MXPA05000302A - Uso de hmgb1 en el tratamiento de dano de tejido y/o para promover la reparacion de tejido. - Google Patents

Abstract

Se describe una composicion que comprende una cantidad eficaz de la proteina HMGB1 o partes funcionales de la misma, o vectores que expresan HMGB1, para el tratamiento de dano de tejido y/o para promover la regeneracion y reparacion de tejido. Ademas se describe una composicion que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de la proteina HMGB1 para el tratamiento de efectos adversos inducidos por el tejido necrotico, tales como el reclutamiento y activacion de celulas mieloide, la perdida de la funcion de barrera del endotelio, y edema.

Description

USO DE HMGB1 EN EL TRATAMIENTO DE DAÑO DE TEJIDO Y/O PARA PROMOVER LA REPARACIÓN DE TEJIDO ANTECEDENTES TÉCNICOS HMGB1 (Proteína grupo 1 de alta movilidad) es tanto un factor nuclear como una proteína secretada. En el núcleo celular ésta actúa como un factor de unión de cromatina arquitectónico que une el ADN y promueve la instalación de proteína en objetivos de ADN específico (Bustin, Mol. Cell. Biol. 19, 5237-5246, 1999). Fuera de la célula, se une con alta afinidad a RAGE (receptor para los productos finales de glicación avanzada) (Horiet et al., J. Biol. Chem. 270, 25752-25761, 1995), y es un mediador potente de inflamación (Wang et al., Science 285, 248-251, 1999; Abraham ef al., J. Immunol. 165, 2950-2954, 2000; Andersson ef al., J. Exp. Med., 192, 565-570, 20009. HMGB1 se secreta activamente por monocitos activados y macrófagos (Wang et al., Science 285, 248-251, 1999), y se libera pasivamente por células dañadas o necróticas (Degryse ef al., J. Cell Biol. 152: 1197-2006, 2001; Müller ef al., EMBO J., 16, 4337-4340, 2001; Falciola et al., J. Cell Biol. 137, 19-26, 1997). Wang ef al. (Science, 285, 248-251, 1999) identificaron la HMGB1 como un último mediador de letalidad de endotoxina en ratones. Éstos mostraron que los monocitos/macrófagos estimulados por LPS, TNF o IL-1 secretaron HMGB1 como una respuesta retardada. En ratones, la administración de anticuerpos anti- HMGB1 atenuaron la endotoxemia inducida por LPS; de manera contraria, la inyección de HMGB1 originó choque tóxico. Además, los pacientes sépticos mostraron niveles de suero elevados de HMGB1, los cuales se correlacionaron con la severidad de la infección (EU 6,303,321; WO 00/47104). Por consecuencia, la HMGB1 también se mostró que originó inflamación aguda de pulmón cuando se administró intratraquealmente (Abraham et al., J. Immunol. 165, 2950-2954, 2000). Los anticuerpos contra la HMGB1 redujeron el edema de pulmón y la migración de neutrófilos, mientras que no redujeron los niveles de las otras citoquinas proinflamatorias TNF-alfa, IL-1beta o macrófago-inflamatorio-proteína-2 (MIP2). Los pituicitos, que proporcionan un enlace importante entre los sistemas neuroendocrinos e inmunes, liberan la HMGB1 en respuesta a los estímulos específicos como TNF-alfa e IL-1beta, sugiriendo que la HMGB1 también participa en la regulación de respuestas inmunes y neuroendocrinas a los procesos inflamatorios (Wang et al., Surgery, 126, 389-392, 1999). Sin embargo, la mayoría de las células (incluyendo los linfocitos, células adrenales o células del riñon) no son capaces de secretar la HMGB1. Los fenómenos investigados por los grupos de Wang y Andersson dependen de la secreción activa (si es no convencional) de HMGB1 por las células específicas, que responden a la estimulación específica por citoquinas proinflamatorias. La secreción de HMGB1 requiere al menos 16 horas después de la estimulación celular, y de esta manera es un último caso en la inflamación. El papel de la HMGB 1 secretada es de esta manera reforzar y prolongar la inflamación que se inició por algún otro caso. En contraste, los autores ahora han demostrado que la H GB1 liberada por las células necrótícas puede ser el activador inicial para las respuestas inflamatorias, y que la H GB1 activada por sí misma puede activar las células inflamatorias. La difusión y liberación de H MGB1 puede tener lugar en cuestión de segundos o minutos, y de esta manera es un caso muy temprano en la inflamación. La habilidad de ciertos tipos de célula para secretar HMGB 1 sin morir por lo tanto debe ser de un tipo de mimetismo molecular: estás células han desarrollado la habilidad de secretar la misma molécula cuya presencia extracelular señala el daño de tejido. Los autores de la presente invención reportan que las células necróticas Hmgb 1" tienen una habilidad mayormente reducida para promover la inflamación, con la condición de que la liberación de H MGB1 pueda señalar la transmisión de una célula a sus vecinos, y el daño de tejido al resto del organismo. Además, las células apoptóticas no liberan HMGB1 aún después de superar la necrosis secundaria y la autolisis parcial, y de esta manera fallan en promover la inflamación aún sino se clarifica prontamente por las células fagocíticas. En las células apoptóticas la HMGB1 se une firmemente a la cromatina debido a la modificación de cromatina generalizada, y se libera en el medio extracelular (promoviendo la inflamación) si la deacetilación de cromatina se previene. De esta manera, las células que superan la apoptosis se programan para retener la radiodifusión de señal por las células dañadas o muertas por trauma. Por lo tanto, a pesar de que la HMGB1 es un componente abundante de cromatina, también tiene un papel como una proteína extracelular, soluble. La siguiente sucesión de casos podría contemplarse: Necrosis->liberación de HMGB1 primaria->activación de célula ínflamatoria->secreción de citoquinas->activación adicional y reclutamiento de células inflamatorias->secreción de H GB1 por células inflamatorias->el ciclo continúa con la secreción de citoquinas y la activación adicional y reclutamiento de las células inflamatorias. Este ciclo creará una retroalimentación positiva, con respuestas inflamatorias fuertes. El ciclo deberá romperse en el mismo punto para interrumpir las respuestas inflamatorias. Además de activar la inflamación, la H MGB1 también activa otros sistemas de protección o reparación de tejido. Se muestra en la presente invención que la HMGB1 puede promover la migración y la proliferación de células cuya función es reparar el daño de tejido. Además entre estas células se encuentran las células germinales. Como un ejemplo del reclutamiento de célula germinal y proliferación , los autores han demostrado el efecto in vitro e in vivo sobre las células germinales asociadas al vaso, los mesoangioblastos. Como un ejemplo de la aplicación práctica inmediata para la HMGB1 como una señal para el daño de tejido, los autores han investigado la regeneración y recuperación funcional de tejido miocardial después del infarto del corazón. Ventajosamente la HMGB 1 promueve la regeneración y recuperación funcional de corazón infartado. El infarto al miocardio cond uce a la pérdida de tejido y deterioro del funcionamiento cardíaco. Una de las metas terapéuticas pri ncipales de la cardiología moderna es diseñar estrategias auxiliadas en la minimización de necrosis miocardial y optimización de reparación cardiaca siguiendo el infarto al miocard io. A pesar de que se han obtenido resultados prometedores con el transplante y movilización de las células de la médula ósea al área del infarto (Orlic et al. , Circ Res. , 27, 1 092-1 1 02, 2002) , hasta ahora las señales que regulan las células germinales que se alojan en áreas de la lesión de tejido no se caracterizaron bien . WO 02/074337 describe q ue la H GB 1 puede ser activa en la regeneración de tejido conectivo . Las células de tejido conectivo no se relacionan de manera embrionógica a las células objetivo de la presente invención. WO 00/471 04 reivindica una composición farmacéutica para tratar las cond iciones (enfermedades) caracterizadas por la activación de la cascada de citoquinas inflamatorias, como la sepsis y obesidad , comprend iendo una cantidad eficaz de un antagonista o inhibidor de H GB1 .

DESCRIPCIÓN DE LA I NVENCIÓN Por lo tanto, un objeto de la presente invención es una composición q ue comprende una cantidad eficaz de la proteína H MGB1 o partes funcionales de la misma, o vectores que expresan la H MGB 1 , para el tratamiento de daño de tejido y/o para promover la regeneración y reparación de tejido. Preferentemente, la regeneración de tejido depende del crecimiento de las células del mismo tipo como aquellas dañadas, excluyendo de esta manera el crecimiento del tejido conectivo para reemplazar el tejido perdido. Más preferentemente, el tejido es cardíaco o músculo esquelético. En un aspecto específico de la invención, la regeneración y/o reparación de tejido incluye la reparación y/o regeneración de áreas de necrosis, preferentemente sitios de trauma, sitios de isquemia incluyendo corazón infartado, sitios de quemadura. En un aspecto preferido de la invención, la composición además comprende una cantidad eficaz de un agente de antiinflamación. El experto del campo seleccionará el agente de antiinflamación más adecuado. En un aspecto preferido de la invención, la composición además comprende diluyentes y/o adyuvantes para la perfusión en el sitio de reparación de tejido. Alternativamente, la composición además comprende diluyentes y/o adyuvantes y/o vehículos para la inyección intramuscular. En un aspecto preferido adicional de la invención, la composición se asocia a las células germinales, preferentemente mesoangioblastos. Otra modalidad de la presente invención es una composición que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de la proteína HMGB1 para el tratamiento de efectos adversos inducidos por el tejido necrótico, tal como el reclutamiento y activación de células de mieloide, la pérd ida de la función de barrera de endotelio, y edema. En un aspecto preferido de la invención, el tejido necrótico se refiere al infarto intestinal , pancreatitis aguda y trauma extensivo. En un aspecto preferido de la invención , los efectos adversos inducidos por el tejido necrótico incluyen los efectos a largo plazo de la necrosis, tal como sepsis y falla múltiple de órgano. El experto en la materia intentará q ue el término "antagonista de HMGB1 " comprenda pero no se limite a los anticuerpos H MGB 1 y porciones sintéticas o recombinantes funcionales de los mismos, ARNs de interferencia, ARNs antisentido, moduladores naturales o sintéticos . En un aspecto particular, la composición se administra ventajosamente dentro de 1 6 horas del caso necrótico. Otro aspecto de la invención es un método para promover la migración de célula germinal y/o proliferación en cultivo celular o in vivo comprendiendo la etapa de exponer tales células a una cantidad eficaz de la . proteína H MGB 1 o partes funcionales de la misma. Preferentemente , las célu las germinales son células germinales de circulación o cardíacas residentes. Otro aspecto de la invención es un método para promover la proliferación de cardiomiocitos en el cu ltivo celular o in vivo comprend iendo la etapa de exponer tales células a una cantidad eficaz de la proteína HMGB 1 o partes funcionales de la misma.

