CN102375064A - 用酶联免疫法检测人体中hmga2含量的体外诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用酶联免疫法检测体内HMGA2含量的体外诊断试剂盒。它是由HMGA2固相板、酶标记物、显色剂、终止液、洗涤液组成。用于人体中HMGA2含量的测定。其优点在于检测灵敏度高、检测限低,是一种新型肿瘤标志物,同时对于胶体金法、化学发光法的其他检测肿瘤结果一致性较好,因此,对大中小型医院均适用,具有临床实用性,为临床诊断肿瘤与预后检测肿瘤情况提供可靠的实验数据。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫体外诊断试剂领域,更具体地说,涉及一种采用酶联免疫法的检测HMGA2抗原的体外诊断试剂盒及制备方法。
背景技术
高迁移率蛋白A(High mobility group A,HMGA)家族是细胞核内一组小分子的染色体结合蛋白,包括HMGA1a,HMGA1b,和HMGA2三种成员。各成员分子内均含有三个短的DNA结合结构域,能与DNA分子小沟内的A-T丰富区结合,在形成高度立体结构特异的转录因子复合体中具有构筑因子(architecturalfactor)的作用。HMGA2在细胞内的正常功能除已知的与胚胎发育有关外,其他尚未完全明确,但由于编码基因位于许多肿瘤细胞染色体断裂点的簇集区,它的异常表达与肿瘤的关系在国际上已日益引起关注,由于其生物学行为类似癌基因,已逐渐被视为一种潜在的肿瘤诊断和判断预后的生物标记。
乳腺癌是严重危及人体生命的恶性肿瘤。它是乳房腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下发生了基因突变,随之乳腺细胞便丧失了正常细胞的特性,导致组织结构紊乱,细胞连接松散,癌细胞很容易脱落游离,随血液或淋巴液等播散全身,形成早期的远端转移,直接威胁人的生命,给乳腺癌的临床治愈增加了很大困难。影响肿瘤发展的基因可分为两类:一类基因在DNA水平发生突变直接导致肿瘤的发生,如BRCA1,BRCA2,P53等;另一类是不同层次表达水平出现变化促使肿瘤的生成和发展,如C-erbB2,Nm23等。乳腺癌的发生和发展均是受到来自以上两类多种基因共同调控的结果。
乳腺癌常发病于40岁以上的妇女,根据世界卫生组织公布乳腺癌发生每年递增0.2~0.3%,每3分钟就有一名妇女被诊断为乳癌,每13分钟就有一名患者死于乳癌。乳癌发病率在我国居女性恶性肿瘤的第二位,且有逐年上升趋势,在某些地区已处于第一位。近年发现其发病呈年轻化趋势,它已严重威胁妇女的身心健康。目前,中、美、德等国研究人员均已经证明了HMGA2与多种癌症有着特定的关系。自1997年Piere等利用RNA印迹分析检测HMGA2在乳腺组织中的表达,并发现其在浸润性乳腺癌高度表达,在正常乳腺或良性乳腺病变中几乎不表达以来,至今国外已有某些科研机构组对其染色体定位、序列和结构等作了一定的基础性研究,作为乳腺癌的特异基因,它在乳腺癌的辅助诊断,判断预后以及基因治疗等方面作用是不可低估的。
早期诊断是提高乳腺癌5年生存率的关键,寻求简单而又可靠的早期诊断方法,提高早期诊断率是当前迫切需要解决的问题。尽管组织病理学等诊断学是临床工作的金标准,肿瘤大小,淋巴结转移与否,雌、孕激素受体状态以及血管浸润等多种病理情况已经对乳腺癌判定预后和选择治疗方案有了许多指导意义,但随着分子生物学研究的不断拓展和深入,发现和应用乳腺癌相关的特异肿瘤标志物已成为可能,这为研究乳腺癌的诊断提供了更多更新的信息。
发明内容
