KR20190073610A - 조직 재생을 유도하기 위한 펩티드 및 그의 이용 - Google Patents

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Abstract

(과제) 골수 중간엽 줄기세포 등의 PDGFRα양성 세포의 자극에 동반하여 혈중 동원, 손상 조직으로의 집적을 촉진하고 체내(in vivo)에서의 조직재생을 유도하는 치료약의 제공을 과제로 한다.
(해결수단) 복수의 펩티드를 합성하고 각 펩티드의 이동 활성의 평가를 시도하였다. 그 결과 PDGFRα양성 골수 중간엽 줄기세포(MSC-1)에 대해 이동 활성을 나타내는 복수의 펩티드의 동정에 성공했다. 나아가 동정한 펩티드가 PDGFRα양성 세포인 피부 섬유아세포에 대해서도 이동 활성을 갖는 것 등을 확인하였다.

Description

조직 재생을 유도하기 위한 펩티드 및 그의 이용{PEPTIDE FOR INDUCING REGENERATION OF TISSUE AND USE THEREOF}
본 발명은 조직 재생을 유도하기 위한 펩티드와 그 이용에 관한 것이다.
생체 내의 각 장기나 조직은 그 구조나 기능의 항상성을 유지하고 있는 조직 줄기 세포를 가지고 있음이 밝혀지고 있다. 예를 들면 심장에는 심근 줄기 세포가, 뇌에는 신경 줄기 세포가, 피부에는 표피 줄기 세포나 모포 줄기 세포가 존재한다. 그들은 생애에 걸쳐 심근 세포, 신경 세포, 및 표피 세포나 모포 상피 세포를 심장, 뇌, 및 피부에 각각 공급하고 심장, 뇌, 피부의 구조와 기능을 유지하고 있다. 한편 골수 속에는 적혈구, 백혈구, 혈소판 같은 혈액 세포로 분화하는 조혈 줄기세포가 존재한다. 이들 조혈 줄기 세포에서 유래하는 혈액 세포는 혈류를 통해 체내의 모든 장기나 조직을 순환하며 산소 공급, 면역 반응, 지혈, 및 손상 조직의 수복 등 생명 유지에 불가결한 기능을 한다. 따라서, 골수 조혈 줄기 세포는 그 편재하는 조직인 골수와 뼈 조직의 항상성 유지라기보다는 차라리, 말초 순환을 통해 생체 내 모든 조직의 항상성 유지에 기여하고 있다고 보는 것이 타당하다.
최근, 골수 내에 조혈 줄기 세포에 더해, 뼈, 연골, 지방 등의 중배엽 조직뿐만 아니라 신경이나 표피 등 외배엽 조직으로도 분화 가능한 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)가 존재하고 있음이 밝혀졌으나 생체 내에서 중간엽 줄기 세포의 존재 의의는 아직 불분명한 점이 많다. 그러나 말초 순환을 통해 혈액 세포를 공급함으로써 모든 조직, 장기의 항상성을 유지하고 있는 조혈줄기 세포가 골수 안에 존재하고 있다면, 마찬가지로 골수 내에 존재하는 중간엽 줄기 세포도 말초 순환을 통해 뼈, 연골, 지방, 신경, 상피 등으로 분화 가능한 세포를 필요로 하는 생체 내 조직과 장기에 제공함으로써 조직의 항상성 유지에 기여하고 있을 것으로 예상된다.
현재 골수 중간엽 줄기 세포를 골수 혈액 채혈로 채취하여 세포 배양에 의해 증식시킨 뒤 난치성 조직 손상 부위 혹은 말초 순환 혈액 중에 이식해 손상 조직의 재생을 유도하는 재생 의료가 활발하게 개발되고 있다. 이미 뇌 경색, 심근 경색, 난치성 피부 궤양 등의 재생 의료에 대해 골수 중간엽 줄기 세포 이식의 임상 응용이 진행되고 있다. 또한 이식한 골수 중간엽 줄기 세포는 생체 내 국소에서 염증, 면역 반응 억제 작용, 섬유성 반흔 형성 억제 작용을 발휘하는 것이 밝혀져 골수 이식이나 수혈 후의 심각한 부작용인 이식 편대 숙주 반응(graft versus host disease, GVHD)이나 자기 면역 질환인 강피증에 대한 새로운 치료법으로서, 골수 중간엽 줄기 세포 이식 요법의 임상 시험이 시작되고 있다. 그러나 골수 중간엽 줄기 세포를 함유하는 골수 혈액은 장골뼈에 굵은 바늘을 몇번이나 자입한다는 외과적 수법으로만 채취된다. 더욱이 골수 중간엽 줄기 세포는 체외에서 계대 배양을 계속하면 점차 증식 능력이나 다분화능을 상실한다. 또한 생체 내 이식의 안전성을 보증하는 품질 관리에 근거한 골수 중간엽 줄기 세포 배양은 CPC(cell processing center)등의 특수 배양 시설을 필요로 하기 때문에 현 시점에서는 지극히 한정된 대학이나 기업에서만 실시 가능하다. 즉, 골수 중간엽 줄기 세포를 이용한 재생 의료를 난치성 조직 손상에 시달리는 세계의 많은 환자에게 가능하게 하려면 모든 의료 시설에서 실시 가능한 중간엽 줄기 세포 재생 의료를 위한 기술 개발이 시급한 과제이다.
HMGB1(High mobility group box 1)단백질은 핵 염색질 구조를 제어하여 유전자 발현과 DNA수복을 제어하는 비히스톤 염색질 단백질로서 약 30년 전에 확인되었다. HMGB1 단백질의 구조는 주로 두 개의 DNA결합 도메인으로 구성되는데 N말단 측에 있는 DNA결합 도메인을 A-box, C-말단 측의 DNA결합 도메인을 B-box라고 부른다. 과거의 연구를 통해 TLR과 결합해 염증 반응을 일으키는 도메인은 HMGB1분자의 B-box내에 존재하는 것이 밝혀졌다.
특허문헌 1 : WO2008/053892 특허문헌 2 : WO2007/015546 특허문헌 3 : WO2009/133939 특허문헌 4 : WO2009/133943 특허문헌 5 : WO2009/133940 특허문헌 6 : 일본 특표 2005-537253
비특허문헌1 : Bustin 등, Mol Cell Biol,19：5237-5246,1999년 비특허문헌2 : Hori 등, J. Biol. Chem., 270,25752-25761,1995년 비특허문헌3 : Wang 등, Science, 285：248-251,1999년 비특허문헌4 : Muller 등, EMBO J, 20：4337-4340, 2001년 비특허문헌5 : Wang 등, Science, 285：248-251, 1999년 비특허문헌6 : Germani 등, J Leukoc Biol. Jan;81(1):41-5, 2007년 비특허문헌7 : Palumbo 등, J. Cell Biol., 164：441-449, 2004년 비특허문헌8 : Merenmies 등, J. Biol. Chem., 266：16722-16729, 1991년 비특허문헌9 : Wu Y 등, Stem cells、25:2648-2659, 2007년 비특허문헌10 : Tamai 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 4. [Epub ahead of print], 108：6609-6614, 2011년 비특허문헌11 : Yang 등, J Leukoc Biol. Jan;81(1):59-66, 2007년
최근 본 발명자들은 피부 기저막 영역의 접착 분자의 유전자 이상으로 전신 피부가 박리하여 전신 화상 유사의 증상을 보이는 유전성 피부 난치병인 "표피 수포증(epidermolysis bullosa)"에서 박리 표피의 재생 메카니즘의 해명을 목적으로 연구를 진행시켰다. 본 발명자들은 박리 표피부터 혈중에 방출되는 HMGB1(High mobility group box 1)단백질이 PDGFRα(platelet-derived growth factor receptor alpha)-양성 세포를 자극하여 골수로부터 혈중으로 동원되어 박리 표피부로의 집적을 유도하는 것과, 박리 표피부에 집적된 PDGFRα-양성 세포는 섬유 아세포와 표피 세포로 분화하여 손상 피부의 재생에 크게 기여하고 있음을 녹색 형광 단백질(GFP, green fluorescent protein)형질 전환 골수 세포를 이식한 표피 수포증 모델 마우스를 이용함으로써 밝혔다. 또한 마우스에 피부 궤양이나 뇌 경색을 유도한 후에 재조합 HMGB1 단백질을 꼬리 정맥에 투여하면 골수로부터 PDGFRα-양성 세포가 혈중 동원되어 피부 궤양부와 뇌 경색부에 집합하여 피부 궤양이나 뇌 경색으로부터 재생을 강하게 유도한다는 점을 밝혔다. 골수 내 PDGFRα-양성 세포는 뼈, 연골, 지방, 또한 신경이나 상피로도 분화 가능한 중간엽 줄기 세포인 것이 이전에 보고되어 있다. 즉, HMGB1투여에 의해 골수 내 PDGFRα-양성 중간엽 줄기 세포를 말초 순환에 동원함으로써 생체로부터 채취된 세포를 체외(ex vivo)에서의 특수한 배양을 하지 않고 생체 내에서 손상 조직에 많은 중간엽 줄기 세포를 집적시킬 수 있게 되었다.
HMGB1을 생체 내 골수 중간엽 줄기 세포의 혈중 동원에 의한 손상 조직 재생 유도 의약으로 개발한다면 모든 의료 기관에서 골수 중간엽 줄기 세포에 의한 재생 유도 의료를 실시할 수 있게 된다. 그 결과, 상술한 현재의 골수 중간엽 줄기 세포를 이용한 재생 의료가 직면하고 있는 많은 과제가 해결된다.
상술한 것처럼, HMGB1의약은 골수 중간엽 줄기 세포의 혈중 동원, 손상 조직으로의 상기 세포의 축적을 촉진하고 그에 따라 체내의 조직 재생을 유도하는 획기적인 치료약이다. 본 발명자들의 이전의 연구에 의하면 고농도의 재조합 HMGB1 단백질을 마우스나 래트(rat)에게 투여해도 전혀 부작용은 관찰되지 않았다. 이러한 관점에서 또 표피 박리 이외에 위독한 증상이 없는 표피 수포증 환자 말초 혈액 내에 아주 고농도의 HMGB1이 존재하고 있다는 본 발명자들의 관찰 사실과 아울러 HMGB1 투여는 안전성이 매우 높다고 예측된다. 그러나 HMGB1에는 염증 효과를 갖는다는 보고도 있다. 상기한 바와 같이 HMGB1에 대해서는 몇가지 발견된 점이 있지만 HMGB1 단백질 단편의 중간엽 줄기 세포에 대한 작용, 조직 재생에 있어서의 역할에 관해서는 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 HMGB1 단백질의 1에서 84번째까지의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 85에서 169번째까지의 아미노산으로 이루어진 펩티드를 각각 HEK293세포의 배지 내에서 재조합 단백질로서 분비시켰다. 배지 중의 목적 단백질을 크로마토그래피에 따라 각각 정제하고 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주(MSC-1)에 대한 이동 촉진 활성을 확인하였다. 그 결과 본 발명자들은 1부터 84번째까지의 아미노산으로 이루어진 펩티드에 이동 촉진 활성을 인정할 수 있었다.
다음으로 본 발명자들은 MSC-1에 대한 이동 촉진 활성이 인정된 HMGB1 단백질의 1에서 84번의 아미노산으로 이루어진 펩티드에 기초하여 1부터 44번의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 45에서 84번의 아미노산으로 이루어진 펩티드를 제작하여 각각 이동 촉진 활성을 조사하였다. 그 결과, 양 펩티드 단편이 모두 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주(MSC-1)에 대해 이동 촉진 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
다음으로 각각의 단편 부분을 중심으로 조금씩 겹치는 다양한 펩티드 단편을 화학 합성하여 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주(MSC-1)에 대한 이동 촉진의 활성을 평가했다. 그 결과 본 발명자들은 이동 촉진 활성을 나타내는 복수의 펩티드의 동정에 성공했다.
또한 본 발명자들은 동정한 펩티드가 PDGFRα-양성인 피부 섬유 아세포에 대해서도 이동 촉진 활성을 가지는 것이나, 뇌 경색 모델 마우스의 뇌 경색부의 크기를 축소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 HMGB1 단백질의 2에서 84번째까지의 아미노산으로 이루어진 재조합 단백질, HMGB1 단백질의 89에서 215번째까지의 아미노산으로 이루어진 재조합 단백질을 대장균에서 발현시켰다. 발현시킨 단백질을 컬럼 크로마토그래피로 정제하고 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주(MSC-1) 및 인간 골수 중간엽 줄기 세포에 대한 이동 촉진 활성을 확인하였다. 그 결과 본 발명자들은 2에서 84번째까지의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 89에서 215번째까지의 아미노산으로 이루어진 펩티드에 이동 촉진 활성을 인정할 수 있었다.
다음으로 본 발명자들은 MSC-1 및 인간 골수 중간엽 줄기 세포에 대한 이동 촉진 활성이 인정된 2에서 84번의 아미노산으로 이루어진 펩티드에 기초하여 2에서 44번의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 45에서 84번의 아미노산으로 이루어진 펩티드를 제작하여 각각 이동 촉진 활성을 조사하였다. 그 결과, 제작된 양 펩티드 단편 모두 MSC-1 및 인간 골수 중간엽 줄기 세포에 대해 이동 촉진 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
다음으로 본 발명자들은 MSC-1 및 인간 골수 중간엽 줄기 세포에 대한 이동 촉진 활성이 인정된 89에서 215번의 아미노산으로 이루어진 펩티드에 기초하여 C-말단을 점진적으로 짧게 한, 즉 89에서 205번의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 89에서 195번의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 및 89에서 185번의 아미노산으로 이루어진 펩티드를 제작하여, 각각에 대해 이동 촉진 활성을 조사하였다. 그 결과, 제작한 펩티드 단편 중 C-말단을 짧게 할수록 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주(MSC-1) 및 인간 골수 중간엽 줄기 세포에 대해 이동 촉진 활성이 증강되었다.
또 2에서 84번의 아미노산으로 이루어진 펩티드에 전체적 또는 부분적 C-말단 산성꼬리(acidic tail,아스파트산 및 글루탐산으로 이루어진 것으로서 10- 혹은 20- 혹은 30-아미노산 서열)를 부가한 3종류의 융합 펩티드를 작성했는데 놀랍게도 모든 융합 펩티드에 대해 2-84의 펩티드의 이동 촉진 활성이 극히 감소한다는 사실이 밝혀졌다. 이는 산성 꼬리의 전체 혹은 일부가 전장의 HMGB1에서 이동 촉진 활성을 억제하도록 제어하는 것을 나타내고 있다. 상기 단편화에 의해 적어도 3곳 이상의 이동 촉진 활성 도메인이 밝혀졌으며 이는 이러한 도메인이 전장의 상태에서는 산성 꼬리에 의해 억제되고 있을 가능성을 시사했다.
또한 본 발명자들은 동정한 펩티드가 손상된 피부 모델에 치료 효과가 있음을 확인하였다.
본원은 이러한 지견에 근거하여 하기 발명을 제공하는 것이다:
[1] 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질을 포함하여 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 조성물:
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터;
[2] 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질을 포함하여 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하기 위해 이용되는 조성물:
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터;
[3] 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질을 포함하여 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물:
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터;
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 이동이 자극되는, 또는 골수로부터 말초혈액으로 동원되는 세포가 PDGFRα-양성 세포인 조성물;
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 이동이 자극되는, 또는 골수로부터 말초혈액으로 동원되는 세포가 줄기 세포인 조성물;
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 이동이 자극되는, 또는 골수로부터 말초혈액으로 동원되는 세포가 골수 세포인 조성물;
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 이동이 자극되는, 또는 골수로부터 말초혈액으로 동원되는 세포가 골수 중간엽 줄기 세포인 조성물;
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 세포 이동 자극 활성을 가지고 HMGB1 단백질의 일부로 이루어진 펩티드가 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나의 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어지고, 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드인 조성물;
[9] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 세포 이동 자극 활성을 가지고 HMGB1 단백질의 일부로 이루어진 펩티드가 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드인 조성물:
(1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
(2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
(3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
(4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
(5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열;
[10] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 세포 이동 자극 활성을 가지고 HMGB1 단백질의 일부로 이루어진 펩티드가 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드인 조성물:
(1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
(2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
(3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
(4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
(5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열;
[11] 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함하여 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 조성물:
(1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
(2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
(3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
(4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
(5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열;
[12] 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함하여 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하기 위해 이용되는 조성물:
(1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
(2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
(3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
(4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
(5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열;
[13] 다음 중 하나의 아미노산 서열을 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함하여 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물:
(1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
(2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
(3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
(4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
(5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열;
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 합성된 펩티드인 조성물;
[15] [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 세포를 이용하여 제조된 펩티드인 조성물;
[16] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 태그(tag)가 부가된 펩티드인 조성물;
[17] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 태그 유래의 펩티드 단편이 부가된 펩티드인 조성물;
[18] 세포 이동 자극 활성을 갖는 HMGB1 단백질의 일부로 이루어진 펩티드;
[19] [18]에 있어서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
[20] [18]에 있어서, 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드:
(1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
(2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
(3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
(4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
(5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열;
[21] [18]에 있어서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드:
(1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
(2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
(3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
(4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
(5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열;
[22] 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드:
(1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
(2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
(3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
(4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
(5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열;
[23] [18] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 합성된 펩티드;
[24] [18] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 세포를 이용하여 제조된 펩티드;
[25] [18] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 태그가 부가된 펩티드;
[26] [18] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 태그 유래의 펩티드 단편이 부가된 펩티드;
[27] [18] 내지 [26] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 코딩하는 DNA;
[28] [27]에 기재된 DNA를 포함하는 벡터;
[29] [27]에 기재된 DNA 또는 [28]에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 세포.