DESC RIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los autores han demostrado que la HMGB1 se libera por (as células necróticas, pero no se limita por las células apoptóticas. De tal manera, la H MGB 1 puede señalar el daño de tejido, ya que el daño de tejido produce la muerte celular no programada (necrosis). Los primeros efectos de HMGB 1 liberada por las células necróticas (en una cuestión de segundos o minutos) serán la activación de células de primer plano, la pérdida de la función de barrera del endotelio, el reclutamiento y la activación de células mieloide, y la activación de la inflamación. Como una respuesta más retardada, HMGB1 (ya sea directamente liberada por células necróticas, o activamente secretadas por las células inflamatorias activadas) promoverá la migración de ciertos tipos de célula, incluyendo células germinales, al sitio de daño de tejido, y su proliferación. Específicamente, tanto las células germinales asociadas por vaso embriónico (mesoangioblastos) como adultas se proliferan cuando se estimulan con H GB1 . La HMGB1 también fue capaz de inducir la migración de mesoangioblasto así como también la transmigración a través de una barrera endotelial. In vivo, las perlas de heparina que contienen HMGB1 inyectada en el músculo tibial fueron capaces de atraer los meso-angioblastos que llevan el lacZ nuclear inyectado en la arteria femoral.

Los datos ¡n vivo muestran que la H G B1 promueve la regeneración de corazones infartados. Como una materia de hecho la HMGB 1 ind uce los miocitos recientemente formados en el corazón infartado. El tejido recientemente formado es visi ble al colorearse con hematoxilina y eosina y expresa los marcadores moleculares cardiacos tales como acti na alfa-sarcomérica, conexina 4, MEF2 y otros. El tejido recientemente formado es altamente proliferativo seg ún se observa por la expresión de K¡67. La HMG B 1 induce de esta manera la proliferación y diferenciación cardiaca en el corazón infartado. Además , los corazones tratados por H MG B 1 mejoraron la función cardíaca según se prueba por los parámetros hemodinámicos y ecocardiográficos . El efecto de la H MGB1 sobre la recuperación del corazón isquémico podría deberse al reclutamiento/proliferación de células germinales card íacas residentes presentes en el corazón y/o al reclutamiento/proliferación de células germinales circulantes, y/o la ind ucción de proliferación de cardiomiocito. La regeneración de tejido card iaco ind ucido por HMG B 1 y su efecto sobre la recuperación de función miocardial es comparable a aq uellas observadas después del transplante de la célula germinal de las células germinales hematopoyéticas (HSC) inyectadas directamente hacia el corazón (Orlic eí al. , Nature, 41 0, 701 -705, 2001 ) . La invención representa un n uevo procedimiento potencial a utilizarse en el tratamiento de infarto del miocard io. La H MG B 1 puede utilizarse sola (o junto con la terapia celular) para todos los tipos de regeneración de tejido. Esto representa una ventaja en comparación a los procedimientos de regeneración basados en célula germinal, los cuales requieren la extracción y expansión de G P, se someten al rechazo de transplante/respuesta inmune, requieren la aprobación bioética y no se envasan fácilmente en un producto industrial. La H MGB1 puede tener la única capacidad de inducir la proliferación de cardiomiocitos y de esta manera la aplicación terapéutico en diversas patologías cardíacas. La H MGB1 puede administrarse como una proteína recombinante inyectada en la pared de contracción que limita el infarto o en perlas de heparina en el músculo tibial. Sin embargo, debido a la vida media corta de la proteína, el esquema de administración puede necesitar dosis repetidas o altas para lograr efectos terapéuticos. Por lo tanto, un procedimiento de terapia de gen podría utilizarse ventajosamente. Un ácido nucleico que se codifica para H MGB 1 puede llevarse a cabo en células en vectores adecuados (plásmidos, virus). La dosificación también es un factor para controlarse profundamente siendo HMGB1 una molécula inflamatoria. En el estudio actual en isquemia, 200 ng de proteína se inyectó en los aspectos posteriores y anteriores del miocardio viable limitando el infarto. Esta dosis es aproximadamente 2000 veces inferior a la dosis requerida para la inflamación sistémica.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS La invención ahora se describirá con referencia a las siguientes Figuras: Figura 1. Asociación de cromatina de HMGB1 en células HeLa muertas y vivientes. El medio que baña las células (S) se analizó por SDS-PAGE a lo largo de las células (P). Las histonas se visualizaron por la coloración Comasíe, la HMGB 1 por inmunomanchado o inmunocoloracón con anticuerpos anti-HMGB1 , ADN con DAPI . Escalas gráficas, 7.5 µ??. a, Células vivientes que expresan HMGB1 -GFP, representadas por imágenes por el contraste de interferencia diferencial y en fluorescencia verde, b, Células de interfase, después de la permeabilización. c, Células necróticas, no permeabilización. La cantidad de HMGB1 en el medio fue proporcional al número de células necróticas (aproximadamente 50%). d, Células apoptóticas, con permeabilización. e, Cinética de HMGB1 y liberación de dehidrogenasa de lactato (LDH) de células que superan la apoptosis y necrosis secundaria. Figura 2. Dinámica de HMGB1 en células apoptóticas y vivientes. Escalas gráficas, 2.3 µ?t? (a, b) y 3.7 µ?? (e, f). Representación por imágenes FLIP (a) y cuantificación (c) de H GB 1 -GFP en una célula de interfase. El área indicada por un círculo se blanqueó repetitivamente, y las células se representaron por imágenes entre pulsos blanqueadores. El núcleo de célula circundante no se afectó. Representación por imágenes FLIP (b) y cuantificación (d) sobre una célula mitótica. El blanqueamiento se ejecutó en el citoplasma (círculo), y la cuantificación se hizo tanto sobre una mancha diferente en el citoplasma, o sobre una mancha sobre los cromosomas condensados. Representación por imágenes FLI P en una célu la apoptótica (e), y en una célula que supera la apoptosis en la presencia de 200 ng/ml de TSA (f), y su cuantificación (g). h , cuantificación FLI P de G FP-H G N2 en células apoptóticas y vivientes. Figura 3. Cambios de cromati na que se originan en apoptosis crean los sustratos de u nión para HMG B1 . Escalas gráficas , 9.5 µ??. a, b Bacterialmente elaboraron H MGB1 (ya sea marcada con Cy5, a, o no marcada, b) se une a la cromatina de fibroblastos Hmgb V'~ apoptóticos, pero no a aquella de fibroblastos no apoptóticos, según se visualiza por el microscopio (a) o Western blotting (b). Las histonas se visualizaron por la coloración Comasíe. c, la fragmentación de ADN no es responsable de la unión de H MGB 1 a los núcleos apoptóticos. Las cél ulas HeLa (q ue expresan una forma etiq uetada de ICAD , o control) se ind ujeron en apoptosis (apoptóticas, líneas 2 y 4) o se trataron falsamente (vivientes, l íneas 1 y 3). I CAD en apoptosis se divide por caspasas y pierde la etiq ueta FLAG (Western, anticuerpos anti-FLAG; l ínea 4). La electroforesis de gel de agarosa evidencia la división internucleosomal de ADN cromosomal en células tipo silvestre apoptóticas (línea 2), y su inhibición en células q ue expresan ICAD apoptóticas (línea 4). Las células apoptóticas que expresan ICAD se permeabilizaron , se fijaron y se colorearon por AD N , HMG B 1 y TUN EL. Mientras q ue todas las células son TUNEL-negativas, la HMGB1 se retuvo firmemente en el núcleo de la célula que muestra la condensación de cromatina (en la esquina derecha superior). d, Extractos totales de aproximadamente 5 millones de células HeLa apoptoticas y vivientes se sometieron a electroforesis 2-D e inmunomanchado con anticuerpos anti-HMGB1. Las múltiples formas acetilatadas de HMGB1 son visibles, pero no hay diferencia detectable entre las dos muestras. e, Histona H4 en células apoptoticas es hipoacetilatada. El inmunomanchado se realizó con anticuerpo R10 (específico para las formas acetilatadas de H4). Figura 4. La liberación de H GB1 promueve respuestas inflamatorias, a, Las células necróticas que carecen de HMGB1 no producen la producción de la citoquina TNF-a proinflamatoria por monocitos. Las barras representan los errores estándar (n=3). b, Las células apoptoticas que superan la necrosis secundaria y autolisis parcial no promueven respuestas inflamatorias, al menos que HMGB1 se movilice por el tratamiento con TSA. El experimento se repitió 3 veces en duplicado, con 2 diferentes cantidades de células apoptoticas para asegurar la linealidad en producción TNF-alfa. Los valores se normalizan a un valor de 1 para la cantidad de TNF-alfa agregada después del cambio con 0.2 x 105 de células apoptoticas. c, Los anticuerpos anti-HMGB1 reducen la inflamación en el hígado lesionado por la sobredosis de acetaminofen (AAP). La lesión del hígado (actividad de transaminasa alanina en suero) y el reclutamiento de célula inflamatoria (actividad de mieioperoxidasa en extractos totales de hígado) se valoró después de 9 horas. Las proporciones de MPO/ALT indican la inflamación normalizada para el daño de hígado. Cada punto representa un ratón, la barra indica el valor medio, y la sombra gris indica el área incluida dentro del error promedio + estándar. Las comparaciones en pareja (prueba Mann-Whitney) entre los grupos de ratones se indican por las flechas. Figura 5. Ensayo quimiotáctico HMGB1 en células estam'males. Los ensayos de quimiotaxis se realizaron utilizando las cámaras Boyden modificadas. El valor de 1 corresponde al número de células que migran en la ausencia de cualquier estimulador (migración de célula al azar). Los datos representan el promedio + SE. La importancia estadística del resultado es P<0.0001 en un modelo ANOVA. El tratamiento con HMGB1 más anti-HMGB1 dio resultados que no difieren estadísticamente del control no estimulado. El tratamiento de células D18 con el anticuerpo anti-HMG1 solo, o un anticuerpo no específico, también fueron indistinguibles del control no estimulado. Figura 6. Curva de crecimiento de las células estaminales en la presencia de HMGB1. Las células D18 5x104 se laminaron en cavidades de 3 cm y crecieron por 24 horas a 37°C en 5% de C02, en RPMI complementado con 20% de suero de bovino fetal (FBS). El medio se reemplazó así con RPMI (no suero) por 16 horas. Por consecuencia, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene RPMI solo, 20% de FBS, y RPMI con HMGB1 en las concentraciones indicadas (no suero). Las células se colectaron en los tiempos indicados (días 1 , 2 y 3) y se contaron con hematocitómetro. Las células en RPMI solo no se dividieron, mientras que las células en RPMI más HMGB1 se dividieron activamente por al menos 24 horas, y después más lentamente debido a la exhaustación de nutrientes. En el día 3, sin embargo, todas las láminas con células D1 8 se estimularon con HMGB1 (todas las concentraciones) contuvieron algunas células de división, según se evalúa por inspección microscópica. Figura 7. Efecto de HMGB1 en proliferación de mesoangioblasto embriónico. (A) Las células D16 crecieron en medio RPMI que no contiene adición, HMGB1 en las concentraciones indicadas, o 20% de FCS. H MGB1 Indujo la proliferación celular en todas las concentraciones probadas, pero el número de célula alcanzó un altiplano después de 48 horas. Cada punto representa el promedio + SD (n=3). El experimento se repitió 3 veces. (B) La división de célula D16 se analizó por FACS: después de 6 horas en la presencia de 30 ng/ml de HMGB1 el contenido de ADN aumenta, pero regresa al contenido de diploide normal después de 24 horas. El asterisco indica la importancia estadística (p<0.001 ). (C) Los fibroblastos 3T3 (tratados como las células D 16 en el panel A) no se dividen en la presencia de H MGB1 . Figura 8. La reestimulación de HMGB1 prolonga la proliferación de mesoangioblasto. Las células D16 se laminaron en el tiempo 0 en el medio RPMI que contiene 30 ng/ml de HMGB1 ; una cantidad similar de HMGB1 también se agregó en los tiempos indicados con un triángulo. Las células D16 estimuladas de manera múltiple se mantuvieron creciendo. Cada punto representa el promedio + SD de dos experimentos realizados en duplicado. Panel de inserción: Western blot de HMGB1 en el medio que baña las células D16 48 horas después del comienzo del experimento. La HMGB 1 todavía estuvo presente en el medio de células reestimuladas pero no en el medio de células estimuladas una vez en el tiempo 0. Este experimento se repitió 2 veces con resultados similares. Figura 9. HMGB1 tiene actividad quimiotáctica en mesoangioblastos embriónicos. (A) Las células D 16 se sometieron a los ensayos de quimiotaxis en aparatos Boyden con 10, 50 o 100 ng/ml de HMGB1 . Los datos representan el promedio + SD de cuatro experimentos realizados en duplicado; el efecto de concentraciones de HMGB1 creciente es altamente importante (p<0.001 en análisis ANOVA). La adición de los anticuerpos anti-HMGB1 que reconocen el peptido 166-1 81 redujo significativamente la respuesta quimiotáctica (p<0.05 en comparación a la muestra sin anticuerpo), mientras que la adición de anticuerpos anti-recuadro A monoclonaies no tuvo efecto. (B) Actividad quimiotáctica en células D16 de varios fragmentos de HMGB1 (todos en 1 0 ng/ml). HMGB1 de longitud completa, recuadros A y B, el di-dominio AB, y HMGB1 sin cola (Abbt) se representan en (C). Abbt tiene un efecto quimiotáctico comparable con la H MGB1 de longitud completa (p<0.05 de proteínas contra el medio solo). En contraste, los recuadros A y B y el di-dominio AB no tienen actividad quimiotáctica importante. Las barras representan el promedio + SD de tres experimentos realizados en duplicado. (D) Western blot con anticuerpos anti-RAGE en el extracto total de célula D 16. Figura 10. H GB1 induce el tránsito de mesoangioblastos a través de una monocapa endotelial. (A) Las células endoteliales primarias de bovino (BAEC) crecieron en confluencia sobre los cubreobjetos de vidrio se expusieron a HMGB1 o VEGF y se colorearon con faloidina marcada por FITC para visualizar las fibras de actina. Ambos tratamientos determinaron la formación de fibras de tensión, y la separación de células entre sí. (B) Los mesoangioblastos embriónicos se colocaron en el comportamiento superior de los aparatos Boyden; las cámaras inferiores contuvieron RPMI solo (medio), RPMI más 100 ng/ml de HMGB1 o RPMI más 1 0 ng/ml de VEGF; las cámaras se separaron por una monocapa de célula endotelial confluente crecida sobre filtros de policarbonato. La HMGB1 significativamente estimuló la transmigración D 1 6 (p<0.01 ). Las barras representan el promedio + SD de tres experimentos realizados en duplicado. Los paneles arriba de la gráfica de barras muestran las células D 1 6 coloreadas con Giemsa, después de la migración hacia el medio solo o RPMI más HMGB1 . Figura 1 1 . HMGB1 atrae los mesoangioblastos in vivo.

