JP2005537253A - 組織損傷の治療におけるおよび/または組織修復を促進するためのhmgb1の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
および/または循環性幹細胞の動員/増殖、および/または心筋細胞増殖の誘導によるものであろう。
命名
高移動度グループ蛋白質(high mobility group protein)は、最近、名称変更された。HMGB1に対する以前名/代替名は、高移動性グループ1、HMG1、HMG-1、アンホテリン(amphoterin)、およびp30である。
プラスミドHMGB1およびその断片は、記載されている(Mullerら、Biochemistry、40、10254〜10261頁、2001年)。蛋白質濃度は、Gillおよびvon Hippelの方法(Analyt. Biochem.、182、319〜326頁、1989年)を用いて分光学的に決定された。以下の吸光係数が、天然蛋白質のために使用されている: ボックスA: A280=9.98 103 M-1 cm-1、ボックスB: A280=1.15 104 M-1 cm-1、AB、ABbtおよび完全長HMGB1: A280=2.14 104 M-1 cm-1。
プラスミドpEGFP-HMGB1は、ラットHMGB1に関するcDNAのコード配列を、EcoRIおよびSacII制限部位を用いてpEGFP-N1 (Clontech)に挿入することにより生成された。pEGFP-H1c、pEGFP-NF1、pEGFP-HMGN2、およびpEF-フラッグ-mICADは、A. Gunjan、N. Bhattacharyya、R. Hock、M. BustinおよびS. Nagata (PhairおよびMisteli、Nature、404、604〜609頁、2000年; Misteliら、Nature 408、877〜881頁
、2000年; Enariら、Nature 391、43〜50頁、1998年)により恵与された。HeLa細胞および線維芽細胞(ラインVA1、Hmgb1+/+、およびラインC1、Hmgb1-/-)は、(Calogeroら、Nature Genet. 22、276〜280頁、1999年)に記載されたとおり増殖した。HeLa細胞は、pEGFP-HMGB1により電気穿孔され、18時間後に観察された。細胞集団におけるHMGB1-GFPの平均量は、HMGB1の1%と3%との間(抗HMGB1抗体による免疫ブロット法により)であった。単一細胞レベルにおいて、HMGB1-GFP量は、異なる細胞間で多くても10倍までの変化であり、分析には中等度の蛍光レベルを有する細胞を使用するように常時注意を払った。
細胞を平板培養し、Axiovert 135M顕微鏡(Zeiss)を用いてLabTek II室(Nalgene)中で観察した。FLIP実験を、(PhairおよびMisteli、Nature、404、604〜609頁、2000年)に記載されたとおり、Arレーザの488 nm励起線および500〜575 nmでの検出を用いてLeica TCS-SP共焦点顕微鏡上で実施した。細胞を退色し(半径1μMの点で、公称出力20 mW、200〜500 ms)、6秒間隔で画像化した(公称出力0.2 mW)。
Hmgb1-/-線維芽細胞を、2 ng/ml h TNF-アルファと35μMシクロヘキシミドとで処理した。16時間後、アポトーシス細胞は、皿を静かに洗い流して回収した。千万個のアポトーシスHmgb1-/-線維芽細胞および非アポトーシス対照集団を、0.32 Mショ糖、0.5% NP-40および、Cy5 (Pharmacia)で蛍光標識したまたは未標識の1μMの細菌で産生されたHMGB1を含有する50μl PBSに再懸濁した。平均標識は、1HMGB1分子当たり2.3 Cy5分子であった。室温で30分後、細胞サンプルを混合し、1.5μg/ml DAPIを含有するVectashield (Vector Laboratories)を用いてスライド上に載せて、TRITCフィルタ付のAxiophot顕微鏡(Carl Zeiss)上で観察した。