成的。細胞凋亡或第一型細胞死亡，以及自噬或第二型細胞死亡均為程序性細胞死亡的形式，而細胞壞死是由於感染或損傷而發生的一種非生理性過程。細胞死亡是體內的一個重要過程，因為它促進清除不需要的細胞。細胞不能死亡或者細胞在不應該死亡的時候死亡，會導致或加劇許多疾病的產生。細胞有幾種不同的死亡方式，例如細胞凋亡、細胞壞死、壞死性凋亡和細胞焦亡。一些死亡方式藉由有組織的、“程式化”過程發生。一些細胞死亡過程不會留下死亡細胞的痕跡，而另一些則用死亡細胞中的物質激活免疫系統。

如本文所用，術語“帶電多泡體蛋白3”或“Chmp3”一般是指一種藉由多泡體(MVB)途徑將跨膜蛋白分揀到溶酶體/液泡中的蛋白質。該蛋白與其他可溶性的含有捲曲線圈的蛋白一起構成ESCRT-III蛋白質複合體的一部分，該複合體與內吞體膜結合，並且募集其它輔助因子將蛋白質分選到MVB中。人Chmp3編碼的蛋白在UniProtKB/Swiss-Prot中的登錄號為Q9Y3E7。術語還包括偶聯到標簽(例如，組胺酸標簽)、小鼠或人Fc或信號序列等的Chmp3或其片段。術語Chmp3包括其功能變體和/或片段，它還包括其同源基因序列和同源物。術語Chmp3包括來自任何物種的Chmp3基因或蛋白質，例如人類，或非人類動物(諸如狗、小鼠、大鼠、豬、猴子(例如恆河猴)、牛、貓、雞、斑馬魚等)。

如本文所用，術語“帶電多泡體蛋白4B”或“Chmp4b”一般是指染色質修飾蛋白/帶電多泡體蛋白(CHMP)族的一員。該蛋白是內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)複合物III(ESCRT-III)的一部分，其功能是將內源性細胞表面受體分類到多囊泡胞內體中。ESCRT機制還在細胞分裂的最後脫落階段和包膜病毒(例如HIV-1)的出芽過程中發揮作用。CHMP4亞族的三個蛋白與程序性細胞死亡6相互作用蛋白(PDCD6IP，也稱為ALIX)相互作用，後者也在ESCRT途徑中發揮作用。CHMP4蛋白組裝成形成圓形支架並且促進或穩定向外出芽的5nm膜附著細絲。這些聚合物被認為有助於生成多泡體的管腔囊泡。人Chmp4b編碼的蛋白在UniProtKB/Swiss-Prot中的登錄號為Q9H444。術語還包括偶聯到標簽(例如，組胺酸標簽)、小鼠或人Fc或信號序列等的Chmp4b或其片段。術語Chmp4b包括其功能變體和/或片段，它還包括其同源基因序列和同源物。術語Chmp4b包括來自任何物種的Chmp4b基因或蛋白質，例如人類，或非人類動物(諸如狗、小鼠、大鼠、豬、猴子(例如恆河猴)、牛、貓、雞、斑馬魚等)。

如本文所用，術語“顯性負性”一般是指基本上阻止包含野生型功能的相應蛋白發揮野生型功能的突變體或變異體蛋白，或編碼突變體或變異體蛋白的基因。例如，它可指一種編碼對抗野生型基因產物的基因產物的基因或其基因變體。

如本文所用，術語“內吞體分選轉運複合體”或“ESCRT”一般是指通常由細胞質蛋白複合體(稱為ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II和ESCRT-III)組成的ESCRT機制。前兩個複合體的功能主要是分選蛋白，以及募集ESCRT-III和含有Bro1結構域的蛋白。相比之下，ESCRT-III複合體協調膜斷裂功能。ESCRT機制在多個細胞過程中發揮了重要作用，包括多泡體(MVB)生物生成、細胞脫落和病毒出芽。ESCRT機制由亞功能特異性靶向模塊募集到作用位點。這些因子包括能夠與ESCRT組分和Bro1結構域蛋白結合的ESCRT-0(MVE形成)、CEP55(細胞分裂)和Gag(病毒出芽)。在ESCRT介導膜修復過程中，ESCRT組分被募集到損傷位點，並且掐掉損傷膜以促進修復。ESCRT介導膜修復在激光、洗滌劑、細胞壞死和細胞焦亡導致的不同類型損傷後維持細胞存活率方面發揮著重要作用。ESCRT能夠修復100nm左右的小塊膜損傷。ESCRT組分包括Chmp4b、Vps4a和Chmp3。

如本文所用，術語“工程”一般是指核酸(例如，有機體基因組內的核酸)、多肽或其它組分的一個或多個改變。術語“工程”可以指基因、多肽或其它組分的改變、添加和/或刪除。術語“工程細胞”一般是指人類或非人類來源的修飾細胞。例如，工程細胞可以指包含添加、刪除和/或改變基因、多肽或其它組分的細胞。

如本文所用，術語“離體方法”一般是指基本上所有步驟均在生物體(例如，動物或人體)外進行的方法。例如，離體方法可在外部環境中對自然條件進行最小改變的生物體組織中或在其上進行。可採用多種方式移除組織，包括部分器官移除、整個器官移除或更大的器官系統。例如，在離體方法中，待測樣本可能已經從生物體中提取。例如，使用來自同一生物體的活細胞或組織也可視為是離體的。一個廣泛進行的離體研究是雞胚絨毛尿囊膜(CAM)試驗。在這個試驗中，在生物體(雞)外的雞胚CAM膜上促進血管生成。

如本文所用，術語“體外方法”一般是指在微生物、細胞或生物分子的正常生物環境之外進行的方法。例如，體外方法可在實驗室器皿(例如試管、燒瓶、培養皿和微量滴定板)中進行。體外方法可使用從其通常生物環境中分離的生物體組分進行。例如，微生物或細胞可在培養基中進行研究，蛋白質可在溶液中進行檢測。

如本文所用，術語“體內方法”一般是指一種方法，其中各種生物實體的影響在整個活的生物體或細胞(通常是動物，包括人類和植物)上進行測試，而不是組織提取物或死亡有機體。例如，體內方法可在整個生物體中進行，而不是其分離細胞。

如本文所用，術語“功能片段”一般是指包含全長蛋白或核酸的部分區域，但保留或部分保留全長蛋白或核酸的生物活性或功能的片段。

如本文所用，術語“功能變體”一般是指包含與天然序列相似的胺基酸或核酸序列的核酸分子或多肽，並且保留天然序列的一個或多個特性。

如本文所用，術語“減弱”一般是指與不含遺傳修飾以減少表達的對應對照細胞或生物體中靶向mRNA或相應蛋白質的表達量相比，在轉基因細胞或生物體中靶向mRNA或相應蛋白質的表達量可測量的減少。所屬技術領域具有通常知識者很容易理解如何使用各種遺傳方法(例如，siRNA、shRNA、microRNA、反義RNA或其它RNA介導抑制技術)來減弱靶向多核苷酸序列。

如本文所用，術語“剔除”一般包括以干擾靶向多核苷酸序列功能的方式，刪除靶向多核苷酸序列的全部或部分。例如，藉由誘導靶向多核苷酸序列在靶向多核苷酸序列的功能域中的缺失來改變靶向多核苷酸序列，從而實現剔除。所屬技術領域具有通常知識者將很容易理解根據本文描述的細節，如何使用各種遺傳方法(例如CRISPR/Cas系統、ZFN、TALEN、TgAgo)來剔除靶向多核苷酸序列或其一部分。

如本文所用，術語“膜損傷擴大”一般是指膜損傷位點的擴大(例如，直徑擴大)，甚至是不可修復的翅膜損傷(例如，膜裂解)。

如本文所用，術語“膜修復”或“膜癒合”一般是指主動或被動重新封閉膜破壞，以維持內穩態和/或防止細胞死亡或膜損傷的進展。“膜修復”可包括細胞膜修復和非細胞膜修復。細胞膜修復可包括來自各種細胞功能的機制(包括囊泡運輸、胞吞和胞吐)，以修補破裂或損傷膜。

如本文所用，術語“藥學上可接受的賦形劑”一般是指任何惰性物質，其本身不具備治療和/或預防作用。添加這種賦形劑旨在獲得具有可接受技術特性的醫藥組成物。

如本文所用，術語“細胞焦亡”一般是指程序性細胞死亡的一種炎症形式。它最常發生在感染細胞內病原體時，並且形成免疫系統抗微生物反應的一部分。在這個過程中，免疫細胞在攝入病原體後能識別外來危險信號，這導致免疫細胞釋放能夠帶來和激活先天和適應性免疫細胞、膨脹、爆裂和死亡的促炎性細胞因子。術語細胞焦亡來源於希臘語pyro(意為火或發燒)和ptosis(意為墜落)，這反映了它的炎症性質，並且強調它與其它形式的程序性細胞死亡不同。細胞焦亡需要由炎性體激活的半胱天冬酶-1酶的功能。細胞焦亡的特徵是細胞腫脹，細胞膜完整性的迅速喪失，以及促炎性細胞因子和細胞內含物的釋放。與主要用於抗炎的細胞凋亡相反，細胞焦亡由於加工和釋放IL-1β和IL-18而與強促炎活性有關。

如本文所用，術語“富含四跨膜蛋白的宏結構域”或“TEMAs”一般是指由多個小TEM(富含四跨膜蛋白的微結構域)組裝的微米級宏結構域。

如本文所用，術語“富含四跨膜蛋白的微結構域”或“TEMs”一般是指膜上富含四跨膜蛋白和膽固醇的微結構域。TEM的大小約為約100nm，並且高度富含一組四跨膜蛋白(例如，TSPAN4)和所謂的筏脂(例如，膽固醇)。

如本文所用，術語“四跨膜蛋白”一般是指一種膜蛋白，該膜蛋白也被稱為跨膜4超家族(TM4SF)蛋白，並且可能包含四個跨膜α-螺旋體和兩個胞外域。例如，術語“四跨膜蛋白”可包括四跨膜蛋白的各種異構體、以及其自然存在等位基因及加工形式。

