BRPI0208870B1

BRPI0208870B1 - método de produção de polipeptídeos, vetor, composição farmacêutica, bem como método para diagnóstico de distrofia retinal

Info

Publication number: BRPI0208870B1
Application number: BRPI0208870A
Authority: BR
Inventors: David Hicks; Saddek Mohand-Said; Thierry Leveillard
Original assignee: Novartis Ag; Univ Pasteur; Univ Strasbourg
Priority date: 2001-04-06
Filing date: 2002-04-05
Publication date: 2016-01-12
Also published as: US8518695B2; IL199316A; BRPI0208870B8; NZ528376A; PL364681A1; US20120108657A1; US8957043B2; US20080004231A1; CA2443345C; RU2384586C2; US8071745B2; US8114849B2; US7795387B2; NO331277B1; IL158013A0; AU2002312794B2; PL213658B1; EP1379657A2; RU2003130638A; IL158013A

Abstract

"proteína associada à doença". a presente invenção refere-se a métodos e composições para o diagnóstico precoce, monitoração e tratamento de distrofia retinal, degeneração macular relacionada com a idade, síndrome de bardet-biedel, síndrome de bassen-kornzweig, doença de best, coroidema, atrofia do giro, amourose congênita, síndrome de refsun, doença de stargardt e síndrome usher. em particular, a invenção refere-se a uma proteína, chamada "rdcvf1", que é diferencialmente descrita e expressa em indivíduos que sofrem de distrofia retinal e semelhantes, tais como, distrofia retinal e degeneração macular relacionada com a idade em comparação com não-sofredores, anticorpos que reconhecem esta proteína, e métodos para o diagnóstico de tais condições.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DO DE PRODUÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS, VETOR, COMPOSIÇÃO

FARMACÊUTICA, BEM COMO MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE DISTROFIA RETINAL".

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a métodos e a composições para a detecção e tratamento de doenças degenerativas retinais. Em particular, a invenção refere-se a uma proteína que protege contra de- generação de células de cone, a moléculas de ácido nucléico que co- dificam tal proteína, a anticorpos que reconhecem a proteína, e a mé- todos para o diagnóstico de doenças degenerativas retinais.

Fundamentos da Invenção Fotorreceptores são um subconjunto especializado de neurônios reti- nais, que são responsáveis pela visão. Fotorreceptores consistem em bastonetes e cones que são células fotossensíveis da retina. Cada bastonete e cone elabora um cílio especializado, chamado de segmen- to externo que aloja a maquinaria de fototransdução. Os bastonetes contêm um pigmento visual absorvedor de luz, rodopsina. Há três classes cones em seres humanos, caracterizadas pela expressão de pigmentos visuais distintos: pigmentos de cone azul, de cone verde e de cone vermelho. Cada tipo de proteína de pigmento visual é ajusta- do para absorver luz de modo máximo em diferentes comprimentos de onda. O bastonete rodopsina media a visão escotópica (em luz fraca), enquanto que os pigmentos de cone são responsáveis pela visão fotó- pica (em luz brilhante). Pigmentos vermelho, azul e verde também formam a base da visão de cor em seres humanos. Os pigmentos vi- suais em bastonetes e cones respondem à luz e geram um potencial de ação nas células de saída, os neurônios bipolares de bastonete, que é então recolocada pelos neurônios de gânglios retinais para pro- duzir um estímulo visual no córtex visual. [003] Em seres humanos, numerosas doenças da retina envol- vem a degeneração progressiva e morte eventual de fotorreceptores, que levam inexoravelmente à cegueira, Degeneração de fotorrecepto- res, tais como por dístrofas retinais herdadas (por exemplo, retínose pigmentosa), degeneração macular relacionada com a idade e outras maculopatias, ou descolamento retinal, são todos caracterizados pe- la atrofia progressiva e perda da função de segmentos externos de fo- torreceptor. Além disso, morte de fotorreceptores ou perda da função de fotorreceptor resulta em desaferenciação parcial de neurônio de segunda ordem (células bipolares de bastonetes e células horizontais) em pacientes com distrofias retinal, desse modo diminuindo a eficácia total da propagação do sinal elétrico gerado por fotorreceptores. Mu- danças de epitélio pigmentoso secundárias e glial secundários à de- generação de fotorreceptores resultam em mudanças vasculares que levam à isquemia e gliose. Fatores tráficos que são capazes de resga- tar fotorreceptores de células mortas e/ou restaurar a função de fotor- receptores disfuncionais (atróficos ou distróficos) podem representar terapias úteis para o tratamento de tais condições. [004] A progressão destas condições é indicativa de uma perda sequencial das duas classes de fotorreceptores: inicialmente bastone- tes são perdidos como um resultado direto de uma lesão desconheci- da ou genética ou ambiental, que resulta em cegueira noturna e redu- ção no campo visual seguido inevitavelmente por perda de cones que levam à cegueira total. Assim, cones morrem indiretamente uma vez que eles não expressam a lesão primária. [005] Nem todos os genes associados à distrofia retinal já foram identificados, identificação de tais genes tornaria possível diagnosticar tanto a doença quanto identificar as terapias eficazes.

Sumário da Invenção [006] A invenção refere-se em geral à nova família de gene, Fator de Viabilidade de Cone Derivado de Bastonete (Rdcvf). Em um primei- ro aspecto, a invenção provê um polipeptídeo isolado com uma se- quência de aminoácidos como indicada em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Tal polipeptídeo, ou seu fragmento, é encontrado no olho de sofredores de distrofias retinais em um extensão muito menor do que no olho de indivíduos sem distrofia retinal. Fragmentos do polipeptídeo isolado com uma sequência de aminoácidos como indicada em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 compreenderá polipeptídeos compreen- dendo de cerca de 5 a 10 aminoácidos, de preferência de cerca de 10 a cerca de 20 aminoácidos, mais de preferência de cerca de 20 a cer- ca de 100 aminoácidos, e mais de preferência de cerca de 20 a cerca de 50 aminoácidos. De acordo com este aspecto da invenção são pro- vidos um novo polipeptídeo de origem mamífera, e em particular de origem humano ou de camundongo bem como seus derivados, varian- tes e fragmentos biologicamente, diagnosticamente e terapeuticamen- te úteis, variantes e derivados dos fragmentos, e análogos expostos acima. Também dentro do escopo da presente invenção estão polipep- tídeos que são substancialmente similares ao polipeptídeo com a se- quência de aminoácidos como indicada em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID

NO: 4, por exemplo, uma sequência de aminoácidos indicada em SEQ

ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14. [007] Em um segundo aspecto, a invenção provê uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotí- deos como indicada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3. Também dentro do escopo da presente invenção estão ácidos nucléico que são substancialmente similares ao ácido nucléico com a sequência de nu- cleotídeos como indicada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, por exemplo, sequências de nucleotídeos como indicadas em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13.

Em uma concretização preferida, a invenção provê uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste nos polipeptídeos indicados em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID

NO: 12 e SEQ ID NO: 14, por exemplo, nucleotídeos 45-374 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 26-676 de SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 24-353 de SEQ ID NO: 5, nucleotídeos 48-686 de SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 265-570 de SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 300-770 de SEQ ID NO: 11 ou nucleotídeos 331-738 de SEQ ID NO: 13. Em uma concretização preferida, o DNA isolado toma a forma de uma molécula de vetor com- preendendo o DNA como indicada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3. [008] Um terceiro aspecto da presente invenção inclui um método para o diagnóstico de distrofia retinal em um ser humano que inclui a detecção da transcrição diminuída do RNA mensageiro transcrito a partir de DNA que codifica Rdcvfl ou Rdcvf2 no olho de um organismo mamífero, de preferência um ser humano, onde tal transcrição diminu- ída é diagnóstico da doença do organismo com distrofia retinal ou eve- Ihecimento patológico (ARMD). Outra concretização do aspecto de en- saio da invenção provê um método para o diagnóstico de distrofia reti- nal em um organismo mamífero, de preferência um ser humano, que exige a medição da quantidade de um polipeptídeo de Rdcvfl ou Rdcvf2 ou seus fragmentos no olho de um ser humano suspeito de sofrer de uma distrofia retinal, onde a presença de uma quantidade diminuída do polipeptídeo ou seus fragmentos, em relação à quantida- de do polipeptídeo ou seus fragmentos no olho de um indivíduo que não sofre de uma distrofia retinal, é o diagnóstico do sofrimento huma- no de distrofia retinal. [009] De acordo com um outro aspecto da invenção são providos polinucleotídeos anti-sentido que regulam transcrição do gene de Rdcvfl ou Rdcvf2; em uma outra concretização, RNA de filamento du- plo é provido que pode regular a transcrição do gene de Rdcvfl ou Rdcvf2. [0010] Um outro aspecto da invenção provê um processo para a produção dos polipeptídeos, fragmentos de polipeptídeo, variantes e derivados acima mencionados, fragmentos das variantes e derivados, e análogos dos expostos acima. Em uma concretização preferida des- ta aspecto da invenção são providos métodos para a produção dos polipeptídeos de Rdcvfl acima mencionados compreendendo o cultivo de células hospedeiras tendo incorporado ali um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo de codificação de Rdcvfl ou Rdcvf2 exo- genamente derivado sob condições suficientes para expressão de po- lipeptídeos de Rdcvfl ou Rdcvf2 no hospedeiro e então recuperação do polipeptídeo expresso. [0011] De acordo com um outro aspecto da invenção são providos produtos, composições, processos e métodos que utilizam os polipep- tídeos e polinucleotídeos acima mencionados para, inter alia, finalida- des de pesquisa, biológicas, clínicas e terapêuticas. [0012] Em certos aspectos preferidos adicionais da invenção são providos um anticorpo ou um seu fragmento que se liga especifica- mente a um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoáci- dos indicada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ

ID NO: 8, isto é, Rdcvfl, ou SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, isto é, Rdcvf2. Em certos aspectos particularmente preferi- dos a este respeito, os anticorpos são altamente seletivos para poli- peptídeos de Rdcvfl ou Rdcvf2 de mamífero, de preferência camun- dongo e em particular ser humano ou porções de tais polipeptídeos de Rdcvfl ou Rdcvf2. Em um aspecto relacionado, é provido um anticorpo ou seu fragmento que se liga a um fragmento ou porção da sequência de aminoácidos indicada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14. [0013] Em um outro aspecto, métodos de tratamento de uma do- ença em um indivíduo, onde a doença é mediada por ou associada a uma mudança de expressão de gene de Rdcvfl ou Rdcvf2, por exem- plo, uma diminuição na presença de polipeptídeo de Rdcvfl ou Rdcvf2 no olho, é provido pela adminitração de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma proteína de Rdcvfl ou Rdcvf2 como indicada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou uma proteína relaciona- da ou um seu fragmento ou porção com o indivíduo. Também providos são métodos para o diagnóstico de uma doença ou uma condição as- sociada a uma diminuição em expressão de gene de Rdcvfl ou Rdcvf2 ou diminuição na presença de polipeptídeo de Rdcvfl ou Rdcvf2 em um indivíduo, que compreende a utilização de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos indicada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, ou um seu fragmento ou por- ção em um imunoensaio. [0014] Em ainda outro aspecto, a invenção provê células que po- dem ser propagadas in vitro, de preferência células vertebrais, que são capazes de crescimento em cultura de produção de um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos indicada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou seus fragmentos, onde as célu- las contêm sequências de DNA de controle transcritivas que não se- quências de controle transcritivas de Rdcvfl ou Rdcvf2 de camundon- go ou de ser humano, onde as sequências de controle transcritivas controlam a transcrição de DNA que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou seus fragmentos. [0015] Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê um método para a produção de polipeptídeos de Rdcvfl ou Rdcvf2 que compreende o cultivo de uma célula hospedeira tendo incorporado ali um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo de codificação de Rdcvfl ou Rdcvf2 exogenamente derivado sob condições suficientes para expressão de polipeptídeos de Rdcvfl ou Rdcvf2 na célula hos- pedeira, desse modo causando a produção de um polipeptídeo ex- presso, e recuperando o polipeptídeo expresso. [0016] Em outro aspecto da presente invenção são providos méto- dos de ensaio e kits compreendendo os componentes necessários pa- ra detectar, por exemplo, expressão anormal, por exemplo, abaixo do normal de polipeptídeos ou polinucleotídeos de Rdcvfl ou Rdcvf2 ou seus fragmentos em amostra de tecido de corpo derivadas de um pa- ciente, tais kits compreendendo, por exemplo, anticorpos que se ligam a Rdcvfl ou Rdcvf2 ou sondas de oligonucleotídeos que se hibridizam com polinucleotídeos da invenção. Em uma concretização preferida, tais kits também compreendem instruções que detalham os procedi- mentos pelos quais os componentes de kit devem ser usados. [0017] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo de Rdcvfl ou Rdcvf2 para o uso no tratamento de um corpo humano ou animal. Um aspecto relacionado refere-se ao uso de um polipeptí- deo de Rdcvfl ou Rdcvf2 ou seu fragmento, a nucleotídeo que codifica Rdcvfl ou Rdcvf2 ou um seu fragmento, ou a anticorpo que se liga a Rdcvfl ou Rdcvf2 ou um seu fragmento na fabricação de um medica- mento para tratar uma distrofia retinal. [0018] Em outro aspecto, a invenção provê um agente retinoprote- tor compreendendo um polipeptídeo selecionado do grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, e, opcionalmente, um veículo far- maceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado à invenção provê composições farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo de Rdcvfl ou Rdcvf2 ou seu fragmento, nucleotídeo que codifica Rdcvfl ou Rdcvf2 ou um seu fragmento, para o tratamento de uma distrofia retinal. Em um outro aspecto relacionado, a invenção provê uma com- posição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um polipeptídeo selecionado do grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 e um veículo farmaceuticamente aceitá- vel. [0019] Em um aspecto relacionado, a invenção provê um método para o tratamento de distrofia retinal compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo sele- cionado do grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 e um veículo farmaceuticamente aceitável, a um indivíduo que necessi- ta. [0020] Em outro aspecto, a invenção refere-se a métodos para a identificação de moléculas que podem se ligar a Rdcvfl ou Rdcvf2 e/ou modular a atividade de Rdcvfl ou Rdcvf2 ou moléculas que po- dem se ligar à sequências de ácidos nucléicos que modulam a tanscri- ção ou tradução de Rdcvfl ou Rdcvf2. Tais métodos são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. n°s 5.541.070; 5.567.317; 5.593.853; 5.670.326; 5.679.582; 5.856.083; 5.858.657; 5.866.341; 5876.946; 5.989.814; 6.010.861; 6.020.141; 6.030.779; e 6.043024, todas as quais são incorporadas por referência aqui em sua totalidade. Molécu- las identificadas por tais métodos também caem dentro do escopo da presente invenção. [0021] Em um outro aspecto a invenção provê um método de pro- ver células fotor receptor as para a implantação em que as células fotor- receptoras são cultivadas juntamente com Rdcvfl ou Rdcvf2. [0022] Outros objetivos, características e aspectos da presente invenção se tornarão evidentes por aqueles de habilidade a partir da seguintes descrição. Deve ser entendido, no entanto, que a seguinte descrição e os exemplos específicos, enquanto indicando concretiza- ções preferidas da invenção, serão dados apenas a título de ilustra- ção. Várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção descrita se tornarão evidente para aqueles versados na téc- nica a partir da leitura da seguinte descrição e a partir da leitura de ou- tras partes da presente descrição.

Breve Descrição dos Desenhos [0023] A figura 1: sequencia de nucleotídeos de Rdcvfl de ca- mundongo da clonagem de expressão e sequencia de aminoácidos de Rdcvfl. [0024] A figura 2: sequencia de nucleotídeos de Rdcvfl de ca- mundongo e sequencia de aminoácidos. [0025] A figura 3: RdcvflL humano e sequencia de aminoácidos de Rdcvfl humana. [0026] A figura 4: sequencia de nucleotídeos de Rdcvfl L humana, sequencia de aminoácidos de RdcvflL humana. [0027] Figura 5: sequencia de nucleotídeos de Rdcvf2 de camun- dongo e: aminoácidos de Rdcvf2 de camundongo. [0028] Figura 6: sequencia de nucleotídeos de Rdcvf2L de camun- dongo e aminoácido de Rdcvf2L [0029] A figura 7: sequencia de nucleotídeos de Rdcvf2 humana, e sequencia de aminoácidos de Rdcvf2 humana. [0030] A figura 8: mostra alinhamentos de aminoácidos das formas curtas de Rdcvf: (SEQ ID NO; 2, 6, 10 e 14), e das formas longas de Rdcvf: SEQ ID NO: 4, 8, 12 e 14). [0031] A figura 9: mostra os iniciadores de GST-Rdcvf 1. [0032] Afigura 10: alinhamento múltiplo de Rdcvfl (SEG ID NO: 2/ Rdcvf2 (SEQ ID NO: 10).