未標識HMGB1と共にインキュベートされた2つのプールの細胞を、PBS中1.16 Mショ糖の5 mlおよびPBS中2 Mショ糖の6 mlクッションにより形成された不連続勾配に重ね、SW27 Beckmanロータ内で90分間30,000 gで遠心分離した。膜破片のないアポトーシスおよび非アポトーシスクロマチンを、チューブの底から回収し、12% SDS-PAゲルに塗布した。アポトーシスおよび非アポトーシスクロマチンに結合した組換えHMGB1量を、1:3000希釈の抗HMGB1抗体(Pharmingen)を用いる免疫ブロット法により測定した。また、アポトーシスおよび非アポトーシスクロマチンの一定分量を、抗アセチル-ヒストンH4 (R10、B. Turnerから贈与)、抗アセチル-ヒストンH3 (Lys 9、Biolabs)および抗アセチル-リジン抗体(Biolabs)により綿密に調べた。
HMGB1は、分裂間期細胞および有糸分裂細胞双方のクロマチンに疎に結合され、透過細胞または壊死細胞において膜の一体性が失われると、これは速やかに媒体中に漏出する(Degryseら、J. Cell. Biol. 152: 1197〜2006頁、2001年; Mullerら、EMBO J.、16、4337〜4340頁、2001年; Falciolaら、J. Cell Biol. 137、19〜26頁、1997年)。これらの結果は、生細胞において、HMGB1はクロマチンに迅速に会合し、また、そこから解離することを示唆している。これを証明するために、HMGB1は、そのC末端においてGFPで標識し、トランスフェクションアッセイ(Zappavignaら、EMBO J.、15、4981〜4991頁、1996年)においてHOXD9-応答性レポーター遺伝子の発現を高める非摂動HMGB1と等価なキメラ蛋白質を形成した。融合蛋白質を発現するHeLa細胞は、それらの核の均一な緑色蛍光により容易に検出できた。有糸分裂を受ける細胞は、拡散細胞質蛍光を示したが、また、凝集染色体へのHMGB1-GFPの明白な会合も示し、それはM期の間中続いた(図1a)。HMGB1-GFP形質導入HeLa細胞は、NP-40を透過させると、2、3秒後に大部分が蛍光を退色したが、クロマチンに対するHMGB1の疎性会合を確認した。しかしながら、2,3の細胞は、明色蛍光を保持した。それら核の特徴的な断片化の外観から、これらの細胞はアポトーシス性であると思われた。次いでHeLa細胞を、TNF-アルファとシクロヘキシミドとの処理によりアポトーシスを起こさせ、透過させ、内因性の未修飾HMGB1に対して免疫染色した。対照の非アポトーシス細胞は、全てのHMGB1を媒体に漏出されたが(図1b、d)、前記蛋白質は、アポトーシス細胞の核内に保持された(図1d)。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)のような溶解性蛋白質が、細胞外培地に漏出しれた場合、HMGB1は、長期インキュベートおよびアポトーシス細胞の部分的自己溶解後であっても核残存物と会合して大部分が保持された(図1e)。HMGB1およびHMGB1-GFPはまた、エトポシドまたはH2O2処理によりアポトーシスに誘導された、または非摂動培養で自然にアポトーシスしている(データは示さず) HeLa細胞および3T3細胞のクロマチンに堅固に結合された。対照的に、HMGB1は、壊死細胞のクロマチンから解離し、細胞外媒体に漏出した(図1c)。
、アポトーシス後の細胞残存物は、単球における強力な炎症応答を促進しなかった(図4b)。しかしながら、アポトーシスを受けながらTSAで処理された線維芽細胞は、凍結-解凍により殺処理された一次壊死細胞と同じく激しく炎症を促進した二次的壊死細胞残存物を生成した。
材料および方法
細胞
ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)は、(Palumboら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.、22、405〜11頁、2002年)に記載された新たに屠殺されたウシの胸部大動脈の切片から単離された。中胚葉性血管芽細胞は、以前に記載された(De Angelisら、J. Cell Biol.、147、869〜878頁、1999年)マウス胎仔の背部大動脈および幼若動脈から単離された。クローニング後、細胞を、マイトマイシンC処理STO線維芽細胞のフィーダー層上に展開した。中胚葉性血管芽細胞遺伝子発現パターンを示すクローン類(CD34の存在、キット、Flk1およびMEF2D)を、in vitroおよびin vivo実験に用いた。胎仔中胚葉性血管芽細胞(クローンD16)は、核LacZをコードするレンチウィルスベクターによって形質導入されるが、成体中胚葉性血管芽細胞(クローンG1)はDiIで標識され、次いでマウスの大腿大動脈に注入された。
完全長HMGB1蛋白質およびその断片の発現および精製は、以前に記載された(Mullerら、Biochemistry、40、10254〜10261頁、2001年)とおりに実施された。エンドトキシン類を、デトキシ-ゲルカラム(Pierce)を通過させて除去した。
細胞を、6ウェルプレート(1×105細胞/ウェル)に接種し、20% FCSを補ったRPMI中で増殖させた。24時間後、培地を無血清RPMIで16時間交換した。引き続き、細胞を、培地単独、または20% FCS または1、3、10、および30 ng/ml濃度のHMGB1添加の培地で増殖させた。細胞は、1日、2日および3日後にカウントし、トリパンブルー染色排除を、細胞生存のインジケータとして用いた。全ての実験は、3回重複して実施した。
細胞移動は、ボイデンチャンバーを用いてアッセイされた(Degryseら、J. Cell. Biol. 152: 1197〜2006頁、2001年)。簡単に言うと、8μmポアを備えたPVPを含まないポリカーボネートフィルタ(Costar)を、5μg/mlブタ皮膚ゼラチン(Sigma)でコートした。無血清RPMI (陰性対照)、10、50または100 ng/ml HMGB1を含有するRPMI、および20%血清を有するRPMI (陽性対照)を下部チャンバーに入れた。D16細胞は、RPMIプラス10% FCS中で増殖させ、一晩飢餓状態におき、浮遊細胞を除外するためにPBSで2回洗浄し、トリプシンにより収穫した。200μl RPMI中に再懸濁させた5000個の細胞を上部チャンバーに入れ、5% CO2中37℃で16時間インキュベートした。フィルタの上面に残っている細胞を機械的に除去し、下面の移動したものをエタノールで固定し、修飾ギームザ染色(Sigma)で染色し、1フィルタ当たり10の無作為領域において400×拡大率でカウントした。アッセイを3回実施し、独立した実験で3回反復した。
BAEC細胞を、単層を形成するまでポリカーボネートトランスウェル挿入物(3μmポア; Costar)上、DMEMプラス10% FCS中で5日間増殖させた。次いで前記挿入物を、ボイデン装置のチャンバー間に置き、単層の気密度を、室間でBSAの拡散を測定することによりチェックした。中胚葉性血管芽細胞(100μl RPMI中105細胞)を上部コンパートメントに入れて、HMGB1またはVEGF (R&D Systemsより、大腸菌で発現されるヒトVEGFの成熟した121個のアミノ酸変異体)を含有するRPMIを、下部コンパートメント(500μl)に入れた。37℃で8時間後、フィルタを取り外し、結果は、ケモタキシスアッセイに関して記載されたとおり評価した。これらの実験は、3回重複して実施された。
一晩飢餓状態に置かれた中胚葉性血管芽細胞を、RPMI培地単独、RPMIプラス20% FCSまたはRPMIプラス100 ng/ml HMGB1中、6、12、24または48時間増殖させた。細胞を洗浄し、70%エタノールで固定し、PBSプラス50μg/ml RNase A中50μg/mlヨウ化プロピジュウム(PI)で染色し、室温で30分間インキュベートした。DNA含量は、Standard CellQuestソフトウェアを用いて流動細胞計測(FACScan; Becton-Dickinson) により測定した。