为了解决目前临床上检测肿瘤标志物单一、灵敏度低、其他方法有弊端、放免试剂有限期短、放射性废弃物污染危害等多种因素干扰、底物大部分有毒等不足,本发明提供了一种采用酶联免疫法检测人体HMGA2含量的体外诊断试剂盒及其制备方法。
本发明涉及一种用酶联免疫法检测体内HMGA2含量的体外诊断试剂盒。它是由HMGA2固相板、酶标记物、显色剂、终止液、洗涤液组成。其中所述的固相板为兔抗人HMGA2包被板、酶标记物为HRP与兔抗人HMGA2结合的溶液。
所述的的HMGA2固相板是用0.2M pH值为6.5的磷酸盐缓溶液配置成所需的抗体浓度,并将包被液负载于固相载体上,用含1%pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液封闭后,真空干燥,铝箔袋密封,2-8℃保存。
所述的酶标记物配置方法为:含有10%-30%的HRP的磷酸盐缓冲溶液。
使用本发明的试剂盒检测人体HMGA2,操作简便,灵敏度高,特意型号,与其他方法学诊断肿瘤标志物的结果符合度极高。是一种新型肿瘤标志物的诊断试剂盒。
在上述技术方案的基础上:优选结果为:
所述的酶结合物为含有辣根过氧化物酶(HRP)的溶液,底物为TMB,终止液为1N的盐酸溶液。
在上述技术方案的基础上,本发明还提供了一种新型检测肿瘤标志物的酶联免疫试剂盒的制备方法,包括一下步骤:
1.包被固相载体的制备:以兔抗人HMGA2抗体包被固相载体采用一下方法制备:用0.2M pH值为6.5的磷酸盐缓溶液配置成所需的抗体浓度,并将包被液负载于固相载体上,用含1%pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液封闭后,真空干燥,铝箔袋密封,2-8℃保存。
2.酶标记物的制备:将将0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液透析的抗人HMGA2加入含有HRP的溶液中,反应结合后通过层析柱纯化、分装、低温避光保存。
具体实施方式
将兔抗HMGA2抗体用于制备ELISA试剂盒的制备和操作如下:
1.微孔包被
多克隆兔抗人HMGA2包被到96孔I型微孔板上。在0.2M NaPO4,pH值为6.5的缓冲液中制备0.01mg/mL兔抗人HMGA2多克隆的抗体溶液。将100μL抗体溶液添加到各微孔中,并在4℃温育整夜。然后除去抗体溶液,用300μL 10mM PH值7.4的磷酸盐缓冲液冲洗各微孔,然后添加150μL含1%牛血清白蛋白溶液,PH值7.4的10mM磷酸盐缓冲液到各微孔中。微孔板在室温中温育整夜。除去含1%牛血清白蛋白的溶液,往各微孔中添加250μL含2.5%蔗糖溶液,PH值为7.4的10mM磷酸盐缓冲液,温育四小时。除去蔗糖溶液,真空干燥微孔板整夜。微孔板保持干燥。
2.辣根过氧化物酶的结合
使用前,用1L PH值9.6的0.01M碳酸氢钠缓冲液透析5mg兔抗人HMGA2多克隆抗体,2-8℃下整夜。此外,7.5mg辣根过氧化物酶溶解于1.9L蒸馏水中,混合时逐滴将0.4mL 0.1M的高碘酸钠溶液加入辣根过氧化物酶溶液中。在暗处混合25分钟,然后用1L PH值4.3的1mM醋酸盐缓冲液透析该溶液,2-8℃下整夜。之后将透析的辣根过氧化物酶溶液添加到纯化的兔抗人HMGA2多克隆抗体中,该溶液在室温下暗处混合3-4小时。将定量的硼氢化钠溶液添加到反应混合物中,并置于2-8℃下两小时,期间不时混合。最后,用1L PH值7.2,含0.85%氯化钠的0.05M磷酸钾缓冲液透析该溶液。再用S-300柱进一步纯化该结合物溶液。
3.人HMGA2标准曲线
用胎牛血清将重组人HMGA2(取自HMGene,Inc.)稀释到0,1.5,3.0,6.0,12,24,48,96,及192ng/mL.