Las células D16 se transdujeron primero con un vector lentiviral que codifica LacZ nuclear y después se inyectaron a través de la arteria femoral de ratones en donde las perlas de heparina (ya sea cargadas con HMGB1 o sin cargar) se han inyectado en el músculo anterior tibial. Los ratones se sacrificaron así después de 24 horas. (A) Músculos anteriores tibiales inyectados con perlas de control y cargadas de HMGB1. (B, C, D) Criosecciones de músculos tratados con perlas de heparina de control (B) o perlas de heparina revestidas con HMGB1 (C, D). Las flechas indican las perlas. Las secciones se colorearon con X-gal y mesoangioblastos (puntas de flecha) aparecen azules. Los mesoangioblastos se encontraron en grandes aglomeraciones (C) o como células aisladas (D) solamente en músculos inyectados con perlas revestidas de HMGB1. Figura 12. Efecto de HMGB1 sobre mesoangioblastos adultos. (A) Los mesoangioblastos de G1 solo, obtenidos de la médula ósea de ratón, crecieron en el medio RPMI que contiene de 1, 10 o 30 ng/ml de HMGB1. Para comparación, las células G1 también crecieron en el medio RPMI solo o RPMI más 20% de FCS. (B) Migración de células G1 hacia la cámara inferior de los aparatos Boyden que contienen RPMI (medio) o RMPI más 10 ng/ml de HMGB1 (HMGB1). En el experimento de "migración", las cámaras se separaron por un filtro, en el experimento de "transmigración" las cámaras se separaron por un filtro recubierto con una monocapa de células endoteliales. Cada barra representa el promedio + SD de tres experimentos, y los resultados son estadísticamente importantes (p<0.05). (C) Las células G1 se marcaron con Dil y después se inyectaron a través de la arteria femoral de ratones en donde las perlas de heparina (ya sea cargadas con HMGB1 o no cargadas) se habían inyectado en el músculo anterior tibial. Superior, contraste de fase; inferior, fluorescencia. Las células G1 (fluorescencia roja) migran en la proximidad de células cargadas de HMGB1; no se detectan células G1 cerca de las perlas de control. Figura 13. HMGB1 induce la formación de nuevos cardiomíocitos in vivo. (A) Coloración de eosina y hematoxilina de la zona de infarto en GST y corazones tratados con HMGB-1. Una modificación importante en la organización de tejido se observó en los corazones inyectados con HMGB1. (B) La inmunocoloración KI67 (fluorescencia verde) revela un número de células positivas en corazones inyectados con HMGB1. (C) Inmunocoloración de actina a-sarcomérica (fluorescencia roja). Fluorescencia azul, marcado Hoechst de núcleos. Las células que expresan actina a-sarcomérica se detectan en corazones tratados con H GB1. (D) Inmunocoloración MEF-2 (fluorescencia verde brilloso). Figura 14. El tratamiento de HMGB1 mejora la función miocardial: estudios ecocardiográficos. Ecocardiografía representativa de control (no infartados) y ratones infartados (panel izquierdo). Fracción de expulsión (EF) calculada por ecocardiografía (panel derecho). Los resultados son promedios + desviación estándar (SD). *P<0.05 de HMGB1 vs. GST. Figura 15. El tratamiento de HMGB1 mejora la función miocardial: estudios hemodinámicos. Efectos de infarto al miocardio (MI) en presión desaroilada (LVDP), presión diastólica de extremo ventricular izquierdo (LVEDP), LV+dP/dt (velocidad de aumento de presión) y LV-dP/dt (velocidad de desintegración de presión). Los resultados son de ratones infartados y operados en falso (falsos) no tratados y tratados ya sea con GST o HMGB-1. Los resultados son promedios + desviación estándar (SD). El asterisco señala la importancia estadística en la prueba t del Estudiante (p<0.05).

EJEMPLO 1 MATERIALES Y MÉTODOS Nomenclatura Las proteínas de grupo de alta movilidad se han renombrado actualmente. Los nombres previos/alternativos para HMGB1 son grupo 1 de alta movilidad, HMG1, HMG-1, anfoterian, y p30.

Clonación, expresión y purificación de proteína HMGB1 y fragmentos Los plásmidos de HMGB1 y fragmentos de los mismos se han descrito (Müller eí al., Biochemistry, 40, 10254-10261, 2001). Las concentraciones de proteína se determinaron espectroescópicamente utilizando el método de Gilí y von Hippel (Analyt. Biochem., 182, 319-326, 1989). Los siguientes coeficientes de extinción se han utilizado para la proteína nativa: Recuadro A: A28o=9.98 103 M"1 cm~1, Recuadro B: A28o=1-15 104 M"1 cm"1, AB, ABbtk y HMGB1 de longitud completa: A28o=2.14 104 M" cm"1.