如本文所用，術語“四跨膜蛋白5(TSPAN5)”一般是指TSPAN5基因和/或由TSPAN5基因編碼的蛋白。例如，TSPAN5的NCBI Entrez基因可為10098。例如，術語“四跨膜蛋白5”可包括四跨膜蛋白5的各種異構體，以及其自然存在等位基因和加工形式。術語還包括偶聯到標簽(例如，組胺酸標簽)、小鼠或人Fc或信號序列等的TSPAN5或其片段。術語TSPAN5包括其功能變體和/或片段，它還包括其同源基因序列和同源物。術語TSPAN5包括來自任何物種的TSPAN5基因或蛋白質，例如人類，或非人類動物(諸如狗、小鼠、大鼠、豬、猴子(例如恆河猴)、牛、貓、雞、斑馬魚等)。

除非另外說明，“一個/種(a)”、“一個/種(an)“、“該(the)”和“至少一個/種(at least one)”替換使用，並且意為一個/種或超過一個/種。

在本揭露中，術語“包括(comprise)”也包括“是(is)”、“包含(has)”和“由(consist of)”。例如，“由X和Y組成的組成物”可理解為包括至少由X和Y組成的組成物，也應理解為揭露僅由X和Y組成的組成物(即，由X和Y組成的組成物)。

除非特別聲明或從上下文中明顯看出，如本文使用的術語“約(about)”應理解為處於本領域的正常公差範圍內，例如在平均值的2個標準差內。“約”可理解為在規定值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、 1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%以內。除非從上下文中可以明顯看出，否則本文提供的所有值均由術語修飾。

方法

在一些實施例中，其中，該細胞損傷包括細胞死亡。

例如，本揭露提供了一種用於膜修復、傷口癒合和/或細胞損傷調節的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能，其中該細胞損傷可包括細胞死亡，其中該細胞死亡可包括細胞凋亡、細胞壞死和/或細胞焦亡。

例如，本揭露提供了一種用於調節膜修復、傷口癒合和/或細胞損傷調節的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能，其中該細胞損傷可能是由激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞引起的。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

例如，本揭露提供了一種用於調節膜修復、傷口癒合和/或細胞損傷調節的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能，其中該細胞損傷可能是由NK細胞引起的。

在一些實施例中，其中，該膜包含直徑為至少約100nm的損傷區。例如，該膜可包含直徑為約90nm、約95nm、約100nm、約105nm、約110nm、約115nm、約120nm、約125nm、約130nm、約135nm、約140nm、約145nm、約150nm或更大的損傷區。

例如，本揭露提供了一種用於調節膜修復的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能，其中該膜可包含直徑為至少約100nm的損傷區，其中該損傷區可能是由物理因素、化學因素和/或生物因素(例如，激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞)引起的。

例如，該方法包括調節待修復膜中的TPSAN4數量和/或功能。

例如，該膜可包括細胞膜、組織/器官的膜、細胞外囊泡膜和/或細胞亞結構的膜(例如，細胞器的膜)。例如，該膜還可包括自然存在膜以及修飾膜，例如，該膜可為自然存在細胞膜，例如，該膜也可為修飾細胞膜。

例如，本揭露提供了一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能，其中該膜可為自然細胞膜或修飾細胞膜，並且該膜可包含直徑為至少約100nm的損傷區，其中該損傷區可能是由物理因素、化學因素和/或生物因素(例如，激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞)引起的。

例如，本揭露提供了一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能，其中該膜可為自然細胞外囊泡膜或修飾細胞外囊泡膜，該膜可包含直徑為至少約100nm的損傷區，其中該損傷區可能是由物理因素、化學因素和/或生物因素(例如，激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞)引起的。

如本文所用，術語“人工膜”一般用於指合成膜，包括自然界中存在或不存在的膜結構。例如，該膜可為人工細胞膜或人工細胞外囊泡膜。

例如，本揭露提供了一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能，其中該膜可為人工細胞膜或人工細胞外囊泡膜。

在一些實施例中，該方法包括增加該TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種用於增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷的方法，該方法包括增加TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種用於增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷的方法，該方法包括過表達TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。

例如，本揭露提供了一種用於增加該細胞膜修復、減輕該細胞損傷和/或保護細胞免受該細胞損傷的方法，該方法包括在該細胞中過表達TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。

在一些實施例中，該方法包括促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

例如，本揭露提供了一種用於增加膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

例如，本揭露提供了一種用於增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷的方法，該方法包括促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

TSPAN4介導TEMAs的形成。

其中，該TPSAN4可位於待修復膜中和/或在該細胞中。

例如，本揭露提供了一種用於增加膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括增加TSPAN4的數量和/或功能，以及增加能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中該ESCRT的一個或多個組分包括Chmp4b、Vps4a、Chmp3、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。

在一些實施例中，其中該Chmp4b為大鼠Chmp4b。

在一些實施例中，其中該Chmp4為人Chmp4。

在一些實施例中，其中，該Chmp4包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列或包含與SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%同源性的胺基酸序列。

在一些實施例中，其中該Vps4a為大鼠Vps4a。

在一些實施例中，其中該Vps4a為人Vps4a。

在一些實施例中，其中，該Vps4a包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或包含與SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%同源性的胺基酸序列。

在一些實施例中，其中該Chmp3為大鼠Chmp3。

在一些實施例中，其中該Chmp3為人Chmp3。

在一些實施例中，其中，該Chmp3包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列或包含與SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%同源性的胺基酸序列。

例如，本揭露提供了一種用於增加膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括增加TSPAN4的量和/或功能，以及增加能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。

其中，該增加TSPAN4的數量和/或功能可包括過表達TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。

其中，該第二製劑可包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分(例如Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3)、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。

在一些實施例中，該方法抑制該膜修復，抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷。

在一些實施例中，該方法包括減少該TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種用於減少膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括減少TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種用於抑制膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷的方法，該方法包括減少TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種用於抑制細胞膜修復和/或促進該細胞損傷的方法，該方法包括減少該細胞中的TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種用於抑制細胞膜修復和/或促進該細胞損傷的方法，該方法包括在該細胞中減弱或剔除編碼跨膜蛋白4的基因表達。

在一些實施例中，該方法包括抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

例如，本揭露提供了一種用於抑制細胞膜修復和/或促進該細胞損傷的方法，該方法包括抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

在一些實施例中，該方法包括施用TSPAN4抑制劑。

例如，本揭露提供了一種用於減少膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括施用TSPAN4抑制劑和減少能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

例如，本揭露提供了一種用於減少膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括施用TSPAN4抑制劑和施用能夠抑制膜修復和/或導致細胞損傷的外加劑；

其中，該外加劑包括激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞(例如，NK細胞)。

例如，本揭露提供了一種用於減少膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括施用TSPAN4抑制劑，減少第二製劑的數量和/或功能，以及施用能夠抑制膜修復和/或造成細胞損傷的外加劑；

其中，該第二製劑可包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一種或多種組分(例如，Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3)、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑；

其中，該外加劑可包括激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞。

在一些實施例中，該方法是一種體內法。

例如，本揭露提供了一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的體內法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，該方法是一種體外法或離體法。

例如，本揭露提供了一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的體外法或離體法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能。

製劑

在一些實施例中，其中，該細胞損傷包括細胞死亡。

例如，本揭露提供了一種能夠調節TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於調節膜修復、傷口癒合和/或細胞損傷調節。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

例如，本揭露提供了一種能夠調節TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於調節膜修復、傷口癒合和/或細胞損傷調節，其中該細胞損傷可能是由物理因素、化學因素和/或生物因素引起的。

例如，本揭露提供了一種能夠調節TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於調節膜修復，其中該膜損傷可包含直徑為至少約100nm的損傷區。

在一些實施例中，該製劑能夠調節該膜中該TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種能夠調節膜中TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程。

例如，本揭露提供了一種能夠調節TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程，其中該膜可為天然細胞膜或修飾細胞膜，並且該膜可包含直徑為至少約100nm的損傷區，其中該損傷區可為物理因素、化學因素和/或生物因素(例如，激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞)引起的。

例如，本揭露提供了一種能夠調節TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程，其中該膜可為自然細胞外囊泡膜或修飾細胞外囊膜，並且該膜可包含直徑為至少約100nm的損傷區，其中該損傷區可為物理因素、化學因素和/或生物因素(例如，激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞)引起的。

如本文所用，術語“人工膜”一般用於指合成膜，包括自然界中存在或不存在的膜結構的。例如，該膜可為人工細胞膜或人工細胞外囊泡膜。

例如，本揭露提供了一種能夠調節TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程，其中該膜可為人工細胞膜或人工細胞外囊泡膜。

在一些實施例中，該製劑能夠增加該TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種能夠增加TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷。

例如，本揭露提供了一種能夠增加該細胞表達或包含的TSPAN4數量和/或功能的製劑，用於增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷。

在一些實施例中，該製劑能夠導致TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子的過表達。

例如，本揭露提供了一種能夠導致TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子過表達的製劑，用於增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷。

例如，本揭露提供了一種包含TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子的製劑，用於增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷。

例如，本揭露提供了一種能夠增加該細胞中該TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於增加細胞膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷。

在一些實施例中，該製劑能夠促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

例如，本揭露提供了一種用於增加細胞膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷的製劑，其中該製劑能夠促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

TSPAN4介導TEMAs的形成。

其中，該TPSAN4在膜中和/或該TSPAN4在該細胞中。

在一些實施例中，其中該Chmp4b為大鼠Chmp4b。

在一些實施例中，其中該Chmp4為人Chmp4。

在一些實施例中，其中該Vps4a為大鼠Vps4a。

在一些實施例中，其中該Vps4a為人Vps4a。

在一些實施例中，其中該Chmp3為大鼠Chmp3。

在一些實施例中，其中該Chmp3為人Chmp3。

例如，本揭露提供了一種能夠增加該細胞中該TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於增加細胞膜修復、減輕該細胞損傷和/或保護細胞免受該細胞損傷，其中該製劑用於與第二製劑結合使用，其中該第二製劑包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分(例如，Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3)、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。

在一些實施例中，該製劑能夠減少該TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種能夠減少該細胞中該TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於抑制該膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷。

例如，本揭露提供了一種能夠在該細胞中減弱或剔除編碼跨膜蛋白4的基因表達的製劑，用於抑制該膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷。