[도 1] 도 1은 HEK293세포를 이용하여 펩티드 및 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터를 나타낸다.
[도 2] 도면 중 A는 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주의 펩티드에 대한 이동 촉진 활성을 나타내는 사진이다. 양성 대조군인 전장의 HMGB1(1-215), 1부터 84번의 아미노산으로 이루어진 펩티드(1-84), 85에서 169번의 아미노산으로 이루어진 펩티드(85-169), 1부터 44번의 아미노산으로 이루어진 펩티드(1-44), 45에서 84번의 아미노산으로 이루어진 펩티드(45-84)를 비교했다. 이들 펩티드는 모두 HEK293을 이용하여 생산했다. 도면 중 B는 골수 중간엽 줄기 세포에서 PDGFRα의 발현 유무를 웨스턴 블롯에서 보여주고 있다. 인간 골수 중간엽 줄기 세포에서의 PDGFRα의 발현이 확인됐다.
[도 3] 도 3은 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주의 펩티드에 대한 이동 활성을 나타내는 사진이다. HMGB1의 45 내지 215번의 아미노산으로 이루어진 펩티드(45-215) 및 63에서 215번의 아미노산으로 이루어진 펩티드(63-215)을 비교했다. 이들 펩티드는 모두 HEK293을 이용하여 생산했다.
[도 4] 도 4는 PDGFRα-GFP마우스에서 골수 세포를 채취하여 일정 기간 부착 세포 배양 접시를 사용해 배양 후, MACS를 사용하여 분리된 CD11b-양성 세포와 CD11b-음성 세포의 GFP형광을 나타내는 사진이다.
[도 5] 도 5는 HMGB1_1-44 펩티드에 대해 초대 배양된 골수 중간엽 줄기 세포의 이동 촉진 활성을 보여주는 사진이다.
[도 6] 도 6은 초대 배양된 골수 중간엽 줄기 세포(PDGFRα-양성, Lin음성, c-kit 음성)의 골 분화능(A), 지방 세포 분화능(B)을 보여 주는 한 세트의 사진이다.
[도 7] 도 7은 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주의 각종 합성 펩티드에 대한 이동 촉진 활성을 나타내는 한 세트의 사진이다.
[도 8] 도면 중 A는 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주의 각종 합성 펩티드에 대한 이동 촉진 활성을 보여 주는 한 세트의 사진이다. 도면 중 B는 A의 왼쪽 아래 사진의 이동 촉진 활성을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 합성 펩티드 및 음성 대조군 각각에 대해 이동한 세포 수를 현미경 하에서 계측하였다. 음성 대조군의 평균값을 100으로 한 경우의 각각의 값을 그래프로 했다. 도면 중 C는 골수 중간엽 줄기 세포(MSC-1)에 대한 각종 펩티드의 이동 촉진 활성 결과를 보여 주는 사진이다. 이 그래프는 음성 대조군에 상대적으로 사진의 각 지점에서 측정된 평균 세포수의 비를 나타낸다.
[도 9] 도 9는 각종 합성 펩티드에 대해 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주의 이동 촉진 활성을 보여주는 사진이다.
[도 10] 도 10은 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주의 각종 펩티드에 대한 이동 촉진 활성을 보여 주는 사진 및 다이어그램이다. 항상 펩티드를 분비하는 HEK293세포 유래, 일시적인 플라스미드 형질감염을 통해 펩티드를 분비하는 HEK293세포 유래, 대장균 유래, 펩티드 합성 각각의 생산계를 이용하여 제조한 각 HMGB1_1-44펩티드(1-44)을 양성 대조군인 전장 HMGB1과 비교했다.
[도 11] 도 11은 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주에서 PDGFRα, 가계 마커(Lineage marker), CD44에 대한 FACS분석을 보여준다.
[도 12] 도면 중 A는 마우스 각질세포(keratinocytes)의 HMGB1_1-34 펩티드(1-34)에 대한 이동 촉진 활성을 나타내는 그래프이다. B는 PDGFRα-GFP 마우스 피부에서 케라틴 5의 면역 조직 화학상(immunohistochemistry) 사진이다. 케라틴 5-양성 세포인 각질세포는 PDGFRα을 발현하지 않았다.
[도 13] 도면 중 A는 마우스 피부 섬유 아세포의 HMGB1_1-34펩티드(1-34)에 대한 이동 촉진 활성을 나타내는 사진이다. B는 PDGFRα-GFP 마우스 피부에서의 비멘틴의 면역 조직 화학상 사진이다. 비멘틴-양성인 피부 섬유 아세포의 일부는 PDGFRα을 발현하였다.
[도 14] 도 14는 PDGFRα-GFP 마우스의 피부 섬유 아세포와 야생형 마우스(C57/Bl6 마우스)의 섬유 아세포의 FACS분석을 보여준다. 마우스 피부 섬유 아세포의 거의 98%이상에서 PDGFRα이 발현되고 있다.
[도 15]도 15는 합성 펩티드(1-44)에 의한 혈중으로의 PDGFRα-양성 CD44양성 세포의 동원을 FACS로 나타낸다.
[도 16]도 16은 합성 펩티드(1-44) 또는 음성 대조군, PBS를 투여한 래트 뇌 경색 모델의 뇌의 단면 사진이다. 합성 펩티드(1-44)에 의한 뇌 경색 크기의 축소가 관찰됐다.
[도 17] 도 17은 합성 펩티드(1-44) 또는 음성 대조군, PBS를 투여한 래트 뇌 경색 모델의 뇌의 우뇌 면적에 대한 뇌 경색 병소 면적의 비율을 나타낸 다이어그램 및 사진이다. 동일 뇌에서 4개의 단면을 제작하고 각각의 면적을 계측하였다.
[도 18a] 도 18a는 인간 HMGB1의 N말단 측에 6XHis 태그와 TEV 프로테아제 절단 서열을 부가한 것을 나타낸다. 이 단백질을 발현하는 cDNA를 새로 제작하고 대장균 발현 벡터에 삽입했다.
[도 18b] 도 18b는 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주의 HMGB1단편에 대한 이동 촉진 활성을 나타낸다. 이들 단편은 모두 대장균을 이용하여 생산했다.
[도 18c] 도 18c는 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주의 HMGB1단편에 대한 이동 촉진 활성을 정량하고 각각의 활성의 평균값을 그래프화한 것이다.
[도 18d] 도 18d는 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주의 HMGB1단편에 대한 이동 촉진 활성을 정량한 평균값을 나타낸 표이다.
[도 19] 도면 중 A는 89번째 내지 215번의 아미노산으로 이루어진 HMGB1조각을 대장균을 이용하여 생산해 니켈 친화성(affinity) 정제한 것(I:input)을 음이온 교환 컬럼으로 처리하여 얻은 SDS-PAGE의 사진이다. M은 분자량 마커이다. 낮은 염 농도에서는 15.5kDa의 단편(*3)이 용출되었고 염 농도가 높아질수록 16kDa(*2) 및 17kDa(*1)의 단편이 순차적으로 용출되었다. (*3) 및 (*2)는 (*1)가 분해된 것이라고 예상된다. 도면 중 B는 A에서 얻어진 분획의 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주에 대한 이동 촉진 활성을 나타낸다. NC는 음성 대조군, 2-215는 양성 대조군이다. 절단 편으로 생각되는 가장 저분자의 단편(*3)이 더 긴 단편 (*1) 및 (*2)보다 강한 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 그 활성은 2-215보다 강하다. 도면 중 C는 89 내지 205번의 아미노산으로 이루어진 HMGB1 단편을 대장균을 이용하여 생산해 니켈 친화성 정제한 것(I:input)을 음이온 교환 컬럼으로 처리하여 얻은 SDS-PAGE의 사진이다. 낮은 염 농도에서는 가장 짧은 단편(*4)이 용출되었고 염 농도가 높아질수록 긴 단편 (*5) 및 (*6)가 용출되었다. (*5) 및 (*6)은 (*4)가 분해된 것이라고 예상된다. 또한 정제한 HMGB1단편 89-195 및 89-185를 동시에 SDS-PAGE하였다. M은 분자량 마커이다. 도면 중 D는 C에서 얻어진 분획의 확립된 PDGFRα-양성 골수 중간엽 줄기 세포주에 대한 이동 촉진 활성을 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. 절단 편으로 생각되는 가장 저분자의 단편(*4)이 더 긴 단편 (*5) 또는 (*6)보다 강한 활성을 갖는다는 것이 인정된다. 한편 미리 C-말단을 더 줄인 HMGB1 단편 즉 89-195 및 89-185는 더욱 강한 활성을 보여주었다.
[도 20] 도면 중 A는 HMGB1단편 85-169의 이동 촉진 활성을 나타낸다. 양성 대조군, HMGB1단편 2-215보다 강한 활성을 관찰하였다. 도면 중 B는 A의 이동 촉진 활성을 정량화한 평균값의 그래프이다. 도면 중 C는 B의 평균값을 나타낸 표이다.
[도 21a] 도면 중 A는 대장균을 이용하여 제작한 HMGB1의 단편, 2-215, 2-205, 2-195, 및 2-185에 대한 골수 중간엽 줄기 세포주(MSC-1)의 이동 촉진 활성을 나타낸다. 도면 중 B는 대장균을 이용하여 생산한 HMGB1의 단편의 인간 골수 중간엽 줄기 세포에 대한 이동 촉진 활성을 나타내는 사진이다.
[도 21b] 도면 중 C는 정제한 인간 HMGB1의 단편(2-84)에 인간 HMGB1의 산성 꼬리의 단편(186-215), (186-205), 또는 (186-195)을 부가한 융합 단편 (2-84)+(186-215), (2-84)+(186-205), (2-84)+(186-195) 각각에 대해 SDS-PAGE로 전기영동한 겔에 대해 CBB 단백질 염색한 것을 나타낸다. 정제된 각각의 단편을 확인하였다. 도면 중 D는 정제한 단편을 이용하여 MSC-1에 대한 이동 촉진 활성을 조사한 다이어그램이다. 2-84의 단편에 산성 꼬리의 서열을 부가하여 얻어진 융합 단편은 모두 이동 촉진 활성을 나타내지 않았다. 한편 2-84의 단편 자체는 이동 촉진 활성을 나타냈다.
[도 22] 도 22는 래트 등에 제작한 피변(skin flap)의 1주일 후의 사진이다. PBS는 음성 대조군이다. HEK293세포에서 생산한 전장을 포함한 HMGB1(1-215(HEK)) 및 1 내지 44번째까지 아미노산의 합성 펩티드(1-44(합성 펩티드)) 투여군을 비교했다. 화살표는 괴사한 피부 조직을 나타낸다.
[도 23] 도 23은 래트 등에 제작한 피변의 5주 후의 사진이다. PBS는 음성 대조군이다. HEK293세포에서 생산한 전장을 포함한 HMGB1(1-215(HEK)) 및 1 내지 44번째까지 아미노산의 합성 펩티드(1-44(합성 펩티드)) 투여군을 비교했다. 빨갛게 채색한 부분은 피부 궤양 형성 부분이다.
[도 24] 래트 등에 제작한 피변의 7주 후의 사진이다. PBS는 음성 대조군이다. HEK293세포에서 생산한 전장을 포함한 HMGB1(1-215(HEK)) 및 1 내지 44번째까지 아미노산의 합성 펩티드(1-44(합성 펩티드)) 투여군을 비교했다.
[도 25] 래트 등에 제작한 피변에 발생한 상처 부분(괴사 부분)의 면적을 정량화한 그래프이다. 피변 제작 1주에서 3주 후 HEK293세포에서 생산한 전장을 포함한 HMGB1(1-215(HEK)) 및 1 내지 44번째까지 아미노산의 합성 펩티드(1-44(합성 펩티드)) 투여군이 음성 대조군에 비해 상처 부분 축소 효과가 인정되었다. 4주 이후에는 1-44(합성 펩티드)가 다른 두 개의 군에 비해 더욱 축소 효과가 관찰되었다.
[도 26] 화학 합성한 HMGB1펩티드(1-44)와 (17-25)을 피부 손상을 제작한 래트의 꼬리 정맥에 투여했다. 피변 제작 후 2주 후 및 6주 후 각각의 피변 전체 면적에 대한 피부 손상 부위의 면적의 상대적 비율(%)을 나타낸 도면이다.
본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질이 포함되어 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 조성물을 제공한다:
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포;
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
본 발명의 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 조성물에는 시약 조성물 및 의약 조성물이 포함된다. 본 명세서에서 시약 조성물은 시약으로도 표현되고 의약 조성물은 의약, 약재 또는 약학적 조성물로도 표현된다.
본 발명의 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 시약 조성물은 예를 들면, 재생 의료, 재생 유도 의료 개발을 위한 기초 연구 및 임상 연구에 필요한 시약으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 해당 시약 조성물을 사용하여 실험 동물의 생체 조직에 세포를 동원하여 조직 수복, 조직 기능 재건 수위를 검토할 수 있다. 또 예를 들면, 해당 시약 조성물을 사용함으로써 시험관 내(in vitro)에서 세포 동원에 의한 조직 재생 유도 연구를 실시할 수 있다.
본 발명의 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 의약 조성물은 예를 들면, 재생 의료, 재생 유도 의료의 의약으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 해당 의약 조성물을 사용함으로써 조직을 재생할 수 있다. 또 예를 들면, 해당 의약 조성물은 이른바 예방 의약으로서 조직 줄기세포의 감소에 의한 조직 및 장기의 기능 저하를 예방 또는 대안적으로 항노화 의약으로서 노화성 변화의 진행을 지연시키는 데에 이용할 수 있다.
본 명세서에서 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 조성물은 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 제제, 세포 이동 자극제, 세포 이동을 유도하기 위해 이용되는 조성물, 세포 이동을 유도하기 위해 이용되는 제제, 세포 이동 유도제, 또는 세포 유도제라고도 표현된다.
본 발명에서 세포 이동 자극 활성은 세포 이동을 자극하는 활성을 의미한다. 본 명세서에서 세포 이동 자극 활성은 세포 이동 유도 활성 또는 세포 유도 활성으로도 표현된다.
본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질이 함유되어 골수 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하기 위해 이용되는 조성물을 제공한다:
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포;
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
본 발명의 골수 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하기 위해 이용되는 조성물에는 시약 조성물 및 의약 조성물이 포함된다.
본 발명의 조직을 재생하기 위해 이용되는 시약 조성물은 예를 들면, 재생 의료, 재생 유도 의료 개발을 위한 기초 연구 및 임상 연구에 필요한 시약으로 사용할 수 있다. 또 본 발명의 조직을 재생하기 위해 이용되는 의약 조성물은 예를 들면, 재생 의료, 재생 유도 의료의 의약으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 해당 의약 조성물을 사용함으로써 말초 순환 중에 골수 조직 줄기세포를 동원해 조직을 재생할 수 있다. 또 예를 들면, 해당 의약 조성물을 이용하여 말초 혈중에 동원시킨 세포를 체외로 회수 후, 농축해 조직에 투여하고 치료할 수도 있다. 종래의 방법으로는 체내 깊숙이에 있는 골수에서 세포를 회수하기 위해 생체에 대해 침습이 있었지만, 본 발명의 의약 조성물을 이용하면, 침습이 덜한 방식으로 골수 세포를 말초 혈액에서 회수해 골수 세포 이식 등에 이용할 수 있다. 본 명세서에서 골수 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하기 위해 이용되는 조성물은 골수 세포를 골수에서 말초 혈액으로 유도하기 위해 이용되는 조성물로 표현될 수 있다.
본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질을 함유하고 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물을 제공한다:
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포;
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
본 발명의 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물에는 시약 조성물 및 의약 조성물이 포함된다.
본 발명의 조직을 재생하기 위해 이용되는 시약 조성물은 예를 들면, 재생 의료, 재생 유도 의료 개발을 위한 기초 연구 및 임상 연구에 필요한 시약으로 사용할 수 있다. 또 본 발명의 조직을 재생하기 위해 이용되는 의약 조성물은 예를 들면, 재생 의료, 재생 유도 의료의 의약으로 사용할 수 있다.
본 명세서에서 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물은 조직 재생을 유도 또는 촉진하기 위해 이용되는 조성물, 조직 재생을 유도 또는 촉진하기 위해 이용되는 제제, 조직 재생 유도제 또는 조직 재생 촉진제라고도 표현된다. 또 조직 재생에는 조직 수복도 포함된다.