Construcciones y células. El plásmido pEGFP-H GB1 se generó al insertar la secuencia de codificación del cADN para el HMGB1 de rata en pEGFP-N1 (Clontech) utilizando los sitios de restricción EcoRI y Sacll. pEGFP-HIc, pEGFP-NF1 , pEGFP-H GN2, y pE-flag-mICAD se proporcionaron generosamente por A. Gunjan, N. Bhattacharyva, R. Hock, M. Bustin y S. Nagata (Phair y Misteli, Nature, 404, 604-609, 2000; Misteli et al., Nature 408, 877-881, 2000; Enari et al., Nature 391, 43-50, 1998). Las células HeLa y fibroblastos (línea VA1, Hmgb1+/+, y línea C1, Hmgbl^') crecieron según se describe (Calogero eí al., Nature Genet. 22, 276-280, 1999). Las células HeLa se sometieron a electroforesis con pEGFP-HMGB1 y se observaron 18 horas después. La cantidad promedio de HMGB1-GFP en la población de célula fue entre 1 y 3% de HMGB1 (por inmunomanchado con anticuerpos anti-HMGB ). En el nivel de célula única, la cantidad de HMGB1-GFP varió en el nivel diez entre diferentes células; se tuvo cuidado para utilizarse siempre para las células de análisis con un nivel de fluorescencia moderada. La apoptosis se indujo al tratar las células por 16 h con 2 ng/ml de TNF-alfa humano y 35 µ? de cicoheximida. La necrosis se indujo por el tratamiento por 16 h ya sea con 5 µ? de ionomicina y 20 µ? de CCCP, o 6 mM de deoxiglucosa y 10 mM de azida de sodio, o por 3 ciclos de congelación y descongelación. Tres diferentes clones de células HeLa transfectadas establemente con pEF-flag-mICAD se colorearon con TUNEL (sistema de detección de Apoptosis , Promega), y sus ADN cromosomal se extrajo y se sometió a electroforesis en un 1 .5% de gel de agarosa. La inmu nofluorescencia indirecta se realizó según se describe (Degryse eí al. , J. Cell Biol. 1 52, 1 1 97-2006 , 2001 ) utilizando un anticuerpo policlonal anti-HMG B1 (Pharmingen) en 1 : 1600 de dilución, y anticuerpos de anti-conejo conjugados con FITC y TRI C (Boehringer) en 1 : 1 300 de d ilución .

Microscopía in vivo y FLIP. Las células se laminaron y se observaron en cámaras LabTEk I I (Nalgene) con un microscopio Axiovert 135 M (Zeiss). Los experimentos FLIP se llevaron a cabo en un microscopio confocal Leica TCS-SP uti lizando la línea de excitación 488 nm de un láser Ar y detección en 500-575 nm según se describe (Phair y Misteli , Nature, 404, 604-609, 2000). Las células se blanq uearon (en una mancha del µ?? en radio, 20 mW de salida nominal , 200-500 ms) y se representaron por imágenes (en 0.2 mW de salida nominal) en intervalos de 6 s.

Unión de HMGB 1 recombinante a cromatina. Los fibroblastos Hmgb V1' se trataron con 2 ng/ml de hTNF-alfa y 35 µ? de cicloheximida. Después de 16 h , las células apoptóticas se recuperaron por lavado suave del plato. Diez millones de fibroblastos Hmgb 1'/' apoptótícos y una población de control de unos no apoptótícos se volvieron a suspender en 50 µ? de PBS conteniendo 0.32 M de sucrosa, 0.5% de NP-40 y 1 µ? bacterialmente produjeron HMGB1, ya sea fluorscentemente marcados con Cy5 (Pharmacia) o no marcados. El marcado promedio fue 2.3 de moléculas Cy5 por molécula HMGB1. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, las células de muestra se mezclaron y se montaron en portaobjetos utilizando Vectashield (Vector Laboratories) conteniendo 1.5 µ9/??? de DAPI, y se observaron en un microscopio Axiophot (Cari Zeiss) con filtro TRITC. Los dos grupos de células incubadas con HMGB1 no marcada se cubrieron sobre gradientes discontinuos formados por 5 mi de 1.16 mM de sucrosa en PBS y un cojín de 6 mi de 2M de sucrosa en PBS, y se centrifugaron en 30,000 g por 90 minutos en un rotor Beckman SW27. La cromatina no apoptótica y apoptótica libre de polvo de membrana se recuperó desde la parte inferior de los tubos, y se aplicó a un 12% de gel SDS-PA. La cantidad de HMGB1 recombinante unido a cromatina no apoptótica y apoptótica se determinó por inmunomanchado utilizando un anticuerpo anti-HMGB1 (Pharmingen) en 1:3000 de dilución. Las alícuotas de cromatina no apoptótica y apoptótica también se probaron con anti-acetil-histona H4 (R10, un regalo de B. Turner), anti-acetil-Histona H3 (Lys 9, Biolabs) y anticuerpo anti-acetil-lisina (Biolabs).

Ensayos de Inflamación. Para medir la producción de TNF-alfa in vitro, la médula ósea se recuperó de las patas traseras de ratones hembra C56B16, se diluyó en 5 106 células/ml en Optimem y se distribuyó en placas de microconcentración de 96 cavidades (120 µ? por cavidad). Las células necróticas (destruidas por lisinas por 3 ciclos de congelación-descongelación) o células apoptóticas se agregaron a la concentración final indicada en las cavidades y se incubaron en 37°C por 1 8 horas. TNF-alfa en el sobrenadante se ensayó por ELISA (Quantikine , &D Systems). TSA se agregó a 200 ng/ml junto con TNF-alfa, cuando se indicó, y se lavó antes de mezclar las células apoptóticas con las células de médula ósea. Para medir la inflamación in vivo, los ratones de un día de edad (pesando 1 .1 + 0.1 gramos) se inyectaron intraperitonealmente con 20 µ? de PBS conteniendo 320 µg de acetaminofen (Sigma) y 320 µg de anticuerpos (Pharmingen BD) en donde se indicó. Después de 9 horas, los ratones se analizaron para la actividad ALT de suero con el equipo de GP-Transaminasa (Sigma) y para la actividad MPO en extractos de hígado según se describe (Kato et al. , Am. J . Pathol. 157:297-302, 2000). El análisis estadístico se realizó con la prueba Mann-Whitney no paramétrica en proporciones MPO/ALT. Los resultados similares se obtuvieron utilizando la prueba t en los niveles MPO de ratones aparejados a fin de minimizar la diferencia en los niveles de ALT.