[0033] A figura 11; comparação de Rdcvf2 de camundongo (SEG ID NO: 10) e de ser humano (SEG ID NO: 36). [0034] A figura 12: alinhamento múltiplo de Rdcvf2 (SEG ID NO: 37) de camundongo com clones de EST be552141 (SEG ID NO: 20), bi517442 (SEQ ID NO: 21), bg707818 (SEQ ID NO: 22) e 51603812 (SEQ ID NO: 23). [0035] A figura 13: alinhamento múltiplo de Rdcvfl (SEG ID NO: 38} com clones de EST bg 299078 (SEQ ID NO; 15), ai716631 (SEQ ID NO: 16), bg294111 (SEQ ID NO: 17), be108041 (SEQ ID NO: 18) e bg395l78 (SEQ ID NO: 19). [0036] A figura 14: sequência de EST bg299078 (SEQ ID NO: 15) corrigida para emparelhar Rdcvfl [0037] A figura 15: sequência de EST bg 294111 (SEQ ID NO: 17) corrigida para emparelhar RdcvflL [0038] A figura 16: análise de RT-PCR em tempo real da expres- são de arrestina de bastonete (A) e RdCSFI (B) em cinco semanas retina C57BL/6@N 5 semanas (cinza) e C3H/HE@N (preto). [0039] A figura 17: análise de RT-PC mostrando que Rdcvf2 é ex- presso em um modo dependente de bastonete e é expresso em outra parte do SNC. [0040] A figura 18: análise de PCR mostrando que RdCVFI é ex- presso de um modo dependente de bastonete.

Descricão Detalhada da Invenção [0041] Todos os pedidos de patentes, patentes e referências literá- rias citadas aqui são incorporadas neste relatório por referência em sua totalidade. [0042] Na prática da presente invenção, muitas técnicas convencí- onais em biologia molecular, microbiologia e dna recombinante são usadas. Estas técnica são bem-conhecidas e são explicadas, por exemplo, em current protocols in molecular biology, volumes i, ii, and iii, 1997 (f. m. ausubel ed.); sambrook et al., 1989, molecular cloning: a laboratory manual, second edition, cold spring harbor laboratory press, cold spring harbor, n.y.; dna cloning: a practical approach, volumes i and ii, 1985 (d. n. glover ed.); oligonucleotide synthesis, 1984 (m. I. gait ed.); nucleic acid hybridization, 1985, (hames and higgins); transcrip- tion and translation, 1984 (hames and higgins eds.); animal cell culture, 1986 (r. i. freshney ed.); immobilized cells and enzymes, 1986 (irl press); perbal, 1984, a practical guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and Μ. P. Cabs eds., Cold Spring Harbor Laboratory); and Methods in Enzymology Vol. 154 e Vol. 155 (Wu and Grossman, e Wu, eds., respectivamente). [0043] Como usado aqui, "gene diferencialmente expresso" refere- se a (a) um gene contendo pelo menos uma das sequências de DNA descritas aqui (por exemplo, como mostrado na fig 1 e SEQ ID NO: 1 ou como mostrado na figura 2 e SEQ ID NO: 3); (b) qualquer sequên- cia de DNA que codifica a sequência de aminoácidos codificada pelas sequências de DNA descritas aqui (por exemplo, como mostrada na figura 1 e SEQ ID NO: 2 ou como mostrada na figura 2 e SEQ ID NO: 4); ou (c) qualquer sequência de DNA que é substancialmente similar às sequências de codificação descritas aqui. [0044] Em seu sentido mais amplo, o termo "substancialmente si- milar", quando usado aqui com relação a uma sequência de nucleotí- deos, significa uma sequência de nucleotídeos que corresponde a uma sequência de nucleotídeos de referência, em que a sequência corres- pondente codifica um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma estrutura e função que o polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de referência, por exemplo, onde apenas mudanças nos aminoácidos não afetam a função de polipeptídeo ocorrer. Desejavel- mente a sequência de nucleotídeos substancialmente similar codifica o polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de referência. A percentagem de identidade entre a sequência de nucleotídeos subs- tancialmente similar e a sequência de nucleotídeos de referência é pe- lo menos de 90%, mais de preferência pelo menos de 95%, ainda mais de preferência pelo menos de 99%. Comparações de sequência são realizadas usando-se um algoritmo de alinhamento de sequência Smith-Waterman (ver, por exemplo, Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman &

Hall. Londres: 1995. ISBN 0-412-99391-0, ou em http://www- hto.usc.edu/software/seqaln/index.html). O programa localS, versão 1.16, é usado com os seguintes parâmetros: emparelhar: 1, penalida- de de mal emparelhamento: 0,33, penalidade de lacuna aberta: 2, pe- nalidade de lacuna prolongada: 2. Uma sequência de ncuelotídeos "substancialmente similar" a sequência de nucleotídeos de referência hibridiza para sequência de nucleotídeos de referência em 7% de sul- fato de dodecila de sódio (SDS), NaP04 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 C o com lavagem com 2X SSC, 0,1% de SDS a 50 C, mais desejavelmen- te em 7% de sulfato de dodecila de sódio (SDS), NaP04 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 C com lavagem em 1X SSC, 0,1% de SDS a 50 C, mais desejavelmente ainda em 7% de sulfato de dodecila de sódio (SDS), NaP04 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 C com lavagem em 0,5X SCC, 0,1% de SDS a 50 C, de preferência em 7% de sulfato de dode- cila de sódio (SDS), NaP04 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 C com lava- gem em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 50 C, mais de preferência em 7% de sulfato de dodecila de sódio (SDS), NaP04 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 65 C, mesmo as- sim ainda codifica um produto de gene funcionalmente equivalente. [0045] Estes genes diferencialmente expressos descritos aqui são expressos em tecido de olho e em particular são produzidos em célu- las de bastonetes, no entanto, em um ser humano afligido com uma distrofia retinal tais como retinose pigmentosa, degeneração macular relacionada com a idade, síndrome de Bardet-Biedel, síndrome de Bassen-kornzweig, doença de Best, coroidema, atrofia do giro, amou- rose congêntica, síndrome de Refsun, doença de Stargardt e síndrome de Usher é produzido em quantidades diminuídas em relação, isto é, a uma extensão menor do que nos tecidos correspondentes de seres humanos os quais não sofrem de distrofia retinal. RNA mensageiro transcrito a partir dos genes diferencialmente expressos, e proteína traduzida a partir de tal mRNA, está presente em tecidos de bastonete e/ou associada a tais tecidos em uma quantiade de pelo menos cerca de metade, de preferência pelo menos cerca de cinco vezes, mais de preferência pelo menos uma quantidade dez vezes, mais de preferên- cia pelo menos cerca de 100 vezes menos do que os níveis de mRNA e proteína encontrados em tecidos correspondentes em seres huma- nos os quais não sofrem de um distrofia retinal. Tais tanscrições dimi- nuídas de mRNA de Rdcvfl ou Rdcvf2 é chamada aqui de "transcrição diminuída". [0046] Uma "célula hospedeira", como usada aqui, refere-se a uma célula procariótica ou eucariótica que contém DNA heterólogo que foi introduzida para dentro da célula por qualquer meio, por exem- plo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção, transformação, infecção viral, e semelhantes. [0047] "Heterólogo" como usado aqui significa "de diferente origem natural" ou representa um estado não-natural. Por exemplo, se uma célula hospedeira for transformada com um DNA ou gene derivado de um outro organismo, particularmente de uma outra espécie, aquele gene é heterólogo com relação àquela célula hosepedeira e também com relação a descendentes da célula hospedeira que porta aquele gene. Similarmente, heterólogo refere-se a uma sequência de nucleo- tídeos derivada do e inserida no mesmo tipo de célula original, natural, mas que está presente em um estado não-natural, por exemplo, um diferente número de cópias, ou sob o controle de diferentes elementos reguladores. [0048] Uma molécula de vetor é uma molécula de ácido nucléico para dentro da qual o ácido nucléico heterólogo pode ser inserido que pode então ser introduzido para dentro de uma célula hospedeira apropriada. Vetores de preferência têm uma ou mais origens de repli- cação, e um ou mais sítios em que o DNA recombinante pode ser in- serido. Vetores freqüentemente têm meios convenientes pelos quais células com vetores podem ser selecionadas daquelas sem, por exemplo, eles codificam agentes de resistência à droga. Vetores co- muns incluem plasmídios, genomas virais e "cromossomas artificiais" (principalmente em levedura e bactérias). [0049] "Plasmídios" em geral são designados aqui por um p mi- núsculo precedido e/ou seguido por letras maiúsculas e/ou números, de acordo com as convenções de nome padrão que são familiares àqueles na técnica. Plasmídios de partida descritos aqui são ou dispo- nível comercialmente, publicamente em uma base não-restrita, ou po- de ser construído a partir dos plasmídios disponíveis por aplicações rotineira de procedimentos publicados bem-conhecidos. Muitos plas- mídios e outros vetores de expressão e de clonagem que podem ser usados de acordo com a presente invenção são bem-conhecidos e estão prontamente disponíveis para aqueles versados na técnica.

Além disso, aqueles versados prontamente podem construir qualquer número de outros plasmídios adequados para o uso na invenção. As propriedades, construção e uso de tais plasmídios, bem como outros vetores, na presente invenção estarão prontamente evidentes para aqueles versados a partir da presente descrição. [0050] O termo "isolado" significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for de ocor- rência natual). Por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo de ocorrência natural presentes em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de alguns ou a tota- lidade dos materiais coexistentes no sistema natural, é isolado, ainda que subseqüentemente reintroduzido para dentro do sistema natural.

Tais polinucleotídeos poderiam ser parte de um vetor e/ou tais polinu- cleotídeos ou polipeptídeos poderia ser parte de uma composição, e ainda serem isolados naquele tal vetor ou composição não é parte de seu ambiente natural. [0051] Como usado aqui, o termo "sequência de controle transcri- tivo" refere-se à sequências de DNA, tais como sequências iniciado- ras, sequências intensificadoras, e sequências promotoras, que indu- zem, reprimem ou de outro modo controlam a transcrição de sequên- cias de nucleotídeos codificadoras de proteína à qual elas são opera- velmente ligadas. [0052] Como usado aqui, "sequências de controle transcritivas de RdcvfT' ou "sequências de controle transcritivas Rdcvf2" são qualquer uma daquelas sequências de controle transcritivas normalmente en- contradas associadas a um gene de Rdcvfl ou Rdcvf2 de mamífero, de preferência com o gene de Rdcvf2 como encontrado no genoma humano ou de camundongo. [0053] Como usado aqui, "sequência de controle transcritiva não- humana" é qualquer sequência de controle transcritiva não encontrada no genoma humano. [0054] O termo "polipeptídeo" é usado aqui intercambeavelmente com os termos "polipeptídeos" e "proteína(s)". [0055] Como usado aqui, um "derivado químico" de um polipeptí- deo da invenção é um polipeptídeo da invenção que contém porções químicas adicionais não normalmente uma parte da molécula. Tais porções podem aperfeiçoar a solubilidade, absorção biológica, semi- vida da molécula, etc.. As porções podem alternativamente diminuir a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar qualquer efeito colateral indesejável da molécula, etc.. Porções capazes de mediar tais efeitos são descritas, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa (1980). [0056] Como usado aqui, um "agente neuroprotetor" é um com- posto que evita ou protege células neuronais contra degeneração. Um "agente retinoprotetor" é um composto que evita ou protege células retinais contra degeneração. [0057] A invenção inclui moléculas de ácido nucléico, de preferên- cia moléculas de DNA, tais como (1) um isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos como indicada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, (2) moléculas de ácido nucléico isoladas que compreendem sequência de ácidos nucléicos que hibridizam sob altas condições ri- gorosas para DNA isolado como indicado em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, e (3) sequência de nucleotídeos que hibridizam para (1) ou (2) acima. Tais condições de hibridização podem ser altamente rigoro- sas ou menos altamente rigorosas, como descritas acima. Em casos, em que as moléculas de ácido nucléico são desoxioligonucleotídeos ("oligos"), condições altamente rigorosas podem fazer referência, por o exemplo, à lavagem em 6X SSC/0,05% de pirofosfato de sódio a 37 C o o (para oligos de 14 bases), 48 C (para oligos de 17 bases), 55 C (para o oligos de 20 bases), e 60 C (para oligos de 23 bases). Faixas adequa- das de tais condições rigorosas para ácidos nucléicos de composições variávies são descritas em Krause e Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200:546-556 além de Maniatis e outros, citados acima. [0058] Estas moléculas de ácido nucléico podem agir como molé- culas anti-sentido de gene alvo, úteis, por exemplo, em regulação de gene alvo /e ou como iniciadores anti-sentido nas reações de amplia- ção de sequência de ácidos nucléicos de gene alvo. Além disso, tais sequências podem ser usadas como parte de sequências de hélice tripla e/ou ribozima , também úteis são regulação de gene alvo. Ainda outras, tais moléculas podem ser usadas como componentes de mé- todos de diagnósticos pelo que a presença de alelo causador de doen- ça de Rdcvfl ou Rdcvf2, pode ser detectada. [0059] A invenção também inclui (a) vetores que contêm qualquer uma das sequências de codificação acima mencionadas (isto é, senti- do) e/ou seus complementos (isto é, anti-sentido); (b) vetor de expres- são que contém qualquer uma das sequências de codificação expos- tas acima operativamente associadas com um elemento regulador que dirige a expressão das sequências de codificação; e (c) células hospe- deiras geneticamente engenheiradas que contêm qualquer uma das sequências expostas acima operativamente associadas com um ele- mento regulador que dirige a expressão das sequências de codificação na célula hospedeira. Como usado aqui, elementos reguladores inclu- em mas não são limitados a promotores induzíveis e não-induzíveis, intensificadores, operadores e outros elementos conhecidos por aque- les versados na técnica que dirigem e regulam expressão. [0060] A invenção inclui fragmentos de qualquer uma das sequên- cias de ácidos nucléicos descrutas aqui. Fragmentos do gene de Rdcvfl ou Rdcvf2 de comprimento total podem ser usados como uma sonda de hibridização para uma biblioteca de cDNA para isolar o gene de comprimento total e isolar outros genes que têm uma alta similari- dade de sequência em relação ao gene Rdcvfl ou Rdcvf2 e à ativida- de biológica similar. Sondas deste tipo de preferência têm pelo menos cerca de 30 bases e podem conter, por exemplo, de cerca de 30 a cerca de 50 bases, cerca de 50 bases a cerca de 100 bases, cerca de 100 a cerca de 200 bases, ou mais do que 200 bases (por exemplo, 300). A sonda pode também ser usada para identificar um clone de cDNA que corresponde a um transcrito de comprimento total e um clo- ne genômico ou clones que contêm o gene de Rdcvfl ou Rdcvf2 com- pleto incluindo íntrons, éxons, regiões reguladoras e promotoras. Um exemplo de uma varredura compreende o isolamento da região de co- dificação do gene de Rdcvfl ou Rdcvf2 por uso da sequência de DNA conhecida para sintetizar uma sonda de oligonucleotídeo ou iniciador aleatório da sequência isolada descrita nas figuras de 1 a 8. Oligonu- cleotídeos rotulados tendo uma sequência complementar àquele gene da presente invenção são usados para varrer uma biblioteca de cDNA humano, DNA genômico para determinar a quais clones individuais da biblioteca a sonda hibridiza. [0061] Além das sequências de genes descritas acima, ortólogos de tais sequências, como podem, por exemplo, estar presentes em outras espécies, podem ser identificados e podem ser prontamente isolados, sem experimentação imprópria, por técnicas biológicas mole- culares bem-conhecidas na técnica. Além disso, podem existir genes em outros locais genéticos dentro do genoma que codificam proteínas que têm homologia extensa (homólogos) a um ou mais domínios de tais produtos de genes. Estes genes podem também ser identificados via técnicas similares. Exemplos de ortólogos ou homólogos são pro- vidos nas figuras 8, 10, 11, 12 ou 13. [0062] Por exemplo, sequências de genes expressas isoladas po- dem ser rotuladas e usadas para varrer uma biblioteca de cDNA cons- truída a partir de mRNA obtido a partir do organismo de interesse.