1000万個の胎仔または成体の中胚葉性血管芽細胞を、20% FCSを補ったRPMI中100 mm皿に接種した。24時間後、細胞をRPMI単独中一晩飢餓状態に置いた。次に細胞をPBS中で洗浄し、CFDASE (Molecular Probes)を、室温で8分間2.5μMの最終濃度に加えた。染色は、10% FCSの添加によりクエンチし、細胞をRPMI中で洗浄した。次いで蛍光標識された細胞を、RPMI単独、RPMIプラス100 ng/ml HMGB1、またはRPMIプラス20% FCS中で増殖し、48時間後収穫した。次いで細胞をFACScan上で分析した。
BAEC細胞を、完全に集密になるまでガラスカバースリップ上で増殖させた。本文に記載された処理後、細胞をPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドにより室温で10分間固定した。次に細胞を、FITC共役ファロイジン(Sigma)で染色して、(Degryseら、J. Cell. Biol. 152: 1197〜2006頁、2001年)に記載されたとおり、アクチン細胞骨格を可視化した。
ヘパリンビーズ(直径34μm)を、HiTrapヘパリンHPカラム(Pharmacia)から回収し、PBS中で広範に洗浄した。次いでビーズ(20μl充填体積)を、60μg HMGB1と共に4℃で1時間インキュベートし、遠心分離により収穫し、PBSで2回洗浄し、PBS中再懸濁した。SDS-PAGEを実施し、ビーズ上のHMGB1量をチェックした。
HMGB1で装填されたヘパリンビーズ(20μl PBS中3μlビーズを含有するスラリー)または装填されていないビーズを、インスリンシリンジを用いて6週齢メスCD-1マウス(1群につき3匹)の脛骨前部筋に注入した。1時間後、中胚葉性血管芽細胞(4×105細胞/動物)を、以前記載された(Torrenteら、J. Cell Biol.、152、335〜48頁、2001年)とおり大腿骨大動脈を介して注入し、24時間後、動物を殺処理した。組織化学分析のために、脛骨前部筋のサンプルを液体窒素冷却イソペンタン中で凍結させ、低温槽切断した。厚さ10μmの連続筋肉切片を、LacZ標識細胞(Totsugawaら、Cell Transplant、11、481〜8頁、2002年)による実験のためにX-galで染色し、またはDiIによる実験のために直接可視化した。DiIはMolecular Probesから入手した。
HMGB1は血管関連胎仔幹細胞の増殖を刺激する
E9.5胎仔のマウス背部大動脈から単離された幹細胞(中胚葉性血管芽細胞)をin vitroで培養し、CD34、Kit、Flk1およびMEF2D細胞マーカー(Minasiら、Development. 129、2773〜2783頁、2002年) の存在に関して試験した。著者らは、これらのクローン(D16と呼ばれる)の1つを用いて、HMGB1が分裂促進剤として作用できるかどうかを評価した。
著者らは、HMGB1がラット平滑筋細胞(RSMC)に対して化学誘引物質であることを以前に示している(Degryseら、J. Cell. Biol. 152: 1197〜2006頁、2001年)。次に、彼らは、HMGB1が、D16細胞に対しても化学誘引物質であるかどうかを調べた。改造ボイデンチャンバーを用いるケモタキシスアッセイにおいて、HMGB1は、濃度依存様式でD16細胞の移動を刺激した(図9A)。HMGB1のアミノ酸166〜181 (抗166〜181、図7A)に対して上昇したポリクローナル抗体は、移動性応答を有意に減少させた。しかしながら、前記移動性応答は、ボックスAを認識する抗HMGB1モノクローナル抗体によっては影響を受けなかった。