RES U LTADOS HMGB1 se une de manera suelta a cromatina tanto de las células mitóticas como de interfase, y se derrama rápidamente hacia el medio cuando la integridad de la membrana se pierde en las células necróticas o permeabilizadas (Degryse et al., J. Cell. Biol. 152:1197-2006, 2001; Müller eí al., EMBO J., 16, 4337-4340, 2001; Falciola eí al., J. Cell Biol. 137, 19-26, 1997). Estos resultados sugieren que en las células vivientes HMGB1 se asocia y se disocia rápidamente de cromatina. Para probar esto, la HMGB1 se etiquetó con GFP en su terminal C, formando una proteína quimérica que fue equivalente a la HMGB1 no perturbada en el refuerzo de la expresión de un gen reportador responsivo de HOXD9 en los ensayos de transfección (Zappavigna et al., EMBO J., 15, 4981-4991, 1996). Las células HeLa que expresan la proteína de fusión fueron fácilmente detectables por la fluorescencia verde uniforme de sus núcleos. Las células que superan la mitosis mostraron una fluorescencia citoplásmica difusa, pero también una asociación distinta de HMGB1-GFP a los cromosomas condensados, que duraron a lo largo de la fase M (Fig. 1a). Cuando las células HeLa transfectadas con HMGB1-GFP se permeabilizaron con NP-40, la mayoría perdió su fluorescencia después de pocos segundos, confirmando la asociación suelta de HMGB1 a cromatina. Sin embargo, unas pocas células retuvieron su fluorescencia brillosa. De la apariencia característicamente fragmentada de sus núcleos, estas células aparecieron apoptóticas. Las células HeLa se forzaron así a superar la apoptosis por tratamiento con TNF-alfa y cicloheximida, se permeabilizaron y se inmunocolorearon por su HMGB1 endógena, no modificada. Mientras que las células no apoptóticas de control derramaron toda su HMGB1 hacia el medio (Fig. 1b, d) la proteína se retuvo dentro del núcleo de las células apoptóticas (Fig. 1 d). La H MGB1 se retuvo mayormente asociada con los remanentes nucleares aún después de la incubación prolongada y la autolisis parcial de las células apoptóticas, cuando las proteínas citoplásmicas solubles como dehidrogenasa de lactato (LDH) se derramaron hacia el medio extracelular (Fig. 1 e). La HMGB1 y HMGB1 -G FP también unidas herméticamente a la cromatina en las células 3T3 y HeLa se indujeron hacia la apoptosis por etoposido o tratamiento H202, o se sometieron a apoptosis espontáneamente en los cultivos no perturbados (datos no mostrados). En contraste, la HMGB1 se disoció de la cromatina de células necróticas y se derramó hacia el medio extracelular (Fig. 1 c). Para cuantificar las propiedades dinámicas de HMGB1 -GFP dentro de las células únicas, una técnica llamada pérdida de fluorescencia en fotoblanqueamiento (FLIP) se utilizó (Phair y Misteli, Nature, 404, 604-609, 2000). El blanqueamiento repetido de la misma área conduce a la pérdida de fluorescencia del resto del núcleo, con la cinética dependiente de la movilidad global de la proteína de fluorescencia. Si una fracción del grupo de proteína se encuentra en cualquier momento dado unido a cromatina, la pérdida de su fluorescencia se disminuirá. El blanqueamiento del HMGB1 -GFP nuclear total se obtuvo rápidamente (Fig. 2a); en contraste, en las células HeLa que expresan las fusiones FGP a las proteínas de cromatina HMGN 1 y H GN2, o factor de transcripción NF1 , la pérdida de fluorescencia fue significativamente inferior; en las células que expresan las fusiones GFP-histona H 1 c, la pérdida de fluorescencia fue muy limitada (Fig.2c). Los autores también valoraron la velocidad de difusión de a HMGB1-GFP asociada a los cromosomas condensados de las células HeLa vivientes durante la mitosis. El blanqueamiento repetido de HMGB1-GFP citoplásmico condujo a la rápida y paralela pérdida de fluorescencia de los cromosomas condensados y del citoplasma (Fig. 2b, d), proporcionando inequívocamente que HMGB1 se vuelva más rápida entre los estados solubles y unidos por cromatina. En el otro extremo, la HMGB1-GFP pareció casi inmóvil en células apoptóticas (Fig. 2e, g). El bloqueo de H GB1 es específico, ya que la movilidad de GF-HMGN1, GFP-HMGN2, GFP-NF1 y GFP solo no se reduce en células apoptóticas según se opone a las vivientes (Fig. 2h y resultados no mostrados). De esta manera, la condensación de cromatina durante la apoptosis no deteriora la movilidad de proteína en general. Las células Hmgb ' nos ofrecieron la oportunidad de probar si la unión de HMGB1 a cromatina apoptótica fue debido a las alteraciones de HMGB1, o de los núcleos que superan la apoptosis. Los fibroblastos embriónicos obtenidos de ratones Hmgb1'/' y Hmgb1*/+ (Calogero eí al., Nature Genet., 22, 276-280, 1999) fueron igualmente susceptibles a la apoptosis (no mostrada), indicando que la congelación de HMGB1 en cromatina es una consecuencia de la apoptosis, pero no un requisito. Los fibroblastos de Hmgb1'/' se trataron con TNF-alfa y cicloheximida, y las células apoptóticas se recuperaron del matraz por lavado suave. Esta población de célula, y una población de control de fibroblastos Hmgb1~/~ no apoptóticos, se permeabilizaron con detergente y se expusieron a HMGB1 marcada con Cy5, bacterialmente producida. La HMGB1 se unió a los núcleos apoptóticos, pero no a los no apoptóticos (Fig. 3a). Este resultado se confirmó bioquímicamente (Fig. 3b): los fibroblastos mqbV1' no apoptóticos y apoptóticos permeabilizados se incubaron con HMGB1 bacterialmente elaborada y se dividieron a través de un gradiente de sucrosa discontinua. Nuevamente, la HMGB1 se asoció a los núcleos de las células apoptóticas, pero no a las no apoptóticas. Los experimentos anteriormente descritos indican que, en la apoptosis, la cromatina supera alguna transición estructural o química que la hace susceptible a la unión de HMGB1. La naturaleza de HMGB1 por sí misma, si es endógena o se elabora en bacteria, etiquetada con fluoroforos o fusionada a GFP, es irrelevante. Los autores enseguida investigaron la naturaleza de la modificación de cromatina siguiendo la unión estable de HMGB1. Ya que la HMGB1 se une herméticamente a los mononucleosomas reconstruidos in vitro (Falciola et al., J. Cell Biol., 137, 19-26, 1997), los autores probaron si la fragmentación de cromatina a oligo- y mononucleosomas que ocurre en las últimas etapas de apoptosis podría proporcionar los sitios de unión estables para HMGB1. Las células HeLa se transfectaron establemente con una construcción que expresa ICAD, el inhibidor de la nucleasa CAD que fragmenta el ADN durante la apoptosis. Las células HeLa que sobreexpresan ICAD superaron la apoptosis, pero su ADN mostró poca, si la hubiere, fragmentación (Enari, eí al., Nature, 391, 43-50, 1998) (Fig. 3c). La HMGB1 se unió igualmente de manera estable a la cromatina no fragmentada, que expresa ICAD, y a la cromatina fragmentada (Fig. 3c). La fragmentación de ADN por lo tanto no puede contar para la unión de H GB1 estable en apoptosis. La alteración del estado de acetilación de cromatina se probó enseguida. TSA, un inhibidor de deacetilasa general, se agregó al medio de las células HeLa justo antes de la inducción de apoptosis: en este caso, la congelación de HMGB1 sobre cromatina se suprimió (Fig. 2f, g). Este resultado sugiere que la hipoacetilación de uno o más componentes de cromatina se origina durante la apoptosis, y favorece la unión de HMGB1. No se observó diferencia en el pl o el modelo de peso molecular de HMGB1 presente en las células no apoptóticas o apoptóticas. (Fig. 3d), indicando que la apoptosis no cambió el estado de acetilación de HMGB1 por sí misma. En contraste, la histona H4 de la cromatina apoptótica se hipoacetilató notablemente en comparación a la cromatina no apoptótica, y la hipoacetilación de H4 en la apoptosis se suprime por TSA (Fig.3e). Los autores mostraron de esta manera que la unión de HMGB1 a la cromatina depende de la viabilidad de la célula, y claramente distingue las células necróticas de las apoptóticas. La liberación diferencial de H GB1 puede explotarse como un aviso a las células cercanas para activar las respuestas adecuadas a la muerte de célula programada y no programada. La muerte no programada usualmente es el resultado de trauma, envenenamiento o infección, todos los casos que requieren la pronta reacción y contención de daño y/o reparación. La inflamación es la respuesta de daño de tejido primario en mamíferos, y la HMGB1 ya se ha reportado que es un mediador de inflamación (Wang et al. , Science, 285, 248-251 , 1 999; Abraham et al. , J. Immunol. 165, 2950-2954, 2000; Andersson et al. , J . Exp. Med. 1 92, 565-570, 2000). Para probar directamente si la liberación de HMGB1 por células necroticas puede ser el activador inmediato para una respuesta inflamatoria, los autores cambiaron las células de médula ósea tipo silvestre con fibroblastos mgbl'1' o muertos tipo silvestre (+/+). Según se espera, las células necroticas tipo silvestre activaron la producción de la citoquina proinflamatoria TNF-alfa, mientras que las células apoptoticas tipo silvestre fueron mucho menos eficaces (Fig. 4a). De manera importante, las células necroticas H gb l'1' también fueron a su vez ineficaces en la activación de monocitos. La HMGB1 purificada también produce la producción de TNF-alfa en este ensayo (Andersson ef al. , J. Exp. Med . 1 92, 565-570, 2000). De esta manera, este experimento muestra q ue la H GB 1 es una de las señales de necrosis mayormente difusoras. Por el otro lado, éste no puede probar si las células apopíóticas escapan de la vigilancia inflamatoria debido a que éstas retienen HMG B 1 : las células apoptoticas comienzan a derramar los componentes celulares solamente después de varias horas, e in vivo se clarifican rutinariamente por las células fagocíticas bien antes de que este proceso (denominado necrosis secundaria) pueda tener lugar. Los autores sin embargo podrían probar si las células que superan la necrosis secundaria, post-apoptótica, son capaces de promover las respuestas inflamatorias en monocitos. Los fibroblastos apoptóticos, tipo silvestre se incubaron por 72 horas, hasta que la mayoría de LDH se liberó en el medio extracelular; los remanentes de célula post-apoptótica no promovieron una fuerte respuesta inflamatoria en monocitos (Fig . 4b). Sin embargo, los fibroblastos tratados con TSA mientras están superando la apoptosis generaron remanentes de célula necrótica secundaria que promovieron la inflamación tan vigorosamente como las células necróticas primarias muertas por congelación-descongelación. Los autores no pudieron probar si los ratones Hmgbl'1' tienen una respuesta inflamatoria reducida siguiente a la necrosis de tejido, debido a que estos ratones sobreviven solamente unas pocas horas después de nacer (Calogero et al., Nature Genet. , 22, 276-280, 1999). Para proporciona evidencia en un modelo de animal para la importancia de liberación de HMGB1 , la necrosis de hepatocito masiva se indujo en ratones tipo silvestre y la respuesta inflamatoria se midió. Tanto en los humanos como en los roedores, una sobredosis del acetaminofen analgésico (AAP, también conocido como paracetamol) produce grandes áreas de necrosis de hígado, concomitante con la inflamación local, la activación de célula Kupffer y el reclutamiento y secuestro de neutrófilos y macrofagos en el tejido lesionado (Lawson et al. , Toxicol Sc¡. , 54, 509-516, 2000; Thomas, Pharmacol. Ther. , 60, 91 -120, 1993). Los niveles de daño de hígado y secuestro de neutrófilos son estrictamente proporcionales hasta que la mayoría de los hepatocitos se vuelven necróticos entre 12 y 24 horas después del envenenamiento de AAP (Lawson eí al. , Toxicol Sci . , 54, 509-51 6 , 2000). Los autores administraron 300 mg/kg de AAP con una inyección intraperitoneal única a ratones jóvenes, y 9 horas después estimaron la lesión de h ígado al medir la actividad de transami nasa de alanina (ALT) en suero, y el secuestro de célula inflamatoria al medir la actividad de mieloperoxidasa (M PO) en los extractos totales de h ígado. Un grupo de ratones (n=8) no recibió AAP, un grupo (n= 1 0) recibió solo AAP, otro (n=6) AAP y anticuerpos anti-H MGB 1 purificados por afinidad (300 mg/kg), y el último (n=8) AAP y anticuerpos de conejo irrelevantes (300 mg/kg). Todos los 3 grupos inyectados con AAP tuvieron niveles ALT elevados en comparación a los controles tratados en falso, pero las diferencias entre los 3 g rupos tratados no fueron estad ísticamente importantes. De esta manera , los anticuerpos no se protegen contra el daño de h ígado, al menos al comienzo de la respuesta inflamatoria. Los autores utilizaron así la proporción de MPO/ALT para comparar el recl utamiento de célula inflamatoria, normalizado al n ivel del daño de hígado (Fig . 4c). Los anticuerpos anti-H MGB1 fueron eficaces en la reducción de la inflamación siguiendo la necrosis de h ígado inducida por AAP: estos ratones mostraron una proporción M PO/ALT red ucida de manera importante ( 1 .5 + 0.3) tanto en comparación a ratones inyectados con AAP solo (2.7 +. 0.3;· p<0.05), y a ratones inyectados con AAP e lgGs de conejo preinmune (2.4 + 0.3; p<0.05). Nada de H MGB 1 puede derivar de monocitos activados y macrófagos en nuestro experimento, debido a que la secreción de HMGB1 de las células inflamatorias requiere al menos 16 horas (Wang eí al., Science, 285, 248-251, 1999; Abraham eí al., J. Immunol.. 165, 2950-2954, 2000; Andersson et al., J. Exp. Med. 192, 565-570, 2000). De esta manera, la HMGB1 actúa como un activador inmediato de inflamación, así como también un último mediador de inflamación según se describe previamente (Wang et al., Science, 285, 248-251, 1999). En conclusión, los autores han mostrado que la liberación pasiva de un componente de cromatina abundante puede servir como una señal difusora de muerte no programada, que puede utilizarse como un aviso para las células cercanas. Las histonas de núcleo, a pesar de ser más abundantes, podían probablemente no ser tan buenas señales de necrosis, a medida que permanecen sujetas a la cromatina insoluble de las células necróticas. Las células apoptóticas no son el resultado de un daño inmediato y presente y no activan la inflamación en las condiciones fisiológicas. Éstas retienen componentes nucleares hasta que se clarifican por macrófagos o células cercanas que actúan como fagocitos semi-profesionales, que se atraen y activan al mostrar señales de "cómeme" (Ren y Savill, Cell Death Different, _5, 563-568, 1998). Sin embargo, las células apoptóticas que escapan de la clarificación pronta superan la necrosis secundaria, conducida a un nivel aumentado de auto-anticuerpos nucleares (Scott et al., Nature, 211, 201-211, 2001), y se han propuesto jugar un papel patogenético importante en enfermedades autoinmunes, tales como lupus (Herrmann et al., Artritis Reum., 41, 1241-1250, 1998). De esta manera, la retención de H GB1 por células apoptoticas que superan la necrosis secundaria representa una seguridad adicional contra las células apoptoticas y necróticas de confusión.