Condições de hibridização serão de um rigor inferior quando a bibliote- ca de cDNA foi derivada de um organismo diferente do tipo de orga- nismo do qual a sequência rotulada foi derivada. Alternativamente, o fragmento rotulado pode ser usado para varrer uma biblioteca genômi- ca derivada do organismo de interesse, novamente, usando-se, condi- ções rigorosas aproximadamente baixas. Tais baixas condições rigo- rosas serão bem-conhecidas por aqueles versados na técnica, e varia- rão presumivelmente dependendo da filogênia dos organismos especí- ficos a partir dos quais a biblioteca e as sequências rotuladas são deri- vadas. Para orientação com relação a tais condições ver, por exemplo, Sambrook e outros, citados acima. [0063] Além disso, sequência de tipo de gene expresso anterior- mente desconhecida pode ser isolada por realização de PCR usando- se dois conjuntos de iniciadores de oligonucleotídeos degenerados projetadas com base em sequências de aminoácidos dentro do gene de interesse. O modelo para a reação pode ser cDNA obtido por tran- crição reversa de mRNA preparado a partir de tecido ou linhagens de células humanas ou não-humanas conhecidos ou suspeitos de ex- pressar variantes homólogas ou de união. [0064] O produto de PCR pode ser subclonado e seqüenciado pa- ra assegurar que as sequências ampliadas representem as sequên- cias de uma sequência de ácidos nucléicos de tipo gene expresso. O fragmento de PCR pode então ser usado para isolar um clone de cDNA de comprimento total por uma variedade de métodos. Por exemplo, o fragmento ampliado pode ser rotulado e usado para varrer uma biblioteca de cDNA de bacteriófago. Alternativamente, o fragmen- to rotulado pode ser usado para varrer uma biblioteca genômica. [0065] Tecnologia de PCR pode também ser utilizada para isolar sequências de cDNA de comprimento total. Por exemplo, RNA pode ser isolado, seguindo procedimentos padrão, de uma fonte de tecido ou celular apropriada. Uma reação de transcrição reversa pode ser realizada sobre o RNA usando-se um iniciador de oligonucleotídeo es- pecífico para a maioria das extremidades 5' do fragmento ampliado para o iniciador da síntese de primeiro filamento. O híbrido de RNA/DNA resultante pode então ser "seguir imediatamente" com gua- ninas usando-se uma reação de transferase terminal padrão, o híbrido pode ser digerido com RNAase H, e síntese de segundo filamento po- de então ser inicializada com um iniciador poli-C. Assim, sequências de cDNA a montante do fragmento ampliado podem facilmente ser iso- ladas. Para uma revisão das estratégias de clonagem que podem ser usadas, ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, supra. [0066] Em casos onde o gene diferencialmente expresso identifi- cado é o gene normal ou de tipo selvagem, este gene pode ser usado para isolar alelos mutantes do gene. Tal isolamento é preferível em processos e distúrbios que são conhecidos como ou suspeitos de ter uma base genética. Alelos mutantes podem ser isolados de indivíduos ou conhecidos como ou suspeitos de ter um genótipo que contribui pa- ra sintomas de doença. Alelos mutantes e produtos de alelo mutante podem então ser utilizados nos sistemas de ensaio de diagnósticos descritos acima. [0067] Um cDNA do gene mutante pode ser isolado, por exemplo, por uso de RT-PCR, uma técnica que é bem-conhecida por aqueles versados na técnica. Neste caso, o primeiro filamento de cDNA pode ser sintetizado por hibridização de um oligonucleotídeo oligo-dT (ou hexâmeros aleatórios) para mRNA isolado do tecido conhecido como ou suspeito de ser expresso em um indivíduo que porta putativamente o alelo mutante, e por extensão do novo filamento com transcriptase reversa. O segundo filamento do cDNA é então sintetizado usando-se um oligonucleotídeo que hibridiza especificamente a extremidade 5' do gene normal (ou por qualquer outro meio). Usando-se dois iniciadores, o produto é então ampliado via PCR, é clonado em um vetor adequa- do, e é submetido à análise de sequência de DNA através de métodos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Por comparação da sequência de DNA do gene mutante com aquele do gene normal, a(s) mutação(ções) para a perda ou alteração de função do produto gene mutante pode(m) ser determinada(s).

[0068] Alternativamente, uma biblioteca genômica ou de cDNA pode ser construída e varrida usando-se DNA ou RNA, a partir de um tecido conhecido como ou suspeito de expressar o gene de interesse em um indivíduo suspeito de portar o alelo mutante. O gene normal ou qualquer seu fragmento adequado pode então ser rotulado e usado como uma sonda para identificar o alelo mutante correspondente na biblioteca. O clone contendo este gene pode então ser purificado atra- vés de métodos rotineiramente praticados na técnica, e submetidos à análise de sequência como descrito acima. [0069] Adicionalmente, uma biblioteca de expressão pode ser con- truída utilizando-se DNA isolado de um cDNA sintetizado a partir de um tecido conhecido como ou suspeito de expressar o gene de inte- resse em um indivíduo suspeito de portar o alelo mutante. Deste mo- do, produtos de gene produzidos pelo tecido putativamente mutante podem ser expressos e varridos usando-se técnicas de varredura de anticorpo padrão em combinação com anticorpos incitados contra o produto de gene normal, como descrito abaixo. (Para técnicas de var- redura, ver, por exemplo, Harlow, E. e Lane, eds., 1988, "Antibodies: A

Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor).

Em casos onde a mutação resulta em um produto de gene expresso com função alterada (por exemplo, como um resultado de uma muta- ção no sentido inverso), um conjunto policlonal de anticorpos devem provavelmente reagir cruzadamente com o produto de gene mutante.

Clones de biblioteca detectados via sua reação com tais anticorpos rotulados podem ser purificados e submetidos à análise de sequência como descrito acima. [0070] Produtos de gene diferencialmente expressos incluem aquelas proteínas codificadas pelas sequências de nucleotídeos indi- cadas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13, em particular, um polinucleotídeo que é ou inclui a sequência de aminoácidos indicada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, ou seus fragmentos. [0071] Além disso, produtos de gene expressos podem incluir pro- teínas que representam produtos gene funcionalmente equivalentes.

Tal produto de gene equivalente pode conter deleções, adições ou substituições de resíduos de aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos codificada pelas sequências de genes diferencialmente expressos descritos, acima, mas que resultam em uma mudança si- lenciosa, assim produzindo um produto de gene diferencialmente ex- presso funcionalmente equivalente (polimorfismos). Substituições de aminoácido podem ser feitas com base em similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou natureza anti- pática dos resíduos envolvidos e em comparação com sequência de aminoácidos de outras espécies. [0072] Por exemplo, aminoácidos não-polares (hidrofóbicos) inclu- em alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treoni- na, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos positiva- mente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e ami- noácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. "Funcionalmente equivalente", como utilizado aqui, pode referir-se a uma proteína ou um polipeptídeo capaz de exibir uma atividade in vivo ou in vitro substancialmente similar como os produtos de genes diferencialmente expressos endógenos codificados pelas sequências de genes diferencialmente expressas descritas acima. "Funcionalmente equivalente" pode também referir-se à proteínas ou polipeptídeos capazes de interagir com outras moléculas celulares ou extracelulares de um modo similar ao modo em que o faria a porção correspondente do produto de gene diferencialmente expresso endó- geno. Por exemplo, um peptídeo de "funcionalidade equivalente" seria capaz, em um imunoensaio, de diminuir a ligação de um anticorpo ao peptídeo correspondente (isto é, cuja sequência de aminoácidos pep- tídica foi modificada para se conseguir o peptídeo "funcionalmente equivalente") da proteína endógena, ou para a própria proteína endó- gena, onde o anticorpo foi incitado contra o peptídeo correspondente da proteína endógena. Uma concentração equimolar do peptídeo fun- cionalmente equivalente diminuirá a ligação supracitada do peptídeo correspodente por pelo menos cerca de 5%, de preferência entre cer- ca de 5% e 10%, mais de preferência entre cerca de 10% e 25%, ain- da mais de preferência entre cerca de 25% e 50, e com maior prefe- rência entre cerca de 40% e 50%. [0073] Os produtos de genes diferencialmente expressos podem ser produzidos por tecnologia de DNA recombinante usando-se técni- cas bem-conhecidas na técnica. Assim, métodos para a preparação dos peptídeos e polipeptídeos de genes diferencialmente expressos da invenção por expressão de ácido nucléico que codifica sequências de genes diferencialmente expressos como descritos aqui. Métodos que são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usa- dos para construir vetores de expressão contendo sequências de codi- ficação de proteína de gene expresso e sinais de controle transcriti- vos/traducionais. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinantes in vitro, técnicas sintéticas e recombinação in vi- vo/recombinação genética. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook e outros, 1989, supra, e Ausubel e outros, 1989, supra. Al- ternativamente, RNA ou cDNA capaz de codificar sequências de prote- ínas de genes expressos podem ser quimicamente sintetizadas usan- do-se, por exemplo, sintetizadores. Ver, por exemplo, as técnicas des- critas em "Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M.J. ed., IRL Press, Oxford, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. [0074] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hos- pedeiro pode ser utilizada para expressar as sequências de genes di- ferencialmente expressos da invenção. Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências de codifi- cação de interesse podem ser produzidas e subseqüentemente purifi- cadas, mas também representam células que podem, quando trans- formadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nu- cleotídeo, expressar a proteína de gene diferencialmente expresso da invenção in situ. Estes incluem mas não são limitados a microorganis- mos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transforma- das com vetores de expressão de DNA de cosmídio, DNA de plasmí- dio ou DNA de bacteriófago recombinantes contendo as sequências de codificação de proteína de gene diferencialmente expresso; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinantes contendo as sequências de co- dificação de proteína de gene diferencialmente expresso; sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recom- binantes (por exemplo, baculovírus) contendo as sequências de codifi- cação de proteína de gene diferencialmente expresso; sistemas de célula de planta infectados com vetores de expressão de vírus recom- binantes(por exemplo, vírus de mosaico de couve-flor, CaMV; vírus de mosaico de tabaco, TMV) ou transformados com vetores de transfor- mação de plasmídios recombinantes (por exemplo, plasmídio de Ti) contendo as sequências de codificação de proteína de gene diferenci- almente expresso; ou sistemas de célula de mamífero (por exemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que incluem constructos de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7,5K de vírus de vacínia; promotor de gene precoce de Citomegaloví- rus). [0075] Expressão de Rdcvfl ou Rdcvf2 por uma célula de um gene de Rdcvfl ou Rdcvf2 que é nativo para uma célula pode também ser realizada. Métodos para tal expressão são detalhados, por exemplo, nas patentes U.S. n°s 5.641.670; 5.733.761; 5.968.502; e 5.994.127, todas as quais são expressamente incorporadas por referência aqui em sua totalidade. Células que foram induzidas para expressar Rdcvfl ou Rdcvf2 pelos métodos de qualquer uma das patentes U.S. n°s 5.641.670; 5.733.761; 5.968.502 e 5.994.127 podem ser implatadas em um tecido desejado em um animal vivo a fim de aumentar a con- centração local de Rdcvfl ou Rdcvf2 no tecido. [0076] Sistemas bacterianos, numerosos vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso preten- dido para a proteína de gene diferencialmente expresso sendo expres- sa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal proteína deve ser produzida, para a geração de anticorpos ou para varrer bibliotecas de peptídeo, por exemplo, vetores que dirigem a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são prontamente purifica- dos podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, mas não são limita- dos, ao vetor de expressão pUR278 de E. coli (Ruther e outros, 1983, EMBO J. 2:1791), em que a sequência de codificação de proteína de gene diferencialmente expresso pode estar ligada individualmente no vetor em quadro com a região de codificação de lac Z de modo que uma proteína de fusão seja produzida; vetores de pIN (Inouye & Inou- ye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); e semelhantes. Vetores PGEX podem também ser usados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em ge- ral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purifi- cadas de células lisadas por adsorção em contas de glutationa- asefagarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores PGEX são projetados para incluir trombina ou sítios de diva- gem de protease de fator Xa de modo que a proteína de gene alvo clonada pode ser liberada a partir da porção de GST por uso destas endopeptidases. [0077] Regiões promotoras podem ser selecionadas de qualquer gene desejado usando-se vetores que contêm uma unidade transcriti- va repórter que carece de uma região promotora, tal como uma trans- ferase de cloranfenicol acetila ("cat") ou unidade transcritiva de lucife- rase, a jusante de sítio ou sítios de restrição para a introdução de um fragmento de promotor candidato; isto é, um fragmento que pode con- ter um promotor. Como é bem-conhecido, a introdução para dentro do vetor de um fragmento contendo promotor no sítio de restrição a mon- tante do gene de luciferase ou cat provoca produção de atividade de luciferase ou CAT, que pode ser detectada por ensaios de CAT padrão ou luminometria. Vetores adequados para este fim são bem- conhecidos e prontamente disponíveis. Três tais vetores são pKK232- 8, -pCM7 e pGL3 (Promega, E1751, Genebank Ass no. u47295). As- sim, promotores para expressão de polinucleotídeos da presente in- venção incluem promotores não apenas bem-conhecidos e pronta- mente disponíveis, mas também promotores que prontamente podem ser obtidos pela técnica exposta acima, usando-se um ensaio de gene repórter. [0078] Entre promotores bacterianos conhecidos adequados para a expressão de polinucleotídeos e polipeptídeos de acordo com a pre- sente invenção são os promotores de lacl e LacZ de E. coli, os promo- tores T3 e T7, os promotres T5 tac, os promotores lambda PR, PL e o promotor trp. Entre promotores conhecidos eucarióticos adequados a este respeito são o promotor precoce imediato de CMV, o promotor de cinase de timidina de HSV, os promotores de SV40 tardio e precoce, os promotores de LTRs retrovirais, tais como aqueles do vírus de sar- coma de Rous ("RSV"), e promotores de metalotioneína, tal como o promotor de metalotioneína-l. [0079] Em um sistema de inseto, vírus de poliedrose nuclear Auto- grafa califórnica (AcNPV) é um dos vários sistemas de inseto que po- dem ser usados como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus se desenvolve em células Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de gene diferencialmente expresso pode ser clonada indi- vidualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene poliedri- na) do vírus e colocada sob o controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina). Inserção com sucesso de sequên- cia de codificação de gene diferencialmente expresso resultará em ina- tivação do gene de poliedrina e produção de vírus recombinante não inoculado (isto é, vírus que carece do revestimento proteináceo codifi- cado pelo gene de poliedrina). Estes vírus recombinantes são então usados para infectar células de Spodoptera frugiperda em que o gene inserido é expresso (por exemplo, ver Smith e outros, 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, patente U.S. no. 4.215.051). [0080] Em células hospedeiras de mamífero, numerosos sistemas de expressão de base viral podem se utilizados. Em casos, onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a sequência de co- dificação de gene diferencialmente expresso de interesse pode ser li- gada a um complexo de controle transcritivo/tradução, por exemplo, a sequência de líder tripartido ou promotor tardio. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. Inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará em um vírus recombi- nante que é viável e capaz de expressar proteína de gene diferencial- mente expresso em hospedeiros infectados, (por exemplo, Ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3655-3659). Sinais de iniciação específicos podem também ser necessários para tradução eficiente de sequências de codificação de gene diferencialmente ex- presso. Estes sinais incluem o códon de iniciação de ATG e sequên- cias adjacentes. Em casos onde um gene diferencialmente expresso inteiro, incluindo seu próprio códon de iniciação e sequências adjacen- tes, é inserido no vetor de expressão apropriado, nenhum sinal de con- trole de traducional adicional pode ser necessário. No entanto, em ca- sos onde apenas uma porção da sequência de codificação de gene diferencialmente expresso é inserida, sinais de controle traducionais exógenos, incluindo, talvez, o códon de iniciação de ATG, deve ser provido. Além do mais, o códon de iniciação deve estar em fase com o quadro de leitura da sequência de codificação desejada para assegu- rar tradução do inserto inteiro. Estes sinais de controle traducionais exógenos (sequência de Kozack) e códons de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiên- cia de expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos aumentadores de transcrição apropriados, terminadores de transcri- ção, etc. (ver Bittner e outros, 1987, Methods in Enzymology. 153:516- 344). [0081] Seleção de promotores e vetores apropriados para expres- são em uma célula hospedeira é um procedimento bem-conhecido e as técnicas necessárias para construção de vetor de expressão, intro- dução do vetor para dentro do hospedeiro e expressão no hospedeiro per se são habilidades rotineiras na técnica. [0082] Em geral, vetores de expressão recombinantes incluirão origens de replicação, um promotor derivado de um gene altamente expresso para dirigir transcrição de uma sequência estrutural a jusan- te, e um marcador selecionável para permitir o isolamento de células contendo vetor depois da exposição ao vetor. [0083] Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser esco- lhida que modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto de gene na forma específica desejada. Tais modi- ficações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, divagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a fun- ção da proteína. Células hospedeiras diferentes têm características e mecanismos específicos para o processamento pós-traducionais e modificação de proteínas. Linhas de células apropriadas e sistemas de hospedeiro podem ser escolhidos para assegurar o processamento e modificação correta da proteína estranha expressa. Para este fim, cé- lulas hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento adequado do transcrito primário, glicosilação e fosfori- lação do produto de gene podem ser usadas. Tais células hospedeiras de mamífero incluem mas não são limitadas a CHO, VERO, BHK, He- La, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 etc. [0084] Para produção de alto rendimento, de longo prazo de prote- ína recombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhas de células que estavelmente expressam a proteína diferencialmente expressa podem ser engenheiradas. Ao invés do uso de vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, células hospedei- ras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, aumenta- dor, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Seguindo a introdução do DNA es- tranho, células engenheiradas podem ser deixadas se desenvolver por 1-2 dias em um meio enriquecido, e então são mudadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídio recombinante confere resistência à seleção e permite células estavelmente integrem o plas- mídio em seus cromossomas e se desenvolverem para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos nas linhas de célu- las. Este método pode vantajosamente ser usado para engenheirar linhas de células que expressam a proteína diferencialmente expres- sada. Tais linhas de células engenheiradas podem ser particularmente úteis na triagem e na avaliação dos compostos que afetam a atividade endógena da proteína diferencialmente expressa. Estas linhas de célu- las estáveis podem ser usadas como um modo de terapia celular dire- tamente ou depois da encapsulação. [0085] Numerosos sistemas de seleção podem ser usados, inclu- indo mas não limitados aos genes de cinase de timidina de vírus de herpes simplex (Wigler, e outros., 1977, Cell 11: 223), fosforribosil- transferase de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:2026), e fosforribosiltransferase de ade- nina (Low, e outros., 1980, Cell 22:8 17) podem ser empregados em células de tk", hgprt" ou aprt", respectivamente. Também, genes de re- sistência a antimetabólito podem ser usados como a base de seleção para dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler, e outros., 1980, Natl. Acad. Sei. USA 77:3567; 0'Hare, e outros., 1981, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 78:1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072); neo, que confere resistência a aminoglicosídeo G-418 (Col- berre-Garapin, e outros., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); e hygro, que confe- re resistência a higromicina (Santerre, e outros, 1984, Gene 30:147) genes. [0086] Um sistema de proteína de fusão permite a pronta purifica- ção de proteínas de fusão desnaturadas expressas em linhas de célu- las humanas (Janknecht, e outros., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 8972-8976). Neste sistema, o gene de interesse é subclonado em um plasmídio de recombinação de vacínia tal que o quadro de leitura do gene é traducionalmente fundido a um carácter amino-terminal que consiste em seis resíduos de histidina. Extratos oriundos de células infectadas com vírus de vacínia recombinante são carregados sobre colunas de ácido nitriloacético Ni2+-agarose e proteínas etiquetadas com histidina são seletivamente eluídas com tampões contendo imi- dazol. [0087] Quando usado como um componente em sistemas de en- saio tais como aqueles descritos abaixo, a proteína diferencialmente expresa pode ser marcada, ou diretamente ou indiretamente, para faci- litar a detecção de um complexo formado entre a proteína diferencial- mente expressa e uma substância de teste. Qualquer uma variedade de sistemas de marcação adequados pode ser usada incluindo mas não limitada a radioisótopos tal como 125l; sistemas de marcação de enzima que geram uma luz ou sinal calorimétrico detectável quando expostos a substrato; e rótulos fluorescentes. [0088] Onde tecnologia de DNA recombinante é usada para pro- duzir a proteína diferencialmente expressa para tais sistemas de en- saio, pode ser vantajoso engenheirar proteína de fusão que podem facilitar a marcação, imobilização e/ou detecção. [0089] Marcação indireta envolve o uso de uma proteína, tal como uma proteína marcada, que especificamente se liga ou a qualquer produto de gene diferencialmente expresso. Tais anticorpos incluem mas não são limitados a, fragmentos de Fab, de cadeia única, quimé- ricos, monoclonais e fragmentos produzidos por uma biblioteca de ex- pressão de Fab. [0090] Em outra concretização, ácidos nucléicos compreendendo uma sequência que codifica proteína de Rdcvfl ou Rdcvf2 ou seu de- rivado funcional, são administrados para promover função de célula de cone, a título de terapia genética. Terapia genética refere-se a terapia realizada pela administração de um ácido nucléico a um indivíduo.