본 발명의 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물은 투여, 첨가 부위를 가리지 않는다. 즉, 그 조성물은 재생이 필요한 조직, 재생이 필요한 조직과 다른 조직, 혈중 등 어느 조직에 투여되어도 그 효과를 발휘할 수 있다. 예를 들면, 그 조성물을 투여, 첨가함으로써, 투여, 첨가 부위 또는 그 근방의 조직 세포가 동원되고 조직 재생을 유도 또는 촉진한다. 또한 예를 들면, 그 조성물을 손상 조직 부위 또는 그 근방에 투여, 첨가함으로써, 해당 손상 조직 세포가 동원되고 조직 재생을 유도 또는 촉진한다. 또 예를 들면, 그 조성물을 재생이 필요한 조직과 다른 조직에 투여, 첨가함으로써, 재생이 필요한 조직에 말초 순환을 통해 골수로부터 골수 세포가 동원되고 조직 재생을 유도 또는 촉진한다. 여기에서 "말초 순환"은 "혈액 순환", 또는 "말초 순환 혈류"라고도 불린다.
재생이 필요한 조직은 예컨대 손상된 조직, 괴사하고 있는 조직, 수술 후 조직, 기능이 저하된 있는 조직, 섬유화된 조직, 노화된 조직, 병의 조직 등을 포함한다. 상기 조직의 예는 생체 피부 조직 및 체내의 생검(수술)으로 수득한 조직(뇌, 폐, 심장, 간, 위, 소장, 대장, 췌장, 신장, 방광, 비장, 자궁, 고환이나 혈액 등)을 포함한다.
재생이 필요한 조직과 다른 조직으로의 투여는 재생이 필요한 부위 이외의 부위(재생이 필요한 부위와는 다른 부위)에 투여하는 것을 의미한다. 따라서 "재생이 필요한 조직과 다른 조직"은 재생이 필요한 조직과 다른 부위, 재생이 필요한 부위와는 다른 부위, 재생이 필요한 조직에서 떨어진 부위, 재생이 필요한 부위에서 떨어진 부위, 재생이 필요한 부위에서 원위에 있는 부위, 재생이 필요한 조직에서 원위에 있는 조직, 원위부위, 원위 조직으로 표현할 수도 있다.
따라서 본 발명의 조성물은 체외에서 직접 약제를 투여하기 어려운 조직(뇌, 심장 등)을 재생하기 위해 효과적으로 이용된다.
재생이 필요한 조직에 동원된 세포는 여러가지 세포로 분화하고 재생이 필요한 조직의 기능적 재생 및 기능 유지, 기능 강화에 기여한다. 본 발명에서 재생이 필요한 조직의 예는 허혈/소혈(疎血, hypoperfusive)/저산소 상태에 기인하는 다양한 병태, 외상, 화상, 염증, 자가 면역, 유전자 이상 등에 의해 손상된 조직을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조직은 골수 유래 세포가 분화 가능한 조직인 한, 특별히 제한은 없다. 예를 들면 피부 조직, 골 조직 연골 조직, 근육 조직, 지방 조직, 심근 조직, 신경계 조직, 폐 조직, 소화관 조직, 간, 담, 췌장 조직, 비뇨, 생식기 등, 생체 내의 모든 조직을 포함한다. 또, 상기 조성물을 이용함으로써 난치성 피부 궤양, 피부 상처, 수포증, 탈모증 등의 피부 질환은 물론 뇌 경색, 심근 경색, 골절, 폐 경색, 위 궤양, 장염 등의 재생이 필요한 조직에서 기능적 조직 재생을 유도하는 치료가 가능하다. 상기의 조성물이 투여되는 동물종은 특별히 제한은 없고 포유류, 조류, 어류 등을 포함한다. 포유류는 인간 또는 비인간 동물을 포함하는데 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 말, 양, 및 고래 등을 예시할 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한 재생이 필요한 조직과 다른 조직의 예는 혈액 조직, 근육 조직, 피하 조직, 피내 조직, 복막 등을 포함한다.
신경 조직은 중추 신경 조직을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또 신경 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물은 예를 들면, 뇌 경색, 뇌 출혈, 뇌 좌상 등의 치료에 사용할 수 있지만, 이들 에 한정되지 않는다. 또한 뼈 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물은 예를 들어 골절 치료에 사용할 수 있는데, 이에 한정되지 않는다. 또 피부 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물은 예를 들면, 피부 궤양, 수술 상처의 봉합 부전, 화상, 창상, 타박상, 피부 짓무름, 및 찰과상 등의 치료에 사용할 수 있지만, 이들 제한되지 않는다.
또, 본 발명에서 이동이 자극되는 세포 또는 골수로부터 말초혈액으로 동원되는 세포는 미분화 세포, 및 각종 분화 단계에 있는 세포 등을 포함하는데 이들에 한정되지 않는다. 또한 본 발명에서 이동이 자극되는 세포 또는 골수로부터 말초혈액으로 동원되는 세포로서는 줄기세포, 비줄기세포 등을 포함하는데 이들에 한정되지 않는다. 줄기세포는 순환성의 줄기세포, 또는 비순환성의 줄기세포가 포함된다. 비순환성의 줄기세포는 조직에 상주하고 있는 조직 줄기세포를 예시할 수 있다. 순환성의 줄기세포는 혈액 순환성의 줄기세포를 예시할 수 있다.
또 이동이 자극되는 세포 또는 골수로부터 말초혈액으로 동원되는 세포는 비세포 또는 조혈계 줄기세포를 포함하는데 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 "조혈계 줄기세포"는 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구, 대식 세포 등을 포함하는 백혈구의 외에, 적혈구, 혈소판, 비만 세포, 수지상 세포 등의 혈구계의 세포로 분화 가능한 줄기세포이다. 마커로 인간에서는 CD34-양성, CD133-양성, 마우스에서는 CD34-음성, c-Kit-양성, Sca-1-양성, 가계 마커(Lineage marker)-음성임이 알려져 있다. 또 조혈계 줄기세포는 배양 접시에서 배양하는 경우 단독으로 배양하기가 어려우므로 간질 세포(stromal cell)와의 공배양이 필요하다.
본 명세서에서 "골수 세포"는 골수 내에 존재하는 세포를 의미하는 한편 "골수 유래 세포"는 골수로부터 골수 외로 동원된 "골수 세포"을 의미한다. "골수 세포"는 골수 중에 존재하는 조직 전구 세포 집단을 포함하는 세포를 포함한다. 또한 "골수 유래 세포"는 메소앤지오블라스트(mesoangioblast)를 포함한 세포여도 되고 메소앤지오블라스트를 제외한 세포여도 된다.
조직 전구 세포는 혈액계 이외의 특이 조직 세포로 일방향성 분화 능력을 갖는 미분화 세포라고 정의하고 전술한 바와 같이 중간엽조직, 상피계조직, 신경 조직, 실질 장기, 혈관 내피로 분화 능력을 갖는 미분화 세포를 포함한다.
"골수 세포" 및 "골수 유래 세포"는 조혈계 줄기세포 및 이것에 유래하는 백혈구, 적혈구, 혈소판, 골아세포, 섬유세포 등의 분화 세포, 또는 지금까지 골수 중간엽 줄기세포, 골수 간질 다능성 줄기세포, 혹은 골수 다능성 줄기세포로 불리는 세포로 대표되는 줄기세포다. 본 명세서에서 "골수 줄기세포"는 골수 내에 존재하는 줄기세포를 의미하는 한편 "골수 유래 줄기세포"는 골수에서 골수 외로 동원된 "골수 줄기세포"를 의미한다. 본 발명에서 이동이 자극되는 세포 또는 골수로부터 말초혈액으로 동원되는 세포로서는 "골수 유래 줄기세포"를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "골수 세포" 및 "골수 줄기 세포"는 골수 채취(골수 세포 채취), 혹은 말초 혈액 채혈에 의해 분리할 수 있다. 조혈계 줄기세포는 비부착 세포이지만, "골수 세포" 및 "골수 줄기 세포"의 일부는 골수 채취(골수 세포 채취), 또는 말초 혈액 채혈에 의해 얻어진 혈액 중의 단핵구 분획 세포 배양에 의해 부착 세포로서 얻어진다.
또한 "골수 세포" 및 "골수 줄기 세포"는 중간엽 줄기세포를 포함하고, 바람직하게는 골아 세포(분화를 유도하면 칼슘의 침착을 관찰함으로써 특정 가능), 연골 세포(알시안 블루 염색 양성, 사프라닌-O 염색 양성 등에서 특정 가능), 지방 세포(수단 III 염색 양성에서 특정 가능), 또 섬유 아세포, 평활근 세포, 간질 세포, 힘줄 세포 등 기타 중간엽 세포, 또 신경 세포, 상피 세포(예를 들어 표피 각화 세포, 장관 상피 세포는 사이토케라틴 패밀리를 발현한다), 혈관 내피 세포로의 분화 능력을 갖는 것이다. 분화 후의 세포는 위 세포에 한정되는 것이 아니라 간장, 신장, 췌장 등의 실질 장기 세포로의 분화 능력도 포함한다.
본 명세서에서 "골수 중간엽 줄기세포", "골수 간질 다능성 세포" 혹은 "골수 다능성 줄기세포"는 골수 내에 존재하는 세포를 말하며 골수로부터 직접 또는 다른 조직(혈액, 피부, 지방, 및 기타 조직)으로부터 간접적으로 채취되어 배양 접시(플라스틱 또는 유리 제품)에 부착 세포로 배양, 증식 가능하며, 뼈, 연골, 지방 등 중간엽 조직(간충직계 줄기세포) 혹은 골격근, 심근, 신경 조직, 및 상피 조직(다능성 줄기세포)로의 분화 능력을 갖는다는 특징을 갖는 세포이며, 골수 세포 채취에 의해 취득할 수 있는 세포이다.
한편, 골수에서 골수 외로 동원된 "골수 유래 골수 중간엽 줄기세포", "골수 유래 골수 간질 다능성 세포" 혹은 "골수 유래 골수 다능성 줄기세포"는 말초 혈액 채혈, 또는 지방 등 간충직 조직, 피부 등 상피 조직, 뇌 등의 신경 조직에서 채취에 의해 취득할 수 있는 세포이다.
또 이들 세포는 채취 후 즉시 혹은 한번 배양 접시에 부착시켜 세포를 생체의 병소에 투여함으로써, 예를 들면 피부를 구성하는 케라틴 세포 등의 상피 조직, 뇌를 구성하는 신경계 조직으로의 분화 능력도 갖는다는 특징을 갖는다.
골수 중간엽 줄기세포, 골수 간질 다능성 줄기세포, 골수 다능성 줄기세포, 혹은 골수에서 골수 외로 동원된 이들 세포는 바람직하게는 골아 세포(분화를 유도하면 칼슘의 침착을 관찰하는 것 등으로 특정 가능), 연골 세포(알시안 블루 염색 양성, 사프라닌-O 염색 양성 등으로 특정 가능), 지방 세포(수단 III 염색 양성 등으로 특정 가능)외에, 예를 들면 섬유 아세포, 평활근 세포, 골격근 세포, 간질 세포, 힘줄 세포 등 기타 중간엽 세포, 신경 세포, 색소 세포, 표피 세포, 모포 세포(사이토케라틴 패밀리, 헤어케라틴 패밀리 등을 발현한다), 상피계 세포(예를 들어 표피 각화 세포, 장관 상피 세포는 사이토케라틴 패밀리 등을 발현한다), 내피 세포, 나아가 간, 신장, 췌장 등의 실질 장기 세포로 분화하는 능력을 가지는 것이지만 분화 후의 세포는 상기 세포들에 한정되는 것은 아니다.
인간 골수 세포 및 인간 골수 유래 세포로는 골수 채취(골수 세포 채취), 말초 혈액 채혈, 지방 채취에 의해 직접 취득하거나 혹은 단핵구 분획을 분리 후에 배양해 부착 세포로서 취득할 수 있는 세포가 예시될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 인간 골수 세포, 인간 골수 유도 세포의 마커로는 예컨대 PDGFRα-양성, Lin-음성, CD45-음성, CD44-양성, CD90-양성, CD29-양성, Flk-1-음성, CD105-양성, CD73-양성, CD90-양성, CD71-양성, Stro-1-양성, CD106-양성, CD166-양성, CD31-음성의 전부 또는 일부를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
또한 마우스 골수 세포, 마우스 골수 유래 세포로는 골수 채취(골수 세포 채취), 말초 혈액 채혈, 지방 채취에 의해 직접 취득하거나 혹은 단핵구 분획을 분리 후에 배양해 부착 세포로서 취득할 수 있는 세포가 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 마우스 골수 세포, 마우스 골수 유래 세포의 마커로는 예컨대 CD44-양성, PDGFRα-양성, PDGFRβ-양성, CD45-음성, Lin-음성, Sca-1-양성, c-kit-음성, CD90-양성, CD29-양성, Flk-1-음성의 전부 또는 일부를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 이동이 자극되는 세포 또는 골수로부터 말초 혈액에 동원되는 세포로서는 PDGFRα -양성 세포가 있으며, 이에 한정되지 않는다. 또, PDGFRα 이외의 마커로는 CD29-양성, CD44-양성, CD90-양성, CD271-양성, CD11b-음성, Flk-1-음성의 전부 또는 일부가 예시하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. PDGFRα-양성 세포로서는 PDGFRα-양성의 골수 유래 세포, PDGFRα-양성의 골수 유래 골수 중간엽 줄기세포, PDGFRα-양성 조직에 상주하고 있는 조직 세포(예를 들면, 섬유 아세포 등이 예시된다), PDGFRα-양성의 골수 유래 세포이며, 골수 채취(골수 세포 채취), 말초 혈액 채혈에 의해 얻어진 혈액 중의 단핵구 분획 세포 배양에 의해 부착 세포로 얻어지는 세포 등이 예시되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에는 상기 (a) 내지 (c)에 기재된 물질 중 적어도 1개의 물질 이외에 다른 물질이 포함된다. 본 발명의 조성물에서 상기(a) 내지 (c)에 기재된 물질 중 적어도 1개의 물질 이외의 물질은 세포 이동 자극 활성, 세포 동원 활성, 또는 조직 재생 촉진 활성을 저해하지 않는 한, 특별히 제한은 없다. 예컨대, 본 발명의 조성물에는 상기 (a) 내지 (c)에 기재된 물질 가운데 적어도 1개의 물질 외에 상기 (a) 내지 (c)에 기재된 물질의 기능을 강화하는 관련 분자(군); 상기 (a) 내지 (c)에 기재된 물질의 기대되는 효과 이외의 작용을 억제하는 분자(군); 세포의 증식과 분화를 제어하는 인자, 이들 인자 혹은 세포 기능을 강화/유지하는 기타 인자를 포함하는 것이 가능하다.
본 발명의 HMGB1 단백질은 인간 유래 HMGB1 단백질로서 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 해당 단백질을 코딩하는 DNA로서 서열번호:2에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA가 예시할 수 있는데 이들에 한정되는 것은 아니다.
또 마우스 유래 HMGB1 단백질로서 서열번호:3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 해당 단백질을 코딩하는 DNA로서 서열번호:4에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA를 예시할 수 있는데 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한 래트 유래 HMGB1 단백질로서 서열번호:5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 해당 단백질을 코딩하는 DNA로 서열번호:6에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA가 예시할 수 있는데 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 함유한다. 본 발명의 HMGB1 단백질의 일부로 이루어진 펩티드는 세포 이동 자극 활성을 갖는 도메인을 포함하고 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.
HMGB1 단백질의 일부로 이루어진 펩티드의 세포 이동 자극 활성은 예를 들면 실시예의 기재 방법 외, 이하에 나타낸 방법에 의해서 확인할 수 있지만 이에 한정되지 않아 다른 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 세포 이동 능력 측정 방법으로 측정할 수도 있다.
HMGB1 단백질 또는 펩티드를 삽입한 실리콘 튜브를 피하 등에 심고, 일정 시간 후에 꺼내 튜브 내로 이동한 세포를 확인하는 방법.
HMGB1 단백질 또는 펩티드를 수지 비즈 등에 결합시킨 후 조직 내에 심고, 일정 시간 후에 꺼내 비즈로 이동한 세포를 확인하는 방법.
젤라틴 및 히아루론산 등의 서방 작용이 있는 고분자체에 HMGB1 단백질 또는 펩티드를 함침시켜 조직 내에 심고, 일정 시간 후에 꺼내 고분자체로 이동한 세포를 확인하는 방법.
본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 하기 펩티드를 예시할 수 있지만, 다음에 한정되지 않는다.
본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 예컨대 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하는 활성, 또는 조직 재생 촉진 활성을 갖는 펩티드를 포함한다.
본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 예컨대 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함한다.
또 본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 예컨대 다음 중 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 하기 아미노산 서열은 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이다:
(1)17 내지 25번의 아미노산 서열;
(2)45 내지 74번의 아미노산 서열;
(3)55 내지 84번의 아미노산 서열;
(4)85 내지 169번의 아미노산 서열;
(5)89 내지 185번의 아미노산 서열; 및
(6)93 내지 215번의 아미노산 서열.