EJEMPLO 2 Los autores también demostraron que la HMGB1 tiene actividad quimiotáctica en mesoangioblastos de ratón D18 derivados de las células de aorta fetal (Minasi eí al., Development. 129, 2773-83, 2002). Las células germinales mesoangioblásticas pueden derivarse de las células de aorta fetal de ratón pero también de las células del cordón umbilical, las células ckit+ de la médula ósea y vasos sanguíneos periféricos en ratones post-natales. Una vez derivadas de estas poblaciones de célula originales con un método adecuado (descrito en Minasi et al., Development. 129, 2773-83, 2002), las células mesoangioblásticas, de las cuales D18 son un ejemplo, se inmortalizan "naturalmente" (crecen indefinidamente). Las células D18 sirven como precursor de los siguientes tipos de tejido mesodérmico: hueso, cartílago, músculo cardíaco y liso esquelético, células endoteliales, monocitos, macrófagos y osteoclastos. También son capaces de generar hepatocitos y neuronas. El clon D18 se depositó de acuerdo al tratado de Budapest en CBA, Centro de Biotecnología Avanzada, Génova, Italia, N. PDO2005). Los ensayos de quimiotaxis se realizaron utilizando las cámaras de Boyden modificadas. El valor de 1 corresponde al número de células que migran en la ausencia de cualquier estimulador (migración celular al azar). Los datos representan el promedio + SE. La importancia estadística del resultado es P<0.0001 en un modelo ANOVA. El tratamiento con H GB1 más anti-HMGB1 dio resultados que no difirieron estad ísticamente del control no estimulado. El tratamiento de las células D 18 con el anticuerpo anti-HMGB1 solo, o un anticuerpo no específico, también fueron indistinguibles del control no estimulado. Las células germinales se espera que proliferen en el sitio en donde la reparación de tejido debe tener lugar. Los autores probaron así si la HMGB1 también podría estimular la proliferación de célula germinal. Las células germinales en RPMI sin suero no se dividieron, mientras que las células en RPMI sin suero pero en la presencia de H MGB1 se dividieron activamente por al menos 24 horas, y después más lentamente debido a la exhaustación de nutrientes. En el día 3, sin embargo, todas las láminas con células D 18 estimuladas con HMGB1 (en todas las concentraciones) contuvieron algunas células de división, según se evalúa por la inspección microscópica. Las células en RPMI solo no se dividieron, mientras que las células en RPM I más HMGB1 se dividieron activamente por al menos 24 horas, y después más lentamente debido a la exhaustación de nutrientes. En el d ía 3, sin embargo, todas las láminas con células C1 8 estimuladas con H MGB 1 (en todas las concentraciones) contuvieron algunas células de d ivisión , según se evalúa por inspección microscópica (Fig. 6). El experimento se ha repetido con mesoangioblastos derivados de capilares de ratón adulto (células germinales de adultos), mostrando el mismo efecto ind uctor de prol iferación . Todos los experimentos mostrados anteriormente también se repitieron con otro clon de célula germinal , llamada D 1 6, con resultados similares, según se ilustra en el siguiente Ejemplo 3.

EJEMPLO 3 HMGB1 extracelular, u na señal de daño de tejido, induce a la proliferación y migración de mesoangioblasto. MATERIALES Y MÉTODOS Células Las células endoteliales de aorta de bovino (BAEC) se aislaron de una sección de la aorta toráxica de un becerro frescamente de carne (Palumbo et al. , Arterioscler. Thromb . Vasc. Biol. , 22, 405- 1 1 , 2002). Los mesoangioblastos se aislaron de la aorta dorsal de embriones de ratón y de arterias j uveniles según se describe previamente (De Angelis eí al. , J . Cell. Biol. 147, 869-78 , 1999). Después de clonarse, las células se expandieron sobre una capa alimentadora de fibroblastos STO tratados por C mitomicina. Los clones q ue muestran el modelo de expresión de gen de mesoangioblasto (presencia de CD34, Kit, Flk1 y EF2D) se utilizaron para ios experimentos in vitro e ¡n vivo. Los mesoangioblastos embriónicos (clon D16) se transdujeron con un vector lentiviral que se codifica para LacZ nuclear, mientras que los mesoangioblastos adultos (clon G1) se marcaron con Dil y después se inyectaron hacia la arteria femoral de ratones.

HMGB1 y anticuerpos La expresión y purificación de la proteína de H GB1 de longitud completa y fragmentos de la misma se realizó según se describe previamente (Müller et ai, Biochemistry, 40, 10254-10261, 2001). Las endotoxinas se removieron por el paso a través de las columnas Detoxi-Gel (Pierce). Los anticuerpos anti-HMGB1 policlonales de conejo elevados contra el peptido 166-181 fueron de Pharmingen, BD, anticuerpos policlonales contra el recuadro A fueron de BL. El anticuerpo de cabra anti-RAGE fue de Chemikon. Los Western blots se realizaron según se describe (Degryse et al., J. Cell Biol. 152, 1ig7-2006, 2001).

Ensayo de proliferación Las células se cultivaron en placas de 6 cavidades (1x105 células/cavidad) y crecieron en RPMI complementado con 20% de FCS. Después de 24 horas, el medio se reemplazó con RPMI libre de suero por 16 horas. Por consecuencia, debido a que las células crecieron con medio solo, o medio con la adición de 20% de FCS o HMGB1 en la concentración de 1, 3, 10, y 30 ng/ml. Las células se contaron después de 1 , 2 y 3 d ías, y la exclusión de tinte azul Trypan se utilizó como ind icador de la viabilidad de célula. Todos los experimentos se realizaron tres veces en duplicado.

Ensayo de quimiotaxis La migración celular se ensayó utilizando las cámaras Boyden (Deg ryse eí al. , J. Cell . Biol . , 1 52, 1 197-2006 , 2001 ). En resumen, los filtros de policarbonato libre de PVP con 8 µ?? de poros (Costar) se revistieron con 5 µg/ml de gelatina de piel de porcino (Sigma). El RPMI libre de suero (control negativo), RPM I que contiene 1 0, 50 o 1 00 ng/ml de HMGB1 , y RPMI con 20% de suero (control positivo) se colocaron en las cámaras inferiores . Las células D 16 crecieron en RPMI más 1 0% de FCS, se pusieron en inanición durante la noche, se lavaron dos veces con P BS para eliminar cualquiera de las células flotantes, y se colectaron con tripsina. Cincuenta mil células vueltas a suspender en 200 µ? de RPM I se colocaron en las cámaras superiores y se incubaron a 37°C en 5% de C02 por 16 h. Las cél ulas permanecidas sobre la superficie superior de los filtros se removieron mecánicamente, aq uellas q ue habían migrado a la superficie inferior se fijaron con etanol , se colorearon con Giemsa Stain Modified (Sigma) y se contaron en 400 x de magnificación en diez campos al azar por filtro. Los ensayos se realizaron en triplicado y se repitieron tres veces en experimentos independientes.

Ensayo de Transmigración Las células BAEC crecieron en DME más 10% de FCS en inserciones transversas de policarbonato (3 µ?? de poros; Costar) por 5 d ías hasta q ue formaron una monocapa. Las inserciones se colocaron así entre las cámaras en aparatos Boyden , y lo hermético de las monocapas se revisó al medir la difusión de BSA entre las cámaras. Los mesoangioblastos ( 1 05 de células en 1 00 µ? de RP M I) se colocaron en los compartimientos superiores y el RPM I que contiene H MG B1 o VEGF (variante de aminoácido 121 maduro de VEG F humano expresado en E. coli, de R&D Systems) se colocó en los compartimientos inferiores (500 µ?). Después de 8 horas a 37°C los filtros se removieron, y el resultado se evaluó según se describe para el ensayo de q uimiotaxis. Estos experimentos se llevaron a cabo tres veces en dupl icado.

Citometría de flujo Los mesoangioblastos se dejaron en inanición durante la noche, crecieron en medio RPMI solo, RP M I más 20% de FCS o RPMI más 1 00 ng/ml de H MGB 1 por 6, 1 2, 24, o 48 horas. Las células se lavaron, se fijaron en 70% de etanol, se colorearon con 50 µ?/??? de yoduro de propid io (Pl) en PBS más 50 µg/ml de RNasa A y se incubaron por 30 min a temperatura ambiente. El contenido de ADN se mid ió por citometría de flujo (FACScan; Becton-Dickinson) uti lizando el software Standar CelIQuest.

Estimación del número de divisiones celulares Diez millones de mesoangioblastos adultos o embriónicos se cultivaron en platos de 1 00 mm en RP I complementado con 20% de FCS. Después de 24 horas, las células se dejaron en inanición en RPMI solo durante la noche. Las células se lavaron as í en PBS, y CFDASE (Probetas Moleculares) se agregó a la concentración final de 2.5 µ? por 8 minutos a temperatura ambiente. La coloración se enfrió rápidamente por la adición de 1 0% de FCS y las células se lavaron en RPMI. Las células marcadas de manera fluorescente crecieron así en RPM I solo, RPM I más 1 00 ng/ml de HMG B 1 o RPMI más 20% de FCS y se colectaron después de 48 horas. Las células se analizaron en FACScan.