在一些實施例中，該製劑能夠抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

例如，本揭露提供了一種用於抑制該膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷的製劑，其中該製劑能夠抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

在一些實施例中，該製劑包括TSPAN4抑制劑。

例如，本揭露提供了一種用於抑制該膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷的製劑，該製劑與第二製劑組合使用，該第二製劑包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一種或多種組分(例如，Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3)、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

例如，本揭露提供了一種用於抑制該膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷的製劑，該製劑用於與能夠抑制膜修復和/或造成細胞損傷的外加劑結合使用。

其中，該外加劑可包括激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞(例如，NK細胞)。

在本揭露中，製劑可為小分子化合物、抗體、核酸分子、多肽或其片段。在某些情況下，製劑可包括一種或多種活性組分，以單一分子或單獨分子的形式存在。

製劑可以非活性形式提供，並且在施用前、施用中或施用後在體外或體內轉化為活性形式。

製劑可為藥用製劑或非藥用製劑。

製劑可直接或間接藉由其它外加劑、組成物或細胞的功能發揮所需功能。

工程細胞

在一個方面中，本揭露提供了一種工程細胞，該工程細胞與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該工程細胞已被修飾用來改變該工程細胞中的TSPAN4的數量和/或功能。

“相應的未修飾細胞”或”未修飾的相應細胞“一般是指未經修飾以改變其中的鞘磷脂數量和/或功能的細胞，而所有其它特徵與工程細胞基本相同。在某些情況下，相應的未修飾細胞是野生型細胞(例如，與工程細胞相同的細胞類型)。在某些情況下，相應的未修飾細胞可包括一個或多個修飾，但修飾可出於其它目的。

細胞可藉由適用於本揭露目的的任何方法進行修飾。例如，修飾可為基因修飾。在某些情況下，修飾可包括用一種或多種引起所需變化或效果的製劑來處理細胞。修飾可為暫時的、瞬時的修飾，也可為穩定的或永久的修飾。在某些情況下，工程細胞可為已被修飾的母細胞後代。

在一些實施例中，其中，該細胞損傷包括細胞死亡。

例如，本揭露提供了一種工程細胞，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復、傷口癒合和/或細胞損傷調節的能力有所改變，該工程細胞已被修飾用來改變其中TSPAN4的數量和/或功能，其中該細胞損傷可包括細胞死亡，其中該細胞死亡可包括細胞凋亡、細胞壞死和/或細胞焦亡。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

例如，本揭露提供了一種工程細胞，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復、傷口癒合和/或細胞損傷調節的能力有所改變，該工程細胞可能已被修飾用來改變其中TSPAN4的數量和/或功能，其中該細胞損傷可能是由物理因素、化學因素和/或生物因素(例如，激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞)引起的。

例如，本揭露提供了一種工程細胞，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復、傷口癒合和/或細胞損傷調節的能力有所改變，該工程細胞可能已被修飾用來改變其中TSPAN4的數量和/或功能，其中該細胞損傷可能是由NK細胞引起的。

在一些實施例中，該工程細胞已被修飾用來增加膜中TSPAN4的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種工程細胞，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該工程細胞可能已被修飾用來增加膜中TSPAN4的數量和/或功能。

在一些實施例中，該工程細胞已被修飾用來促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

例如，本揭露提供了一種工程細胞，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該工程細胞可能已被修飾以促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

例如，本揭露提供了一種工程細胞，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該工程細胞可能已被修飾用來增加TSPAN4的量和/或功能，並且增加能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。

例如，本揭露提供了一種工程細胞，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該工程細胞可能已被修飾為增加TSPAN4的數量和/或功能，並且增加第二製劑的數量和/或功能，其中該第二製劑可包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。

在一些實施例中，該工程細胞已被修飾用來抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。

在一些實施例中，該工程細胞已被TSPAN4抑制劑處理。

在一些實施例中，該工程細胞已採用能夠抑制膜修復和/或導致細胞損傷的外加劑進行進一步處理。

在一些實施例中，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。

例如，本揭露提供了一種工程細胞，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該工程細胞可被修飾用來減少TSPAN4的數量和/或功能，並且用能夠抑制膜修復和/或導致細胞損傷的外加劑處理。

例如，本揭露提供了一種工程細胞，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該工程細胞可被修飾為減少TSPAN4的數量和/或功能，並且用外加劑處理，其中該外加劑可包括激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞(例如，NK細胞)。

在一個方面中，本揭露提供了一種用於製備工程細胞的方法，與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該方法包括修飾該細胞以改變其中TSPAN4的數量和/或功能。

在一個方面中，本揭露提供了一種修改該細胞來改變其中TSPAN4的數量和/或功能的製劑的用途，用於製備具有與未修飾的相應細胞相比，調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變的工程細胞。

用途

組成物

本揭露的組成物可為一種醫藥組成物。醫藥組成物可包括藥學上可接受的賦形劑。

組成物可包括有效量的本揭露的製劑。有效量可為當單獨或與另一製劑一起施用於細胞、組織或受試者時，能有效達到預期效果(例如，調節遷移體的形成和/或調節遷移體介導生物過程)的制劑量。

組成物可進一步包括藥學上可接受的材料、組成物或載體(例如，液體或固體填料)、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料，即載體。這些載體參與將受試製劑從一個器官或身體的一部分運送到另一個器官或身體的另一部分。每種載體都應該是“可接受的”，即與配方中的其它成分兼容，並且不會對受試者造成傷害。

配方和施用方法一般根據待治療位點和疾病進行調整。示例性配方包括但不限於適合於腸外施用(例如，靜脈內、動脈內、肌肉內或皮下施用)的配方。本揭露的製劑量將根據調節所需程度和嚴重性、施用組成物的活性、受試者的一般健康狀況以及技術人員所熟知的其它考慮因素而變化。

本文所述的製劑可摻入適合施用的組成物中。這種組成物通常包括製劑和藥學上可接受的載體。輔助活性化合物也可摻入組成物中。在又一些實施例中，本文所述的製劑被局部輸送。局部遞送允許非系統地輸送製劑，例如輸送到所需調節位點。

試劑盒

本揭露的試劑盒可包括根據本揭露的製劑、工程細胞和/或組成物。

製劑、工程細胞和/或組成物可包含在適當的包裝中，以及可包括使用說明、實驗研究(例如，臨床研究)探討、副作用清單等書面材料。此類試劑盒還可包括信息(例如科學文獻參考、包裝內頁材料、實驗結果(例如臨床試驗結果))和/或這些及類似信息的總結。這些信息表明或確定製劑、工程細胞和/或組成物的活性和/或優勢，和/或描述劑量、施用方式、副作用、藥物相互作用或其它對用戶(如保健提供者或消費者)有用的信息。這種信息可基於各種研究(例如，使用涉及體內模型的實驗動物的研究和基於人類臨床試驗的研究)的結果。

試劑盒可進一步包含外加劑。在一些實施例中，製劑、工程細胞和/或本發明的組成物以及外加劑可作為試劑盒內不同容器中的單獨組成物提供。在一些實施例中，製劑、工程細胞和/或本揭露的組成物以及外加劑作為試劑盒容器內的單一組成物提供。適當的包裝和額外的使用物品(例如，用於液體製劑的量杯，用於儘量減少暴露於空氣中的鋁箔包裝等)是本領域已知的，並且可包括在試劑盒中。本文描述的試劑盒可提供、銷售和/或推廣給用戶(例如，健康提供方)，包括科學家、醫生、護士、製劑師、處方官員等。在一些實施例中，試劑盒也可直接向消費者出售。

TSPAN4

在本申請中，“四跨膜蛋白-4”在本文中縮寫為“TSPAN4”，除非另有說明，否則是指在膜修復中發揮正常作用的功能性TSPAN4。因此，術語TSPAN4包括功能性變體多肽。“TSPAN4”用於指單獨的TSPAN4多肽(或蛋白)、與其它多肽融合的TSPAN4多肽，以及只要TSPAN4蛋白表現出TSPAN4功能/活性與一個或多個其它多肽相關的TSPAN4多肽。TSPAN4功能/活性的實例包括但不限於介導形成TEMs的能力，介導形成TEM的能力，或形成遷移體的能力。TSPAN4可為人、豬、犬、大鼠或小鼠TSPAN4。編碼不同異構體的選擇性剪切轉錄變體已被確認。全長多肽和多核苷酸序列是已知的，而許多功能片段、突變體和修飾版本也是已知的。TSPAN4包括全長TSPAN4和/或完全或部分缺失非四個疏水結構域的TSPAN4多肽等。

在一些實施例中，其中該TSPAN4為大鼠TSPAN4。

在一些實施例中，其中，該TSPAN4為人TSPAN4。

在一些實施例中，其中，該TSPAN4包含如SEQ ID NO：1-2中任一項所示的胺基酸序列或包含與SEQ ID NO：1-2所示的胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%同源性的胺基酸序列。

例如，本揭露提供了一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括調節人TSPAN4的數量和/或功能，其中該TSPAN4包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列或包含與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%同源性的胺基酸序列。

例如，本揭露提供了一種能夠調節人TSPAN4的數量和/或功能的製劑，用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程，其中該TSPAN4包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列或包含與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%同源性的胺基酸序列。

調節TSPAN4的數量和/或功能

例如，本申請提供了一種用於調節TPSAN4的數量和/或功能的方法。

例如，增加TPSAN4的數量和/或功能可包括提供TPSAN4、過表達TPSAN4和/或激活TPSAN4。例如，增加TPSAN4的數量和/或功能可包括引入TPSAN4和/或編碼TPSAN4的基因。例如，增加TPSAN4的數量和/或功能可包括促進TPSAN4與TEMs的其它成分(例如，膽固醇、其他四跨膜蛋白和/或整合素α5)之間的相互作用。

例如，減少TPSAN4的數量和/或功能可包括剔除編碼TPSAN4的基因表達、減弱編碼TPSAN4的基因表達和/或施用能夠抑制TPSAN4功能的製劑。例如，減少TPSAN4的數量和/或功能可包括引入CRISPR Cas9系統和/或靶向TPSAN4的miRNA。例如，減少TPSAN4的數量和/或功能可包括抑制TPSAN4 與TEMs的其它成分(例如，膽固醇、其它四跨膜蛋白和/或整合素α5)之間的相互作用。例如，減少TPSAN4的數量和/或功能可包括與TPSAN4結合。