Nesta concretização da invenção, o ácido nucléico produz sua proteí- na codificada que media um efeito terapêutico por promoção de função de cone. [0091] Qualquer um dos métodos para terapia genética disponí- veis na técnica pode ser usado de acordo com a presente invenção. Métodos exemplares são descritos abaixo. [0092] Em um aspecto preferido, a terapêutica compreende um ácido nucléico de Rdcvfl ou Rdcvf2 que é parte de um vetor de ex- pressão que expressa uma proteína de Rdcvfl ou Rdcvf2 ou seu fra- gmento ou sua proteína quimérica em um hospedeiro adequado. Em particular, tal ácido nucléico tem um promotor operavelmente ligado à região de codificação de Rdcvfl ou Rdcvf2, o dito promotor sendo in- duzível ou constitutivo, e, opcionalmente, específico de tecido. Em ou- tra concretização particular, uma molécula de ácido nucléico é usada em que sequências de codificação de Rdcvfl ou Rdcvf2 e quaisquer outras sequências desejadas são flanqueadas por regiões que promo- vem recombinação homóloga em um sítio desejado no genoma, assim provendo expressão intracromossomal do ácido nucléico de Rdcvfl ou Rdcvf2 (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 8932-8935; Zijlstra e outros, 1989, Nature 342:435-438). [0093] Fornecimento do ácido nucléico para dentro de um paciente pode ser ou direto, caso esse em que o paciente é diretamente expos- to ao ácido nucléico ou vetor portador de ácido nucléico, ou indireto, caso essse em que, células são primeiramente transformadas com ácido nucléico in vitro, então são transplantadas para dentro do paci- ente. Estas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapia genética in vivo ou ex vivo. [0094] Em uma concretização específica, o ácido nucléico é dire- tamente administrado in vivo, onde ele é expresso para produzir o pro- duto codificado. Isto pode ser realizado por qualquer um dos numero- sos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por sua construção como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e sua administração de modo que ele se torne intracelular, por exemplo, por infecção usando-se um retroviral atenuado ou defeituoso ou outro vetor viral (adenovírus, vírus adeno-associado e lentivírus) (ver, por exemplo, a patente U.S. no. 4.980.286 e outras mencionadas infra), ou por injeção direta de DNA nu, ou por uso de bombardeio de micropar- tículas (por exemplo, uma pistola de gene; Biolistic, Dupont), ou reves- timentos com lipídios ou receptores de superfície de célula ou agentes de tranfecção, encapsulação em lipossomas, micropartículas, ou mi- crocápsulas ou por sua administração em ligação a um peptídeo que é conhecido como entrando no núcleo, por sua administração em liga- ção a um ligante sujeito a endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, as patentes U.S. nos. 5.166.320; 5.728.399; 5.874.297; e 6.030.954, todas as quais são incorporadas por referência aqui em sua totalidade) (que podem ser usados para direcionar tipos de célula que expressam especificamente os receptores), etc. Em outra concretiza- ção, um complexo de ácido nucléico-ligante pode ser formado em que o ligante compreende um peptídeo viral fusogênico para romper en- dossomas, permitindo que o ácido nucléico permita degradação lisos- somal. Em ainda outra concretização, o ácido nucléico pode ser direci- onado in vivo para expressão e captação específica de célula, por di- recionamento de um receptor específico (ver, por exemplo, publica- ções de PCT WO 92/06180; WO 92/226635; WO 92/20316; WO 93/14188; eWO 93/20221). [0095] Alternativamente, o ácido nucléico pode ser introduzido in- tracelularmente e incorporado dentro do DNA de célula hospedeira pa- ra expressão, por recombinação homóloga (ver, por exemplo, as pa- tentes U.S. nos. 5.413.923; 5.416.260 e 5.574.205; e Zijlstra e outros, 1989, Nature 342-435-438). [0096] Em uma concretização específica, um vetor viral que con- tém o ácido nucléico de Rdcvfl ou Rdcvf2 é usado. Por exemplo, um vetor retroviral pode ser usado (ver, por exemplo, as patentes U.S. nos. 5.219.740; 5.604.090; e 5.834.182). Estes vetores retrovirais fo- ram modificados para deletar sequências retrovirais que não são ne- cessárias para embalagem do genoma viral e integração no DNA de célula hospedeira. O ácido nucléico de Rdcvfl ou Rdcvf2 a ser usado em terapia genética é clonado no vetor, que facilita fornecimento do gene para dentro de um paciente. [0097] Adenovírus são outros vetores virais que podem ser usados em terapia genética. Adenovírus são veículos especialmente atraentes para o fornecimento de genes a epitélios respiratórios. Adenovírus na- turalmente infectam epitélios respiratórios onde eles causam uma do- ença moderada. Outros alvos para sistemas de fornecimento à base de adenovírus são fígado, o sistema nervoso central, células endoteli- ais, e músculo. Adenovírus têm a vantagem de ser capaz de infectar células que não se dividem. Métodos para a condução de terapia ge- nética à base de adenovírus são descritos nas, por exemplo, patentes U.S. nos. 5.824.544; 5.868.040; 5.871.722; 5.880.102; 5.882.877; 5.885.808; 5.932.210; 5.981.225; 5.994.106; 5.994.132; 5.994.134; 6.001.557; e 6.033.8843, todas as quais são incorporadas aqui por re- ferência em sua totalidade. [0098] Vírus adeno-associado (AAV) também foi proposto para o uso em terapia genética. Vírus adeno-associados são veículos especi- almente atraentes para o fornecimento de gene à retina. Métodos para a produção e a utilização de AAV são descritos, por exemplo, nas pa- tentes U.S. nos. 5.173.414; 5.252.479; 5.552.311; 5.658.785; 5.763.416; 5.773.289; 5.843.742; 5.869.040; 5.942.496; e 5.948.675, todos as quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. [0099] Outra abordagem para terapia genética envolve a transfe- rência de um gene para células em cultura de tecido por tais métodos como eletroporação, lipofecção, transfecção medidada por fosfato de cálcio ou infecção viral. Usualmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador estável para as células. As células são então colocadas sob seleção para isolar aquelas células que absor- vem e estão expressando o gene transferido. Aquelas células são en- tão fornecidas a um paciente diretamente ou depois da encapsulação. [00100] Nesta concretização, o ácido nucléico é introduzido para dentro de uma célula antes da administração in vivo da célula recom- binante resultante. Tal introdução pode ser realizada por qualquer mé- todo conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção com um vetor viral ou bacterió- fago contendo as sequências de ácidos nucléicos, fusão de célula, transferência de gene medidada por cromossoma, transferência de gene mediada por microcélula, fusão de esferoplasto, etc. Numerosas técnicas são conhecidas na técnica para a introdução de genes estra- nhos para dentro de células e podem ser usadas de acordo com a presente invenção, com a condição de que as funções fisiológicas e desenvolventes das células receptoras não sejam rompidas. A técnica proveria a transferência estável do ácido nucléico para a célula, de modo que o ácido nucléico seja exprimível pela célula e de preferência herdável e expremível por sua progênie de célula. [00101] As células recombinantes resultantes podem ser fornecidas a um paciente por vários métodos conhecidos na técnica. Em uma concretização, células epiteliais são injetadas, por exemplo, subcuta- neamente. Em outra concretização, células de pele recombinantes po- dem ser aplicadas como um enxerto de pele sobre o paciente. Células sanguíneas recombinantes (por exemplo, células progenitoras ou tron- co hematopoiéticas) são de preferência administradas intravenosa- mente. A quantidade de células previstas para o uso depende do efeito desejado, do estado do paciente, etc., e pode ser determinada por aquele versado na técnica. [00102] Células dentro das quais um ácido nucléico pode ser intro- duzido para finalidades de terapia genética incluem qualquer tipo de célula disponível, desejado, e incluem, mas não são limitadas a células epiteliais, células endoteliais, ceratinócitos, fibroblastos, células mus- culares, hepatócitos; células sangüíneas tais como linfócitos T, linfóci- tos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias Células-tronco ou original, em particular células progenitoras ou tronco hematopoiéticas, por exemplo, como obtidas a partir de medula óssea, sangue de cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, etc.. [00103] Em uma concretização, a célula usada para terapia genéti- ca é autóloga ao paciente. [00104] Em uma concretização em que células recombinantes são usadas em terapia genética, um ácido nucléico de Rdcvfl ou Rdcvf2 é introduzido para dentro das células tal que é expremível pelas células ou sua progênie, e as células recombinantes são então administradas in vivo para efeito terapêutico. Em uma concretização específica, célu- las progenitoras ou tronco são usadas. Quaisquer Células-tronco e/ou progenitoras que podem ser isoladas e mantidas in vitro podem poten- cialmente ser usadas de cadeia reta ou ramificada esta concretização da presente invenção. Tais Células-tronco incluem mas não são limi- tadas a Células-tronco hematopoiéticas (HSC), Células-tronco de teci- dos epiteliais tais como a pele e o revestimento do intestino, células musculares de coração embriônico, Células-tronco de fígado (ver, por exemplo, WO 94/08598), e Células-tronco neurais (Stemple and An- derson, 1992, Cell 71:973-985). [00105] Células-tronco epiteliais (ESCs) ou ceratinócitos podem ser obtidos a partir de tecidos tais como a pele e o revestimento do intesti- no por procedimentos conhecidos (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229). Em tecido epitelial estratificado tal como pele, a renovação ocorre por mitose de Células-tronco dentro da camada germinal, a camada mais próxima à lamina basal. Células-tronco dentro do reves- timento do intestino provê uma taxa de renoção rápida deste tecido. ESCs ou ceratinócitos obtidos a partir da pele ou do revestimento do intestino de um paciente ou doador podem ser desenvolvidos em cul- tura de tecido (Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771).