또 본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 다음 중 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 하기 아미노산 서열은 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이다:
(1)17 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
(2)45 내지 74번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
(3)55 내지 84번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
(4)85 내지 169번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드; 및
(5)89 내지 185번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드.
본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부로 이루어지고, 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드의 예로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 195 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 185 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 170번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 170 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 84번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 84 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 또는 1 내지 44번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 44 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다)이며, 그 아미노산 서열에서 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
이하에 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에 대해 기재한다. 그러나 해당 펩티드에 포함되는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"등의 다른 펩티드에 대해서도 마찬가지로 기재할 수 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열에서 선택되는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"라고도 표현할 수 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서 해당 아미노산 서열에서 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (1)~(60) 중 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 하기 (1)~(57) 및 (59)~(61) 중 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 17 내지 25번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (1)~(61) 중 하나의 아미노산 서열로 이루어진 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다. 하기 아미노산 서열은 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이다.
(1)1 내지 44번의 아미노산 서열
(2)1 내지 25번의 아미노산 서열
(3)1 내지 34번의 아미노산 서열
(4)1 내지 42번의 아미노산 서열
(5)1 내지 43번의 아미노산 서열
(6)1 내지 45번의 아미노산 서열
(7)1 내지 46번의 아미노산 서열
(8)1 내지 47번의 아미노산 서열
(9)1 내지 48번의 아미노산 서열
(10)1 내지 49번의 아미노산 서열
(11)1 내지 50번의 아미노산 서열
(12)1 내지 51번의 아미노산 서열
(13)1 내지 52번의 아미노산 서열
(14)1 내지 62번의 아미노산 서열
(15)1 내지 84번의 아미노산 서열
(16)10 내지 25번의 아미노산 서열
(17)11 내지 25번의 아미노산 서열
(18)11 내지 27번의 아미노산 서열
(19)11 내지 28번의 아미노산 서열
(20)11 내지 29번의 아미노산 서열
(21)11 내지 30번의 아미노산 서열
(22)11 내지 34번의 아미노산 서열
(23)11 내지 44번의 아미노산 서열
(24)12 내지 25번의 아미노산 서열
(25)12 내지 30번의 아미노산 서열
(26)13 내지 25번의 아미노산 서열
(27)13 내지 30번의 아미노산 서열
(28)14 내지 25번의 아미노산 서열
(29)14 내지 30번의 아미노산 서열
(30)15 내지 25번의 아미노산 서열
(31)15 내지 30번의 아미노산 서열
(32)16 내지 25번의 아미노산 서열
(33)16 내지 30번의 아미노산 서열
(34)17 내지 30번의 아미노산 서열
(35)1 내지 70번의 아미노산 서열
(36)1 내지 81번의 아미노산 서열
(37)1 내지 170번의 아미노산 서열
(38)2 내지 25번의 아미노산 서열
(39)2 내지 34번의 아미노산 서열
(40)2 내지 42번의 아미노산 서열
(41)2 내지 43번의 아미노산 서열
(42)2 내지 44번의 아미노산 서열
(43)2 내지 45번의 아미노산 서열
(44)2 내지 46번의 아미노산 서열
(45)2 내지 47번의 아미노산 서열
(46)2 내지 48번의 아미노산 서열
(47)2 내지 49번의 아미노산 서열
(48)2 내지 50번의 아미노산 서열
(49)2 내지 51번의 아미노산 서열
(50)2 내지 52번의 아미노산 서열
(51)2 내지 62번의 아미노산 서열
(52)2 내지 70번의 아미노산 서열
(53)2 내지 81번의 아미노산 서열
(54)2 내지 84번의 아미노산 서열
(55)2 내지 170번의 아미노산 서열
(56)17 내지 44번의 아미노산 서열
(57)1 내지 185번의 아미노산 서열
(58)1 내지 195번의 아미노산 서열
(59)2 내지 185번의 아미노산 서열
(60)2 내지 195번의 아미노산 서열 및
(61)17 내지 25번의 아미노산 서열.
본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드의 예로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 195 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 185 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 170번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 170 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 84번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 84 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다) 또는 45 내지 84번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 40 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다)이며, 그 아미노산 서열에서 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드 등을 포함하는데, 이에 한정되지 않는다.
이하에 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에 대해 기재한다. 그러나 해당 펩티드에 포함되는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"등의 다른 펩티드에 대해서도 마찬가지로 기재할 수 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열에서 선택되는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"라고 표현할 수 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는, 하기 (a)~(k) 중 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 하기 (a)~(h) 및 (j)~(l) 중 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 45 내지 74번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (a)~(l) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
하기 아미노산 서열은 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이다:
(a)1 내지 84번의 아미노산 서열;
(b)45 내지 84번의 아미노산 서열;
(c)1 내지 81번의 아미노산 서열;
(d)1 내지 170번의 아미노산 서열;
(e)2 내지 81번의 아미노산 서열;
(f)2 내지 84번의 아미노산 서열;
(g)2 내지 170번의 아미노산 서열;
(h)1 내지 185번의 아미노산 서열;
(i)1 내지 195번의 아미노산 서열;
(j)2 내지 185번의 아미노산 서열;
(k)2 내지 195번의 아미노산 서열; 및
(l)45 내지 74번의 아미노산 서열.
본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부로 이루어지고, 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함한다.
이러한 펩티드의 예로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 195 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 185 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 170번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 170 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 84번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 84 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다) 또는 45 내지 84번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 40 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다)이며, 그 아미노산 서열에서 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드 등을 포함하는데 이에 한정되지 않는다.
이하에 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에 대해 기재한다. 그러나 해당 펩티드에 포함되는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"등의 다른 펩티드에 대해서도 마찬가지로 기재할 수 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열에서 선택되는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"라고 표현할 수 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는, 하기 (A)~(J) 중 어느 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 하기 (A)~(G) 및 (I)~(K) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 55 내지 84번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (A)~(K) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다. 하기 아미노산 서열은 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이다:
(A)1 내지 84번의 아미노산 서열;
(B)45 내지 84번의 아미노산 서열;
(C)1 내지 170번의 아미노산 서열;
(D)2 내지 84번의 아미노산 서열;
(F)2 내지 170번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
(G)1 내지 185번의 아미노산 서열;
(H)1 내지 195번의 아미노산 서열;
(I)2 내지 185번의 아미노산 서열;
(J)2 내지 195번의 아미노산 서열; 및
(K)55 내지 84번의 아미노산 서열.
본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이고, 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함한다.
이러한 펩티드의 예로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 195 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 185 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 1 내지 170번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 170 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 89 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 101 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다)이며, 그 아미노산 서열에서 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드 등을 포함하는데 이에 한정되지 않는다.
이하에 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에 대해 기재하지만 해당 펩티드에 포함되는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"등의 다른 펩티드에 대해서도 마찬가지로 기재할 수 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열에서 선택되는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"라고 표현할 수도 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (i)~(vi) 중 어느 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 하기(i)~(iii) 및 (v)~(vii) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 85 내지 169번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (i)~(vii) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다. 덧붙여 하기 아미노산 서열은 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이다:
(i)1 내지 170번의 아미노산 서열;
(ii)2 내지 170번의 아미노산 서열;
(iii)1 내지 185번의 아미노산 서열;
(iv)1 내지 195번의 아미노산 서열;
(v)2 내지 185번의 아미노산 서열;
(vi)2 내지 195번의 아미노산 서열; 및
(vii)85 내지 169번째.
본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이고, 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드의 예로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 195 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 및 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 185 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다)이며, 그 아미노산 서열에서 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드 등을 포함하는데 이에 한정되지 않는다.
이하에 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에 대해 기재한다. 그러나 해당 펩티드에 포함되는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"등의 다른 펩티드에 대해서도 마찬가지로 기재할 수 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열에서 선택되는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"라고 표현할 수도 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (I)~(VI) 중 어느 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 하기 (I) 및 (III)~(V) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 89 내지 185번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (I)~(V) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다. 하기 아미노산 서열은 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이다:
(I)1 내지 185번의 아미노산 서열;
(II)1 내지 195번의 아미노산 서열;
(III)2 내지 185번의 아미노산 서열;
(IV)2 내지 195번의 아미노산 서열; 및
(V)89 내지 185번의 아미노산 서열.
본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 93 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함하는 펩티드를 포함한다.
이러한 펩티드의 예로서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 45 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 171 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 63 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 153 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다), 89 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드(이 펩티드의 아미노산 수는 123 이하 자연수에서 선택되는 아미노산의 갯수이다)이며, 그 아미노산 서열에서 93 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드 등을 포함하는데 이에 한정되지 않는다.
이하에 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 93 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에 대해 기재한다. 그러나 해당 펩티드에 포함되는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 63 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 89 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"등의 다른 펩티드에 대해서도 마찬가지로 기재할 수 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 93 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드”는 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 215번의 아미노산 서열에서 선택되는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드로서 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 93 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"라고 표현할 수도 있다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 93 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (W)~(Y) 중 어느 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 93 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 93 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드이며, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 하기 (X)~(Z) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.
본 발명에서 "서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 215번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 해당 아미노산 서열에서 93 내지 215번의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드"에는 하기 (W)~(Z) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 포함된다. 하기 아미노산 서열은 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부이다:
(W)45 내지 215번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
(X)63 내지 215번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
(Y)89 내지 215번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드; 및
(Z)93 내지 215번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드.
따라서 본 발명에서 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 가지는 펩티드는 다음의 펩티드를 포함하지만 이들에 한정되지는 않는다:
<1>1 내지 44번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<2>1 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<3>1 내지 34번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<4>1 내지 42번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<5>1 내지 43번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<6>1 내지 45번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<7>1 내지 46번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<8>1 내지 47번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<9>1 내지 48번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<10>1 내지 49번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<11>1 내지 50번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<12>1 내지 51번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<13>1 내지 52번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<14>1 내지 62번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<15>1 내지 84번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<16>10 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<17>11 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<18>11 내지 27번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<19>11 내지 28번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<20>11 내지 29번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<21>11 내지 30번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<22>11 내지 34번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<23>11 내지 44번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<24>12 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<25>12 내지 30번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<26>13 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<27>13 내지 30번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<28>14 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<29>14 내지 30번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<30>15 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<31>15 내지 30번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<32>16 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<33>16 내지 30번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<34>17 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<35>17 내지 30번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<36>45 내지 74번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<37>45 내지 84번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<38>45 내지 215번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<39>55 내지 84번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<40>63 내지 215번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<41>1 내지 70번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<42>1 내지 81번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<43>1 내지 170번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<44>2 내지 25번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<45>2 내지 34번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<46>2 내지 42번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<47>2 내지 43번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<48>2 내지 44번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<49>2 내지 45번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<50>2 내지 46번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<51>2 내지 47번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<52>2 내지 48번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<53>2 내지 49번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<54>2 내지 50번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<55>2 내지 51번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<56>2 내지 52번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<57>2 내지 62번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<58>2 내지 70번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<59>2 내지 81번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<60>2 내지 84번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<61>2 내지 170번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<62>85 내지 169번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<63>89 내지 185번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<64>89 내지 195번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<65>89 내지 205번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<66>89 내지 215번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<67>93 내지 215번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<68>17 내지 44번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<69>1 내지 185번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<70>1 내지 195번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<71>1 내지 205번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<72>2 내지 185번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드;
<73>2 내지 195번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드; 및
<74>2 내지 205번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드.
또한 본 발명에 대해서는 다음과 같이 규정되는 펩티드도 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드로 예시할 수 있다:
서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 일부를 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드로서 다음의 조건을 충족하는 펩티드:
상기 <1>으로부터 <74>의 군으로부터 2개의 펩티드를 선택하고 짧은 편을 A로, 긴 편을 B로 할 경우 A를 적어도 포함하고 B의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드.
나아가 본 발명은 다음 중 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드와 그의 용도도 제공한다. 이러한 펩티드는 예를 들어 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 하나 이상(예를 들면 200개 이하, 100개 이하, 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 20개 이하, 10개 이하, 5개 이하, 3개 이하, 2개 이하가 제시되는데, 이들에 한정되지 않음)의 아미노산 서열이 부가된 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드도 포함된다. 하기 어느 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드에는 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드는 포함되지 않는다:
[1]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
[2]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
[3]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
[4]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
[5]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
마우스, 래트 및 인간의 HMGB1은 1 내지 85번째까지의 아미노산 서열이 A-box, 86 내지 169번째까지의 아미노산 서열이 B-box로 알려져 있다. 마우스, 래트 및 인간의 1 내지 169번째까지의 아미노산 서열은 모두 일치하고 100% 상동성을 유지하고 있다. 마찬가지로 마우스, 래트 및 인간의 HMGB2에서도 14 내지 25번의 아미노산 서열은 HMGB1과 일치한다.
본 발명은 상술한 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 제공한다. 또한 본 발명은 해당 펩티드를 코딩하는 DNA, 해당 DNA가 삽입된 벡터 및 그러한 벡터가 도입된 형질 전환 세포를 제공한다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA, 해당 DNA가 삽입된 벡터 및 그러한 벡터가 도입된 형질 전환 세포는 공지의 기술을 이용하여 제작된다. 상기 DNA는 본 발명의 펩티드를 코딩하는 한 예를 들면, 인공적으로 합성된 DNA(예를 들면 축중 돌연변이체, degenerate mutants)이어도 된다.
본 발명은 본 발명의 펩티드이며 세포를 이용하여 제조된 펩티드, 본 발명의 펩티드인 인공적으로 합성된 펩티드도 제공한다. 본 발명의 펩티드는 해당 펩티드를 코딩하는 DNA를 적당한 발현계에 넣어 재조합체(recombinants)로서 수득할 수도, 또는 인공적으로 합성할 수도 있다. 본 발명의 펩티드를 유전 공학적인 수법에 따라 얻기 위해서는 해당 펩티드를 코딩하는 DNA를 적당한 발현계에 넣어 발현하면 된다.
따라서 본 발명은 하기 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 본 발명의 펩티드의 제조 방법을 제공한다:
(a)본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA를 세포에 도입하여 해당 펩티드를 발현시키는 공정; 및
(b)세포에서 해당 펩티드를 회수하는 공정.
또한 본 발명은 하기 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 것으로서, HMGB1 단백질보다 높은 세포 이동 자극 활성을 가지는 본 발명의 펩티드의 제조 방법을 제공한다:
(a)본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA를 세포에 도입하여 해당 펩티드를 발현시키는 공정; 및
(b)세포에서 해당 펩티드를 회수하는 공정.
해당 제조 방법은 다음의 공정을 더 포함할 수 있다:
(c) HMGB1 단백질보다 높은 세포 이동 자극 활성을 가지는 해당 펩티드를 선택하는 공정.
본 발명에 응용 가능한 숙주(host)로는 원핵생물 세포, 진핵생물 세포가 있으며, 이들에 한정되지 않는다. 또한 본 발명에 응용 가능한 숙주로는 세균(예를 들면 대장균), 효모, 동물 세포(예를 들면 HEK293세포나 CHO세포 등의 포유 동물 세포, 누에 세포 등의 곤충 세포), 식물 세포 등도 포함하는데 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 응용 가능한 숙주/벡터계의 예는 발현 벡터 pGEX와 대장균을 포함한다. pGEX는 외래 유전자를 글루타티온 S-전달 효소(GST)와의 융합 단백질로 발현시킬 수 있다(Gene, 67:31-40, 1988). 본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA을 넣은 pGEX를 히트 쇼크로 BL21 같은 대장균주에 도입해 적당한 배양 시간 후에 isopropylthio-β-D-galactoside(IPTG)을 첨가하여 GST융합 펩티드의 발현을 유도한다. 본 발명에 의한 GST는 글타티온 세파로즈 4B에 흡착하므로 발현 생성물은 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 쉽게 분리 및 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 펩티드의 유전자 재조합체를 얻기 위한 숙주/벡터 시스템으로선 이 밖에도 다음과 같은 것을 응용할 수 있다. 먼저 세균을 숙주로 이용하는 경우에는 태그 등을 이용한 융합 단백질용 발현 벡터가 상업적으로 입수가능하다. 또한 본 발명의 유전자 재조합체에는 태그나 그 일부의 펩티드가 부가된 상태의 것도 포함된다.
본 발명의 펩티드에 부가되는 태그로서는 본 발명의 펩티드의 활성에 영향을 미치지 않는 한, 특별히 제한은 없다, 예를 들면, 히스티딘 태그(예를 들면 6×His, 10×His), HA 태그, FLAG 태그, GST 태크, T7-태그, HSV-태그, E-태그, lck 태그, B-태그 등을 포함한다.