中胚葉性血管芽細胞は、一般的な循環により損傷組織に移動することができる血管関連幹細胞であり(Sampaolesiら、未発表データ)、内皮バリアを通して移行する能力を有する。したがって、著者らは、HMGB1が、ボイデン装置の室間のセプタム上で増殖された内皮単層を越えた幹細胞の遊出もまた促進できるかどうかを試験した。著者らは、100 ng/ml HMGB1を下室の媒体に加えた場合、添加物のない媒体と比較すると、単層を交差するD16細胞数は、8倍増加した(図10B)。HMGB1は、血管内皮成長因子(VEGF)よりも高い効力を有し、シグナル分子は、内皮バリアを越えた細胞移動を促進することが知られている。VEGFは、経細胞質ストレス線維の形成および内皮バリア機能を維持するために重要な固着接合部の分解を特徴とする内皮細胞の深在性細胞骨格の再組織化を誘導する(Rousseauら、J. Biol. Chem.、275、10661〜72頁、2000年; Esserら、J. Cell Sci.、111、1853〜65頁、1998年)。したがって、著者らは、内皮細胞に対するHMGB1の効果をVEGFの効果と比較した。
著者らは最後に、中胚葉性血管芽細胞のin vivo移動を制御するためのHMGB1の能力を評価した。ヘパリンビーズは、3μg/mlの濃度のHMGB1により装填してから、マウスの脛骨前部筋に細針により注入した。核LacZの発現を生じるレンチウィルスベクターにより形質導入されたD16細胞を30分後に、大腿骨大動脈を介して注入した(材料と方法を参照)。24時間後にマウスを殺処理し、脛骨前部筋を取り出し、切片にし、免疫組織化学により分析した。HMGB1装填ビーズにより注入された筋肉は、模擬注入筋肉(示さず)および非装填ヘパリンビーズにより注入された筋肉の双方と比較してかなりの腫脹を示し(図11A)、HMGB1はかなりの筋肉炎症を生じることを示唆した。このことは、炎症誘発性サイトカインとしてのHMGB1の役割と一致する。
)。非装填ビーズにより注入された筋肉からの切片は、全く青色細胞を有さなかった(パネルB)。
これらの知見は、胎仔中胚葉性血管芽細胞の移動および増殖に対する炎症誘発性サイトカインの1つである細胞外HMGB1の役割を特定する。しかしながら、組織損傷が存在しても胎仔に炎症は生じない。次に、著者らは、HMGB1がなおその上、成体中胚葉性血管芽細胞に対する効果を有するかどうかを求めた。
免疫組織化学分析
心臓を、梗塞から1週目の心拡張期に停止させ、10% (体積/体積)ホルマリンで逆行灌流し、パラフィンに埋包し、4μmの切片とした。切片を、組織学的試験用にヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色するか、または免疫組織化学分析用に処理して、新たに形成された心細胞を確認した。以下の抗体を、心臓分化の評価に使用した: ウサギポリクローナルコネキシン43抗体(Sigma、米国ミズーリ州セントルイス)、マウスモノクローナル抗α-筋節アクチン(クローン5C5; Santa Cruz Biotechnology州サンタクルーズ)、ウサギポリクローナル抗MEF-2(C-21; Santa Cruz)。Ki67は、マウスモノクローナル抗体Ki67 (クローンMIB5 Novocastra Laboratories、英国)を用いることにより検出された。FITC共役ヤギ抗ウサギおよびTRITC共役ヤギ抗マウス(Sigma)を二次的抗体として使用した。
心エコー検査は、13-MHz線形変換器を具備したSequoia 256c装置を用いて意識のあるマウスにおいて実施された。二次元画像およびM-モード投影図は、乳頭筋のレベルで胸骨傍の短軸図から記録された。M-モード投影図から、拡張期および収縮期における解剖学的パラメータが得られた(Orlicら、Nature、98、10344〜10349頁、2001年)。血行動態試験に関して、マウスを、抱水クロラール(400 mg/kg体重)で麻酔にかけ、右頚動脈を、ミクロチップ圧変換器(Millar 1.4F)でカニューレ挿入し、左心室圧(LV、LV+および-dP/dt)を測定した。
HMGB1は、梗塞心臓において新たな筋細胞形成を促進する
心筋梗塞は、C57BL/6マウスにおいて麻酔下で左冠動脈を結紮することにより誘導した(Liら、J. Clin. Invest.、100、1991〜1999頁、1997年)。4時間後、動物を再手術し、200 ngの精製HMGB1を、左心室の梗塞周囲領域に投与した。梗塞マウスからなる対照動物に、200 ngの無関係蛋白質(GST)を注入した。