Se as ESCs forem providas por um doador, um método para supres- são de hospedeiro versus reatividade de enxerto (por exemplo, irradia- ção, administração de anticorpo ou de droga para promover imunos- supressão moderada) pode também ser usado. Célula tronco retinais (Tropepe e outros, 2000, Science, 297:2032). [00106] Com relação a Células-tronco hematopoiéticas (HSC), qualquer técnica que provê o isolamento, a propagação e a manuten- ção in vitro de HSC pode ser usada nesta concretização da invenção. Técnicas pelas quais isto pode ser realizado incluem (a) o isolamento e o estabelecimento de culturas de HSC de células da medula óssea isoladas do ourtro hospedeiro, ou um doador, ou (b) o uso de culturas de HSC de longo prazo anteriormente estabelecidas, que podem ser alogênicas ou xenogênicas. HSC não autólogas são usadas de prefe- rência em combinação com um método de suprimir reações imunes de transplante do futuro hospedeiro/paciente. Em uma concretização par- ticular da presente invenção, células da medula óssea humanas obti- das a partir da crista ilíaca posterior por aspiração com agulha (ver, por exemplo, Kodo e outros, 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384). Em uma concretização preferida da presente invenção, as HSCs podem ser tornadas altamente enriquecidas ou em forma substancialmente pura. Este enriquecimento pode ser realizado antes, durante ou após o cultivo de longo prazo, e pode ser feito por qualquer técnica conhecida na técnica. Culturas de longo prazo de células da medula óssea po- dem ser estabelecidas e mantidas por uso, por exemplo, de técnicas de cultura de célula Dexter modificadas (Dexter e outros, 1977, J. Cell Physiol. 91:335) ou técnicas de cultura Witlock-Witte (Witlock and Wit- te, 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:3608-3612). [00107] Em uma concretização específica, o ácido nucléico a ser introduzido para as finalidades de terapia genética compreende um promotor induzível operavelmente ligado à região de codificação, tal que expressão do ácido nucléico é controlável por controle da presen- ça ou da ausência do indutor apropriado de transcrição. [00108] Descritos aqui são métodos para a produção de anticorpos capazes de especificamente reconhecer um ou mais epítopos de gene diferencialmente expressos. Tais anticorpos podem incluir, mas não são limitados a, anticorpo policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos humanizados e quiméricos, anticorpo de cadeia simples, fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab')2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti- Id), e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos expostos acima. Tais anticorpos podem ser usados, por exemplo, na detecção de uma impressão digital, alvo, gene em uma amostra biológica, ou, alternativamente, como um método para a inibição de atividade de ge- ne alvo anormal. Assim tais anticorpos podem ser utilizados como par- te de métodos de tratamento de doença, e/ou podem ser usados como parte de técnicas de diagnóstico pelo que pacientes podem ser testa- dos quanto a níveis anormais de Rdcvfl ou Rdcvf2, ou para a presen- ça de formas anormais de Rdcvfl ou Rdcvf2 por amostragem do hu- mor aquoso e/ou vítreo por métodos familiares por aqueles de habili- dade na técnica (por exemplo, Forster, RK, Abbott, RL, Gelender, H. (1980) Management of infectious endophtalmitis Ophthalmology 87, 313-319)]. [00109] Para a produção de anticorpos para um gene diferencial- mente expresso, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com uma proteína diferencialmente expressa, ou uma sua porção ou por imunização de DNA. Tais animais hospedeiros podem incluir mas não são limitados a, coelhos, camundongos e ratos, para nomear alguns. Vários auxiliares podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie de hospedeiro, incluin- do mas limitados a, Freund's (completo e incompleto), géis minerais tal como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas tais como lisoleci- tina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, he- mocianina de lapa "keyhole" (KLH), dinitrofenol e auxiliares humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. [00110] Anticorpos policlonais são populações heterogêneas de moléculas de anticorpo derivadas dos soros de animais imunizados com um antígeno, tal como produto de gene alvo, ou um seu derivado funcional antigênico. Para a produção de anticorpos policlonais, ani- mais hospedeiros tais como aqueles descritos acima, podem ser imu- nizados por injeção com produto de gene diferencialmente expresso suplementado com auxiliares como também descritos acima. [00111] Anticorpos monoclonais, que são populações homogêneas de anticorpos a um antígeno particular, podem ser obtidos por qual- quer técnica que provê a produção de moléculas de anticorpo por li- nhas de células contínuas em cultura. Estas incluem, mas não são li- mitadas à técnica de hibridoma de Kohler e Milstein, (1975, Nature 256;495-497; e a patente U.S. no. 4.376.110), a técnica de hibridoma de célula B humana (Kosbor e outros, 1983, Immonology Today 4:72;

Cole e outros, 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:2026-2030), e a técnica de hibridoma de EBV (Cole e outros, 1985, Monoclonal Antibo- dies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Tais anti- corpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e sua qualquer subclasse. O hibridoma que produz o mAb desta invenção pode ser cultivado in vitro ou in vivo. Produção de altos títulos de mAbs in vivo torna este método presentemente pre- ferido de produção. [00112] Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison e outros, 1984, Proc. Natl. Acad.

Sei., 81:6851-6855; Neuberger e outros, 1984, Nature, 312:604-608;

Takeda e outros, 1985, Nature, 314:452-454) por união dos genes de uma molécula de anticorpo de camundongo da especificidade de antí- geno apropriado juntamente com genes de uma molécula de anticorpo humana de atividade biológica apropriada podem ser usados. Um anti- corpo quimérico é uma molécula em que diferentes porções são deri- vadas de diferentes espécies de animais, tais como aqueles tendo uma região variável ou hipervariável derivada de um mAb de camun- dongo e uma região contanto de imunoglobulina humana. [00113] Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (patente U.S. no. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston e outros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883; e Ward e outros, 1989, Nature 334:544-546) po- dem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples de ge- ne diferencialmente expresso. Anticorpos de cadeia simples são for- mados por ligação dos fragmentos de cadeia leve e pesada da região de Fv via uma ponte de aminoácido, resultando em um polipeptídeo de cadeia simples. [00114] Mais de preferência, técnicas úteis para a produção de "an- ticorpos humanizados" podem ser adaptadas para produzir anticorpos para os polipeptídeos, fragmentos, derivados e equivalentes funcionais revelados aqui. Tais técnicas são reveladas nas patentes U.S. no. 5.932.448; 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; 5.910.771; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.545.580; 5.661.016; e 5.770.429, cujas revelações são incorporadas por referência aqui em sua totalidade. [00115] Fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos especí- ficos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem mas não são limitados a: os fragmentos de F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão de pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos de Fab que podem ser gerados por redução de pontes de dissulfeto dos fragmentos de F(ab')2. Alternativamente, bibliotecas de expressão de Fab podem ser construídas (Huse e ou- tros, 1989, Science, 246:1275-1281) para permitir identificação fácil e rápida de fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade dese- jada. [00116] Particularmente preferido, para facilidade de detecção, é o ensaio de sanduíche, cujas numerosas variações existem, pretende-se que todas as quais estejam incluídas pela presente invenção. [00117] Por exemplo, em um ensaio avançado típico, anticorpo não marcado é imobilizado sobre um substrato sólido e a amostra a ser testada foi posta em contato com a molécula ligada. Depois de um pe- ríodo adequado de incubação, por um período de tempo suficiente pa- ra permitir a formação de um complexo binário de anticorpo-antígeno.

Neste ponto, um segundo anticorpo, marcado com uma molécula re- pórter capaz de induzir um sinal detectável, é então adicionado e é in- cubado, permitindo tempo suficiente para a formação de um complexo ternário de anticorpo marcado de anticorpo-antígeno. Qualquer mate- rial não reagido é removido por lavagem, e a presença do antígeno é determinada pela observação de um sinal, ou pode ser quantificado por comparação com uma amostra de controle contendo quantidade conhecidas de antígeno. Variações sobre o ensaio avançado incluem o ensaio simultâneo, em que tanto amostra quanto anticorpo são adi- cionados simultaneamente ao anticorpo ligado, ou um ensaio reverso em que o anticorpo marcado e amostra a serem testados são primei- ramente combinados, incubados e adicionados ao revestimento ligado de superfície não marcada. Estas técnicas são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica, e a possibilidade de variações menores serão prontamente evidentes. Como usado aqui, "ensaio de sanduí- che" tem a finalidade de incluir todas as variações sobre a técnica de dois sítios básicos. Para os imunoensaios da presente invenção, o único fator de limitação é que os anticorpos marcados e não marcados sejam um anticorpo específico de Rdcvfl ou Rdcvf2. [00118] As moléculas repórteres mais comumente usadas neste tipo de ensaio são ou enzimas, moléculas contendo fluoroforo ou ra- dionuclídeo. No caso de um imunoensaio de enzima uma enzima é conjugada ao segundo anticorpo, usualmente por meio de glutaraldeí- do ou periodato. Como será prontamente reconhecido, no entanto, uma ampla variedade de diferentes técnicas de ligação existe, que são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica. Enzimas comumen- te usadas incluem peroxidase rábano silvestre, glicose oxidase, beta- galactosidase e fosfatase alcalina, entre outros. Os substratos a serem usados com as enzimas específicas são em geral escolhidos para a produção, quando da hidrólise pela enzima correspondente, de uma mudança de cor detectável. Por exemplo, fosfato de p-nitrofenila é adequado para o uso com conjugados de fosfatase alcalina; para con- jugados de peroxidase, 1,2-fenilenodiamina ou toluidina são comu- mente usados. É também possível empregar substratos cromogênicos observados acima. Uma solução contendo o substrato apropriado é então adicionada ao complexo terciário de anticorpo-anticorpo marca- do por Rdcvfl ou Rdcvf2. O substrato reage com a enzima ligada ao segundo anticorpo, dando um sinal visual equivalente, que pode ser ulteriormente quantificado, usualmente, espectrofotometricamente, pa- ra dar uma avaliação da quantidade de Rdcvfl ou Rdcvf2 que está presente na amostra do soro. [00119] Alternativamente, compostos fluorescentes, tais como fluo- resceína e rodamina, podem ser quimicamente acoplados a anticorpos sem alterar sua capacidade de ligação. Quando ativada por iluminação com luz de um comprimento de onda particular, o anticorpo marcado com fluorocromo absorve a energia de luz, induzindo o estado de exci- tabilidade na molécula, seguido por emissão da luz em um comprimen- to de onda mais longo característico. A emissão aparece como uma cor característica visualmente detectável com um microscópio de luz.

Imunofluorescência e técnicas de EIA são tanto muito bem estabeleci- das na técnica quanto são particularmente preferidas para o presente método. No entanto, outras moléculas repórteres, tais como radioisó- topos, moléculas quimioluminescentes ou bioluminescentes podem também ser empregadas. Será também prontamente evidente para o versado na técnica como variar o procedimento para adaptar o uso requerido. [00120] Esta invenção descreve também o uso de polinucleotídeos da presente invenção como reagentes de diagnósticos. Detecção de uma forma mutada do gene que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste nos polipeptídeos indicados em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14 que está associada com uma disfunção pro- verá uma ferramenta de diagnóstico que pode adicionar a, ou definir, um diagnóstico de uma doença, ou suscetibilidade a uma doença, que resulta de infra-expessão, ultra-expressão ou expressão temporal ou espacial alterada do gene. Indivíduos que portam mutações no gene podem ser detectados no nível de DNA por uma variedade de técni- cas. [00121] Ácidos nucléicos para diagnósticos podem ser obtidos a partir de células do indivíduo, tais como a partir de material de autóp- sia ou biopsia de sangue, saliva, urina ou sangue. O DNA genômico pode ser usado diretamente para detecção ou pode ser ampliado en- zimaticamente por uso de PCR ou outras técnicas de ampliação antes da análise. RNA ou cDNA pode também ser usado em forma similar.

Deleções e inserções podem ser detectadas por uma mudança no ta- manho do produto ampliado em comparação com o genótipo normal.

Mutações de ponto podem ser identificadas por hibridização de DNA ampliado para sequências de nucleotídeos marcadas. Sequências per- feitamente emparelhadas podem ser distingüidas de duplas mal empa- relhadas por digestão de RNase ou por diferenças em temperaturas de ponto de fusão. Diferenças de sequência de DNA podem também ser detectadas por alterações em mobilidade eletroforética de fragmentos de DNA em géis, com ou sem agentes de desnaturação (SSCP), ou por sequênciação de DNA direta (por exemplo, Myers e outros, Scien- ce (1985) 230:1242). Mudanças de sequência em locais específicos podem também ser reveladas por ensaios de proteção de nuclease, tais como proteção de RNase e de S1 ou o método de divagem (ver Cotton e outros, Proc. Natl Acad Sei USA (1985) 85: 4397-4401). Em uma outra concretização, um conjunto de sondas de oligonudeotídeos compreendendo a sequêndas de nudeotídeos de Rdcvfl ou Rdcvf2 ou seus fragmentos podem ser construídos para conduzir triagem efi- ciente de, por exemplo, mutações genéticas. Métodos de tecnologia de conjunto são bem-conheddos e têm aplicabilidade geral e podem ser usados para tratar uma variedade de questões em genéticas molecula- res incluindo expressão de gene, ligação genética e variabilidade ge- nética (ver, por exemplo, M. Chee e outros, Science, vol. 274, págs. 610-613(1996)). [00122] Os ensaios de diagnóstico oferecem um processo para di- agnosticar ou determinar uma suscetibilidade a doença através da de- tecção de mutação no gene de Rdcvfl ou Rdcvf2 pelos métodos des- critos. Além disso, tais doenças podem ser diagnosticadas por méto- dos compreendendo a determinação de uma amostra derivada de um indivíduo uma expressão de Rdcvfl ou Rdcvf2 anormal: Expressão pode ser medida no nível de RNA usando-se qualquer um dos méto- dos bem-conhecidos na técnica para a quantificação de polinucleotí- deos, tal como, por exemplo, ampliação de ácido nucléico, por exem- plo, proteção de PCR, RT-PCR, RNase, Northern blotting e outros mé- todos de hibridização. Técnicas de ensaio que podem ser usadas para determinar níveis de uma proteína, tal como um polipeptídeo da pre- sente invenção, em uma amostra derivada de um hospedeiro são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica. Tais métodos de ensaio incluem radioimunoensaios, ensaios de ligação competitivas, análise de Western Blot e ensaios ELISA. [00123] Assim em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit de diagnóstico que compreende: (a) um polinucleotídeo da presente invenção, de preferência a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste nos polipeptídeos indi- cados em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14, ou um seu fragmento; (b) uma sequência de nucleotídeos complementar àquela de (a); (c) um polipeptídeo da presente invenção, de preferência o polipeptídeo de ou um seu fragmento; ou (d) um anticorpo para um polipeptídeo da presente invenção, de preferência para um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste nos polipeptídeos indicados em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14. [00124] Será apreciado que em qualquer tal kit (a), (b), (c) ou (d) pode compreender um componente substancial. Tal kit será de uso em diagnóstico de uma doença ou uma suscetibilidade a uma doença, particularmente retinite pigmentose, degeneração macular relacionada com a idade, síndrome de Bardet-Biedel, síndrome de Bassen- kornzweig, doença de Best, coroidema, atrofia do giro, amourose con- gênita, síndrome de Refsun, doença de Stargardt e síndrome de Us- her. As sequências de nucleotídeos da presente invenção são também variáveis para localização de cromossoma. A localização cromossomal pode ser obtida por PCR sobre DNA preparado a partir de um painel de linhas de células híbridas (camundongo-hamster). A localização cromossomal do gene humano pode ser prevista a partir da localiza- ção do gene de camundongo por sintenia (McCarthy e outros (1997), Genome research, 7, 1153). A sequência é especificamente dirigida a, e pode hibridizar com, uma localização particular sobre um cromosso- ma individual, incluindo um cromossoma de camundongo ou humano. O mapeamento de sequências relevantes para cromossomas de acor- do com a presente invenção é uma primeira etapa importante em cor- relação àquelas sequências com doença associada a gene. Uma vez que uma sequência foi mapeada para uma localização cromossomal precisa, a posição física da sequência sobre o cromossoma pode estar correlacionada com dados de mapa genéticos. Tais dados são encon- trados, por exemplo, em V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponível on-line através de Johns Hopkins University Welch Medicai Library, RetNet). A relação entre genes e doenças que foram mapea- das para a mesma região cromossomal é então identificada através de análise de ligação (co-herança de genes fisicamente adjacentes). [00125] As diferenças na sequência genômica ou de cDNA entre indivíduos afetados e não afetados podem também ser determinadas.