過表達

增加TSPAN4(包括其功能變體、或其功能片段)的表達可包括過表達TSPAN4。過表達可藉由引入外源蛋白或編碼蛋白的外源核酸分子，或者藉由導致內源蛋白或編碼該蛋白的內源基因的表達增加來實現。例如，這種過表達可能是由編碼蛋白的基因調節區的突變引起的。在某些情況下，過表達可藉由改變轉錄和/或轉譯機制的一個或多個組分的功能來實現。在某些情況下，TSPAN4蛋白可包括SEQ ID NO：1-2中的任一項所示的胺基酸序列。

剔除

剔除TSPAN4是指使TSPAN4編碼基因失效(“剔除”)的遺傳過程。當TSPAN4編碼基因被剔除時，它可包括雜合剔除或純合剔除。在雜合剔除中，兩個基因拷貝(等位基因)中僅有一個基因拷貝被剔除；在純合剔除中，兩個拷貝均被剔除。

剔除可藉由各種技術來完成。在某些情況下，剔除可為被篩選或識別的自然發生的突變(例如，藉由DNA測序或其它方法)。

在某些情況下，剔除是藉由同源重組產生的。例如，它可涉及構建包含所需突變的核酸(例如，DNA)構建體。構建體還可包括代替所需剔除基因的抗藥性標誌。構建體可進一步包含與靶向序列同源的最小長度(例如，2kb或以上)。構建體可輸送至靶細胞(例如，藉由顯微注射法、電穿孔法或轉染，使用病毒或非病毒系統等其它方法)。然後，這種方法依靠細胞自身的修復機制將核酸構建體重組到現有DNA(例如，細胞基因組)中。這可能會導致基因序列被改變，並且在大多數情況下，如果基因被轉譯，則會被轉譯為無功能蛋白。構建體上的藥物選擇標記可用於選擇已發生重組事件的細胞。在二倍體生物中，大多數基因含有兩個等位基因，也可能包含在同一作用下協作的幾個相關基因，可以進行額外轉化和選擇，直到每個靶向基因均被剔除。可能需要進行選擇性育種以產生純合剔除動物。

在某些情況下，剔除是用位點特異性核酸酶產生的。可使用各種方法來精確靶向DNA序列，以引入雙鏈斷裂。一旦發生這種情況，細胞的修復機制通常藉由直接將兩個切割末端連接的非同源性末端接合(NHEJ)，以試圖修復這個雙鏈斷裂。這可能並不完美，因此有時會造成鹼基對的插入或刪除，從而引起移碼突變。這些突變可使發生突變的基因失去功能，從而造成該基因的剔除。

例如，鋅指核酸酶可用於產生此類剔除。鋅指核酸酶包含可精確瞄準DNA序列的DNA結合結構域。每個鋅指可識別所需DNA序列的密碼子，因此可採用模塊化方式進行組裝，以結合到特定序列。這些結合結構域與限制性內切酶偶聯，從而可在DNA中造成雙鏈斷裂(DSB)。修復過程可引入破壞基因功能的突變。

作為另一個實例，類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)可用於產生此類剔除。TALEN包含DNA結合結構域和可裂解DNA的核酸酶。DNA結合區可包括識別所需靶向DNA序列的單個鹼基對的胺基酸重複序列。如果這種裂解靶向基因編碼區，並且NHEJ介導修復引入插入和刪除，往往會產生移碼突變，從而破壞基因功能。

作為再一實例，成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)系統可用於產生此類剔除。CRISPR/Cas9法是一種包含與Cas9蛋白複合的指導RNA的用於編輯基因組的方法。指導RNA可設計成藉由簡單互補鹼基對來匹配所需DNA序列。偶聯Cas9可能導致DNA中的雙鏈斷裂。遵循與鋅指和TALEN相同的原則，嘗試修復雙鏈斷裂往往會導致框架移碼突變，從而形成一個無功能基因。

剔除也可包括條件性基因剔除。條件性基因剔除允許在滿足某些條件時，以組織特定方式等在組織或細胞中刪除基因。它可藉由在基因周圍引入稱為loxP位點的短序列來實現。這些序列將藉由與剔除相同的機制引入種系。然後這個種系可與另一個含有Cre重組酶的種系雜交。Cre重組酶為可識別這些序列，重組這些序列並刪除這些位點兩側基因的病毒酶。

減弱

減弱TSPAN4是指減少TSPAN4編碼基因表達的一個過程。這種減少可藉由基因修飾或用包含與基因或mRNA轉錄物互補的序列的試劑(例如，短DNA或RNA寡核苷酸)處理而發生。

減弱可藉由基因修飾產生，也可以是瞬時的。如果對有機體或細胞的DNA進行基因修飾，產生的有機體或細胞可稱為“減弱有機體”或“減弱細胞”。如果基因表達的變化是由寡核苷酸與mRNA結合或暫時與基因結合引起的，則將導致不修飾染色體DNA的基因表達發生暫時變化，並且結果可被稱為“瞬時性減弱”。

在瞬時性減弱中，這種寡核苷酸與活性基因或其轉錄物的結合藉由各種過程導致表達減少。結合可藉由阻斷轉錄(在基因結合的情況下)、mRNA 轉錄物的降解(例如，藉由小干擾RNA(siRNA))或RNase-H依賴性反義，或藉由阻斷mRNA翻譯、前mRNA剪接位點或用於其它功能性RNA(包括miRNA)成熟的核酸酶裂解位點(例如，藉由嗎啉基寡核苷酸或其它RNase-H非依賴性反義)而發生。

RNA干擾(RNAi)是一種用於藉由mRNA降解使基因沉默的手段。該方法藉由在細胞質中引入雙鏈小干擾RNA(siRNA)來實現基因減弱。小干擾RNA可來自細胞內部，也可外源性地引入細胞中。一旦引入細胞，外源性siRNA藉由RNA誘導沉默複合體(RISC)來處理。siRNA與要沉默的靶向mRNA互補，並且RISC用siRNA作為模板來定位靶向mRNA。在RISC定位到靶向mRNA後，RNA被核糖核酸酶裂解。

在某些情況下，shRNA用於減弱TSPAN4。shRNA可藉由病毒構建體引入細胞中。在某些情況下，病毒構建體是一種慢病毒構建體。

增加TSPAN4的功能

增加TSPAN4的功能可包括向TSPAN4蛋白引入突變，從而增加其一種或多種功能。在某些情況下，增加TSPAN4的功能可藉由增加或減少能夠調節TSPAN4功能的因素，從而間接增加TSPAN4的功能來實現。在某些情況下，增加TSPAN4的功能包括施用TSPAN4激活劑。

降低TSPAN4的功能

抑制或降低TSPAN4的功能可包括向TSPAN4蛋白引入突變或引入突變TSPAN4蛋白(例如，顯性負性TSPAN4)，從而損傷TSPAN4的功能。在某些情況下，可藉由增加或減少能夠調節TSPAN4功能的因子來降低TSPAN4 的功能，從而間接抑制或降低TSPAN4的功能。在某些情況下，減少TSPAN4的功能包括向細胞施用TSPAN4抑制劑。

膜修復和/或膜修復相關生物過程

膜修復和/或膜修復相關生物過程可藉由觀察，即使用顯微鏡(例如，掃描電子顯微鏡(SEM)和/或透射電子顯微鏡(TEM))來監測和/或確定。

與膜修復相關生物過程可包括與膜修復有關的所有生物過程例如傷口癒合和/或細胞損傷調節，只要涉及到膜損傷修復。與膜修復相關生物過程還可包括膜修復機制的一部分，例如TSPAN4介導TEMs的形成、TSPAN4介導TEMAs的形成和/或該TSPAN4向損傷膜位點的募集。

膜修復可包括抑制膜損傷擴大和/或促進膜癒合。膜修復可包括多種機制，包括胞吐作用、胞吞作用、SYX-2-EFF-1修復機制和ESCRT機制。

在一些實施例中，該膜修復和/或膜修復相關生物過程可包括TSPAN4和/或TSPAN5介導膜修復。

該TSPAN4對損傷膜位點的募集

在一些實施例中，該TSPAN4形成TEMs，並且以TEMs形式募集到膜損傷處，還可形成TEMAs以促進膜損傷修復。TEMAs處於液態有序相，並且在損傷位點周圍形成剛性環，限制了損傷擴散並且防止了膜解體，從而促進其它機制的膜修復。

例如，損傷膜位點邊緣的TSPAN4含量可比未損傷位點高0.1%、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍左右。

TSPAN4介導TEMs的形成

TSPAN4介導TEMs的形成可包括將膜組織成富含膽固醇的膜域的TSPAN4，其稱為富含四跨膜蛋白的微結構域(TEMs)。TEMs可募集大量膜蛋白。例如，富含TEMs的分子可包括其它四跨膜蛋白和整合素α5。

TSPAN4介導TEMAs的形成

TSPAN4介導TEMs的形成可包括TSPAN4將膜組織成富含膽固醇的膜域，其稱為富含四跨膜蛋白的微結構域(TEMs)。TEMs可組裝成微米級富含四跨膜蛋白的宏結構域(TEMAs)。TEMA可能處於液態有序相，並且在損傷位點周圍形成剛性環，可限制損傷擴大，防止膜解體，從而促進其它機制的膜修復。

第二製劑

如本文所用，術語“第二製劑”包括本領域已知用於增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的任何活性劑。術語“活性劑”可包括向該動物患者施用時能對其產生有益影響的蛋白質、抗體、肽、核苷酸、小分子藥物等。合成產生的、自然衍生的或重組產生的餾分也包括在這個術語中。活性劑可為生物活性劑的類似物、衍生物、激動劑、拮抗劑、對映體或藥學上可接受的鹽。