Visualizactón del Citoesqueleto Las célu las BAEC crecieron en cubreobjetos de vidrio hasta q ue fueron completamente confluentes. Después de los tratamientos descritos en el texto, las células se lavaron con PBS y se fijaron con 4% de paraformaldeh ído a temperatura ambiente por 1 0 minutos. Las célu las se colorearon as í con faloid ina conjugada por FITC (Sig ma) para visualizar el citoesqueleto de actina según se describe (Deg ryse eí al. , J . Cell Biol. , 152, 1 1 97-2006, 2001 ).

Preparación de perlas cargadas con HMGB 1 Las perlas de heparina (34 µ?? de diámetro) se recuperaron de una columna HP de heparina HiTrap (Pharmacia) y se lavaron extensivamente en PBS. Las perlas (20 µ? de volumen envasado) se incubaron así por 1 hora a 4°C con 60 µ9 de HMGB1, se colectaron por centrifugación, se lavaron dos veces con PBS y se volvieron a suspender en PBS. SDS-PAGE se realizó para revisar la cantidad de HMGB1 sobre las perlas.

Suministro Intra-arteria de mesoangioblastos en ratones Las perlas de heparina (una mezcla que contiene 3 de perlas en 20 µ? de PBS), ya sea cargadas con HMGB1 o no, se inyectaron con una jeringa de insulina en músculos anteriores tibiales de ratones hembra de 6 semanas de edad CD-1 (3 por grupo). Después de 1 hora, los mesoangioblastos (4x105 células/animal) se inyectaron a través de la arteria femoral según se describe previamente (Torrente ef al., J. Cell Biol. 152/335-48, 2001); los animales se sacrificaron 24 horas después. Para el análisis de histoquímica, las muestras de los músculos anteriores tibiales se congelaron en isopentano enfriado por nitrógeno líquido y criostat-seccionados. Las secciones del músculo serial de 10 µ?t? de espesor se colorearon con X-gal para el experimento con células marcadas por LacZ (Totsugawa et ai, Cell Transplant., 11, 481-8, 2002), o visualizadas directamente para el experimento con Dil. Dil fue de Probetas Moleculares.

RESULTADOS HMGB1 estimula la proliferación de células germinales asociadas por vasos Las células germinales aisladas de la aorta dorsal de ratón de embriones E9.5 (mesoangioblastos) se cultivaron in vitro y se probaron para la presencia de los marcadores celulares CD34, it, Flk1 y MEF2D (Minasi ef al., Development, 129, 2773-2783, 2002). Los autores utilizaron uno de estos clones (llamados D16) para valorar si la HMGB1 puede actuar como un mitógeno. Las células D16 se cultivaron en medio RPMI con 20% de FCS y se dejaron en inanición así por 16 horas en la ausencia de suero para sincronizar la población de célula. Las concentraciones en aumento de HMGB1 se agregaron así al medio sin suero, y las células se contaron después de 1, 2 y 3 días. La Figura 7A muestra que existe un aumento importante en el número de mesoangioblastos D16 después de la estimulación con HMGB1 hasta el día 2, mientras que solamente se origina la ligera proliferación entre los días 2 y 3. Todas las concentraciones probadas tuvieron efectos similares. Las células D16 estimuladas por H GB1 tuvieron una morfología normal y excluyeron el Trypan azul hasta el final del experimento, mientras que las células en los cultivos de control sin HMGB1 se murieron (no mostradas). La H GB1 no tuvo efecto mitogénico en fibroblastos 3T3 (Figura 7C). Los autores investigaron a mayor detalle la respuesta proliferativa de las células D16 para HMGB1: las células se expusieron por 6, 12 y 24 horas al medio RPMI solo (control negativo), o medio que contiene 30 ng/ml de HMGB1 o 20% de FCS, y se analizaron para el contenido de ADN por FACS después de la coloración de yoduro de propidio. Después de seis horas de estimulación con HMGB 1 , la mayoría de los mesoangioblastos habían ingresado al ciclo celular; después de 24 horas, la mayoría de las células parecían tener un contenido de ADN diploide y de esta manera encontrarse en G1 o GO (Fig. 7B). Los. autores evaluaron el número de ciclos celulares activados por HMGB1 al colorar en el tiempo 0 las membranas celulares con el tinte fluorescente CFDASE (Colombetti ef al. , J. Immunol. , 169, 6178-86, 2002)6; después de 48 horas la mayoría de las células tuvo la mitad de la cantidad inicial de tinte (y así había superado una división) y una minoría tuvo un cuarto (y había superado dos divisiones). Por comparación, todas las células cultivadas en 20% de FCS se habían dividido al menos dos veces (datos no mostrados). Estos datos indican que la HMGB 1 induce un número limitado de las divisiones celulares. Esto podría deberse a un programa específico de mesoangioblastos, o a la supresión de HMGB1 en el medio. Los autores por lo tanto agregaron 30 ng/ml de HMGB1 en el tiempo 0, y el adicional de H MGB 1 en 1 2, 36 y 60 horas. Los mesoangioblastos expuestos continuamente a HMGB1 continuaron dividiéndose (Figura 8). Después de 48 horas, nada de HMGB 1 fue detectable por Western blot en el medio de las células estimuladas una vez, mientras que la H MGB1 equivalente a aproximadamente 40 ng/ml permaneció en el medio de células expuestas de manera múltiple (ver el panel de inserción Fig. 8).

Tomados juntos estos resultados indican que la HMGB1 actúa como un factor de crecimiento para las células D16, pero se suprime rápidamente.

HMGB1 induce la migración de mesoangioblasto Los autores han mostrado previamente que la HMGB1 es un quimioatractor para las células de músculo liso de rata (RSMC) (Degryse ef al., J. Cell. Biol., 152, 1197-2006, 2001). Investigaron así si la HMGB1 es un quimioatractor para las células D16 también. En un ensayo de quimiotaxis que utiliza las cámaras Boyden modificadas, la migración estimulada por HMGB1 de las células D16 en una manera dependiente de la concentración (Fig. 9A). Los anticuerpos policlonales elevados contra los aminoácidos 166-181 de HMGB1 (anti 166-181, Fig. 7A), redujeron significativamente la respuesta migratoria. Sin embargo, la respuesta migratoria no se afectó por los anticuerpos monoclonales anti-HMGB1 que reconocen el recuadro A. Los autores también probaron los dominios individuales de H GB1 por la habilidad para inducir la migración de célula D16 (Fig. 9B). Ni el recuadro A ni el recuadro B solos indujeron a la migración apreciable. El fragmento de di-dominio (comprendiendo los recuadros A y B) no tuvieron un efecto significante, mientras que el fragmento Abbt, que solamente carece del extremo acídico (Fig. 9C), fue tan potente como la proteína de longitud completa. Huttunen et al. (Cáncer Res., 62, 4805-4811, 2002) han identificado los residuos 150-183 como el segmento de HMGB1 que ¡nteractúa con RAGE. De manera notable, los anticuerpos anti-HMGB1 que bloquean la migración D16 (Fig. 9A) específicamente interactúan con la tensión de aminoácido entre los residuos 166 y 181 (Fig. 9C), y por lo tanto excluyen la superficie de interacción RAGE. Los anticuerpos monoclonales que reconocen el recuadro A no pueden prevenir la interacción con RAGE. Nuestros datos por lo tanto indican que HMGB1 es un quimioatractor poderoso para las células D16, y sugieren que RAGE es su receptor. La configuración de ARN de las células D16 (no mostradas) indican que expresan RAGE, y la proteína RAGE es detectable en las células D16 por Western blot (Fig.9D).

HMGB1 induce la migración de mesoangioblasto a través de las monocapas endoteliales Los mesoangioblastos son células germinales asociadas por vasos que pueden migrar a los tejidos dañados a través de la circulación general (Sampaolesi et al., datos no publicados), y tienen la habilidad de transitar a través de la barrera endotelial. Los autores probaron así si la HMGB1 podría también promover la transmigración de células germinales a través de una monocapa endotelial crecida sobre el septo entre las cámaras de un aparato Boyden. Cuando los autores agregaron 100 ng/ml de H GB1 al medio en la cámara inferior, el número de células D16 que cruza la monocapa aumentó 8 pliegues cuando se comparó al medio sin ninguna adición (Fig. 10B). La HMGB1 tiene potencia más alta que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), una molécula de señalización se sabe que promueve la migración celular a través de las barreras endoteliales. El VEGF induce la reorganización de citoesqueleto profundo de células endoteliales, caracterizada por la formación de fibras de tensión transcitoplásmica y la desinstalación de juntas adherentes, que son importantes para mantener la función de barrera endotelial (Rousseau et al., J. Biol. Chem., 275, 10661-72, 2000; Esser et al., J. Cell Sci., 111, 1853-65, 1998). De esta manera, los autores compararon el efecto de HMGB1 sobre las células endoteliales a aquel de VEGF. Después de la estimulación con HMGB1 por 5 a 30 minutos, las células endoteliales se fijaron, se marcaron con faloidina conjugada por fluoresceína y se evaluaron por inmunofluorescencia. Tanto la HMGB1 como VEGF originó la formación de fibra de tensión y la disagregación de células endoteliales, sugiriendo que HMGB1 puede aumentar dramáticamente la permeabilidad del lineado endotelial de los vasos (Fig. 10A).

HMGB1 dirige el alojamiento de mesoangioblasto in vivo Los autores finalmente valoraron la habilidad de HMGB1 para controlar la migración de mesoangioblasto in vivo. Las perlas de heparina se cargaron con HMGB1 en la concentración de 3 µg/ml y después se inyectaron con una aguja fina en el músculo anterior tibial de ratones. Las células D16 transducidas por un vector lentiviral que originan la expresión de LacZ nuclear se inyectaron después de 30 min a través de la arteria femoral próxima (ver materiales y métodos).