Se uma mutação for observada em alguns ou na totalidade dos indiví- duos afetados mas não em quaisquer indivíduos normais, então a mu- tação deve provavelmente ser o agente causador da doença. [00126] Uma concretização adicional da invenção refere-se à admi- nistração de uma composição farmacêutica, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, para qualquer um dos efeitos te- rapêuticos discutidos acima. Tais composições farmacêuticas podem consistir de Rdcvfl ou Rdcvf2, miméticos ou agonistas. As composi- ções podem ser administradas sozinhas ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como composto de estabilização, que po- de ser administrado em qualquer veículo farmacêutico biocompatível, estéril, incluindo mas limitado a, solução salina, solução salina tampo- nada, dextrose e água. As composições podem ser administradas a um paciente sozinhas, ou em combinação com outros agentes, drogas ou hormônios. [00127] As composições farmacêuticas incluídas pela invenção po- dem ser administradas por qualquer número de rotas: por exemplo, fornecimento Transscleral de proteína biorreativa a coróide e retina Ambati e outros (2000) Investigative Ophthalmology and Visual Scien- ce 41, 1186. A formulação de preparações oftálmicas tópicas, incluin- do soluções, suspensões e pomadas oftálmicas é bem-conhecida por aqueles versados na técnica (ver Remington's Pharmaceutical Scien- ces, 18a ed., capítulo 86, págs. 1581-1592 Mack Publishing Company, 1990). Outros modos de administração são disponíveis, incluindo inje- ções intracamerais (que podem ser feitas diretamente para dentro da câmara interior ou diretamente para dentro da câmara vítrea), injeções subconjutivais e injeções retrobulbares, e métodos e meios para a produção de preparações oftálmicas adequadas para tais modos de administração são bem-conhecidos. [00128] Como usado neste pedido, "extra-ocular" refere-se à super- fície ocular e o espaço (externo) entre o globo ocular e a pálpebra.

Exemplos de regiões extra-oculares incluem o fórnice da pálpebra ou fundo de saco, a superfície conjuntival e a superfície da córnea. Esta localização é externa a todo tecido ocular e um procedimento invasivo não é necessário para acessar esta região. Exemplos de sistemas ex- tra-oculares incluem insertos e gotas "topicamente" aplicadas, géis ou pomadas, que podem ser usados para fornecer material terapêutico a estas regiões. Dispositivos extra-oculares são em geral facilmente re- movíveis, mesmo pelo paciente. [00129] As seguintes patentes revelam sistemas extra-oculares que são usados para administrar drogas às regiões extra-oculares. Higuchi e outros, revela nas patentes U.S. nos. 3.981.303, 3.986.510 e 3.995.635, um inserto ocular biodegradável que contém uma droga. O inserto pode ser produzido de diferentes formas para retenção no fun- do do saco do globo ocular, e espaço extra-ocular entre o globo ocular e a pálpebra. Vários polímeros biocompatíveis comuns são revelados como adequados para o uso na fabricação deste dispositivo. Estes po- límeros incluem alginato de zinco (ácido láctico), poli(álcool vinílico), poli(anidridos) e poli(ácido glicólico). As patentes também descrevem dispositivo revestido com membrana com permeação reduzida para a droga e câmaras ocas que seguram a formulação de droga. [00130] Theeuwes, na patente U.S. no. 4.217.898 revela reservató- rios microporosos que são usados para fornecimento de droga contro- lada. Estes dispositivos são colocados extra-ocularmente no fundo do saco ocular. Entre os sistemas de fornecimento de interesse incluem copolímeros de poli(cloreto de vinila)-co-poli(acetato de vinila).

Kaufman revela nas patentes U.S. nos. 4.865.846 e 4.882.150 um sis- tema de fornecimento de droga oftálmica que contém pelo menos um material bio-erodível ou veículo de pomada para o saco conjutival. A patente revela sistemas de polímero, tais como, poli(lactídeo), po- li(glicolídeo), poli(álcool vinílico), e colágeno reticulado, como sistemas de fornecimento adequados. [00131] No uso presentemente descrito de produto de proteína de Rdcvfl ou Rdcvf2 para o tratamento de doença ou lesão de retina é também vantajoso que uma formulação oftálmica topicamente aplicada incluem um agente para promover a penetração ou transporte do agente terapêutico para dentro do olho. Tais agentes são conhecidos na técnica. Por exemplo, Ke e outros, na patente U.S. no. 5.221.696 revelam o uso de materiais para aumentar a penetração de prepara- ções oftálmicas através da córnea. [00132] Sistemas intra-oculares são aqueles sistemas que são ade- quados para o uso em qualquer compartimento de tecido dentro, entre ou em volta das camadas de tecido do próprio olho. Estas localizações incluem subconjutival (sob a membrana de mucosa ocular adjacente ao globo ocular), orbital (atrás do globo ocular), intracameral (dentro das câmaras do próprio globo ocular). Em contraste com sistemas ex- tra-oculares, um procedimento invasivo consiste em injeção ou implan- tação é exigido para acessar estas regiões. [00133] As seguintes patentes revelam dispositivos intra-oculares.

Wong, na patente U.S. no. 4.853.224, revela drogas microencapsula- das para a introdução para dentro da câmara do olho. Polímeros que são usados no sistema incluem poliésteres e poliéteres. Lee, na paten- te U.S. no. 4.863.457, revela um dispositivo biodegradável que é cirur- gicamente implantado intra-ocularmente para a liberação sustentada de agentes terapêuticos. O dispositivo é projetado para implantação cirúrgica sob a conjuntiva (membrana de mucosa do globo ocular).

Krezancaki, na patente U.S. no. 4.188.373, revela um veículo farma- cêutico que forma gel a temperatura de corpo do ser humano. Este veículo é uma suspensão aquosa da droga e derivados sintéticos deri- vados de celulose ou gomas. Haslam e outros, revela nas patentes U.S. nos. 4.474.751 e 4.474.752 um sistema de droga de polímero que é líquido a temperatura ambiente e géis a temperatura de corpo. Polí- meros adequados usados neste sistema incluem polioxietileno e polió- xi propileno. Davis e outros, revelam na patente U.S. no. 5.384.333 um polímero de fornecimento de droga injetável biodegradável que provê liberação de droga de longo prazo. A composição de droga é compos- ta de um agente farmaceuticamente ativo em uma matriz de polímero biodegradável, onde a matriz de polímero é um sólido a temperaturas o o o na faixa de 20 C a 37 C e é escoável a temperaturas na faixa 38 C a o 52 C. O polímero de fornecimento droga não é limitado ao fornecimen- to de formulações de droga solúveis ou líquidas. Por exemplo, o polí- mero pode ser usado como uma matriz para estabilizar e reter no sítio de injeção de lipossomas, microesferas contendo droga, ou outras drogas ligadas em partículas. [00134] Um veículo particularmente adequado para injeção intra- ocular é água destilada estéril em que o produto de proteína de Rdcvfl ou Rdcvf2 é formulado como uma solução estéril, isotônica, adequa- damente conservada. Ainda uma outra preparação oftálmica pode en- volver a formulação do produto de proteína de Rdcvfl ou Rdcvf2 com um agente, tais como lipossomas ou microesferas injetáveis, que pro- vê a liberação lenta ou sustentada da proteína que pode ser fornecida como uma injeção depósito. Outro meio adequado para a introdução intra-ocular de produto de proteína de Rdcvfl ou Rdcvf2 inclui, disposi- tivos de fornecimento de droga implantáveis ou que contêm o produto de proteína de Rdcvfl ou Rdcvf2. [00135] As preparações oftálmicas da presente invenção, prepara- ções particularmente tópicas, podem incluir outros componentes, por exemplo, conservantes, agentes de tonicidade, co-solventes, agentes de umectação, agentes de complexação, agentes de tamponamento, antimicrobianos, antioxidantes e tensoativos oftalmicamente aceitá- veis, como bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, agentes aumen- tadores de tonicidade adequados incluem haletos de metal alcalino (de preferência cloreto de sódio ou de potássio), manitol, sorbitol, e seme- lhantes. Agentes aumentadores de tonicidade é vantajosamente adici- onado de modo que a formulação seja instilada para dentro do olho seja hipotônica ou substancialmente isotônica. Conservantes adequa- dos incluem, mas não são limitados a, cloreto de benzalcônio, timero- sal, álcool fenetílico, metilparabeno, poliparabeno, clorexidina, ácido sórbico e semelhantes. Peróxido de hidrogênio pode também ser usa- do como conservante. Co-solventes adequados incluem, mas não são limitados a, glicerina, propileno glicol e polietileno glicol. Agentes de complexação adequados incluem cafeína, polivinilpirrolidona, beta- ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina. Tensoativos adequa- dos ou agentes de umectação incluem, mas não são limitados a, éste- res de sorbitano, polissorbatos tais como polissorbato 80, trometami- na, lecitina, colesterol, tiloxapol e semelhantes. Os tampões podem ser tampões convencionais tais como borato, citrato, fosfato, bicarbonato ou Tris-HCI. [00136] Os componentes de formulação estão presentes em con- centrações que são aceitáveis para o sítio extra-ocular ou intra-ocular de administração. Por exemplo, tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou em pH levemente mais baixo, tipica- mente dentro da faixa de pH de desde cerca de 5 a cerca de 8. Com- ponentes de formulação adicionais podem incluir materiais que provê- em a residência ocular prolongada do agente terapêutico extra- ocularmente administrado de modo a maximizar o contato tópico e promover absorção. Materais adequados incluem polímeros ou mate- riais de formação de gel que provêem viscosidade aumentada da pre- paração oftálmica. Quitosano é um material particularmente adequado como um agente de controle de taxa de liberação ocular em formula- ções de droga oftálmicas líquidas de liberação sustentada (ver, a pa- tente U.S. no. 5.422.116, Yen e outros). A adequabilidade das formu- lações da presente invenção para liberação controlada (por exemplo, fornecimento sustentado ou prolongado) de um agente de tratamento oftálmico no olho pode ser determinada por vários procedimentos co- nhecidos na técnica, por exemplo, como descrito in Journal of Con- trolled Release, 6:367-373, 1987, bem como suas variações. [00137] Além dos ingredientes ativos, estas composições farmacêu- ticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamen- to dos compostos ativos para a formação de preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. Outros detalhes sobre as técnicas pa- ra a formulação e administração podem ser encontradas na última edi- ção de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). [00138] Composições farmacêuticas para a administração oral po- dem ser formuladas usando-se veículos farmaceuticamente aceitáveis bem-conhecidos na técnica em dosagens adequadas para a adminis- tração oral. Tais veículos permitem as composições farmacêuticas se- rem formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líqui- dos, géis, xaropes, pastas fluidas, suspensões e semelhantes para ingestão pelo paciente. [00139] Preparações farmacêuticas para o uso oral podem ser obti- das através da combinação de compostos ativos com excipiente sóli- do, opcionalmente moagem de uma mistura resultante, e processa- mento da mistura de grânulos, depois da adição de auxiliares adequa- dos, se desejado, para se obter comprimidos ou núcleos de drágeas.

Excipientes adequados são carboidratos ou materiais de enchimento de proteína, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; amido oriundo de milho, trigo, arroz, batata ou outras plan- tas; celulose, tal como metil celulose, hidroxipropilmetilcelulose, ou carboximetilcelulose de sódio; gomas incluindo goma arábica e traga- canto; e proteínas tais como gelatina e colágeno. Se desejado, agen- tes de desintegração ou de solubilização podem ser adicionados, tal como a polivinil pirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico, ou um seu sal, tal como alginato de sódio. [00140] Núcleos de drágeas podem ser usados em combinação com revestimentos adequados, tais como soluções de açúcar concen- tradas, que podem também conter goma arábica, talco, polivinilpirroli- dona, gel de carbopol, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, solu- ções de laca, e misturas de solventes ou solventes orgânicos adequa- dos. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou aos revestimentos de drágea para identificação de produto ou para caracterizar a quantidade de composto ativo, isto é, dosagem. [00141] Preparações farmacêuticas que podem ser usadas oral- mente incluem cápsulas de "push-fit" produzidas de gelatina, bem co- mo cápsulas seladas, moles produzidas de gelatina e um revestimen- to, tal como glicerol ou sorbitol. Cápsulas de "push-fit" podem conter ingredientes ativos misturados com um material de enchimento ou aglutinantes, tais como lactose ou amidos, lubrificantes, tais como tal- co ou estearato de magnésio, e, opcionalmente estabilizadores. Em cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou sus- pensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, líquido, ou polietileno glicol líquido com ou sem estabilizadores. [00142] Formulações farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem ser formuladas em soluções aquosas, de preferên- cia em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer ou solução salina tamponada fisiológica.

Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que au- mentam a viscosidade da suspensão, tal como carboximetil celulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Adicionalmente, suspensões dos com- postos ativos podem ser preparados como suspensões de injeção ole- osas apropriadas. Veículos ou solventes lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos ou lipossomas.

Polímeros de amino policatiônicos não-lipídicos podem também ser usados para fornecer. Opcionalmente, a suspensão pode também con- ter agentes ou estabilizadores adequados que aumentam a solubilida- de dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. [00143] Para administração tópica ou nasal, penetrantes apropria- dos para a barreira particular a ser permeada são usados na formula- ção. Tais penetrantes são, em geral, conhecidos na técnica. [00144] As composições farmacêuticas da presente invenção po- dem ser fabricadas de um modo que é conhecido na técnica, por exemplo, por meio de processos de liofilização, aprisionamento, en- capsulação, emulsificação, moagem, formação de drágea, granulação ou dissolução. [00145] A composição farmacêutica pode ser provida como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo mas não limitados a, clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc.

Sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros sol- ventes protônicos do que são as formas de base livre corresponden- tes. Em outros casos, a preparação preferida pode ser um pó liofiliza- do que pode conter qualquer um ou a totalidade dos seguintes: histidi- na a 1-50 mM, 0,1%-2% de sacarose, e 2-7% de manitol, a uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que é combinada com tampão antes do uso. [00146] Depois que as composições farmacêuticas foram prepara- das, elas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e marca- das para tratamento de uma condição indicada. Para administração de Rdcvfl ou Rdcvf2, tal marcação incluiria quantidade, freqüência e mé- todo de administração. [00147] Composições farmacêuticas adequadas para o uso na in- venção incluem composições em que os ingredientes ativos estão con- tidos em uma quantidade eficaz para conseguir a finalidade pretendi- da. A determinação de uma dose eficaz está também dentro da capa- cidade daqueles versados na técnica. [00148] Para qualquer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente ou em ensaios de cultura de célula, por exemplo, de células neoplásicas, ou em modelos de animais, usual- mente camundongos, coelhos, cachorros e porcos. O modelo de ani- mal pode também ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e a rota de administração. Tal informação pode então ser usada para determinar rotas e doses úteis para a administração em seres humanos. [00149] Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àquela quanti- dade de ingrediente ativo, por exemplo, Rdcvfl ou Rdcvf2 ou seus fra- gmentos, anticorpos para Rdcvfl, agonistas, que melhora os sintomas ou a condição. Toxicidade e eficácia terapêutica podem ser determi- nadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de célula ou animais experimentais, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamen- te eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da po- pulação). A razão em dose entre efeitos tóxicos terapêuticos é o índice terapêutico, e pode ser expressa como a razão de LD50/ED50. Com- posições farmacêuticas que exibem grandes índices terapêuticos são preferidas. Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de célula e estudos de animais são usados na formulação de uma faixa de dosa- gem para o uso humano. A dosagem contida em tais composições es- tá, de preferência, dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem emprega- da, da sensibilidade do paciente e da rota de administração. [00150] A dosagem exata será determinada pelo médico, levando em consideração fatores relacionados com o indivíduo que necessita de tratamento. Dosagem e administração são ajustadas para prover níveis suficientes da porção ativa ou para manter o efeito desejado.