효모에서는 Pichia속 효모가 당쇄-함유 단백질의 발현에 유효하다는 것이 공지되어 있다. 당쇄의 부가라는 점에서는 곤충 세포를 숙주로 하는 바큘로바이러스 벡터를 이용한 발현계도 유용하다(Bio/Technology, 6:47-55, 1988). 또한, 포유 동물의 세포를 이용하여 CMV, RSV, 및 SV40 등의 프로모터를 이용한 벡터의 트랜스펙션이 이루어진다. 이들 숙주/벡터계는 어느 것이든 본 발명의 펩티드의 발현계로서 이용이 가능하다. 또한 플라스미드 벡터, 및 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-수반(adeno-associated) 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 엔빌로프 벡터, 및 파필로마 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 이용하여 유전자를 도입할 수도 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 그 벡터에는 유전자 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터 DNA서열, 유전자 발현을 제어하는 인자, 및 DNA의 안정성을 유지하기 위해 필요한 여하한 분자가 포함된다.
얻은 본 발명의 단백질은 숙주 세포 내 또는 세포 외(배지 등)에서 분리해 실질적으로 순수하고 균질한 단백질로 정제할 수 있다. 단백질의 분리, 정제는 통상의 단백질의 정제에 사용되는 분리, 정제 방법을 사용하면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적정 선택, 조합하면 단백질을 분리, 정제할 수 있다.
크로마토그래피로는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 및 흡착 크로마토그래피 등을 포함한다(Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이러한 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC등을 이용하여 실시할 수 있다.
또한 본 발명의 펩티드는 실질적으로 정제된 펩티드인 것이 바람직하다. 여기서 "실질적으로 정제된 "이란 본 발명의 펩티드의 정제도(단백질 성분 전체의 본 발명의 펩티드의 비율)가 50%이상 60%이상, 70%이상, 80%이상 90%이상 95%이상, 100% 혹은 100%에 가까운 것을 의미한다. “100%에 가까운” 상한은 당업자의 정제 기술이나 분석 기술에 의존하지만, 예를 들면, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99% 등이다.
또, 상기의 정제도를 갖는 것이라면 어떠한 정제 방법에 따라 정제된 것도 실질적으로 정제된 단백질에 포함된다. 예를 들면, 상술한 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한 외 여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택 또는 조합함으로써 실질적으로 정제된 단백질을 포함하는데 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 본 발명의 펩티드를 분비하는 세포는 다음과 같은 방식으로도 제조할 수 있다.그 펩티드를 코딩하는 DNA에 분비 신호를 코딩하는 DNA(예를 들면, ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC;서열번호:10)를 결합시킨 DNA를 공지의 발현 벡터나 유전자 치료용 벡터에 삽입함으로써 벡터를 제작할 수 있다. 제작된 벡터를 섬유 아세포(예를 들면 정상 피부 섬유 아세포 및 그로부터 유래한 세포주)등의 포유류 세포나 곤충 세포, 기타 세포에 도입한다. 분비 신호를 코딩하는 DNA로는 상기 서열을 갖는 DNA가 예시되지만, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 세포가 유래하는 동물 종에 특별히 제한은 없지만, 벡터를 투여할 대상 동물 종의 세포, 대상 자체의 세포, 혹은 벡터가 투여되는 대상의 혈연으로부터 유래하는 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
한편 HMGB1의 일부로 이루어진 펩티드를 인공적으로 합성할 수 있다. 본 발명의 펩티드 합성법에서는 펩티드 액상 합성법 또는 펩티드 고체상 합성법 중 어느 방법에 따라서도 펩티드를 화학 합성할 수 있다. 본 발명에 있어서는 펩티드 고체상 합성법에 의해 합성한 펩티드가 바람직하다. 고체상 펩티드 합성법은 펩티드를 화학적으로 합성할 때 일반적으로 이용되는 방법의 하나이다. 표면을 아미노기로 수식한 지름 약 0.1mm의 폴리스티렌 고분자 겔 비드 등을 고체상으로 이용하여 탈수 반응에 의해 1개씩 아미노산 사슬을 신장한다. 목적으로 하는 펩티드의 서열이 다 완성되면 고체상 표면에서 잘라내어 목적하는 물질을 얻는다. 고체상 합성법에 의해 박테리아 내에서 합성하기 어려운 리보솜 펩티드의 합성, D-아미노산이나 중원자 유도체 등의 비천연 아미노산의 도입, 펩티드 및 단백질 주쇄의 수식 등도 가능하다. 고체상 합성법에서는 경우, 네이티브 케미컬 라이게이션법을 이용하여 2개의 펩티드 사슬을 결합시킴으로써 70 내지 100개 이상 아미노산의 긴 펩티드 사슬을 합성할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 방법은 경구 투여 및 비경구 투여를 포함한다. 구체적으로 비경구 투여 방법으로서는 구체적으로는 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 주사 투여의 예로서 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등에 의해서 본 발명의 조성물을 전신 또는 국부적(예를 들면, 피하, 피내, 피부 표면, 안구나 안검 결막, 비강 점막, 구강 내 및 소화관 점막, 질과 자궁 내 점막, 손상 부위 등)으로 투여할 수 있다.
또한 본 발명의 조성물의 투여 방법으로서는 예를 들면, 혈관내 투여(동맥내 투여, 정맥내 투여 등), 혈액내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 복강내 투여를 포함하지만 이런 것들로 한정되지 않는다.
또 투여 부위에 제한은 없으며 예컨대 재생이 필요한 조직 부위 혹은 그 근방, 재생이 필요한 조직과 다른 위치, 또는 재생이 필요한 조직에 대해 원위이고 다른 부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 혈중(동맥내, 정맥 내 등), 근육, 피하, 피내, 복강 등이 있는데, 이들에 한정되지 않는다.
또 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여 방법을 선택할 수 있다. 본 발명의 펩티드를 투여하는 경우, 예를 들면, 단백질의 시간 당 1회 투여량은 환자의 체중 1 kg당 0.0000001mg에서 1000mg의 범위에서 선택할 수 있다. 혹은, 예를 들면, 환자당 0.00001에서 100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 본 발명의 펩티드를 분비하는 세포나 그 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 유전자 치료용 벡터를 투여하는 경우도 해당 펩티드의 양이 상기 범위 내로 되도록 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 의약 조성물은 이러한 투여량에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있고(예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가제를 함께 포함할 수 있다. 예컨대 계면 활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 감미제 등을 포함하지만, 이들에 제한되지 않고, 기타 상용하는 담체가 적절히 사용될 수 있다. 구체예로는 경질 무수 규산, 유당, 결정 셀룰로스, 만니톨, 전분, 칼멜로스 칼슘, 칼멜로스 나트륨, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노 아세테이트, 폴리비닐 피롤리돈, 젤라틴, 중쇄지방산 트리그리세라이드, 폴리옥시에틸렌수소화캐스터오일 60, 백당, 카르복시메틸 셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기 염류 등을 포함한다.
본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질을 포함하는 키트를 제공한다:
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
상기 키트는 세포 이동을 자극하기 때문에 골수 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하기 위해서, 혹은 조직을 재생하기 위해서 사용할 수 있다. 상기 키트로는 (1)피브리노겐에 용해된 상기 물질 및 (2)트롬빈을 포함한 키트; 또는 (1)상기 물질, (2)피브리노겐, 및 (3)트롬빈을 포함한 키트가 예시할 수 있다. 본 발명에서는 시판되는 피브리노겐이나 트롬빈을 사용할 수 있다. 예를 들면, 피브리노겐 HT-Wf(베네시스-미츠비시 웰 파머), 베리플라스트(ZLB베링), 티씰(백스터), 볼힐(카케츠켄), 및 타코콤보(ZLB베링)을 예시할 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
나아가 HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드, 해당 펩티드를 분비하는 세포, 및 해당 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터의 용도는 다음의 (1)~(9)와 같이 표현할 수도 있다.
(1) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질의 유효량을 투여하는 공정을 포함하여 세포 이동을 자극하는 방법;
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
(2) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질의 유효량을 투여하는 공정을 포함하여, 세포를 골수에서 말초 혈액으로 동원하는 방법;
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
(3)하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질의 유효량을 투여하는 공정을 포함하여 조직을 재생시키는 방법;
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
(4)세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 조성물의 제조에 있어서 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질의 사용;
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
(5) 세포를 골수에서 말초 혈액으로 동원하기 위해 이용되는 조성물의 제조에 있어서 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질의 사용;
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
(6) 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물의 제조에 있어서 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질의 사용;
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
(7) 세포 이동을 자극하는 방법에 사용하기 위한 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질;
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
(8) 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하는 방법에 사용하기 위한 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질;
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
(9) 조직을 재생하는 방법에 사용하기 위한 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 물질;
(a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
(b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
(c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
또한 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 적어도 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드의 용도에 대해서도 상기와 마찬가지로 바꾸어 서술할 수 있다.
[1]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
[2]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
[3]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
[4]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
[5]서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
또한 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 편입된다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체화되지만, 하기 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
HEK293을 이용한 HMGB1및 HMGB1-유래 펩티드의 정제
신생 마우스 피부에서 Trizol(invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출하고 SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성했다. 이 cDNA를 주형으로 하여 HMGB1의 cDNA를 PCR(중합 효소 연쇄 반응)법을 이용하여 증폭했다. 분비 신호로서 IgGκ 사슬 신호 서열, 정제의 편의를 위해 아미노산 서열의 N말단에 HA 태그, GST 태그 및 6XHis 태그서열을 부가한 단백질을 벡터가 발현하도록 포유류 세포에서 단백질을 발현시키는 플라스미드 벡터 pCAGGS에 그 결과적인 cDNA를 삽입했다(도 1). 또한 His 태그와 목적 단백질이나 펩티드의 사이에 HRV3C로 절단되는 서열을 삽입했다. HRV3C 절단 후에는 목적 단백질이나 펩티드의 N말단 측에 Gly Pro Gly Thy Gln(서열번호:7)의 펩티드 단편이 부가된다. 또한 전장 HMGB1이나 펩티드의 cDNA는 PCR법을 이용하여 제한 효소 사이트를 부가하고 상기 벡터의 KpnI/EcoRI부분에 그 cDNA를 삽입했다.
인간 태아 신장 세포 유래 배양 세포주 HEK293에 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용하여 위에서 제작한 pCAGGS발현 벡터를 트랜스펙션하였다. 48시간 후 세포 및 배양 상청액을 회수했다. 4℃에서 4400G, 5분간 원심분리함으로써 세포 및 배양 상청액을 분리회수했다. 회수한 상청액은 지름 0.8μm 세공을 갖는 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통과시킨 다음 0.45μm의 세공을 갖는 니트로셀룰로오스 필터를 통과시킴으로써 불용 분획을 제거한 샘플을 조제했다. 상기 샘플을 50mM NaCl 함유 50mM Tris HCl pH8.0(50mL)에서 평형화한 5mL HisTrap FF(GE)에 로딩하여 흡착 성분을 10mM이미다졸 및 50mM NaCl 함유 50mM Tris HCl pH8.0로 씻어내고, 비특이적 흡착 성분을 제거했다. 특이적 흡착 성분은 50mM NaCl 및 100mM 이미다졸 함유 50mM Tris HCl pH8.0로 컬럼으로부터 용출했다. 흡착된 분획은 튜브당 500μL씩 실리콘 코팅한 플라스틱 튜브에 분획하였다. 단백질 함유 분획은 합하고 탈염 컬럼 PD10(GE)을 이용하여 이미다졸을 제거하였다. 150mM NaCl 함유 50mM Tris HCl pH 7.5를 이용하여 상기 분획을 용출했다. 용출된 샘플에 HRV3C(Novagen)를 첨가하고 4℃, 8시간 인큐베이션시켰다. 태그의 절단 후 샘플을 150mM NaCl 함유 50mM Tris HCl pH7.5로 평형화한 HiTrap Heparin 1ml 컬럼(GE)에 로딩하였다. 150mM NaCl 함유 50mM Tris HCl pH7.5로 컬럼 내부를 세척하였다. 컬럼에 결합된 단백질 또는 펩티드를 1000mM NaCl 함유 50mM Tris HCl pH7.5로 용출했다.
이동(migration) 분석
마우스 골수 중간엽 줄기세포주(MSC-1세포, 오사카 대학의 타마이 등이 확립하였음(PDGFRα-positive cells in bone marrow are mobilized by high mobility group box 1(HMGB1) to regenerate injured epithelia.(tamai et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 4.))의 세포를 트립신을 이용하여 접시로부터 분리하고 4℃, 1200rpm, 10분의 원심분리에 의해 회수했다. 결과로 나온 펠렛을 풀고 세포 농도가 2.0~3.0×106세포/ml가 되도록 10%FBS(소태아혈청, Fetal bovine serum) 함유 D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 가하여 현탁하였다. HEK293에서 생산한 재조합 단백질 및 펩티드를 10%FBS 함유 D-MEM으로 희석했다. 음성 대조군은 PBS(Phosphate buffered saline)를 사용했다. 아크릴 보이딘 챔버를 사용하여 상층에는 3X106세포/ml의 농도로 조제된 마우스 골수 중간엽 줄기세포주의 세포를, 하층에는 희석된 단백질 또는 펩티드를 가하였다. 보다 구체적으로는 48웰 케모텍시스 챔버(NEURO PROBE 48WELL CHEMOTAXIS CHAMBER)의 기저판의 각 웰에 단백질 또는 펩티드 용액을 28μl씩 넣고, 기저막의 위에 8μm 세공의 폴리카보네이트막 (Neuro Probe, Inc, Cat:866-417-0014)을 얹었다. 다음으로 그 막위에 상판을 얹고 단단히 조였다. 상판 웰에 세포 농도 조절을 끝낸 마우스 골수 중간엽 줄기세포주의 세포를 50μl 가하였다. 상기 챔버는 37℃, 5% CO2하의 인큐베이터 내에 정치했다. 4시간 후 챔버로부터 상기 막을 회수해 Diff-Quik(Sysmex, Cat:16920)로 염색하여 막공을 통해 하층으로 이동한 세포를 검출했다.
결과
전장 마우스 HMGB1(1-215) 및 1 내지 84번째까지의 펩티드(1-84), 85 내지 169번째까지의 펩티드(85-169), 1 내지 44번째까지의 펩티드(1-44), 45 내지 84번째까지의 펩티드(45-84) 및 음성 대조군(PBS)에 대해 이동 활성의 유무를 확인했다. 단백질 및 펩티드는 각각 50μg/ml의 농도로 사용했다. 85-169에서는 이동 촉진 활성이 검출되지 않았지만 나머지 1-215, 1-84, 1-44, 및 45-84에서는 이동 촉진 활성을 나타냈다(도 2).
또한 45 내지 215번째까지의 펩티드(45-215) 및 63 내지 215번째까지의 펩티드(63-215)를 각각 5, 15, 25μg/ml의 농도로 사용하여 이동 촉진 활성을 시험했다(도 3).
고찰
마우스, 래트 및 인간의 HMGB1(각각 서열번호:3, 5 및 1)는 1 내지 85번째까지의 아미노산 서열은 A-box, 86 내지 169번째까지의 아미노산 서열은 B-box로 알려져 있다. 마우스, 래트 및 인간의 1 내지 185번째까지의 아미노산 서열은 완전히 일치하고 100%가 상동성을 유지하고 있다. 186 내지 215번째까지의 아미노산 서열은 글루탐산 및 아스파르트산의 반복 서열이며, 마우스와 래트가 100%일치하지만 인간과는 2개의 아미노산만 다르다. 85-169는 이동 촉진 활성이 검출되지 않았으므로 이 단편에는 활성이 없거나, 혹은 활성이 이번 실험 조건에서는 검출 한계 이하였던 것으로 생각된다. 반면 1-84, 1-44, 45-84에서는 모두 양호한 이동 촉진 활성을 인정할 수 있으므로 1 내지 44번째까지의 아미노산 서열간, 45 내지 84번째까지의 아미노산 서열간의 적어도 2곳에 이동 활성을 갖는 도메인이 존재할 것으로 예상됐다. HMGB1은 수지상 세포 등의 세포를 이동 촉진시키는 것이 알려져 있지만, RAGE로 불리는 수용체를 HMGB1이 자극함으로써 유발된다고 여겨지고 있다. HMGB1내에 존재하는 RAGE결합 도메인은 150에서 181번의 아미노산에 상당하는 부분에 존재한다는 사실이 알려져 있다. 골수 중간엽 줄기세포를 이동시킨 도메인으로서 RAGE결합 도메인과 다른 부위인 적어도 2곳을 이번에 더 발견한 것은 놀라운 일이다.
45-215, 63-215 모두 농도 의존적으로 이동 활성을 확인했다. 또한 63-215에 비해 45-215에 강한 활성이 확인되었다. 따라서 최소한 63 내지 84번째까지의 아미노산간에 이동 활성을 갖는 도메인이 1개 존재할 것으로 추측된다. 또한 HEK293을 이용하여 생산한 하기 펩티드들도 골수 중간엽 줄기세포주 MSC-1의 이동 촉진 활성을 나타내었다:
1 내지 42번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-42),
1 내지 43번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-43),
1 내지 45번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-45),
1 내지 46번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-46),
1 내지 47번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-47),
1 내지 48번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-48),
1 내지 49번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-49),
1 내지 50번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-50),
1 내지 51번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-51),
1 내지 52번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-52), 및
1 내지 62번의 아미노산 서열을 포함한 펩티드(1-62).