在一些實施例中，第二製劑可為功能上替代TSPAN4的分子，例如，第二製劑可為其它四跨膜蛋白族蛋白，例如TSPAN5。

在一些實施例中，第二製劑可為促進TSPAN4形成TEMS、促進TEMS形成TMAS和/或促進TSAN4向膜損傷位點遷移的分子。例如，該第二製劑可為膽固醇。

在一些實施例中，第二製劑可包括由幾種不同機制(包括出胞作用、入胞作用、SYX-2-EFF-1修復機制和ESCRT機制)介導膜修復的活性劑。

例如，第二製劑可藉由調節胞吐作用來促進膜修復。

例如，第二製劑可藉由調節胞吞作用來促進膜修復。

例如，第二製劑可藉由SYX-2-EFF-1修復機制來促進膜修復。

例如，第二製劑可藉由ESCRT機制促進膜修復。例如，第二製劑可包括ESCRT機制的一個或多個組分。例如，第二製劑可為Chmp4b、Vps4a和Chmp3或其功能片段。

在一些實施例中，可施用一個或多個第二製劑，例如第二製劑包括TSPAN5和膽固醇。同樣，例如，第二製劑包括TSPAN5和chmp4b。同樣，例如，第二製劑包括TSPAN5、膽固醇、chmp4b、Vps4a和Chmp3。

在一些實施例中，方法包括向細胞施用第一製劑和第二製劑，第一製劑用於促進TSPAN4的數量和功能。

在一些實施例中，第二製劑和第一製劑按順序施用。在一些實施例中，第二製劑和第一製劑同時施用。在一些實施例中，第二製劑和第一製劑同期施用。第一製劑或第二製劑可使用本領域已知的各種配方進行施用。

例如，第一製劑是編碼TSPAN4的核酸分子，第二製劑是編碼TSPAN5、Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3的核酸分子。

例如，第一製劑是編碼TSPAN4的核酸分子，第二製劑是膽固醇。

TSPAN4抑制劑

術語“抑制劑”一般是指能夠完全或部分阻止或減少一種或多種特異性生物分子(例如，蛋白質、多肽、脂多糖、糖蛋白、核糖核蛋白複合體等) 的生理功能的化合物/物質或組成物。一個或多個特異性蛋白的生理功能的該減少可包括蛋白質本身的活性減少(例如，與其它分子結合的能力等)或蛋白質本身存在量的減少。合適的抑制劑分子可包括拮抗劑抗體或抗體片段、小分子片段或衍生物、肽、反義寡核苷酸、小有機分子等。在一些實施例中，該抑制劑能夠阻斷細胞信號傳導途徑的激活。

如本文所用，術語“TSPAN4抑制劑”涉及靶向、減少或抑制TSPAN4的化合物，其可直接或間接靶向一個或多個TSPAN4，可在轉錄水平、轉譯水平和/或蛋白質轉譯後修飾水平上抑制該TSPAN4，可抑制該TSPAN4的數量或表達，並且還能夠抑制該TSPAN4的活性。

例如，該TSPAN4抑制劑可藉由siRNA、shRNA、CRISPER/cas體系等物質降低或減弱TSPAN4的表達水平。

例如，該TSPAN4抑制劑可抑制TSPAN4的功能，例如抑制TSPAN4介導的TEMS的形成，或抑制TPAN4向膜損傷位點的遷移。

例如，該TSPAN4抑制劑可包含顯性負性TSPAN4突變體，從而在很大程度上阻止野生型TSPAN4執行野生型功能。

實例

給出以下實施例以便向所屬技術領域具有通常知識者提供如何製備和使用本發明的完全公開和描述，並不旨在限制發明人所認為的其揭露的範圍，也不旨在表示下面的實驗是所進行的全部或唯一實驗。已做出努力確保關於所用數量(例如數量、溫度等)的準確性，但是應該考慮一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，否則份是以重量計的份，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度表示，並且壓力是大氣壓或者接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如pl，皮升；s或 sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌(ly)；ip.，腹腔(ly)；s.c.，皮下(ly)；r.t.，室溫等。

方法

質粒和細胞培養

質粒的構建。將四跨膜蛋白的cDNA選殖到pEGFP-N₁或pmCherry-N₁中進行成像，表明GFP或mCherry在Tspan的C端融合。所有Tspan基因和Chmp3、Chmp4b、Vps4a、Chmp7和整合素α5基因最初均從大鼠基因組中選殖。

對於細胞系。包括正常大鼠腎(NRK)、MGC803和L929細胞及其衍生物的貼壁細胞在37℃和5% CO₂的條件下，於添加10%血清和1%青黴素-鏈黴素的DMEM中進行培養。對於懸浮細胞，YTS細胞在37℃和5%的CO₂的條件下，於添加10%血清和1%青黴素-鏈黴素的RPIM-1640中進行培養。

剔除細胞系的產生

Chmp4b KO細胞。使用被修飾的PX458質粒(由浙江大學郭偉博士提供)刪除NRK細胞中的Chmp4b基因，PX458質粒包含與Cas9核酸酶偶聯的兩個指導RNA。用於CRISPR/Cas9的sgRNA序列為5'-GAGGATCGCGCACTGCATGC-3'(sgRNA#1，SEQ ID NO：6)和5'-GTACCAATCAACAACAGGAC-3'(sgRNA#2，SEQ ID NO：7)。轉染72小時後，藉由螢光激活細胞分選儀(FACS)選擇EGFP信號，將細胞種植到96孔板中。從這些單株細胞的基因組DNA中擴增包含sgRNA靶區的DNA片段，並且對DNA片段進行測序以挑出正確株。檢測引子序列為5’- AGCCCGAAAACTCAGACT-3’(正向，SEQ ID NO：8)和5’-TGGATATTGTAAGCACTCTCA-3’(反向，SEQ ID NO：9)。

根據上述相同方法，Tspan4/Tspan5雙KO細胞在先前產生的Tspan4-KO NRK細胞中刪除Tspan5基因。用於CRISPR/Cas9的Tspan5-KO gRNA序列為5’-GCTCAGCCGCGCGGACCGAG-3’(sgRNA#1，SEQ ID NO：10)和5’-GGCAGAGCGTGGTGTCATAA-3’(sgRNA#2，SEQ ID NO：11)。檢測引子序列為5’-CTACCCTGGCTCCTCTAAAT-3’(正向，SEQ ID NO：12)和5’-TGCAAGGAGATACACGCTGA-3’(反向，SEQ ID NO：13)。用於CRISPR/Cas9的Tspan4-KO gRNA序列為用於NRK細胞的5’-GATGGGGCGTCCGGGAGCCA-3’(sgRNA#1，SEQ ID NO：14)和5’-GCGCACGTGCTCACAAGACC-3’(sgRNA#2，SEQ ID NO：15)。(Huang,Y.et al.Migrasome formation is mediated by assembly of micron-scale tetraspanin macrodomains.Nat Cell Biol 21,991-1002(2019))

細胞轉染

對於NRK細胞及其衍生物，用T溶液和X-001程序對6cm培養皿中的1/3細胞進行2μg DNA的Amaxa核轉染，然後生長15h進行蛋白質表達。對於L929細胞和MGC803細胞，用脂質體-3000轉染試劑盒(Invitrogen)將3.5cm培養皿中的細胞進行4μg DNA核轉染，然後生長15-18h進行蛋白表達。

光損傷試驗

在振鏡掃描模式下進行細胞光損傷實驗，使用裝有100×油物鏡和3倍放大的NIKON A1共聚焦顯微鏡。為了統計分析Chmp4b-mCherry陽性面積和強度，將成像區域放大兩次。用405nm激光對相關區域進行破壞，每幀6-8s，輸出100%，循環7-8次。損傷後，立即將激光功率降低到2%，每個512×512像素區域進行10-15min成像。

光損傷位點的SIM成像

將共表達Tspan4-GFP和Chmp4b-mCherry的細胞播種到網格狀玻璃底皿上15h。定位靶細胞位置，並且用共聚焦顯微鏡對靶細胞進行光損傷。細胞損傷後，立即用4%的PFA在室溫下固定5min，然後在PBS中清洗一次。然後用結構照明顯微鏡(Nikon N-SIM S)對損傷細胞進行成像，並且藉由標準堆棧重建過程進行重建。

洗滌劑處理試驗

藉由微吸管玻璃針，將在24mm玻璃蓋玻片上培養的細胞放到微吸管系統上，並且將玻璃針放置在細胞上的靶向區域附近。給細胞注射0.02%的TritonX-100或模擬液，同時開始延時成像。

在細胞培養室中，在3.5cm共聚焦專用培養皿中培養的細胞置於共聚焦顯微鏡系統上，並且根據所選域固定在X-Y位置上。用0.013%的TritonX-100或模擬液輕輕替換培養基，然後採集延時圖像(512×512像素)，時間為20min。

Laurdan染料染色、成像和GP值計算

為了校準GP值，將5μM的laurdan染料在22℃的DMSO中加入共聚焦專用培養皿中，然後在雙光子顯微鏡系統中用800nm激光激發。在通道1(400-460nm)和通道2(470-530nm)中同時捕捉兩幅圖像。

在37℃下，將5μM的laurdan染料在新鮮培養基中作用於細胞30min，以進行預染色。首先藉由800nm激光用雙光子顯微鏡模式對細胞成像，然後在共聚焦顯微鏡模式下快速進行光損傷。接下來，藉由雙光子顯微鏡對損傷細胞進行3min的延時成像。

GP值按照描述^21,22進行校準和計算，並且以統計圖的形式呈現。如前文所述，對通道1和通道2的圖像進行校準和分析，以GP值模式呈現。

體外耐洗滌劑試驗

GPMV的製備。細胞在12.5ml燒瓶中培養15h，直到實現90%-100%融合。移除培養基後，用GPMV緩衝液(10mM HEPES，2mM CaCl₂，150mM NaCl，pH=7.4)清洗細胞一次。將包含新添加的2mM DTT、25mM甲醛和10μg/ml PE-羅丹明(Avanti)的1ml的GPMV緩衝液在37℃下應用於細胞，持續1h，並且以70rpm/min的速度搖動。最後，在1ml的懸浮液中製備GPMV。