Fatores que podem ser levados em consideração incluem a severida- de do estado da doença, a saúde geral do indivíduo, a idade, o peso e o sexo do indivíduo, a dieta, o tempo e a freqüência de administração, a(s) combinação(ções) de drogas, as sensibilidades de reação e a to- lerância/resposta à terapia. Composições farmacêuticas de longa ação podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, a cada semana ou uma vez a cada duas semanas dependendo da semi-vida e da taxa de de- puração da formualação particular. [00151] Quantidades de dosagem normais podem variar de 0,1 a 100.000 microgramas até uma dose total de cerca de 1 g, dependendo da rota de administração. Orientação quanto a dosagens particulares e métodos de fornecimento é provida na literatura e em geral disponíveis para versados na técnica. Aqueles versados na técnica empregarão formulações diferentes para nucleotídeos do que para proteínas ou seus inibidores. Similarmente, fornecimento de polinucleotídeos ou po- lipeptídeos será específico para células, condições, localizações, etc particulares. Formulações farmacêuticas adequadas para a adminis- tração oral de proteínas são descritas, por exemplo, nas patentes U.S. n°s 5.008.114; 5.505.962; 5.641.515; 5.681.811; 5.700.486; 5.766.633; 5.792.451; 5.853.748; 5.972.387; 5.976.569 e 6.051.561. [00152] Os seguintes exemplos ilustram a presente invenção, sem de maneira alguma limitar o seu escopo.

Exemplos 1, Clonagem de expressão: 1) Purificação de RNA total de retinas de camundonqos normais de cinco semanas: [00153] A biblioteca de cDNA foi construída a partir de retinas de camundongos C57BU6@N de cinco semanas de idade em geral de acordo com o método de Glissin e outros (1974), Bíochemistry, 13, 2633-2637. Resumidamente, depois da morte, animais foram enuclea- dos e os olhos foram primeiramente colocados em solução salina de tampão de fosfato (PBS) suplementada com 0,1% de Dietil Pirocarbo- nato (DEPC). Retina neural foi rapidamente dissecada (o epitélio pig- menta d o retinal foi omitido nesta preparação de tecido). Rapidamente depois de cada dissecação, tecidos foram homogeneizados em cloreto de guanidínio a 6 M fresco. Dez retinas foram combinadas em 2,4 ml de GG em tubos estéreis de 4 ml, e o tecido foi rompido total mente por homogeneização forte por 1 minuto á temperatura ambiente.

Purificação de RNA mensageiro fmRNAI de retinas de camundongos normais de cinco semanas: [00154] rnRNA foi isolado sobre contas porosas revestidas com oli- go-dT (Oligotex, Qiagen) sob condições rigorosas de acordo com o método de Kuribayashí e outros, (1988). Nucleic Acids Res. Sympo- sium series, 19, 61-64. Resumidamente, 100-150 ocg de RNA de retina de camundongo total foram misturados com 15 od de contas de oligo- dT em tampão de ligação [Tris a 10 mM, pH 7,5; NaCI a 0,3 M; EDTA 0,1 M; 0,5% de p/v de sulfato de duodecila de sódio (SDS)] e foram o incubados 6 minutos a 65 C em béquer de 0,5 I de água, então foram progressiva mente resfriados para à temperatura ambiente por cerca de 3-4 horas, então foram centrifugados a temperatura ambiente para recuperar as contas de agarose. Eles foram então lavados duas vezes por incubação de 10 minutos em 0,4 ml de (Tris a 0,1 M, pH 7,5; NaCI a 0,1 M; EDTA a 1 mM; 0,5% de p/v de SDS). RNA ligado (mRNA) fo- ram eluidos em duas etapas com 50 <xt de água livre de RN Ase aque- o cida a 70 C, foram precipitados com 10 od de acetato de sódio, pH 5,2 o e 0,25 ml de etanol e foram incubados 12 horas a -70 G. mRNA foi co- letado por centrifugação (1 hora a 15,000 rpm, seguido por duas lava- gens com 70% de etanol) e foram ressuspensos em 20 od de água li- vre de RNAse. Concentração mRNA foi medida a 260 nm e a ausência de contaminações de rRNA foi checada por eletroforese de gel sob condições de desnaturação como acima. Síntese de cDNA: [00155] Foi realizada de acordo com o método Okayama and Berg,(1982),Mol Cell Bíol., 2, 161-170. Síntese de primeiro fio foi inicia- lizada com 2,5 ocg de oligonucleotídeo adaptador de Notl (5ΤGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGACAA(T)1S 3') e foi in- cubado por 2 horas com 50 unidades transcriptase reversa de vírus de Leucemia de M uri no Moloney (M-MLV) (Superscript II, Life Techno- logy) sob as condições recomendadas pelo fornecedor. Para síntese o de segundo fio, reação foi incubada por 4 horas a 14 C com 4 unida- des de RNAseH e 100 unidades de polimerase I de DNA em tampão de SS [Tris a 40 mM, pH 7,2; cloreto de potássio a 85 mM; cloreto de magnésio a 4,4 mM; DTT a 3 mM; 5 ccg/ml de albumina de soro bovino (BSA)] em um volume final de 0,25 ml. Adaptadores de EcoRI (5-OH AATTCGGCACGAGG 3-OH/3-OH GCCGTGCTCC5—P04) estavam ligados em ambas as extremidades do cDNA de filamento duplo em 14 α horas a 16 C usando-se 40 unidades de ligase de DNA T4 (Promega, Madison, USA) em um volume total de 20 cd sob as condições reco- mendadas pelo fornecedor. Os produtos desta reação são dscDNA que têm um melo sítio Eco RI em 5' e meio sítio Notl em 3’ que podem ser orientados no vetor de clonagem Ligação de dscDNA em pcDNA3: [00156] Foi realizada de acordo com Maniatis T,(1992), Molecular cloning: a labo rato ry manual, 2nd ed., usando-se 10 ocg de plasmídio de pcDNA3 (Invitrogen) preparados por corte com EcoRI e Notl (Pro- mega, Madison, USA) sob as condições especificadas pela fornece- dor.

Propagação de clones recombinantes: [00157] Foi realizada, em geral, de acordo com o método de Birn- boím e outros (1979), Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523, Resumida- mente, a fim de produzir combinações de 100 clones primários, nós levemente modificou-se o protocolo de transformação XL1 Gold (Stra- tegene) {provido pela Stratagene) como se segue. Depois da incuba- ção em meio de crescimento, a reação de transformação foi levada para 20% (vol/vol.) de glicerol e 8% (voi/vol) de albumina de soro de cavalo (HAS, Life Technologies). HAS e glicerol previnem a morte se- guida de congelamento descongelamento. Uma titulação foi feita por laminação sobre placas ágar (100 ccg/ml de ampicilina) aumentando o volume de cada reação de transformação para calcular o volume dan- do 100 colônias, enquanto a reação de transformação de volume foi o armazenada a -80 C, Plasmídios recombinantes oriundos da biblioteca foram purificados até 96 de uma vez. A fim de se preparar 96 conjun- tos de 100 clones, o volume calculado correspondendo a 100 clones o foi laminado sobre ágar e foi desenvolvido por 20 horas a 37 C. O DNA purificado diretamente de colônias separadas de placas de ágar. Um ο estoque de cada cultura a 23% de glicerol foi armazenado a -80 C. O DNA foi purificado usando-se Qiawell ultra (Qiagen), usando-se um protocolo recomendado pelo fornecedor. Tipicamente, 10 oog de plas- mídio purificado foram obtidos, a concentração de cada preparação foi medida usando-se densidade ótica a 260 nm. Para subdividir conjun- tos selecionados de 100 em conjutnos de 10, 50 od de uma diluição de 1/250.000 do estoque de glicerol oriundo do conjunto original foram laminados sobre uma placa de ágar a 100 ocg/ml de ampícilina. Depois * do crescimento por 16 horas a 37 C, 160 colônias individuais foram replicadas sobre 16 placas de ãgar (10 por placa) e foram desenvolví- o das por 16 horas a 37 C, Dez colônias oriundas de cada placa foram coletadas e foram desenvolvidas em meio líquido [Caldo de Lu ri a (LB), 100 ocg/ml de ampícilina] por 3 horas a 37 C, Um estoque destas cultu- o ras a 30% de glicerol foi armazenado a -80 C, DNA de plasmídio foi preparado como antes. Para dividir subconjuntos de 10 em clones in- dividuais, 50 od de uma diluição de 1/250.000 do estoque de glicerol dos subconjuntos de 10 foram laminados sobre placa ágar com 100 o ocg/ml de ampícilina. Depois do crescimento por 16 horas a 37 C, 16 colônias individuais foram apanhadas e se desenvolveram por 16 ho- ras em 2 ml de LB 100 ocg/ml de ampícilina. Um estoque destas cultu- o ras a 30% de glicerol foi armazenado a -80 C. DNA de plasmídio foi preparado como antes.

Transfeccão transitória de células de Cos-1: [00158] Foi realizada usando-se o método de Chen and Okayama (1987). Transformação de alta eficácia de células de mamífero por DNA de plasmídio (Mol Cell Biol., 7, 2745-2752).

Culturas de retina de embrião de pinto: [00159] O protocolo foi adaptado de Adler e Hatlee [(1989) Science, 243, 391]. Retina embriônica de pinto (6 dias in ovo) é dissociada e é laminada em cultura de monocamada. Sob estas condições com au- sência de sinais de diferenciação, cones representam 60-80% de célu- las. Foram produzidos anticorpos policlonais em coelhos contra visini- na (um marcador de cone de frango, número de acesso do Genbank M84729) e verificado que a proporção de cones na cultura é de 60- 80%. O ambiente simples o modelo (meio quimicamente definido, au- sência de célula para contatos de célula) além da facilidade e veloci- dade do método se tornar um sistema muito apropriado para estudar fatores tráficos envolvidos na sobrevivência de cone. Resumidamente, retinas oriundas de embriões saídos de um isolado de controle de pro- genitores, são dissecadas depois de seis dias de desenvolvimento in ovo, células dissociadas e laminadas à baixa densidade (105 célu- las/cm2). Durante dez dias a viabilidade de célula (60-80% de cones) foi seguida usando-se ensaio VIVO/MORTO (Molecular probes, Euge- ne USA) um ensaio que quantifica células vivas e mortas. Numerosas células vivas diminuem até 8% de número de células iniciais depois de sete dias em cultura em meio quimicamente definido. Quando realiza- da na presença de meios condicionados de células de COS1 transfec- tadas com conjuntos de clones oriundos da biblioteca, células vivas são contadas depois de sete dias in vitro. [00160] Progenitores de frango (cepa 657 rótulo vermelho) foram mantidos em um compartimento separado para a finalidade desta ex- periência em uma instalação de chocamento de 25 km do laboratório.

Ovos fertilizados obtidos naturalmente foram coletados semanalmente, o e foram mantidos a 17 C (seu zero biológico) no laboratório depois do o chocamento. Diariamente, 5 ovos são incubados por 24 horas a 20 C -ο então 136 horas a 37 C que reversão intermitente da inclinação dos ovos em uma câmara umidificada, O dia da cultura, superfície de ovos é lavada com Mucocit-A então é quebrada, os embriões de frango são transferidos em PBS. O estágio de desenvolvimento de cada embrião é verificado ser a 29a por comparação visual com Hamburger and Ha- milton (1951), em (Essencial Development Biology, Stern e Holland Ed.). Dois dos embriões foram escolhidos e foram enucleados, os olhos foram transferidos em meio independente de C02 (Life technolo- gies). Retinas foram dissecadas e foram transferidas em tampão de Ringer e foram lavadas duas vezes. Retinas foram cortadas em peda- o ços pequenos e foram tratadas por 20 minutos a 37 C com uma solu- ção de tripsina (0,25% p/v). A reação foi parada por adição de meios de cultura (M199, Life Technologies) suplementada com 10% de FCS inativado. A suspensão de célula é tratada por poucos minutos em 25 od de DNAse I (1 mg/ml, Sigma). A suspensão de célula é então lava- da duas vezes em Meios de Cultura Definidos Químicos [CDCM], vo- lumes iguais de DMEM e meios de M199 (Life Technologies) e AB com suplementos (5 ccg/ml de insulina; 5 ccg/ml de "Transferir ring"; progesterona a 64 nM; putrescina a 0,1 mM; 5 ng/ml de selênio; tauri- na a 3 mM; citidina 5’-difosfoetanolamina a 2,7 <xM; citidina 5’- difosfocolina a 5,2 ocM, 0,2 ccg/ml de hidrocortisona; 3,3’-5-triiodo-L- trionina a 30 nM, piruvato de sódio a 1 mM), prostaglandina D2 a 0,3 ocM; 0,1 mg/ml de ácido linoléico] a fim de remover o FCS. A concen- tração das células manchadas com azul tripano é medida com célula de Mallassez e levada a duas concentrações (5,6 e 1,12 105 célu- las/ml) correspondendo às duas densidades de laminação (2 e 4 105 células/cm2). [00161] Meios condicionados oriundos de células transfectadas por Cos-1 são descongelados sobre gelo e 50 cd transferidos para duas placas pretas tratadas com cultura de tecidos de 96 cavidades (Cor- ning Costar) que foram revestidas com uma solução de 100 ocg/ml de poli-L-lísína (Sigma) de acordo com o plano: Primeiro ciclo de triagem: onde números referem-se a n° de conjuntos de 100 clones, C para meios condicionados de células de Cos-1 tranfectadas com o vetor vazio (pcDNA3) e P um controle positivo (meios condicionados trans- fectados com pcDNA-camundongoGDNF.

Segundo e terceiro ciclo de triagem: onde x {segundo ciclo) e y (terceiro ciclo) representam o n° dos conjun- tos selecionadas no primeiro e segundo ciclo respectivamente. 01 a 16 representam os subconjuntos usadas. x{y) representa a combinação parental a partir do qual os 16 conjuntos derivados. C é como é o pri- meiro ciclo. P foi modificado como pCMVScript-CNTF no segundo ciclo e progressiva mente para pcDNA-939.09.08 no terceiro ciclo. 0 repre- senta células de cone de pinto em meios de CDCM apenas. C57 e C3H, meios condicionados oriundos de explantes de retinas prepara- dos como descrito na (preparação de meios condicionados a partir de explantes de retinas de camundongo) a partir de retinas de camun- dongo de C57BL/6@N e C3H/He@N de 5 semanas respectiva mente. [00162] 50 od de suspensões de célula correspondendo a duas densidades (2 e 4 105 células/cm2) foram adicionados à cavidade das duas placas de 96 cavidades enchidas com meios condicionados com uma pipeta motorizada de 8 canais (Biohit) a fim de minimizar erros experimentais- Células foram incubadas por 7 días a 37 C em 5% de co2.

Preparação de meios condicionados a partir de explantes de retinas de camundonqo: [00163] O segundo e terceiro ciclo de triagem incluía controles posi- tivos adaptados de Mohand-Saíd e outros (1998). Camundongo de cinco semanas de idade 5C7BL/6@N (tipo selvagem} e C3H/He@N (rd1) foram sacrificados e foram enucleados, Duas retinas foram dis- o secadas e foram incubadas em 24 horas a 37 C em 5% de C02 em 1,5 ml de CDCM em placas de 12 cavidades. Meios condicionados foram recuperados e foram concentrados por um fator 40 por ultrafiltração sobre Vivaspin (Sartorius, ponto de corte 10 kDa). Meios condiciona- dos foram frisados em nitrogênio liquido e foram armazenados em alí- quotas a -20 C antes do uso, O dia de uso, meios condicionados foram descongelados sobre gelo, foram diluídos 10 vezes em CDCM e foram esterilizados por filtração sobre filtro de 0,22 cqn (Acrodisk 13, Gelman Sciences).

Ensaios funcionais, ensaio vivo/morto: [00164] Ensaio funcionai é baseado no número de células retinais de frango vivos depois de 7 dias de incubação ín vitro. Foi usado kit de ensaio Vivo/Morto (Molecular probes, Eugene, USA} que é baseado no uso de dois corantes fluorogênicos (Calceina AM e dímero de Etidío) mancham células vivas e mortas, respectiva mente. Uma célula que é viva possui uma atividade metabólica (aqui uma atividade de esterase) que converte o substrato (Calceina AM) em seu produto fluorescente que emite a 520 nm. A permeabilidade de membrana de uma célula morta é alterada e permite o manchamento de DNA do núcleo por dí- mero de Etídio que emite a 635 nm. Uma célula está viva: emitindo a 520 nm depois da excitação a 485 nm, ou morta: emitindo a 635 nm depois da excitação a 520 nm. Usando-se microsoopia epifluorescen- te, os dois tipos de células fluorescentes podem ser visualizados sepa- radamente. Depois de 7 dias, células in vitro foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro com Calcei na-AM a 2,7 qcM e dímero de Etídio a 0,3 mM.