Los ratones se sacrificaron después de 24 horas y el músculo anterior tibial se removió, se dividió, y se analizó por inmunohistoquímica. Los músculos inyectados con peras cargadas con HMGB1 mostraron una absorción considerable en comparación tanto a los músculos inyectados en falso (no mostrados) como los músculos inyectados con perlas de heparina no cargadas (Fig. 11A), sugiriendo que la HMGB1 originó inflamación de músculo considerable. Esto es consistente con el papel de HMGB1 como citoquina pro-inflamatoria. Las secciones musculares se colorearon con X-gal y las células azules se registraron utilizando las técnicas por representación de imágenes auxiliadas por computadora (Fig. 11). Grandes grupos de células azules se encontraron en la proximidad de las perlas cargadas con HMGB1 (panel C); una minoría de secciones mostró las células azules individuales dispersas a lo largo del músculo (panel D). Las secciones de los músculos inyectados con las perlas no cargadas no tuvieron células azules del todo (panel B). Estas observaciones claramente sugieren que la HMGB1 es capaz de reclutar los mesoangioblastos in vivo.

Acción Biológica de HMGB1 sobre mesoangioblastos adultos Estos descubrimientos Identifican un papel para la HMGB1 extracelular, una citoquina proinflamatoria, en la migración y proliferación de mesoangioblastos embriónicos. Sin embargo, la inflamación no se origina en el embrión aún en la presencia de daño de tejido. Los autores se preguntaron así si HMGB1 tuvo un efecto sobre los mesoangioblastos ad ultos, así también . Los autores repitieron los experimentos previamente descritos sobre los mesoangioblastos adultos aislados de la médula ósea (clon G 1 , ver materiales y métodos). La Fig ura 1 2 resume nuestros descubrimientos. La H G B 1 origina la proliferación de célula germinal ad ulta (Panel A), quimiotaxis y transmigración (panel B) . Finalmente, as í como los mesoangioblastos embrión icos, los mesoangioblastos adultos pueden reclutarse por H MGB1 en el músculo anterior tibial (Fig . 1 2C). Los efectos similares también se observaron en los experimentos adicionales con diferentes líneas de mesoangioblasto adulto derivadas de la aorta de ratones de 8 semanas de edad (datos no mostrados).

EJ EMP LO 4 MATERIALES Y MÉTODOS Análisis inmunohistoquímico Los corazones se arrestaron en d iastola a 1 semana del infarto, se prefusionaron de manera retrograda con 1 0% (vol/vol) de formalina, se incorporan en parafina y se seccionaron en 4 µp?. Las secciones se colorearon con hematoxilina y eosina (H&E) para la evaluación histológica o se procesaron por análisis inmunohistoquímico para identificar las células card íacas recientemente formadas. Los sig uientes anticuerpos se uti lizaron para valorar la d iferenciación card iaca: anticuerpo de conexina 43 policlonai de conejo (Sigma St. Louis, MO, USA), actina anti -sarcomérica monoclonal de ratón (clon 5C5; Santa Cruz Biotechnoiogy, Santa Cruz, CA, USA), anti-MEF-2 pol iclonai de conejo (C-21 ; Santa Cruz). K¡67 se detectó al utilizar el anticuerpo monoclonal de ratón Ki67 (clon I B5 Novocastra Laboratories , U K). El anti-conejo de cabra conj ugada por F ITC y anti-ratón de cabra conjugado por TRITC (Sigma) se utilizaron como anticuerpos secundarios.

Evaluación de la función miocardial La ecocardiografía se realizó en ratones concientes con un instrumento Seq uoia 256c eq uipado con u n transd uctor l ineal 13-MHz. Dos imágenes dimensionales e ind icios de modo M se registraron de la vista de eje corto parasternal en el nivel del músculo capilar. De los indicios de modo M, los parámetros anatómicos en diastola y sístole se obtuvieron (Orlic et al. , Nature, 98, 1 0344-1 0349, 2001 ). Para los estudios hemodinámicos, los ratones se anestesiaron con hidrato doral (400 mg/kg de peso corporal), la arteria carótida derecha se can u ló con un transd uctor de presión de micropunta (Miliar 1 .4F) y las presiones Ventriculares Izq uierdas (LV, LV+ y -dP/dt) se midieron .

RESULTADOS HMGB1 promueve la formación de nuevos miocitos en el corazón infartado El infarto al miocardio se indujo en ratones C57BL/6 al ligar la arteria coronaria izquierda (Li et al., J. Clin. Invest. 100, 1991-1999, 1997) bajo anestesia. Después de 4 horas, los animales se re-operaron y 200 ng de HMGB1 purificada se administró en el área peri-infartada en el ventrículo izquierdo. Los animales de control consistieron de ratones infartados inyectados con 200 ng de una proteína sin relacionar (GST). La inyección de HMGB1 en el ventrículo izquierdo peri-infartado da como resultado la formación de un tejido compacto caracterizado por las células alineadas que ocupan la mayoría del área dañada, según se muestra por coloración de hematoxilina y eosina (Fig. 13A). El tejido recientemente desarrollado se extendió desde la zona límite, en donde fue más compacto y organizado, hacia el interior de la región lesionada. Cuando una proteína de control (GST) se utilizó en experimentos similares, nunca se observó nuevo tejido que consiste de células alineadas. Para caracterizar el tejido nuevamente formado, los autores probaron la expresión de actina a-sarcomérica, un marcador específico de diferenciación cardiaca. El análisis inmunohistoquímico mostró que el tejido presente en los corazones inyectados con HMGB1 (n=8) consiste de células positivas de actina a-sarcomérica (Fig. 13C). Además, algunas células mostraron conexina 43, un componente de la abertura-juntas entre los cardiomiocitos (no mostrados). De manera interesante, las células que expresan actina a-sarcomérica también fueron positivas para MEF2, un factor de transcripción incluido en la activación de los promotores de varios genes estructurales cardiacos (Fig. 13D). De manera inversa, solamente las células de infiltración se observaron en corazones tratados con GST (n=6). Los autores también evaluaron la etapa de crecimiento de las células en el corazón tratado con HMGB1 , al analizar la expresión de K¡67, una proteína que se presenta en G 1 , S, G2 y mitosis temprana. Ki67 se expresó en algunas células recientemente formadas, localizadas dentro del tejido infartado (Fig . 13B). Estos datos demuestran que la HMGB1 promueve la formación de nuevos mitocitos en el corazón infartado.

La función miocardial después del infarto se mejora por HMGB1 Una semana siguiente al infarto, los autores investigaron los parámetros hemodinámicos y ecocardiográficos en los ratones sobrevivientes. En comparación con los ratones operados en falso, los animales infartados ya sea tratados o no con HMGB1 mostraron índices de falla cardiaca. En comparación a los ratones infartados pero no tratados, sin embargo, los ratones tratados con H GB1 mostraron una recuperación importante del funcionamiento cardiaco. La fracción de expulsión (EF) fue 51 % mayor en ratones tratados con HMGB1 que en los tratados con GST (Fig . 14). La presión diastólica final LV (LVEDP) fue 39% inferior que en lo ratones tratados con GST, alcanzando niveles similares a aquellos obtenidos en ratones operados en falso (Fig. 15). Los cambios en la presión desarrollada LV (LVDP) y + y - dP/dT) también se mejoraron en los ratones tratados con HMGB1 mostrando un aumento de 34% , 39% y 45% arriba del control, respectivamente. Por lo tanto, HMGB1 , al inducir la formación de cardiomiocitos, mejoró el funcionamiento ventricular izquierdo en el corazón infartado.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Una composición que comprende una cantidad eficaz de la proteína HMGB1 o partes funcionales de la misma, o vectores que expresan HMGB1 , para el tratamiento de daño de tejido y/o para promover la regeneración y reparación de tejido. 2. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque la regeneración de tejido depende del crecimiento de las células del mismo tipo que aquellas dañadas, excluyendo el tejido conectivo, 3. La composición según la reivindicación 2, caracterizada porque el tejido es músculo esq uelético o cardiaco. 4. La composición según la reivindicación 3, caracterizada porque la regeneración y/o reparación de tejido incluye la reparación y/o regeneración de áreas de necrosis. 5. La composición según la reivindicación 4, caracterizada porque las áreas de necrosis comprenden sitios de trauma, sitios de isquemia que incluyen el corazón infartado, sitios de quemadura. 6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo además una cantidad eficaz de un agente de anti-inflamación. 7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo además diluyentes y/o adyuvantes para la perfusión en el sitio de reparación de tejido. 8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo además diluyentes y/o adyuvantes y/o vehículos para la inyección intramuscular. 9. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, asociada además a células germinales. 10. La composición según la reivindicación 9, caracterizada porque dichas células germinales son mesoangioblastos. 1 1 . Una composición que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de la proteína HMGB1 para el tratamiento de efectos adversos inducidos por el tejido necrótico, tales como la activación de células sobrevivientes cercanas, el reclutamiento y activación de las células mieloide, la pérdida de la función de barrera de endotelio, y edema. 12. La composición según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque el tejido necrótico se refiere a infarto intestinal, pancreatitis aguda y trauma extensivo. 13. La composición según la reivindicación 12, caracterizada porque los efectos adversos inducidos por el tejido necrótico incluyen efectos a largo plazo de necrosis, tales como sepsis y falla múltiple de órgano. 14. La composición según las reivindicaciones 1 1 a 1 3, caracterizada porque el antagonista H MGB1 comprende los anticuerpos HMGB1 y las partes sintéticas o recombinantes funcionales de los mismos, ARNs de interferencia, ARNs antisentido, moduladores naturales o sintéticos. 15. La composición según las reivindicaciones 11 a 14, caracterizada porque la composición se administra dentro de 16. horas del caso necrótico. 16. El método para promover la migración de célula germinal y/o proliferación en el cultivo celular o ¡n vivo comprendiendo la etapa de exponer tales células a una cantidad eficaz de la proteína HMGB1 o partes funcionales de la misma. 17. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque dichas células germinales son células germinales circulantes o cardiacas residentes. 18. El método para promover la proliferación de cardiomiocitos en el cultivo celular o in vivo comprendiendo la etapa de exponer tales células a una cantidad eficaz de la proteína H GB1 o partes funcionales de la misma. RESU MEN Se describe una composición que comprende una cantidad eficaz de la proteína H MGB 1 o partes funcionales de la misma, o vectores que expresan H MG B 1 , para el tratamiento de daño de tejido y/o para promover la regeneración y reparación de tejido. Además se describe una composición que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de la proteína H MGB 1 para el tratamiento de efectos adversos inducidos por el tej ido necrótico, tales como el reclutamiento y activación de células mieloide, la pérdida de la función de barrera del endotelio, y edema.