體外微吸管處理。GPMV置於微吸管系統中，並且玻璃針設置於靠近靶向GPMV的位置。將0.5%的磷酸膽鹼十二酯或模擬液注入GMPV，並且同時開始延時成像。

體外塌陷試驗

親水玻璃底室的製備。用電漿清洗裝置(PDC-32G,Harrick電漿)對用於共聚焦成像的玻璃底室進行發光放電，並且進行2.5min的真空處理和60s的高水平電離輻射。玻璃底室置於成像適配器上，並且3μl的GPMV樣品塗於玻璃底室底部的中心。蓋上蓋子，將玻璃底室/樣本在室溫下靜置3min。然後獲得10-15min的延時圖像(512×512像素)。為了進行統計分析，在樣本施加到試驗室後約20min，隨機採集圖像。對於免疫螢光染色，在樣本應用於試驗室20min後，擦掉懸浮液，並且用4%PFA在室溫下固定樣本5min，然後進行標準免疫螢光染色過程。使用以下商業抗體：抗GFP抗體(MBL，598)、抗α1 Na/K ATPase 抗體(Abcam，ab7671)、山羊抗小鼠IgG交叉染色二級抗體、螢光基團633(Invitrogen，A21052)和山羊抗兔IgG交叉染色二級抗體，螢光基團488(Invitrogen，A11008)。

脂蛋白體的製備和冷凍電鏡觀察

脂蛋白體的製備。如前所述，將Tspan4-GFP蛋白純化並插入脂質體中，以形成脂蛋白體。²⁰。

冷凍電鏡樣本的製備。採用電漿清洗裝置(PDC-32G、Harrick Plasma)對Quantifoil網格銅(200/300目，R2/2)進行發光放電，真空處理2min，並且暴露於中等水平電離輻射40s。將4μl的包含或不含Tspan4-GFP的脂質體樣本應用於網格中，然後在Vitrobot Mark IV(賽默飛世爾科學公司)中孵育1min。網格以2.5~4s的印跡時間和0的印跡力進行印跡，然後插入液態乙烷進行玻璃化。用FEI Tecnai Arctica 200kV TEM檢查冷凍電鏡樣本。

對於冷凍電鏡斷層掃描術，在配備有Cs校正器、能量過濾器和K2 Summit直接電子檢測相機(Gatan)的FEI Titan Krios 300kv TEM上採集來自玻璃化試樣的斷層數據。圖像的放大倍率為64,000×(樣本像素大小為1.77Å)，離焦為-1.5μm，插入Volta相板產生~0.5π的相移。使用SerialEM軟體³²從-42°到42°每3°採集一次傾斜序列，總劑量為~85e/Å²。隨後這些結構在IMOD³³中重建，並且在Chimera³⁴中是可視的。

脂蛋白缺乏血清(LPDS)的細胞處理

如前所述，由胎牛血清(FBS)製備LPDS^35,36。為了促進細胞膽固醇耗竭，如我們之前的工作所述，在DMEM培養基中添加10%的FBS、LPDS或LPDS+30μM普伐他汀(TargetMol,T0672)培養表達Tspan4-GFP的NRK細胞60小時。²⁰對各組細胞逐一進行光損傷試驗。根據製造商的說明，使用Amplex^® Red膽固醇檢測試劑盒(Invitrogen，A12216)來測定各組的細胞總膽固醇水平。

LPS電穿孔

對於NRK細胞及其衍生物，使用T溶液和X-001程序，藉由Amaxa核轉染，利用PBS(模擬液)或溶解在PBS中的0.5μg的LPS轉染3×10⁵細胞，然後以每孔1×10³的密度接種到96孔板中。轉染8h後，使用CellTiter-Glo發光細胞存活率檢測試劑盒分析細胞存活率。

NK細胞殺傷實驗

將1.5×10⁵的YTS細胞和1.5~2×10⁴的MGC803細胞或其衍生物在1.5ml通風EP管中，於37℃和5%CO₂下，在100μl細胞培養基中共培養或作為對照品單獨培養3h。在3h內，每隔30min輕輕攪拌細胞一次。細胞以2000rpm的速度離心，然後在4℃下進行CD56-APC染色30min。在PBS中清洗一次後，用AnnexinV-FITC和PI對細胞進行染色，以進一步進行流式細胞儀分析。

強度分析

對於分析光損傷試驗中的損傷位點強度。首先用NIS-分析軟體指定ROI(相關區域)。將損傷區設定為ROI 1，隨機選擇的非損傷區設定為ROI 2。在整個成像期間逐幀追蹤ROI後，測量所有ROI的絕對螢光強度。ROI 1的強度由其配對的ROI 2校準，並且歸一化為在圖中表示的百分比。

對於分析Chmp4b陽性面積和螢光強度。Chmp4b-mCherry信號覆蓋面積由最外層的Chmp4b-mCherry點狀信號之間的最短連接線圈出。在DIC通道圖像中手動量化細胞總基質面積。根據這些測量結果，逐幀計算Chmp4b-mCherry信號覆蓋的面積百分比，並且測量mCherry的總螢光強度。

對於分析洗滌劑處理試驗中的總PI強度。使用Imaris軟體的表面功能在DIC通道圖像上繪製細胞輪廓。使用跟蹤功能追蹤輪廓。逐幀測量細胞的平均PI強度，並且在圖表中以百分數表示。

PI、BAPTA-AM和FM1-43的信息

將碘化丙啶(PI)(Beyotime ST511)加入細胞培養系統中，直至最終濃度為4μg/mL，以在基於成像的實驗中顯示細胞膜的完整性。

將BAPTA-AM(Selleck S7534)加入細胞培養系統中，直至最終濃度為10μM，在37℃下培養30min。然後對細胞進行光損傷試驗。

將FM1-43(ThermoFisher F35355)加入細胞培養系統中，直至最終濃度為5μg/mL，在37℃下培養15min。然後對細胞進行光損傷試驗。

統計數據

所有實驗至少獨立進行三次。

P值用GraphPad Prism5的雙尾非配對t檢驗進行計算。誤差條，平均值±SEM。*P

0.01、**P

0.001、***P

0.0001、NS=無意義。

實例1。將Tspan4-GFP募集到膜損傷位點的邊緣

研究發現，在多個細胞系中，激光質膜創傷導致Tspan4-GFP快速募集到多個細胞系損傷位點的邊緣(圖1A和圖5A)。Tspan4-GFP首先以一系列斑點出現在損傷區周圍。最終，Tspan4-GFP在損傷位點周圍形成環狀結構(圖1B)。Tspan4-GFP的募集似乎是特異性募集，因為膜蛋白(例如，Na/K ATP酶)未被募集到損傷位點(圖5B)。其它形式的損傷(包括局部添加洗滌劑(圖1C和圖1D)和自然殺傷細胞造成的損傷(圖1E))也會導致Tspan4蛋白被募集到損傷位點。Tspan4-GFP的募集逐漸變得可見，在損傷後50s左右開始，在約 200s達到最大強度(圖1F和圖1G)。膜損傷由PI流表示，這表明傷口在2min時仍然是開放的，與Tspan4-GFP和ESCRT的募集時標一致(圖5C和圖5D)。Tspan4-GFP環收縮，PI信號減弱，這表明膜損傷已被修復(圖1F)。

實例2

2.1 Tspan4可保護細胞免受膜損傷

以PI攝取量來測定膜損傷的程度。結果發現，過表達Tspan4顯著減少了光損傷細胞(圖4A和圖4B)以及洗滌劑誘導的膜損傷細胞(圖9A和圖9B)對PI的攝取，而剔除Tspan4對PI進入量的影響相對較小。這表明，Tspan4發揮了保護細胞免受光損傷誘導的細胞死亡和洗滌劑誘導的細胞死亡的作用。

2.2 NRK細胞中Tspan4和Tspan5之間的冗餘性

哺乳動物細胞中共有33個四跨膜蛋白。RNA-seq顯示，除了Tspan4外，Tspan5、Tspan7、Tspan3和Tspan31在NRK細胞中也有相對較高的表達水平，這就提出了四跨膜蛋白的功能冗餘可以解釋Tspan4剔除產生的輕微影響。

構建了Tspan4/Tspan5、Tspan4/Tspan7、Tspan4/Tspan3和Tspan4/Tspan31雙基因剔除細胞系。結果發現，Tspan4/Tspan5雙基因剔除細胞顯示PI進入量明顯增加。同樣，當使用親脂性染料FM 1-43標記損傷膜時，Tspan4/Tspan5雙基因剔除細胞包括更高的FM 1-43信號，這表明這些細胞上有更多損傷膜。此外，Tspan4/Tspan5雙基因剔除細胞顯示洗滌劑誘導活力喪失明顯增強(圖4C至圖4E和圖9C至圖9E)。這些結果表明，Tspan4和Tspan5之間的冗餘可以解釋Tspan4剔除產生的輕微影響。

實例3 Tspan4增強膜修復的生理相關性

3.1 Tspan4保護細胞不受細胞焦亡影響

生理刺激(例如細胞焦亡)已被證明會引起大量膜損傷，而這一損傷可藉由ESCRT介導膜修復機制來抵消。研究發現，過表達Tspan4-GFP可以保護細胞不受LPS轉染誘導的細胞焦亡影響²⁴(圖4F)。相反地，Tspan4剔除使細胞對LPS轉染誘導的細胞焦亡變得敏感，而同時剔除Tspan5和Tspan4則進一步加劇這種敏感性(圖4G和圖9F)。這些結果表明，四跨膜蛋白介導膜修復在細胞焦亡期間維持細胞存活率方面發揮了重要作用。

3.2 Tspan4保護靶細胞免受NK細胞侵害

自然殺傷(NK)細胞藉由穿孔素介導膜破壞和細胞凋亡來殺傷它們的靶細胞^25-31。觀察到Tspan4-BFP被募集到NK細胞和其靶細胞之間的接觸位點上(圖1E)。結果發現，Tspan4的過表達確實保護了靶細胞免受NK介導殺傷，而Tspan4的剔除使靶細胞對NK介導細胞死亡增敏。因此，Tspan4保護靶細胞免受NK細胞的傷害(圖4H及圖4I和圖10A至圖10C)。