초대 배양 PDGFRα 양성 골수 중간엽 줄기세포 소팅(sorting)과 이동 촉진 활성의 확인
도너인 마우스:B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J(PDGFRα-GFP Mouse)에서 대퇴골과 경골을 절제해냈다. 주위에 부착한 근육 및 기타 조직을 제거한 뒤 뼈를 곱게 파쇄하고 0.2%콜라게나제(Roche, REF:10103586001)/DMEM/2%FBS(filtrated)에 37℃, 40분 인큐베이션하였다. 이 후 40μm 나일론 메쉬를 통해 세포 덩어리나 근육 조직을 추가로 제거했다. 1200rpm, 10분 원심분리하고, 세포를 10%FBS 및 1%P/S를 함유하는 αMEM에 현탁하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 100% 세포밀도(confluence)가 될 때까지 인큐베이션하였다. 세포를 회수하고 CD11b 마이크로 비드(Miltenyi Biotec, order No:130-049-601)에 부속되어 있는 프로토콜에 따라 하기 실험을 실시했다. 세포를 PBS(-)로 107개/90μl로 조정하고 CD11b 마이크로 비드를 10μl/107세포로 가하였다. 4℃, 15분간 반응 후 세포를 2회 세척하고 PBS(-) 500μl에 현탁하였다. AutoMACS 분리기에 시험관을 두고 "Depletes" 분리 프로그램에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 접착 세포용 배양 접시에 플레이팅하고 부착 후 형광 현미경을 사용하여 GFP의 형광을 관찰했다. CD11b-음성 세포를 사용하여, 전술한 HEK293에서 생산한 펩티드 1-44에 대해 이동 촉진 활성을 조사했다. 펩티드는 40μg/ml의 농도로 사용했다.
결과
CD11b-양성 세포 가운데에 PDGFRα GFP세포는 거의 보이지 않은 반면 CD11b-음성 세포 가운데에 PDGFRα GFP세포를 많이 검출했다(도 4).
한편 HEK293을 사용하여 생산한 1-44 펩티드는 CD11b-음성, PDGFRα-양성 세포에 대해 강한 이동 촉진 활성을 나타냈다(도 5).
고찰
CD11b 음성, PDGFRα 양성의 세포에는 골수 다능성 줄기세포의 일종인 골수 중간엽 줄기세포가 많이 포함되어 있다고 생각한다. 1-44의 펩티드는 확립된 골수 중간엽 줄기세포주 외에 초대 배양 골수 중간엽 줄기세포에 대해서도 이동 촉진 활성을 갖는다고 생각한다.
인간 골수 중간엽 줄기세포에서의 PDGFRα 단백질의 발현 시험
방법
인간 중간엽 줄기세포(hMSC, human Mesenchymal Stem Cell) (다카라 바이오 주식 회사; 제품 번호 PT034)을 인간 중간엽 줄기세포 전용 완전 합성 배지 키트(MSCGM-CD(tm)BulletKit(tm) (다카라 바이오 주식 회사; 제품 번호 B0632)를 사용하여 제품 매뉴얼에 따라 배양하였다. 적어도 5계대 이내의 세포를 실험에 사용하였다.
웨스턴 블롯에 사용하기 위해 약 5 x 107개의 세포를 회수하여 1mL의 PBS에 현탁했다. 세포 현탁액에 6x SDS-PAGE 샘플 버퍼 200μL를 가하고 95℃에서 5분간 가열했다. 양성 대조군으로서 래트 PDGFRα을 발현하는 대장균(JM109)의 균체 파쇄액을 샘플 버퍼에서 용해하여 사용했다. 다음으로 7.5% SDS-PAGE 겔에 각 샘플 20μl과 분자량 마커로 Precision Plus Dual color Standard(Bio-Rad(cat#:161-0374))를 전기 영동을 했다. 전기 영동이 끝난 뒤 겔을 회수해 종래의 방법에 따라 PVDF막에 전사했다. 샘플이 전사된 PVDF막은 2%탈지유(skim milk)/0.1%Tween20(PBS-T)에 실온에서 1시간 담궈둠으로써 블로킹했다. PBS-T를 이용하여 막에 부착된 여분의 탈지유를 세척했다. 1차 항체로서 PDGFRα 토끼 항-인간 폴리클로날 항체(Lifespan Bioscience(cat#:LS-C9640))을 PBS-T포함 2%탈지유에 3000배 희석하고 블로킹을 한 막을 그 안에 1시간 담궈두었다. 다음으로 그 막을 PBS-T에 10분간 침지시켜 총 3회 세척을 했다. 2차 항체로서 Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey(GE healthcare(cat#:NA934)을 PBS-T포함 2%탈지유로 15000배 희석하고 상기 막을 그 안에 1시간 담궈두었다. 다음으로 그 막을 PBS-T에 10분간 침지시켜 총 3회 세척을 했다. ECL Prime(GE healthcare(cat#:RPN2232)를 제품 매뉴얼에 따라 사용하여 PDGFRα의 밴드를 검출했다.
결과
양성 대조군, 대장균에서 생산한 래트 PDGFRα이 약 170kDa 크기의 밴드로서 검출되었다. 한편 인간 골수 중간엽 줄기세포의 PDGFRα는 약간 분자량이 큰 위치에 검출되었다(도 2B).
고찰
마우스만 아니라 인간의 골수 중간엽 줄기세포에서도 PDGFRα 단백질의 발현이 웨스턴 블롯에서 검출됐다. 대장균에서 생산한 래트 PDGFRα에 비해 약간 큰 크기인 이유는 당쇄(glycosylation) 등의 수식(modification)의 존재 때문일 가능성이 있다. PDGFRα는 인간 골수 중간엽 줄기세포에서도 발현되는 것으로 나타났다.
<초대 배양 PDGFRα 양성 골수 중간엽 줄기세포 다능성의 평가>
PDGFRα 양성, Lineage음성, c-kit음성 세포의 FACS 소팅
C57B16마우스(6주 나이, 수컷)에 대해 이소플루레인을 이용하여 충분히 깊이 마취를 시행하고 이산화 탄소를 흡입시켜 안락사시켰다. 대퇴골과 경골을 절제해 지방 및 근육 조직을 제거하였다. EtOH에 담가 뼈에 부착한 조직을 완전히 제거했다. 26G 바늘을 붙인 주사기를 사용하여 골수 조직을 수득했다. 수득한 골수 세포에 0.2%Collagenase A를 포함한 DMEM을 가해 37℃에서 40분간 인큐베이션했다.
10%FBS 함유 DMEM을 가한 후 1500rpm의 속도로 10분간 원심분리를 했다. 상청액은 버리고 침전된 골수 세포를 회수했다.
상기 세포를 지름 10cm의 배양 접시에 플레이팅하여 1X스트렙토마이신·페니실린 보충된 10%FBS 함유 D-MEM을 이용하고 인큐베이터내 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 3일마다 새로운 배지와 교환했다. 부착한 세포의 배지를 버리고 세포를 10ml의 PBS를 가해 2회 세척하였다. 0.25%트립신 5ml를 가하고 세포를 37℃에서 10분간 인큐베이션했다. 배양 접시에서 떼어낸 세포를 회수하고 10%FBS 함유 DMEM을 가하여 트립신 반응을 멈췄다. 세포를 원심기로 1200rpm의 속도로 3분간 원심분리하였다. 침전된 세포를 회수하고 2%FBS 함유 PBS에 1×106세포/100μl로 현탁하여 둥근 바닥 96 웰(well) 플레이트의 각각의 웰에 분주하였다. 1차 항체로서 APC-mouse Lineage antibody cocktail(BD Phamingen, Cat.558074)를 하나의 웰 당 10μl씩 가하였다. PE-마우스 CD140a(PDGFRa) (BD Bioscience, Cat.12-1401-81), FITC-mouse c-kit(BD Bioscience)를 각각 1μL씩 각 웰에 가하였다. 세포를 차광하여 4℃, 20분간 인큐베이션했다. 2%FBS 함유 PBS을 200μL씩 각 웰에 가한 후 세포를 원심기를 이용하여 1500rpm의 속도로 10분간 원심분리하였다. 상청액은 버렸다. 다음으로, 같은 방식으로 세포를 2회 세척했다. 세포는 BD FACSAria 세포 소터를 사용하여 세포 소팅을 했다.
뼈 분화 유도
세포가 70% confluency로 자랐을 때 배지를 뼈 분화(Osteogenic differentiation) 배지(R&D, SC010로 제조)로 2~3일마다 교환했다. 세포를 37℃, 5% CO2하 인큐베이터내에서 배양했다. 약 3주간 배양을 계속했다.
ALP염색
뼈 분화 유도한 세포를 키트의 고정액(고정 제조액에으로 미리 제조한 것)으로 10초 고정하고, Fast Blue RR Salt과 기질 원액에서 만든 기질액(무토 화학, Cat.No.1568-2)으로 37℃에서 3분간 염색했다. ALP양성 세포는 청자색으로 착색하였다.
지방 분화 유도
세포가 100% 세포밀도로 자랐을 때, 골원성 분화(Adipogenic differentiation) 배지(R&D, SC010으로 제조한 것)로 배지를 3~4일마다 교환했다. 세포를 37℃, 5% CO2하의 인큐베이터에서 배양했다. 약 2주간 배양을 계속했다.
Oil Red 염색
지방 분화 유도한 세포를 키트 부속의 프로필렌 글리콜 고정액으로 고정하고 그 뒤 oil Red O 용액(DBS, item#KT 025)을 이용하여 지방 세포를 염색했다.
결과
뼈 분화 유도한 세포 중에서 청자색으로 염색된 세포가 관찰되었는데 그 세포는 골아세포로 분화한 것을 나타낸다(도 6A). 한편 지방 분화 유도한 세포 중에서 적색으로 염색된 지방 세포의 유적(oil drop)이 관찰되었는데 그 세포는 지방 세포로 분화한 것을 나타낸다(도 6B).
고찰
골수 PDGFRα 양성 세포에는 적어도 뼈 분화, 지방 분화 가능한 골수 중간엽 줄기세포가 포함된 것으로 예상된다.
합성 펩티드의 이동 촉진 활성 평가
하기 펩티드를 MBL(Medical & Biological Laboratories 주식 회사 의학 생물학 연구소)에 의뢰하여 고체상법으로 합성하였다. 마우스 HMGB1의 서열(서열번호:3)에 기초하여 펩티드를 합성한 것이다. 후속하는 실시예들에서의 합성 펩티드들도 마찬가지로 마우스 HMGB1의 서열에 근거해 제조된 것이다.
HMGB1의 1 내지 10번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(1-10),
HMGB1의 1 내지 34번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(1-34),
HMGB1의 37 내지 62번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(37-62),
HMGB1의 27 내지 62번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(27-62),
HMGB1의 56 내지 72번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(56-72),
HMGB1의 11 내지 20번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(11-20),
HMGB1의 11 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(11-25),
HMGB1의 11 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(11-30),
HMGB1의 11 내지 34번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(11-34),
HMGB1의 11 내지 44번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(11-44),
HMGB1의 17 내지 44번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(17-44), 및
HMGB1의 1 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(1-25) 및
양성 대조군으로서 HEK293에서 생산한 전장 마우스 HMGB1(1-215(HEK))을 100μg/ml가 되도록 조정하여 주화성 챔버의 하층에 두고 골수 중간엽 줄기세포(MSC-1)에 대한 이동 촉진 활성을 평가했다.
결과
적어도 합성 펩티드(11-34), (1-34), (11-44), (1-44), 및 (11-30)에는 양성 대조군과 동등 이상의 활성이 있는 것으로 확인되었다(도 7). 나아가 합성 펩티드 (11-25) 및 (1-25)에도 활성이 있는 것으로 확인되었다(도 7).
고찰
실시예 1의 결과로부터 1 내지 44번째까지의 아미노산 서열, 45 내지 84번째까지의 아미노산 서열 중에 각각 이동 촉진 활성 부분이 적어도 1개 존재할 것으로 예상됐다. 이번 실시예 4의 결과로부터 합성 펩티드(11-34)도 강한 이동 촉진 활성을 가지고 있어 적어도 11 내지 34번째까지의 아미노산 서열 속에 활성 중심이 있다고 예상된다. 나아가, 약간 약하긴 하지만 합성 펩티드(11-25)에도 활성이 확인되었다. 11 내지 25번째까지의 아미노산 서열에 활성 중심 부분이 있고, 그 중심 전후의 아미노산 서열은 그 활성을 증강하는 서열이라고 예상된다.
방법
활성 중심의 위치를 더욱 좁히기 위해 보다 짧은 펩티드를 다음과 같이 합성했다.
HMGB1의
11 내지 27번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(11-27),
11 내지 28번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(11-28),
11 내지 29번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(11-29),
12 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(12-30),
13 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(13-30),
14 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(14-30),
15 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(15-30),
16 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(16-30),
17 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(17-30),
18 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(18-30),
19 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(19-30),
20 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(20-30),
21 내지 30번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(21-30),
10 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(10-25),
11 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(11-25),
12 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(12-25),
13 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(13-25),
14 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(14-25),
15 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(15-25),
16 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(16-25),
17 내지 25번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(17-25),
186 내지 215번의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(186-215).
양성 대조군으로서 1일령 마우스 피부(1마리 분)을 PBS에 담가 4℃ 12시간 인큐베이션한 원심상청액 및 HEK293에서 생산한 마우스 전장 HMGB1(HMGB1(HEK_1-215))를 사용했다. 주화성 챔버의 상층에는 골수 중간엽 줄기세포주(MSC-1)을 넣고, 상기 단백질 및 합성 펩티드는 5μM 혹은 10μM의 농도로 주화성 챔버의 하층에 첨가했다. 이동 분석은 실시예 1과 같은 방법으로 시행했다.
결과
적어도 합성 펩티드 (11-27), (11-28), (11-29), (12-30), (13-30), (14-30), 및 (10-25)가 5μM의 농도에서 강한 이동 촉진 활성을 나타내었다. 한편 합성 펩티드 (11-25), (12-25), (13-25), (14-25), (15-25), (15-30), (16-25), (16-30), (17-25), 및 (17-30)는 약한 활성을 나타냈다(도 8A, 도 8B).
고찰
실시예 4의 결과로부터 11 내지 25번의 아미노산 서열 내에 이동 촉진 활성을 갖는 도메인이 위치한다고 예상된다. 따라서 이동 촉진 활성을 갖는 도메인 중 하나는 17번의 아미노산 내지 25번의 아미노산(9개의 아미노산)에 존재할 것으로 예상된다.
HMGB1 단편들의 골수 중간엽 줄기세포에 대한 이동 촉진 활성 비교
방법
HMGB1의 단편으로 이루어진 합성 펩티드 15-30, 16-30, 17-30, 17-44, 45-74, 및 55-84 각각의 골수 중간엽 줄기세포(MSC-1)에 대한 이동 촉진 활성의 강도를 음성 대조군(PBS)과 비교했다. 전술한 바와 같이 보이덴 챔버법을 행하였다. 펩티드는 각각 10μM이 되도록 챔버의 하층에 가하였다. 1.5 X 106개의 세포를 1mL의 10%FBS 함유 DMEM에 분산시킨 것을 챔버의 상층에 가하였다. 상층과 하층의 사이에는 지름 8μm의 세공을 갖는 폴리카보네이트막을 삽입했다. 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 4시간 인큐베이션한 후, 막을 제거하고 Diff-Quik stain(상표)으로 염색처리하여 하층으로 이동한 세포만을 염색했다. 염색 후 세포를 공기건조하고 하층으로 이동한 세포의 수를 현미경으로 계수하였다. 그 평균값을 계산했다.
결과
모든 펩티드는 음성 대조군에 비해 보다 강한 이동 촉진의 활성을 나타내었다.
고찰
펩티드 합성은 HEK293나 대장균 등 세균을 사용한 제조 방법에 비해 저렴한 비용으로 안정된 생산량을 확보할 수 있으며, 생물 유래의 독소 등의 오염을 예방할 수 있는 등 의약품 제조에 있어서는 매우 뛰어난 제조 방법이다. 반면, 생물 내에서 제조와 달리 번역 후 수식(post-translational modification)이나 접힘(folding)이 정확하게 행해지지 않기 때문에 높은 소수성의 아미노산을 함유하는 저분자량의 펩티드는 수용액 내에서 매우 불용성이 되는 경우가 종종 있다. 본 실시예에서도 펩티드의 이동 촉진 활성이 상대적으로 약하기 때문에 음성 대조군에 대비한 활성의 강도를 현미경을 사용하여 정확하게 측정했다. 모든 펩티드에서 음성 대조군에 비해 강한 이동 촉진 활성을 검출했다(도 8C).