梗塞1週後、著者らは、生存マウスにおいて心エコー検査および血行動態パラメータを調べた。模擬手術マウスと比較して、HMGB1で処理されてもされなくても梗塞動物は、心不全の指標を示した。しかしながら、梗塞だが未処理マウスと比較すると、HMGB1で処理したマウスは、心臓性能の有意な回復を示した。駆出率 (EF)は、GST処理マウスよりもHMGB1処理マウスにおいて51%高かった(図14)。LV終末拡張期圧(LVEDP)は、GST処理マウスよりも39%低く、模擬手術マウスで得られたものと同様のレベルに到達した(図15)。LV発生圧(LVDP)ならびに+および-dP/dTにおける変化もまた、HMGB1処理マウスにおいて改善し、上記対照からすると、それぞれ34%、39%および45%の増加を示した。
Claims (18)
- 組織損傷の治療のため、および/または組織修復および再生を促進するための、有効量のHMGB1蛋白質またはその機能性部分、またはHMGB1発現ベクターを含む組成物。
- 前記組織再生が、結合組織を除き、損傷を受けたものと同じタイプの細胞の増殖に依る請求項1に記載の組成物。
- 前記組織が、心筋または骨格筋である請求項2に記載の組成物。
- 前記組織修復および/または再生が、壊死領域の修復および/または再生を含む請求項3に記載の組成物。
- 前記壊死領域が、外傷部位、梗塞心臓などの虚血部位、火傷部位を含む請求項4に記載の組成物。
- 有効量の抗炎症剤をさらに含む請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組織修復部位における灌流のために希釈剤および/またはアジュバントをさらに含む請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
- 筋肉内注射のために希釈剤および/またはアジュバントおよび/または担体をさらに含む請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
- 幹細胞にさらに関連する請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、中胚葉性血管芽細胞である請求項9に記載の組成物。
- 近傍の生存細胞の活性化、骨髄細胞の動員および活性化、内皮のバリア機能の喪失、浮腫などの、壊死組織により誘導される副作用の治療のための、有効量のHMGB1蛋白質のアンタゴニストを含む組成物。
- 前記壊死組織が、腸梗塞、急性膵炎および広範囲な外傷に関連している請求項11に記載の組成物。
- 前記壊死組織により誘導される副作用が、敗血症および多臓器不全などの長期壊死作用を含む請求項12に記載の組成物。
- 前記HMGB1アンタゴニストが、HMGB1抗体およびその機能的組換え体または合成部分、干渉RNA、アンチセンスRNA、合成または天然モジュレーターを含む請求項11から13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物を、壊死事象の16時間以内に投与する請求項11から14のいずれか一項に記載の組成物。
- 有効量の前記HMGB1蛋白質またはその機能性部分に幹細胞を曝露させるステップを含む、細胞培養においてまたはin vivoで幹細胞の移動および/または増殖を促進させる方法。
- 前記幹細胞が、定住心幹細胞または循環性幹細胞である請求項16に記載の方法。
- 有効量の前記HMGB1蛋白質またはその機能性部分に心筋細胞を曝露させるステップを含む、細胞培養においてまたはin vivoで心筋細胞の増殖を促進させる方法。
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Christian Weber | Word count: 1584 Main text word count: 796 |
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