實例4 Tspan4介導的膜損傷保護機制

4.1 Tspan4以TEMs形式募集到損傷位點

為了研究Tspan4是否以富含四跨膜蛋白的微結構域(TEMs)形式募集到損傷位點，檢查了一系列富含TEMs的分子(包括其它四跨膜蛋白和整合素α5)。結果發現，所有這些分子均被募集到損傷位點(圖3A)。除了蛋白質，膽固醇是TEMs的一個重要組分，TEMA也依賴於膽固醇形成。研究發現，膽固醇耗竭阻礙了TEMA環的組裝，並明顯增加了PI流(圖3B及圖3C和圖7A至圖7D)。總之，這些數據表明，Tspan4-GFP確實以TEM形式被募集到損傷位點。一旦TEMs到達損傷位點，它們就會組裝成微米級TEMA。Tspan4可藉由形成剛性環來促進膜修復，該剛性環圍繞損傷區並且限制其進一步擴張。

4.2 在損傷位點周圍組裝的TEMA處於液態有序相

膜微結構域(例如，富含四跨膜蛋白的結構域)由於膽固醇濃度高，往往處於液態有序相，從而導致膜剛性高。

為了測試在損傷位點周圍組裝的TEMA是否處於液態有序相，使用了相染料laurdan。laurdan的廣義極化(GP)僅隨相態變化。因此，laurdan已被廣泛用於識別膜中的相態^21,22。經laurdan染料發現，損傷位點呈環狀結構，GP值約為0.4。可見，包裹損傷位點的TEMA處於脂質有序相(圖3D和圖3E)。

4.3 Tspan4從質膜中募集

研究發現，Tspan4-GFP定位在質膜和胞內囊泡上。Tspan4的募集並不依賴於細胞骨架(圖3F)這一事實表明，Tspan4是從質膜募集的。

實例5四跨膜蛋白和ESCRT複合體之間的關係

研究發現，Tspan4-GFP與包括Chmp4b、Vps4a和Chmp3在內的各種ESCRT組分部分共定位(圖2A)。Tspan4-GFP形成相對平滑的環緊密圍繞損傷位點，而ESCRT組分則在損傷位點周圍形成點狀結構，在Tspan4-GFP陽性區的密度最高(圖2B)。延時成像顯示，Tspan4-GFP的募集幾乎與ESCRT組分Chmp4b的募集同時發生。5分鐘後，Chmp4b的信號變弱，而Tspan4-GFP的信號即使在Chmp4b消失後也保持緩慢上升(圖2C)。SIM圖像顯示，在光損傷和洗滌劑誘導損傷後，Chmp4b信號與Tspan4接近，但不與Tspan4完全共定位(圖2D和圖6A)。這些觀察結果表明，Tspan4和Chmp4b並未被募集到完全相同的位置。

研究發現，過表達(OE)顯性負性Vps4a突變體或Chmp3突變體¹⁰(圖2E和圖6C)，或剔除(KO)Chmp4b(圖2F和圖6D)均已被證明能抑制ESCRT III的活性，但不影響Tspan4-GFP的募集。這表明，Tspan4募集不需要ESCRT III活性。

有趣的是，結果發現Tspan4-GFP的過表達顯著減少了Chmp4b斑點陽性的損傷位點的周圍區域。在表達Tspan4-GFP的細胞中，Chmp4b斑點限制在緊緊圍繞Tspan4-GFP信號的區域中，而在對照細胞中，Chmp4b斑點迅速從損傷位點擴散，從而佔據更大區域(圖2G至圖2I)。剔除Tspan4僅輕微加劇了Chmp4b斑點的擴散，這表明其它四跨膜蛋白可補償Tspan4的作用。同樣，過表達Tspan4-GFP明顯減少了Chmp4b募集到損傷位點的數量，而剔除Tspan4僅略微增強了Chmp4b的募集(圖2H和圖2J)。

這些數據表明，Chmp4b募集不需要Tspan4。此外，由於已知Chmp4b標記了損傷位點，這些數據也暗示了Tspan4-GFP的過表達阻止了膜損傷的擴散。

實例6膜修復過程可在體外復原

假設物理特性是TEM介導的膜修復機制的基礎，而非複雜的生物過程。

為了驗證這一假設，我們從包含或不含Tspan4-GFP表達的NRK細胞中生成巨型質膜囊泡(GPMV)。然後，我們調整了廣泛使用的實驗方案，藉由將GPMV滴到親水玻璃表面來生成支撐雙層(圖3G)。當GPMV接觸親水表面時，它們變得更平坦，並且形成越來越薄的餅狀雙膜結構。隨著“餅”越來越大，越來越薄，膜的上層在其中心破裂，最終形成單膜雙分子層附著在支撐表面上。

研究發現，在來自Tspan4-GFP過表達細胞的GPMV中，膜破裂導致Tspan4-GFP被迅速募集到破裂位點的邊緣；相反地，Na/K ATPase和GFP-CAAX等膜蛋白均未被募集到破裂位點，這表明這一過程具有高度特異性(圖3H及圖3I和圖8A及圖8B)。此外，Tspan4的存在穩定了破裂餅狀結構，並且防止其坍塌成單膜雙分子層(圖3J和圖8C)。該實驗進一步支持Tspan4對膜損傷位點的募集可由富含四跨膜蛋白的微結構域(TEM)在損傷位點的橫向組裝來驅動。此外，它表明富含四跨膜蛋白的微結構域的組裝可以穩定膜損傷位點。

實施例7來自表達Tspan4的細胞的GPMV對洗滌劑具有更強抗性

如前所述，洗滌劑的局部輸送可導致Tspan4-GFP環在細胞中組裝。因此，測試來自表達Tspan4-GFP的細胞的GPMV是否對洗滌劑具有更強的抵抗力。在這個系統中，從對照品和表達Tspan4-GFP的細胞中生成GPMV，並且使用Rho-PE對膜進行觀察。然後藉由微吸管施用洗滌劑，並且用活體成像來監測這一過程。結果發現，Tspan4-GFP GPMV對洗滌劑具有更強的抵抗力。在暴露於0.5%的磷酸膽鹼十二酯後，來自表達Tspan4的細胞的GPMV比對照品GPMV的存活時間長得多(圖3K至圖3L)。具體的活體成像分析表明，在用微吸管施加洗滌劑後，對照品GPMV立即爆炸。相反地，當Tspan4 GPMV暴露於洗滌劑後，膜的一小部分中的Rho-PE信號變弱，這表明膜的這一部分被損傷。損傷膜很快從GPMV中被排出，並且損傷位點再次關閉。這個過程不斷重複，直至最終產生較小但仍然完整的GPMV(圖8D)。

實例8

偶然發現Tspan4-GFP包埋的蛋白脂質體在冷凍電鏡下呈現出不同尋常的形態。不包含Tspan4的對照品脂質體在冷凍電鏡圖像中都是完整的。相反地，在Tspan4-GFP包埋的蛋白脂質體中，藉由低溫電子斷層掃描術觀察到一些蛋白脂質體破裂但仍保留泡狀形態(圖3O)。在靠近破裂位點的地方，觀察到可能是被排出損傷膜片段的散亂膜片段。

我們對這一觀察結果的解釋是，冷凍電鏡樣本的製備過程會造成輕微的膜損傷，可能是由印跡過程中的液面擠壓²³造成的。在對照脂質體中，所有損傷囊泡都很快被破壞，因此無法藉由冷凍電鏡觀察到。在Tspan4-GFP包埋的蛋白脂質體中，囊泡破裂的中間“開放”階段被Tspan4穩定，隨後被冷凍保存，從而可用冷凍電鏡進行觀察。綜合來看，這些數據表明，Tspan4藉由在膜破裂過程中保持結構完整性和藉由隔離損傷區來促進膜損傷修復。藉由這種方式，Tspan4防止局部損傷向整體損傷的災難性傳播。

雖然本文已經顯示和描述了本發明的示例性實施例，但是對所屬技術領域具有通常知識者顯而易見的是，這樣的實施例僅以舉例的方式提供。並不打算讓本發明受說明書中提供的具體實例的限制。雖然已參照上述說明書描述了本發明，但本文中實施例的描述和說明並不應以限制意義解釋。在不背離本實用新型的情況下，所屬技術領域具有通常知識者將易於想到各種變型、改變和替代。此外，應該理解，本發明的所有方面不限於特定的描述、本文描述的構造或相對比例，其取決於多種條件和變量。應該理解，也可應用本文描述的本發明各實施例的多種替代方案來實施本發明。因此可以想到，本發明還包括這些改變、變化和等效方案。本文旨在下列申請專利範圍限定了本發明的範圍，並且從而覆蓋這些申請專利範圍內的方法和結構及其等同項。

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Claims

一種用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的方法，該方法包括調節TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項1所述的方法，其中，該膜修復相關生物過程包括傷口癒合和/或細胞損傷調節。
如請求項2所述的方法，其中，該細胞損傷包括細胞死亡。
如請求項3所述的方法，其中，該細胞死亡包括細胞凋亡、細胞壞死和/或細胞焦亡。
如請求項2至4中任一項所述的方法，其中，該細胞損傷是由物理因素、化學因素和/或生物因素引起的。
如請求項2至5中任一項所述的方法，其中，該細胞損傷是由激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞引起的。
如請求項6所述的方法，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。
如請求項1至7中任一項所述的方法，其中，該膜包含直徑為至少約100nm的損傷區。
如請求項1至8中任一項所述的方法，其中，該方法包括調節該待修復膜中的該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項1至9中任一項所述的方法，其中，該膜來源於生物材料和/或為人工膜。
如請求項1至10中任一項所述的方法，其中，該膜為細胞膜，並且該方法包括調節該細胞表達或包含的該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項1至11中任一項所述的方法，其中，該TSPAN4為人TSPAN4。
如請求項1至12中任一項所述的方法，其中，該TSPAN4包含如SEQ ID NO：1-2中任一項所示的胺基酸序列。
如請求項1至13中任一項所述的方法，其中，該膜修復包括抑制膜損傷擴大和/或促進膜癒合。
如請求項1至14中任一項所述的方法，其中，該方法增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷。
如請求項15所述的方法，其中，該方法包括增加該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項16所述的方法，其中，該方法包括過表達TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。
如請求項15至17中任一項所述的方法，其中，該膜為細胞膜，並且該方法包括增加該細胞中的該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項15至18中任一項所述的方法，其中，該方法包括促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。
如請求項15至19中任一項所述的方法，其中，該方法進一步包括增加能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。
如請求項20所述的方法，其中，該第二製劑包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。
如請求項21所述的方法，其中，該ESCRT的一個或多個組分包括Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3。
如請求項1至14中任一項所述的方法，其中，該方法抑制該膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷。
如請求項23所述的方法，其中，該方法包括減少該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項23或24所述的方法，其中，該膜為細胞膜，並且該方法包括減少該細胞中的該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項23至25中任一項所述的方法，其中，包括減弱或剔除編碼跨膜蛋白4的基因表達。
如請求項23至26中任一項所述的方法，其中，包括抑制：