합성 펩티드의 이동 촉진 활성 확인
실시예 4에서 사용한 합성 펩티드(1-44), 및 (1-34), 45번의 아미노산 내지 74번의 아미노산으로 이루어진 펩티드(45-74), 55번의 아미노산 내지 84번의 아미노산으로 이루어진 펩티드(55-84)를 실시예 5와 동일한 방식으로 주화성 챔버를 사용하여 이동분석을 시행했다. 각각 10μM 및 5μM의 2종류의 농도로 동시에 했다.
결과
합성 펩티드(1-44) 및 (1-34)에 비해 약하지만 합성 펩티드(45-74) 및 합성 펩티드(55-84)에도 이동 촉진 활성이 나타났다(도 9).
고찰
실시예 1의 결과에서는 HEK293에서 생산한 펩티드(1-84), (1-44), 및 (45-84)에 PDGFRα 양성 중간엽 줄기세포에 대한 강한 이동 촉진 활성이 인정되었다. 실시예 4의 결과에서는 합성 펩티드(1-44) 및 (1-34)에서도 강한 활성이 보유되고 있는 것이 나타났다. 한편 이번의 실시예 6의 결과에서는 합성 펩티드(45-74), 및 (55-84)가 약간 감쇠하고는 있지만, 마찬가지로 이동활성이 인정되었다.
HEK293등의 진핵 생물의 세포에서 펩티드 및 단백질이 합성될 때 및 당쇄 수식(glycosylation) 등의 수식을 하는 것이 알려져 있다. 반면 합성한 펩티드는 수식을 하지 않는다. 45 내지 84번째까지의 아미노산 서열의 합성 펩티드"(45-74) 및 (55-84)"의 이동 촉진 활성에 비하여 HEK293에서 생산한 펩티드(45-84)의 이동 촉진 활성이 강하다는 사실은 그 펩티드가 어떤 수식을 받고 있을 가능성을 시사한다.
한편 메소앤지오블라스트(mesoangioblast)를 이용한 과거의 실험(Palumbo등 J. Cell Biol., 164:441-449,2004년)에서는 세포에 대한 HMGB1(전장 215 아미노산)의 이동 촉진 활성은 C말단에서 절단한 1 내지 187번째까지의 아미노산으로 이루어진 서열에서 보유되고 있지만, 1 내지 89번째까지의 아미노산으로 이루어진 서열, 90 내지 176번째까지의 서열, 및 1 내지 176번째까지의 서열에서는 활성이 거의 없는 것으로 나타났다. 반면 HMGB1의 수용체의 하나로 알려진 RAGE의 리간드로 예상되고 있는 부위는 150 내지 181번의 아미노산으로 이루어진 서열과 일치한다. 상기 문헌에는 RAGE의 우성 음성(dominant negative)에 의해 이동 촉진 활성이 억제되는 것이 나타나 있다. 또 다른 보고서(Yang 등, J Leukoc Biol. Jan;81(1):59-66, 2007년)에서는 수지상 세포(dendritic cell)를 HMGB1이 이동 촉진할 때에도 RAGE수용체가 또한 이용하고 있는 것이 제시되어 있다. 따라서 지금까지는 HMGB1의 이동 촉진 활성은 RAGE의 리간드 부분인 HMGB1의 C-말단 측의 펩티드가 주목되고 있었다.
본 실시예에서는 지금까지 세포의 이동 촉진 활성이 없는 것으로 나타났던 부분인 N말단 측의 펩티드 내에 2곳에서 이동 촉진 활성 부위를 동정하는 데 성공했다. 과도한 염증은 조직 재생에 있어서 저해 인자라고 알려져 있다. 본 실시예에서 발견한 활성 부분은 RAGE의 리간드와 전혀 다른 부분이라는 점에서 수지상 세포 같은 염증 세포의 동원을 피하면서 PDGFRα 양성의 줄기세포를 동원할 수 있으므로 보다 부작용이 적은 의약품의 개발이 가능할 것이라 예상된다.
펩티드(1-44)와 전장 HMGB1의 이동 촉진 활성의 정량적 비교
실시예 1과 마찬가지 방식으로로 HEK293세포에 폴리에틸렌 이민을 이용하여 마우스 HMGB1(1-44) 발현 벡터를 트랜스펙션하고, 세포 상청액 중에 분비되는 HMGB1을 회수하여 정제하였다(HEK293 transient). 또 마찬가지로 트란스펙션한 후 2μg/ml의 퓨로마이신을 배양 배지 중에 첨가하고 구성적(constitutingly)으로 HMGB1(1-44)을 분비하는 세포를 상기 약제로 선택했다. 이 세포 상청액 중에 분비된 HMGB1을 정제하였다(HMGB1-stable).
대장균을 이용한 HMGB1-유래 펩티드의 생산
대장균을 이용하여 1-44 아미노산의 펩티드를 제작하기 위해, HRV3C에서 절단되는 마우스 HMGB1의 1 내지 44번의 아미노산을 코딩하는 cDNA의 N-말단측에 부가되는 키메라 펩티드를 발현하는 cDNA를 pENTR 벡터(Invitron사제)에 삽입했다. pDEST17벡터에 전달하기 위해 LR반응을 수행하였다. 상기 발현 벡터는 T7프로모터를 가지며 대장균에서 단백질을 발현할 수 있다. 또한 6X His 태그를 N말단 측에 부가한다. HRV3C 절단의 결과 6X His 태그는 제거되고 펩티드의 N-말단 측에 Gly Pro Gly Thy Gln(서열번호:7)의 펩티드 단편이 부가된다.
대장균 BL21(DE3)에 전기천공법(electroporation)으로 상기 발현 벡터를 형질전환하였다. SOC 배지를 가한 후 37℃에서 60분 동안 진동기에서 배양했다. 세포를 카르베니실린 함유 LB한천 배지 위에 플레이팅하여, 37℃에서 18시간 인큐베이션했다. 단일 콜로니를 채취하여 카르베니실린 함유 LB 배지를 더해 37℃의 진탕기에서 배양했다. O.D.600=0.4-0.5이 되었을 때 IPTG를 최종 농도 0.1mM이 되도록 가하고 30℃에서 진탕시켰다. 6시간 후 대장균을 회수하고 3500rpm에서 30분간 원심분리하였다. 침전된 대장균을 회수하고 거기에 6M 요소 및 50mM NaCl 함유된 50mM Tris-HCl (pH8.0)을 가하였다. 피페팅으로 대장균을 용균하고 6M 요소 및 50mM NaCl 함유된 50mM Tris-HCl (pH8.0)로 평형화한 5ml HisTrap FF(GE)에 로딩하였다. 이후 흡착된 물질을 6M 요소, 50mM NaCl, 및 10mM 이미다졸 함유된 50mM Tris-HCl (pH8.0)로 세척하고 비특이적 흡착 성분을 제거했다. 특이적 흡착 성분을, 칼럼에서 6M 요소, 300mM 이미다졸 및 50mM NaCl 함유 50mM Tris HCl (pH8.0)로 용출했다. 흡착된 물질은 각각 500μL씩 실리콘 코팅된 플라스틱 튜브에 분획되었고, 단백질 함유 분획들을 통합했다. 그 뒤 탈염 컬럼 PD10(GE)을 이용하여 이미다졸을 제거하고 150mM NaCl 함유 50mM Tris-HCl (pH 7.5)를 이용하여 용출했다. 용출한 샘플에 HRV3C(Novagen)를 첨가하여 4℃, 8시간 반응시켰다. 태그의 절단 후 샘플을 150mM NaCl 함유 50mM Tris HCl (pH7.5)로 평형화한 1-mL HisTrap FF 컬럼에 로딩하고 결합 되지 않은 분획으로서 펩티드를 회수했다.
합성 펩티드(1-44)는 상기한 방식과 동일한 방식으로 준비했다. 이들 펩티드 및 단백질을 2μM의 농도로 사용하여 골수 중간엽 줄기세포주(MSC-1)에 대한 이동 촉진 분석을 실시했다. 주화성 챔버의 세공의 면적과 이동된 세포의 면적을 이미지분석 소프트웨어를 이용하여 계측했다.
결과
같은 몰 당으로 비교시, 전장 HMGB1 보다 HEK293에서 생산한 펩티드(1-44) 및 대장균에서 생산한 펩티드(1-44)는 모두 약 1.6배 높은 이동 촉진 활성을 나타냈다. 같은 질량 당으로 비교시, 전장 HMGB1 보다 HEK293에서 생성한 펩티드(1-44) 및 대장균에서 생산한 펩티드(1-44)는 모두 약 8배 높은 이동 촉진 활성을 나타냈다. 한편 합성 펩티드(1-44)의 이동 촉진 활성은 전장 HMGB1에 대해 같은 몰 당에서는 0.57배였지만, 같은 질량 당에서는 2.86배 높은 이동활성을 나타냈다(도 10).
고찰
실시예 1 및 실시예 6 등의 결과로부터 이동 촉진 활성의 중심 부위는 1 내지 44번째까지의 아미노산 서열 및 45 내지 84번째까지의 아미노산 서열 각각에 최소한 1개 이상 존재하고 따라서 전체로서는 2개 이상의 활성 부위가 존재할 것으로 생각된다. 게다가 본 실시예 7의 결과로부터, 같은 질량 당으로는 HEK293에서 생산한 펩티드(1-44)가 전장 HMGB1에 비해 8배에 가까운 이동 촉진 활성(같은 몰에서 비교시는 약 1.6배)을 갖는 것이 나타났다. 게다가 HEK293에서 생산한 펩티드(45-84)도 동등한 이동 촉진 활성을 가지고 있다(도 2). 상기한 발견점에 의하면 HMGB1 내에는 같은 몰 수의 전장 HMGB1 보다 더 높은 이동 촉진 활성을 갖는 부위가 1 내지 44번의 아미노산 서열, 45 내지 84번의 아미노산 서열의 2곳에 적어도 존재하지만, 전장 HMGB1의 활성은 이들 2곳의 활성의 합보다 훨씬 낮은 것으로 밝혀졌다. 전장 HMGB1의 결정 해석의 결과로부터 1 내지 44번째까지의 펩티드와 45 내지 84번째까지의 펩티드는 서로 인접해 있어 서로의 활성을 저해할 가능성이 예상된다. 펩티드로 분리함으로써 저해가 해소되어 각각의 활성이 증강된 것으로 여겨진다.
골수 중간엽 줄기세포주(MSC-1)의 PDGFRα, 가계마커(Lineage marker), 및 CD44의 발현에 대한 FACS분석
마우스 유래 골수 중간엽 줄기세포주의 세포 MSC-1를 직경 10cm의 배양 접시에 플레이팅하여 10%FBS 포함하고 1X 스트렙토마이신-페니실린으로 보충된 D-MEM를 이용하고 5% CO2, 37℃하에서 배양기를 이용하여 배양했다. 80-90% 세포밀도로 증식한 뒤 배지를 버리고 세포에 10ml의 PBS를 더해 2회 세척했다. 0.25% 트립신 5ml를 가하고 37℃, 10분 인큐베이션했다. 배양 접시에서 분리된 세포를 회수하고 10% FBS함유 DMEM을 가해 트립신의 반응을 멈췄다. 세포를 원심분리기로 1200rpm의 속도로 3 분간 원심분리하였다. 침전된 세포를 회수하고 2% FBS함유 100μL의 PBS 당 1×106세포로 현탁하였다. 그 세포를 둥근바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 1차 항체로서 APC-mouse Lineage antibody cocktail(BD Phamingen, Cat.558074)을 1 웰 당 10μL씩 가하였다. PE-mouse CD140a(PDGFRα) (BD Bioscience, Cat.12-1401-81), 및 FITC-mouse CD44(BD Bioscience, Cat.553-133)을 각각 1μL씩 각 웰에 가하고 차광하여 4℃, 20분간 인큐베이션시켰다. 2% FBS함유 PBS를 200μL씩 각 웰에 추가하고 원심기를 이용하여 1500rpm의 속도로 10분간 원심분리한 후 결과적인 상청액을 버렸다. 다음으로 마찬가지 방식으로 세포를 2회 세척했다. PBS 100μL에 세포를 현탁하고 BD FACSCantTMII로 분석했다.
결과
주식화 골수 중간엽 줄기세포(MSC-1)는 PDGFRα-양성, Lineage-음성, 및 CD44-양성이었다(도 11).
고찰
이동 촉진 활성에 사용된 세포는 PDGFRα 양성의 골수 중간엽 줄기세포의 특성을 갖고 있다.
마우스 케라틴 생성세포(keratinocytes)에 대한 합성 펩티드(1-34)의 이동 촉진 활성
신생 C57/Bl6 마우스에 대해 이소플루레인 및 이산화탄소 흡입을 이용하여 안락사 시킨 후, EtOH 및 PBS로 마우스를 완전히 세척했다. 진피와 함께 피부를 벗겨내고 PBS로 혈액을 씻어냈다. 벗겨낸 피부를 디스파제 I(산코 순약, Cat:GD81060)속에 4℃, 16시간 정치했다. 겸자(forcep)로 표피와 진피를 박리하고 표피를 트립신(Nacalai tesque, Cat:3554-64)속에 10분, 37℃에서 정치했다. 백탁하면 S-MEM(GIBCO, Cat:11380) 15% FBS(Ca-)P/S로 반응을 멈추고 160×G, 5분으로 원심분리하였다. 세포를 CnT-07배지(CELLnTEC, Cat:CnT-07 BM)에 현탁하고 10cm접시에 플레이팅했다. 5% CO2, 37℃에서 배양해 3일마다 배지를 교환하고 80~90% 세포밀도에 이르기까지 계대배양을 했다. 세포를 트립신으로 배양접시에서 회수해 10% FBS 함유 D-MEM에서 트립신을 불활성화했다. 그 뒤 상술한 이동 촉진 분석 법에 따라 1 내지 34번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(1-34)의 이동 촉진 활성을 조사했다.
마우스 케라틴 생성 세포의 PDGFRα의 발현
신생 B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J 마우스를 4% PFA에 의한 관류(perfusion)로 고정했다. 신생 피부 1.0×1.0 cm2를 잘라내어 4% PFA에 12시간 침지하고 이후 30% 슈크로스로 12시간, 4℃로 침지하여 고정하였다. 그 피부를 PBS(-)로 세척해 OTC 화합물로 동결 포매했다. 크라이오스탯으로 8μm의 동결 절편을 잘라내었다. PBS로 2회 세척하여 상기 화합물을 씻어 내고, 10%염소 혈청 PBS로 실온에서 1시간 블로킹했다. 사용된 1차 항체는 10% 염소 혈청 함유 PBS로 500배 희석한 토끼 항-케라틴 5(Covance, Cat:PRB-160P), 혹은 토끼 항-비멘틴(Abcam, Cat:ab7783-500)이었다. 상기 절편에 대해 상기 1차 항체로 5시간, 4℃에서 인큐베이션한 후 PBS로 2회 세척했다. 사용된 2차 항체는 10% 염소 혈청 함유 PBS로 500배 희석한 Alexa Fluor 546 염소 항-토끼 IgG(H+L) (Invitrogen, Cat:A11035)이었다. 이를 사용하여 2차 항체와 45분 동안 실온에서 인큐베이션했다. PBS로 2회 세척하고 2μg/ml의 DAPI(4', 6-diamino-2-phenylindole)에서 3분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 다음 PBS로 2회 세척하고 형광체 퇴광 방지제를 포함한 마운트 매질과 함께 탑재했다.
결과
마우스 케라틴 생성 세포에 대해서 합성 펩티드(1-34)는 이동 촉진 활성을 나타내지 않았다(도 12A) 나아가 마우스 케라틴 세포의 마커인 케라틴 5 양성 세포에서 GFP의 형광은 관찰되지 않았다(도 12B).
고찰
케라틴 생성 세포는 PDGFRα을 발현하지 않았다. 또 케라틴 생성 세포에 대해서 합성 펩티드(1-34)는 이동 촉진 활성을 가지고 있지 않았다.
마우스 피부 섬유 아세포에 대한 합성 펩티드(1-34)의 이동 촉진 활성
신생 C57/Bl6 마우스를 이소플루레인 및 이산화 탄소 흡입을 이용하여 안락사 시켰다. 그 후 EtOH 및 PBS로 마우스를 완전히 세척하였다. 진피와 함께 피부를 벗겨내고 PBS로 피를 씻어 냈다. 벗겨낸 피부를 가위로 잘라내어 작은 조각으로 했다. 0.2% 콜라게나아제(Roche, REF:10103586001)를 함유하는 DMEM(Nacalai tesque, Cat:08458-45)속에 피부 조각들을 넣고 37℃, 30분간 진탕했다. DMEM/30%FBS/P/S로 반응을 멈추고, 160×G, 5분으로 원심 후 세포를 10-cm접시에 플레이팅했다. 세포를 5% CO2, 37℃에서 배양하여 3일마다 배지를 교환하고 80~90% 세포밀도가 될 때까지 계대배양을 했다. 세포를 트립신을 이용하여 접시로부터 회수하였다. 10%FBS 함유 D-MEM로 트립신을 불활성화 후, 상술한 이동 촉진 분석법에 따라 1 내지 34번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드(1-34)의 이동 촉진 활성을 조사했다.