Aquisição de imagem: [00165] Resumidamente, aquisição de imagem consistia em auto- focalização de cada cavidade, contagem automática de célula em dois seguida de fluorescência por processamento dos dados brutos usando o programa de computador especialista, por exemplo, Metamorph (Universal Imagíng Corporation, West Chester, USA) para obter ima- gens digitalizadas de cada cavidade da placa. Foi usado um microscó- pio invertido (Nikon TE 200) equipado com uma lâmpada epifluores- cente de mercúrio com dois filtros de excitação de 485 e 520 nm, dois filtros de emissão 520 e 635 nm, um objeto (x10), uma platina motori- zada dirigida por computador (Multicontrol 2000, Martzauzer e uma câmara CCD (Cohu). [00166] Para registrar a placa, ela é posicionada sobre a platina motorizada, e o foco feito manual mente sobre a primeira cavidade e este plano é registrado (origem de z). O limiar da imagem morta e viva é indicado a partir da primeira cavidade. O centro da primeira cavidade também é ajustado usando-se branco claro por alinhamento manual do fundo da primeira cavidade ao fundo da imagem no monitor de computador, então por alinhamento da extrema direita da primeira ca- vidade até a direita da imagem na tela do computador e para registrar as duas posições. O centro da primeira cavidade é calculado e dá a posição do centro de cada cavidade da placa. Foi observado no pro- cesso de desenvolvimento que há uma densidade levemente mais alta de células na aresta da cavidade e excluídos a aresta das aquisições. É importante que a imagem a partir de cada cavidade seja centrada perfeitamente a fim de evitar quaisquer resultados enganosos. Quando ligada, a primeira varredura da placa executa um registro de células mortas. A densidade de células mortas é menos variável sob estas condições. A aplicação executa uma autofocalização por tirar imagens em diferentes planos focais e escolher aquela mais brilhante, o foco direito. Esta posição z é armazenada e platina executa movimentos programados nos eixos x e y tirando um total de 4 imagens quando reconstituídas em uma imagem que representa 2/3 da superfície da cavidade. Uma pilha de imagens oriundas dos planos de foco é arma- zenada para controle. A platina executa uma autofocalização e quatro aquisições para cada cavidade da placa começando por cavidades A1 até A12, então B12 até B1, C1 até C12 etc. No fim, a platina se move do lado de fora da placa a fim de ultra-expor a última cavidade (H1). A varredura de células mortas leva 30 minutos. A segunda varredura (cé- lulas vivas) é executada depois da mudança do filtro. Esta segunda varredura está usando as posições z registradas de cada cavidade a partir da varredura morta. Quatro imagens são tiradas de cada cavida- de como para células mortas. No fim da segunda varredura (22 minu- tos) imagens reconstituídas vivas e mortas são armazenadas em uma fila que é chamada automaticamente com a data do dia. Números de células (mortas e vivas) são contados automaticamente com parâme- tros morfométricos pré-ajustados (mídia) e são exibidos no monitor do computador a fim de checar se a experiência está correta. É importan- te checar em uma base diária que o número de células vivas não é tão alto. Foi observado que se laminadas em densidade demasiademente importante, as células retinais de frango sobreviveram mais tempo mais provavelmente por produção de seu próprio fator de sobrevivên- cia. Foi triado células na ausência deste efeito. Antes da varredura a segunda placa (mesma experiência com duas vezes densidade de cé- lulas laminadas), foi adicionado um a no fim do nome do arquivo de log a partir da primeira placa. Imagens de cada experiência foram arma- zenadas em CD-rom. Foi gerado uma biblioteca de mais do que 250 CD-rom.

Seleção e contagem de células dos coniuntos: [00167] Os números de células (vivas e mortas) foram contados usando-se imagens de cada experiência armazenada em CD-rom. O arquivo de log a partir de uma experiência foi primeiramente carregado em um computador (contagem off-line) e foi aberta usando-se progra- ma Metamorph. Em uma primeira etapa, as imagens que correspon- dem às 14 cavidades C (meios condicionados a partir das células de Cos-1 transfectadas como vetor vazio) são abertas. Depois do ajuste o limiar da imagem, a análise de morfometria integrada de comando é usada para medir a distribuição das áreas entre 10 e 250 do objeto (número de células vivas para cada área total) para estas cavidades de controle, A distribuição segue uma curva de Gaussian com o núme- ro máximo de objetos que correspondem a uma célula isolada. Este valor padrão (SV) é então usado para calcular o valor da área acima da qual um objeto será contado como duas células (corte de objeto padrão, SOC) através de nossa função empírica: SOC = 20/20,74 SV. O valor de SOC de cada placa individual é usado para contar o núme- ro de células vivas da placa, Estes números são então transferidos pa- ra dentro de uma tabela excel. [00168] Para o primeiro ciclo de triagem, o valor foi representado graficamente para cada conjunto como diferença de vezes (números de células vivas aumentadas ou diminuídas) versus a média das 14 cavidades de controle + o desvio padrão. A fim de compensar as vari- ações vindo da diferença de posição dentro da placa, foi calculada a média da diferença de vezes individualmente entre as 80 cavidades que correspondem a posições onde as combinações são testadas e o controle de 14 cavidades para 200 placas independentes. Em média, as diferenças observadas são devido apenas à diferença de posição e números de células foram corrigidos com este coeficiente. A fim de discriminar de um modo mais rigoroso os conjuntos a serem selecio- nados, as contagens de células vivas foram combinadas como dife- rença em vezes versus como controlar todos os valores não exceden- do 1,3 mas excedendo 0,4. Deste modo, todas as combinações eram diferença de vezes versus as 14 cavidades correspondendo a vetor vazio estão no intervalo de 0,4 a 1,3 são consideradas como não ten- do nenhum efeito e usadas como controle. Depois da correção, a dife- rença de vezes versus controle das duas placas foi multiplicada e o resultado foi classificado por diminuição de diferença de vezes. Os conjuntos no topo daquela lista foram ulteriormente checadas por ins- peção visual do gráfico correspondendo àos 20 conjuntos da experiên- cia (ambas as placas) e das imagens de células vivas e mortas para evitar varrer conjuntos enganosos. [00169] Para o segundo ciclo e terceiro ciclo, as placas triando quanto a subcombinações incluem controle adicional. Foram prepara- dos meios condicionados a partir de explantes de retina de 5 semanas de idade. Foram selecionadas experiências onde efeitos positivos fo- ram registrados para explantes de retina de C57BL/6@N e foram des- cartados os outros. Os resultados foram representados graficamente como diferença de vezes versus as 14 cavidades de controle, nenhum recálculo do controle foi feito. A diferença de vezes versus controle das duas placas foi multiplicada e os resultados foram classificados por diminuição de diferença de vezes para as 16 subconjuntos. [00170] cDNA isolado foi seqüenciado usando-se iniciador T7 (5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3') em um sequenciador capilar (CEQ2000, Beckman Coulter). Sequência de DNA foi comparada com os dados de base usando-se Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).

Identificação de Rdcvf2 e homólogos humanos: [00171] Usando-se a sequência de Rdcvfl (a sequência de nucleo- tídeos que codifica os polipeptídeos indicados em SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4) e BLAST, polipeptídeos humanos e de murino homólo- gos foram identificados (figura 8). Clones EST com homologia a RdCVF2 de camundongo (no. de acesso GenBank: bcO 16199) foram identificados: nos. de acesso GenBank be552141, bi 517442, bg707818, bi603812, ai433287, be088414, bg297383, bg297304 (ver também a figura 12). Clones EST com homologia a Rdcvfl de camun- dongo (SEQ ID NO: 1) foram identificados: no. de acesso GenBank: bg299078, at716631, bg294111, be 108041, bg395178 (ver também a figura 13).

Análise de RT-PCR de tempo real de expressão Rdcvfl: [00172] A expressão retinal de Rdcvfl por G57BL/6@N e C3H/He@N de camundongo envelhecido bem como C3H (+/+ e rd/rd) de 5 semanas é estudada usando-se RT-PCR de tempo real no cicla- dor de luz (Roche) com kit de PCR sybergreen (Roche). cDNAs são produzidos por inicialização com um oligonucleotídeo de hexâmero aleatório (pdN6, Amersham), transcriptase reversa de M-MLV (super s- cript II, Life Technologies) e RN A total oriundo de retina de camundon- go são preparados como no 1). cDNAs são normalizados usando-se uma desidrogenase de glicose-6-fosfato mensageiro ubíqua (G6PDH). 0,2 od de síntese de cDNAs de primeiro fio (um equivalente de 10 ng de RNA total) é ampliado com 2 odVI dos oligonucleotídeos de SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25 em triplo em um volume total de 25 od usando- * se o seguinte programa: 30 segundos a 95 C, e 35 ciclos de uma se- ο ο quência (1 segundo a 95 C, 18 segundos a 55 C, 10 segundos a o 72 C). A análise (figura 16) mostra que expressão de Rdcvfl diminui depois da degeneração de bastonete no (C3H/He@N) camundongo rd1. Rdcvfl foi também mostrado ser diretamente expresso por fotor- receptores por RT-PCR de tempo real usando-se RN A preparado a partir da camada externa da retina por seccionamento por "vibratome".

Produtos foram checados por eletroforese de gel de agarose. Resulta- dos similares são obtidos com um outro par de iniciadores específicos de Rdcvfl. Como um controle positivo, a expressão de arrestina de bastonete (no. de Ass. M24086) é monitorada nas mesmas condições com iniciadores (5' CTATTACGTCAAGCCTGTAGCC 3' e 5' CA- TCCTCATCTTTCTTCCCTTC 3'). Confirmação de que Rdcvfl é o fator protetor de cone pode ser obtido por adição de uma quantidade de Rdcvfl a um explante retinal de (C3H/He@N) de camundongo rd1 de 5 semanas de idade. Pode-se chegar aquilo que é uma quantidade adequada por algumas experiências de titulação iniciais. Comparar com controles apropriados; depois de 7 dias de sobrevivência de cone será aumentada.

Análise de RT-PCR de Rdcvf2 [00173] RT-PCR para expressão de Rdcvf2 foi realizada usando-se iniciadores 5' GCCAGCGTTTTCTGCCTTTTAC 3' e 5' AAGCCCTG- CCTGCTCTAACATC 3'. A análise mostra que RdCVF2 é expressa de um modo dependente de bastonete e que expressão Rdcvf2 não é restrita à retina, mas que também outras células neuronais expressam Rdcvf2 (figura 17), enquanto que a expressão Rdcvfl parece ser restri- ta a células retinais.

Ensaios de morto/vivo de Rdcvfl ou Rdcvf2 [00174] Células de COS-1 são transfectadas com um vetor de ex- pressão adequado que porta o Rdcvfl ou Rdcvf2 sob controle de um promotor induzível. Células de controle são transfectadas com o vetor vazio. As células são incubadas por um período de tempo adequado quando da indução de expressão de Rdcvfl ou Rdcvf2. Subsequen- temente» o número de células de cone sobreviventes incubadas com meios condicionados oriundas de células de COS-1 transfectadas com Rdcvfl ou Rdcvf2 e o número de células de controle sobreviventes são contados de acordo com o método descrito acima. As células que ex- pressam Rdcvfl ou Rdcvf2 mostram quantidade significativamente mais alta de células sobreviventes.

Fator específico de bastonete [00175] Análise de RT-PCR em tempo real» realizada sob condições padrão, da expressão de arrestina de bastonete (controle) e Rdcvfl em explantes retinais de 5 semanas oriundos de C57BL/6@N 5 sema- nas e C3H/HE@N, usando-se os iniciadores: SEQ ID NO: 24: 5' TCTATGTGTCCCAGGACCCTACAG 3’ SEQ ID NO: 25: 5 TTTATGCACAAGTAGTACCAGGACAG 3' [00176] demonstra que RdCVFI é expresso apenas na presença de bastonetes (CVF1 derivado de bastonete).

Produção de anticorpos policlonais: [00177] Anticorpos policlonais são preparados por injeção de uma proteína de fusão purificada de glutation-S-transferase (GST) (GST- Rdcvfl) bem como a partir de aminoácidos 11 a 32 de sequência de peptídeo de RdCVFI de camundongo de SEQ ID N02 (Ab n°2) e ami- noácidos 79 a 96 de sequência de peptídeos de SEQ ID N02 (Ab n°3) em coelho. O constructo de fusão pGST-Rdcvf1 é preparado por am- pliação de oligonucleotídeos de SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:27 usan- do-se pcDNA-Rdcvfl como modelo sob condições padrão. O Quadro de Leitura Aberto (ORF) de Rdcvfl é clonado em quadro em pGex2TK (Pharmacia) entre os sítios de restrição de BamHI e de EcoRI, e e é transformado em E. coii [BL21 (DE3) pLysS, Promega] por procedí- mento padrão. Uma única colônia é desenvolvida em 3 litros de meios o líquidos de LB com 100 oqg/ml de ampicilina a 30 C e produção de pro- teína é induzida por adição de 1 ocg//ml de isopropiltio-beta-D- α galactosídeo (IPTG) e é continuada por 4 horas a 30 C. Células são coletadas, são lísadas por sonicação e são purificadas sobre sefarose de glutation sob protocolo padrão. A proteína de fusão é eluída com 10 mM de glutation reduzido à temperatura ambiente. A proteína eluída é dialisada em PBS antes da injeção para coelhos. Pureza de proteína é monitorada por eletroforese de gel de poliacrilamida. Dois coelhos são imunizados por injeção intradérmica em 80 sítios de 100 ccg de GST- Rdcvfl. Soro é coletado depois de 8 semanas.

Claims

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptí- deo selecionado do grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, e um veículo farmaceuticamente aceitável que compreende dex- trose.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o polipeptídeo é selecionado do grupo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 14.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido nu- cleico selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 3 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 5 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 7 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 9 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 11 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 13 ou a região codificadora da mesma, e um veí- culo farmaceuticamente aceitável que compreende dextrose.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de o ácido nucleico é selecionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 13.

5. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 3 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 5 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 7 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 9 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 11 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 13 ou a região codificadora da mesma, operavelmente ligada a uma sequência de controle de trans- crição heteróloga, em que o referido vetor é para uso em terapia gêni- ca de distrofia retinal.

6. Vetor de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pe- lo fato de que a sequência de ácido nucleico é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 7 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 13 ou a região codificadora da mesma.

7. Vetor de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é derivado de um adenovírus ou de um ví- rus adeno associado.

8. Método para o diagnóstico de distrofia retinal em um ser humano, caracterizado pelo fato de que compreende: detecção in vitro ou ex vivo da transcrição de RNA mensa- geiro transcrito correspondendo a um cDNA RDCVF1 ou RDCVF2 conforme descrito na SEQ ID NO: 5 ou a região codificadora da mes- ma, SEQ ID NO: 7 ou a região codificadora da mesma, SEQ ID NO: 13 ou a região codificadora da mesma, no olho de um ser humano, em que a transcrição diminuída relativa a transcrição no olho de um indiví- duo que não sofre de distrofia retinal é diagnóstico do referido ser hu- mano que sofre de distrofia retinal.

9. Método para o diagnóstico de distrofia retinal em um ser humano, caracterizado pelo fato de que compreende: medição in vitro ou ex vivo da quantidade de um polipeptí- deo de RDCVF1 ou RDCVF2 compreendendo uma sequência de ami- noácidos conforme descrita na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 14, em células bastonetes de um ser humano, em que a pre- sença de uma quantidade diminuída do referido polipeptídeo em rela- ção à quantidade do referido polipeptídeo em tecido de olho normal é diagnóstico do referido ser humano que sofre de distrofia retinal.

10. Método para a produção de polipeptídeos RDCVF tendo sequências de aminoácidos consistindo nas sequências de aminoáci- dos conforme descritas na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4, caracte- rizado pelo fato de que compreende: cultura de uma célula hospedeira tendo incorporada nela um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo derivado exoge- namente que codifica um polipeptídeo tendo sequências de aminoáci- dos consistindo nas sequências de aminoácidos conforme descritas na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4, sob condições suficientes para ex- pressão dos referidos polipeptídeos na célula hospedeira, e recupera- ção do polipeptídeo produzido pela referida célula.