所述TSPAN4向所述損傷膜的位點募集；

所述TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

所述TSPAN4介導的TEMAs的形成。
如請求項23至27中任一項所述的方法，其中，該方法包括施用TSPAN4抑制劑。
如請求項23至28中任一項所述的方法，其中，該方法進一步包括減少能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。
如請求項29所述的方法，其中，該第二製劑包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。
如請求項30所述的方法，其中，該ESCRT的一個或多個組分包括Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3。
如請求項23至31中任一項所述的方法，其中，該方法進一步包括施用能夠抑制膜修復和/或導致細胞損傷的外加劑。
如請求項32所述的方法，其中，該外加劑包括物理製劑、化學製劑和/或生物製劑。
如請求項32或33所述的方法，其中，該外加劑包括激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞。
如請求項34所述的方法，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。
如請求項1至35中任一項所述的方法，其中，該方法為體內法。
如請求項1至35中任一項所述的方法，其中，該方法為體外法或離體法。
一種能夠調節TSPAN4的數量和/或功能的製劑，其中，該製劑用於調節膜修復和/或膜修復相關生物過程。
如請求項38所述的製劑，其中，所述膜修復相關生物過程包括傷口癒合和/或細胞損傷調節。
如請求項39所述的製劑，其中，該細胞損傷包括細胞死亡。
如請求項40所述的製劑，其中，該細胞死亡包括細胞凋亡、細胞壞死和/或細胞焦亡。
如請求項39至41中任一項所述的製劑，其中，該細胞損傷是由物理因素、化學因素和/或生物因素引起的。
如請求項39至42中任一項所述的製劑，其中，該細胞損傷是由激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞引起的。
如請求項43所述的製劑，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。
如請求項38至44中任一項所述的製劑，其中，該膜包含直徑為至少約100nm的損傷區。
如請求項38至45中任一項所述的製劑，其中，該製劑能夠調節該膜中該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項38至46中任一項所述的製劑，其中，該膜來源於生物材料和/或為人工膜。
如請求項38至47中任一項所述的製劑，其中，該膜為細胞膜，並且該製劑能夠調節該細胞表達或包含的該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項38至48中任一項所述的製劑，其中，該TSPAN4為人TSPAN4。
如請求項38至49中任一項所述的製劑，其中，該TSPAN4包含如SEQ ID NO：1-2中任一項所示的胺基酸序列。
如請求項38至50中任一項所述的製劑，其中，該膜修復包括抑制膜損傷擴大和/或促進膜癒合。
如請求項38至51中任一項所述的製劑，其中，該製劑用於增加該膜修復、減輕該細胞損傷、促進該傷口癒合和/或保護細胞免受該細胞損傷。
如請求項52所述的製劑，其中，該製劑能夠增加該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項53所述的製劑，其中，該製劑能夠導致TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子的過表達。
如請求項52至54中任一項所述的製劑，其中，該製劑包括TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。
如請求項52至55中任一項所述的製劑，其中，該膜為細胞膜，並且該製劑能夠增加該細胞中的該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項52至56中任一項所述的製劑，其中，該製劑能夠促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。
如請求項52至57中任一項所述的製劑，其中，該製劑用於與能夠增加膜修復、減輕細胞損傷和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑結合使用。
如請求項58所述的製劑，其中，該第二製劑包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。
如請求項59所述的製劑，其中，該ESCRT的一個或多個組分包括Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3。
如請求項38至51中任一項所述的製劑，其中，該製劑用於抑制該膜修復、抑制該傷口癒合和/或促進該細胞損傷。
如請求項61所述的製劑，其中，該製劑能夠減少該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項61或62中任一項所述的製劑，其中，該膜為細胞膜，並且該製劑能夠減少該細胞中的該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項61至63中任一項所述的製劑，其中，該製劑能夠減弱或剔除編碼跨膜蛋白4的基因表達。
如請求項61至64中任一項所述的製劑，其中，該製劑能夠抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。
如請求項61至65中任一項所述的製劑，其中，該製劑包括TSPAN4抑制劑。
如請求項61至66中任一項所述的製劑，其中，該製劑用於與第二製劑結合使用，該第二製劑能夠減少可增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的製劑的數量和/或功能。
如請求項67所述的製劑，其中，該第二製劑能夠減少以下物質的數量和/或功能：內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。
如請求項68所述的製劑，其中，該ESCRT的一個或多個組分包括Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3。
如請求項61至69中任一項所述的製劑，其中，該製劑用於與能夠抑制膜修復和/或導致細胞損傷的外加劑結合使用。
如請求項70所述的製劑，其中，該外加劑包括物理製劑、化學製劑和/或生物製劑。
如請求項70或71所述的製劑，其中，該外加劑包括激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞。
如請求項72所述的製劑，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。
一種工程細胞，該工程細胞與未修飾的相應細胞相比，其調節膜修復和/或膜修復相關生物過程的能力有所改變，該工程細胞已被修飾用來改變該工程細胞中的TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項74所述的工程細胞，其中，該膜修復相關生物過程包括傷口癒合和/或細胞損傷調節。
如請求項75所述的工程細胞，其中，該細胞損傷包括細胞死亡。
如請求項76所述的工程細胞，其中，該細胞死亡包括細胞凋亡、細胞壞死和/或細胞焦亡。
如請求項75至77中任一項所述的工程細胞，其中，該細胞損傷是由物理因素、化學因素和/或生物因素引起的。
如請求項75至78中任一項所述的工程細胞，其中，該細胞損傷是由激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞引起的。
如請求項79所述的工程細胞，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。
如請求項74至80中任一項所述的工程細胞，其中，該膜包含直徑為至少約100nm的損傷區。
如請求項74至81中任一項所述的工程細胞，其中，該工程細胞已被修飾用來增加該膜中的該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項74至82中任一項所述的工程細胞，其中，該TSPAN4為人TSPAN4。
如請求項74至83中任一項所述的工程細胞，其中，該TSPAN4包含如SEQ ID NO：1-2中任一項所示的胺基酸序列。
如請求項74至84中任一項所述的工程細胞，其中，該膜修復包括抑制膜損傷擴大和/或促進膜癒合。
如請求項74至85中任一項所述的工程細胞，其中，該工程細胞具有增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的能力。
如請求項86所述的工程細胞，其中，該工程細胞已被修飾用來增加該工程細胞中該TSPAN4的數量和/或功能。
如請求項87所述的工程細胞，其中，該工程細胞過表達TSPAN4蛋白、其功能片段、其功能變體和/或編碼它們中的一者或多者的核酸分子。
如請求項86至88中任一項所述的工程細胞，其中，該工程細胞已被修飾用來促進：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。
如請求項86至89中任一項所述的工程細胞，其中，該工程細胞已被進一步修飾用來增加能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。
如請求項90所述的工程細胞，其中，該第二製劑包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。
如請求項91所述的工程細胞，其中，該ESCRT的一個或多個組分包括Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3。
如請求項74至85中任一項所述的工程細胞，其中，該工程細胞具有降低膜修復的能力和/或提高促進細胞損傷的能力。
如請求項93所述的工程細胞，其中，該工程細胞與未修飾的相應細胞相比，包括該TSPAN4的減少數量和/或功能。
如請求項93或94所述的工程細胞，其中，該編碼四跨膜蛋白(TSPAN)4的基因表達已經被減弱或剔除。
如請求項93至95中任一項所述的工程細胞，其中，該工程細胞已被修飾用來抑制：

該TSPAN4向該損傷膜的位點募集；

該TSPAN4介導的TEMs形成；和/或

該TSPAN4介導的TEMAs的形成。
如請求項93至96中任一項所述的工程細胞，其中，該工程細胞已採用TSPAN4抑制劑進行處理。
如請求項93至97中任一項所述的工程細胞，其中，該工程細胞已被進一步修飾用來減少能夠增加膜修復、減輕細胞損傷、促進傷口癒合和/或保護細胞免受細胞損傷的第二製劑的數量和/或功能。
如請求項98所述的工程細胞，其中，該第二製劑包括內體蛋白分選轉運複合體(ESCRT)機制的一個或多個組分、TSPAN5、膽固醇和/或能夠增加其數量和/或功能的製劑。
如請求項99所述的工程細胞，其中，該ESCRT的一個或多個組分包括Chmp4b、Vps4a和/或Chmp3。
如請求項93至100中任一項所述的工程細胞，其中，該工程細胞已採用能夠抑制膜修復和/或導致細胞損傷的外加劑進行進一步處理。
如請求項101所述的工程細胞，其中，該外加劑包括物理製劑、化學製劑和/或生物製劑。
如請求項101或102所述的工程細胞，其中，該外加劑包括激光、洗滌劑、穿孔素、光子和/或殺傷細胞。
如請求項103所述的工程細胞，其中，該殺傷細胞包括自然殺傷(NK)細胞。
一種如請求項38至73中任一項所述的製劑和/或如請求項74至104中任一項所述的工程細胞在製備用於該膜修復和/或所述膜修復相關生物過程的調節劑中的用途。
一種組成物，該組成物包括如請求項38至73中任一項所述的製劑，和/或如請求項74至104中任一項所述的工程細胞。
如請求項106所述的組成物，其中，該組成物為醫藥組成物，並且視需要地包括藥學上可接受的賦形劑。
一種試劑盒，該試劑盒包括如請求項38至73中任一項所述的製劑、如請求項74至104中任一項所述的工程細胞和/或如請求項105或106所述的組成物。
如請求項108所述的試劑盒，其中，該試劑盒進一步包括第二製劑。
如請求項109所述的試劑盒，其中，該第二製劑包含在單獨的容器或艙室中。