该实验按下列步骤进行:指定数量的微孔安放在支架上。往各孔中添加100μL标准品。室温下在3,000rpm的旋转振荡器上振荡温育60分钟。除去温育的混合物,用蒸馏水冲洗微孔五次。除去所有残留水滴。往各孔中添加100μL兔抗人HMGA2辣根过氧化物酶结合物试剂。室温下在3,000rpm的旋转振荡器上振荡温育60分钟。除去温育的混合物,用蒸馏水冲洗微孔五次。除去所有残留水滴。添加100μLTMB。室温下在3,000rpm的旋转振荡器上振荡温育20分钟。添加100μL IN HC1终止显色反应。在15分钟内用酶标仪在450nm处读取吸收值。
4.终止液的制备:配置过程(以配置1000ml为例)
量取或称取916.7ml纯化水于适当容器中;
↓
量取83.3ml浓盐酸缓慢加至916.7ml纯化水中,充分溶解即可。
5.洗涤液的制备:(以配置1000ml为例)
量取或称取795ml纯化水于适当容器中
↓
量取200ml 0.5M磷酸钾缓冲液(pH=7.20)于上述溶液中,充分混匀
↓
称取85.0g NaCl于上述溶液中,充分溶解
↓
量取5ml Tween 20于上述溶液中,充分溶解
↓
用6N HCL或5N NaOH调节pH至7.00(±0.1)20倍稀释后pH为7.20
↓
根据需要过0.22μm的滤膜。
使用时用蒸馏水稀释20倍。
6.人HMGA2 ELISA标准曲线
我们在此试验中获得的低端灵敏度约是3.0ng/mL HMGA2。
7.本发明试剂盒的使用方法:
a.将包被好的HMGA2固相板编号,放置于固定的位置。
b.在每个微孔中加入100ul的样本,于室温振动孵育2小时,转速为750rpm.
c.用洗涤液冲洗微孔板4次,在用蒸馏水冲洗1次,并在干净的吸水纸将残留的水分扣干。
d.在每个微孔中加入100ul的HMAG2酶标记物,在室温振荡孵育2小时,转速为750rpm.
e.用洗涤液冲洗微孔板4次,在用蒸馏水冲洗1次,并在干净的吸水纸将残留的水分扣干。
f.在每孔中加入100ul的TMB试剂,在室温暗处振荡孵育20分钟,转速为750rpm.
g.在每孔中加入100ul的盐酸终止液
h.轻轻混匀20秒。
i.在20分钟内,于A450下读取吸光度。
8.采用具体实施中第7点的使用方法对患有人乳腺癌的23例样本进行检测,检测结果如下:
确诊的乳腺癌样本 | 23 |
HMGA2被检测出的数量 | 18 |
根据所上述6、8数据表明,本发明试剂盒特异性、敏感性优良,阳性预测率可达79%,本发明的试剂盒,可以作为人体内新型肿瘤标志物HMGA2检测的辅助手段,对肿瘤患者的分级诊断及预后监控具有及其重要的意义。
以上所述仅为本发明的原则性实施方式,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.用酶联免疫法检测人体中HMGA2含量的体外诊断试剂盒,其特征在于,所述体外诊断试剂盒是有HMGA2固相板、酶标记物、显色剂、终止液、洗涤液组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述固相板是包被了兔抗人HMGA2多克隆抗体的96孔微孔板。其包被浓度为:0.01mg/mL兔抗人HMGA2多克隆抗体,溶液含有pH6.5的0.2mol/L磷酸钠及Ph7.4的牛血清白蛋白。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的酶标记物为HMGA2辣根过氧化物酶结合物。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述显色剂为TMB。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的终止液为1N的盐酸溶液。
6.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的洗涤液为0.5M磷酸钾缓冲液。使用时用蒸馏水稀释20倍。
7.如权利要求1所述的试剂盒的方法,其特征在于包括一下步骤:配制兔抗人HMGA2多克隆抗体,以HRP为抗体结合物,配置显色剂、终止液及洗涤液,分装上述组分并组装为成品。
8.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述以兔抗人HMGA2抗体包被固相载体采用以下方法制备:用0.2M pH值为6.5的磷酸盐缓溶液配置成所需的抗体浓度,并将包被液负载于固相载体上,用含1%pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液封闭后,真空干燥,铝箔袋密封,2-8℃保存。
9.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的酶标记物配置方法为:含有10%-30%的HRP的磷酸盐缓冲溶液。
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