신생 B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J 마우스를 4%PFA로 관류 고정했다. 신생 피부 1.0×1.0 cm2를 잘라내어 4% PFA에 12시간 침지하고 이후 30% 슈크로스로 12시간, 4℃로 침지하여 고정하였다. 그 피부를 PBS(-)로 세척해 OTC 화합물로 동결 포매했다. 크라이오스탯으로 8μm의 동결 절편을 잘라내었다. PBS로 2회 세척하여 상기 화합물을 씻어 내고, 10%염소 혈청 PBS로 실온에서 1시간 블로킹했다. 사용된 1차 항체는 10% 염소 혈청 함유 PBS로 500배 희석한 토끼 항-비멘틴(Abcam, Cat:ab7783-500)이었다. 상기 절편에 대해 상기 1차 항체로 5시간, 4℃에서 인큐베이션한 후 PBS로 2회 세척했다. 사용된 2차 항체는 10% 염소 혈청 함유 PBS로 500배 희석한 Alexa Fluor 546 염소 항-토끼 IgG(H+L) (Invitrogen, Cat:A11035)이었다. 이를 사용하여 45분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 뒤 PBS에서 2회 세척하고 2μg/ml의 DAPI(4', 6-diamino-2-phenylindole)에서 3분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 다음 PBS로 2회 세척하고 형광체 퇴광 방지제를 포함한 마운트매질과 함께 탑재했다.
결과
합성 펩티드(1-34)는 피부 섬유 아세포에 대해 이동 촉진 활성을 나타냈다(도 13A). 나아가, 섬유 아세포의 표지인 비멘틴 양성 세포 중에서 GFP 형광 양성 세포가 관찰되었다(도 13B).
고찰
피부 섬유 아세포는 PDGFRα을 발현하고 있었다. 피부 섬유 아세포에 대해서 합성 펩티드 (1-34)는 이동 촉진 활성을 가지고 있었다. 골수 중간엽 줄기세포도, 신생 피부 섬유 아세포도 PDGFRα 양성이다. 양 세포에 대해 펩티드(1-34)는 이동 촉진 활성을 보여주었으나 PDGFRα 음성 세포인 케라틴 생성 세포에는 이동 촉진 활성을 나타내지 않았다. 펩티드(1-34)을 포함한 아미노산 서열이 이동 촉진 활성을 나타내는 세포에 대한 표지로서 PDGFRα이 유용할 것으로 예상된다.
FACS를 이용하여 마우스 피부 섬유 아세포에서의 PDGFRα의 발현 평가
신생 B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J 마우스를 EtOH 및 PBS로 완전히 세척했다. 피부를 근육으로부터 떼어내고 3mm폭의 작은 조각으로 잘랐다. 그 피부조각을 500unit/ml의 디스파아제 함유 5%FBS-DMEM에 옮기고 4℃에서 18시간 동안 인큐베이션했다. 진피를 표피로부터 박리하고 진피를 가위로 작은 조각으로 잘랐다. 0.2% 콜라게나아제 함유 DMEM 내에 진피의 작은 조각들을 넣고 37℃, 30분 진탕하였다. 30%FBS 함유 DMEM을 가한 후 세포를 원심기로 160×G, 5분간 원심분리하였다. 침전된 세포를 10-cm접시에 플레이팅하고 5% CO2, 37℃에서 배양하되 3일마다 배지를 교환하고 80~90%세포밀도가 될 때까지 계대배양을 했다. 세포를 트립신을 이용하여 접시에서 회수하고 10%FBS 함유 D-MEM을 가한 후 세포를 원심하여 회수했다. 세포의 GFP형광을 BD FACSCantTMII로 검출하고 해석을 실시했다.
결과
신생 마우스 피부 섬유 아세포의 98%이상이 PDGFRα 양성이었다(도 14).
고찰
FACS로 PDGFRα 양성 세포의 수를 정량화했다. 면역 조직 화학(immunohistochemistry)의 결과와 마찬가지로 섬유 아세포의 대부분이 PDGFRα 양성 세포임을 보였다.
방법
C57Bl6 마우스(8주령, 암컷)의 꼬리 정맥에 10μg의 합성 펩티드(1 내지 44번의 아미노산)을 200μL의 PBS에 용해하여 30게이지 바늘 달린 주사기를 이용하여 투여했다. 음성 대조군으로 같은 부피의 PBS를 투여했다. 12시간 후 이소플루레인에 의한 전신 마취 하에서 좌심실에서 말초 혈액을 채혈했다. 3ml의 PBS(Nacalai tesque, Cat.14249-95)를 가한 후, Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare, Cat.17-1440-02)3ml을 혈액 위에 두었다. 원심기를 이용하여 400G, 25℃에서 45분간 원심을 했다. 상층의 혈청을 버리고 중간층의 하얀 밴드로 보이는 세포만을 회수했다. 수거한 세포에 PBS 45ml를 가하고, 원심기를 이용하여 800G, 25℃에서 20분간 원심을 했다. 상청액을 버리고 PBS 10ml를 가하고 원심기로 1500rpm, 25℃에서 10분간 원심을 했다. 상청액을 버리고, HLB(hemolysis buffer, 용혈용 완충 용액) (면역 생물 연구소 사제) 1ml를 세포에 넣었다. 피펫팅 후 세포를 5분간 정치하였다. 다음으로 10ml의 PBS를 세포에 가하고 1500rpm, 25℃에서 10분간 원심을 했다. 침전된 단핵 세포를 회수하고 둥근바닥 96 웰 판에 1×106세포/100μL(2%FBS 함유 PBS)로 조정했다. PE-mouse CD140a(PDGFRα) (BD Bioscience, Cat.12-1401-81)혹은 FITC-mouse CD44(BD Bioscience, Cat.553-133)을 각각 단핵 세포를 함유하는 웰에 1μL씩 가하였다. 그 세포를 차광하여 20분간 4℃에서 인큐베이션했다. 각 웰에 PBS를 200μL씩 가하고 1500rpm, 4℃에서 10분간 원심을 했다. 상청액을 버리고 각 웰에 PBS를 200μL씩 가하고 1500rpm, 4℃에서 10분간 원심을 했다. PBS 100μL에 세포를 현탁하고 1% 파라포름알데하이드 300μL을 가하였다. 또한 이소타입 대조군용 항체를 이용하여 상술한 바와 마찬가지로 대조군을 제작했다. 상기한 바와 같이 제조한 세포를 FACSCant TM II를 이용하여 해석하였다.
결과
음성 대조군(PBS 투여군)에서는 말초 혈액의 PDGFRα 양성, CD44 양성 세포의 비율은 평균 1.33%인 데 반해 펩티드(1-44) 투여군에서는 그 비율이 평균 4.33%로 늘어났다(도 15).
고찰
HMGB1의 1 내지 44번의 아미노산까지의 펩티드를 합성하고 마우스에 투여했는데, 12시간 후에 PDGFRα 양성, CD44 양성의 세포가 증가했다. 실시예 8에서 상기 펩티드는 PDGFRα 양성, CD44 양성 골수 중간엽 줄기세포에 대해 in vitro 이동 촉진 활성을 나타냈다. 본 실시예에서는 in vivo에서도 상기 펩티드가 말초 혈중에 PDGFRα 양성, CD44양성의 세포를 동원하는 것을 보여준다. PDGFRα 양성과 CD44 양성은 둘 다 골수 중간엽 줄기세포 표지이다. 골수 중간엽 줄기세포는 재생 의료에 유용한 것으로 알려져 있으므로, 본 펩티드의 정맥 내 투여가 손상 조직의 치료에 유효할 것이 기대된다.
중대뇌 동맥 색전실 모델의 제작
8-10주령 수컷 Wister 래트를 사용했다. 체온 모니터부를 갖춘 보온 매트상에서 보온하면서 래트에 이소플루레인으로 흡입 마취를 시행했다. 충분한 마취 효과를 확인한 후 경부의 털을 제거하여 피부를 노출시켰다. 수술 부위를 알코올로 소독했다. 경부 정중선상의 피부를 외과용 메스로 절개했다. 오른쪽 외경 동맥을 결찰하고 오른쪽 총경동맥에 긴장을 더해 일시적으로 혈류를 멈춘 뒤 실리콘 코팅한 끝을 갖는 4호 모노필라멘트 나일론제 색전 실을 오른쪽 외경 동맥에서 오른쪽 내 경동맥을 향해 삽입했다. 총경동맥의 긴장을 늦추는 동안 색전 실을 내 경동맥에서 중대뇌 동맥 분기부까지 혈류를 따라 진행시켜 혈류를 차단했다. 게다가 오른쪽 총경동맥에 걸쳐 있는 실을 결찰하다 피를 50분간 완전히 차단했다. 색전 실을 발거하고 총 경동맥의 실을 늦춘 뒤 피부를 봉합하여 수술을 종료했다.
치료제의 투여
합성 펩티드(1-44) 50μg을 꼬리 정맥에 투여했다. 첫회 투여는 뇌 경색 제작 후 6시간으로, 이후 24시간 간격으로 총 5회(합계 5일) 투여했다.
뇌 경색 크기 참조
최종 약제 투여에서 14일 후에 충분히 깊은 마취를 래트에게 가하고 이산화 탄소를 채운 용기 내에 두어서 심장 박동 및 호흡의 정지된 것을 확인했다. 뇌를 꺼내 신속하게 완충 10% 포르말린에 침지하여 고정했다. 파라핀 포매 후 절편을 박절하고 헤마톡실린-에오신 염색을 했다. 4개의 절편을 브레그마로부터 전방 1.92mm(1.92), 0.60mm(0.60) 및 후방 1.56mm(-1.56), 3.24mm(-3.24)에서의 각각의 뇌로부터 제작하고 그 면적을 비교했다.
결과
합성 펩티드(1-44)을 투여한 군(N=10) 중 피질까지 경색이 확장된 마우스는 1 마리만이었고 나머지 9마리는 기정핵에 머물러 있었다(도 16 A1(브레그마로부터 전방 1.92mm), B1(브레그마로부터 전방 0.60mm), C1(브레그마로부터 후방 1.56mm), 및 D1(브레그마로부터 후방 3.24mm)). 한편 음성 대조군(N=11)중 8마리에서 기정핵에서 피질에 걸쳐 경색이 확장되었다(도 16 A2(브레그마로부터 전방 1.92mm), B2(브레그마로부터 전방 0.60mm), C2(브레그마로부터 후방 1.56mm), D2(브레그마로부터 후방 3.24mm). 또 제작한 4개의 절편 각각에 대해 우뇌의 뇌 경색 부분의 면적을 측정하여 우뇌 정상 뇌 면적에 대한 %비를 정하였다. 모든 절편에서 합성 펩티드 투여군의 경색 면적이 음성 대조군에 비해 상당히 축소되어 있었다(도 17).
고찰
최근 뇌 경색 환자에 있어서 자신의 골수 중간엽 줄기세포를 정맥 내 투여함으로써 치료 예후가 개선된다고 보고되고 있다. 골수 내의 세포에 의한 뇌 경색에 대한 치료 효과가 밝혀지고 있다. 또 설치류 실험에 따라 골수 중간엽 줄기세포는 골아 세포, 연골 세포, 지방 세포 등으로 분화하는 것이 알려졌지만, 상피 세포, 신경 세포 등 다양한 세포로 분화하는 것이 추가적으로 밝혀지고 있다. 더욱이 골수 세포는 각종 성장 인자나 세포 생장 인자를 분비하므로 경색부로 이동한 골수 세포가 분비하는 물질에 의해 신경 보호 효과도 기대할 수 있다.
래트의 경우 뇌 경색 크기는 허혈의 48시간 후까지 경색 크기의 80% 내지 90%가 거의 확립되고 그 후 7일에 걸쳐 서서히 확장되는 것으로 알려져 있다. 또 일단 허혈이 일어나면 치료의 유무에 관계 없이 필연적으로 괴사를 초래하는 “코어”로 불리는 부분과 치료에 의해 괴사를 피할 가능성이 있는 피넘브러라 불리는 부분의 존재가 알려져 있다. 따라서 뇌 경색의 치료는 경색이 확장되기 이전에 피넘브라의 괴사를 예방하는 것이 목표이다.
대뇌는 주로 기정핵, 대뇌 피질로 나누어 진다. 특히 기정핵은 대뇌 피질에 비해 저산소에 약하기 때문에 뇌 경색에 의해 더 손상을 받기 쉽다. 본 실시예의 결과에서도 합성 펩티드(1-44)에 의한 경색의 축소가 주로 피질에서 보이지만 기정핵은 괴사를 일으키고 있는 것이 대부분이었다. 대뇌 피질은 감각, 운동의 중추이며, 이들 기능을 개선하는 것은 뇌 경색 치료 후 사회 복귀에 매우 중요하다, 뇌 경색의 유효한 치료약이 적은 상황에서 본 발명의 펩티드에 대한 의약품으로서의 수요는 높다고 예상된다.
본 실시예의 실험에서는 뇌 경색 제작 6시간 후에 펩티드의 투여를 하고 19일 후에 뇌 경색의 크기 축소 효과를 보았다. 치료 효과는 골수 세포에 의한 신경 보호 작용, 세포의 신경 조직으로의 분화에 의한 조직 재생에 의하는 것으로 추정된다. HMGB1의 일부로 이루어진 펩티드는 손상 부위나 그 근방에 투여된 경우 뿐 아니라 손상 부위와 원위이고 상이한 위치의 정맥에 투여된 경우라도 손상 부위에 세포를 동원할 수 있는 것이 강하게 시사되었다. 한편 실시예 4, 5, 및 6에서 기술된 펩티드는 이동 촉진 활성이 약하기 때문에 활성이 검출되지 않은 것으로 보이는 일부의 펩티드를 포함한다. 이들 펩티드의 일부는 본 분석 방법의 검출 한계 이하의 활성인 것으로 생각된다. 펩티드를 용해하는 용매, 이동 촉진 활성 측정 시간, 및 챔버의 상층에 위치하는 세포 수를 최적화함으로써 활성이 검출될 가능성이 있다. 현재 뇌 경색의 치료에 약학적으로 사용되는 tPA의 경우, 경색 후 출혈 등의 부작용을 막기 위해 뇌 경색 발병 후 4시간 이내에 투여해야 하거나, 화상 진단의 판정을 해야 하는 등의 투여 기준이 엄격하게 규정되어 있다. 뇌 경색은 돌발적으로 발병하기 때문에 미리 발병을 예측하는 것은 어렵다. 이러한 이유로 뇌 경색이 발병한 사람들의 대부분은 의료 기관에서 진찰할 때쯤이면 시간의 한계가 만료된 후라서 tPA가 더 이상 적절하지 않는 경우가 많다. 반면, 본 실시예에서는 뇌 경색 작성 6시간 후의 펩티드 투여로 치료 효과를 얻었다. 본 펩티드에는 항 응고 활성은 없다고 생각할 수 있으므로 6시간 이후의 투여도 가능하다. 따라서 뇌 경색이 발병한 많은 사람에게 활용될 것으로 기대된다. 한편 본 실시예에서는 펩티드가 래트(약 250g/개체)에 대해 50μg/개체/투여로 투여되고 있는데, 이는 체중 1킬로그램 당 200μg에 상당한다. 뇌 경색이 발병한 환자에게 경정맥적으로 투여하는 양으로서는 적절한 양으로 생각된다.
HMGB1단편의 발현 벡터 제작, 단백질과 펩티드의 발현, 및 골수 중간엽 줄기세포의 이동 분석 방법
인간 HMGB1의 N-말단 측의 메티오닌(M)을 삭제하고 대신 MKHHHHHHENLYFQ(서열번호:11)을 부가했다. HHHHHH(서열번호:12)는 발현한 단백질 또는 펩티드를 니켈 컬럼을 이용하여 정제하기 위한 태그(6x His tag)이며, ENLYFQG(서열번호:13)는 TEV protease가 인식하는 서열이다(도 18A). 또 T7 promoter 및 lac operator의 하류에 목적하는 단백질 또는 펩티드(2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 2-170, 93-215, 또는 85-169)를 코딩하는 cDNA를 삽입하고 약물 내성 유전자는 카나마이신 내성 유전자를, 복제 개시점으로 pBR322 ori 및 f1 ori를 사용한 벡터를 구축했다. 본 발현 벡터를 이용하여 제작한 단백질 또는 펩티드를 TEV protease로 제거하면 2번의 아미노산부터 시작되는 인간 HMGB1의 단백질 또는 펩티드를 제작할 수 있다. 제작한 플라스미드를 이용하여 BL-21(DE3)을 형질 전환했다. 카나마이신 함유 LB배지 중, 37℃에서 상기 균체를 하룻밤 진탕 배양하고 균체 현탁액 5ml을 100ml의 LB배지에 옮기고, 37℃, 140 rpm에서 진탕 배양했다. 탁도계로 탁도를 측정하고, OD 0.5~0.7이 되면 최종 농도 1mM이 되도록 Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)을 가했다. 2-215, 2-84, 2-70, 2-81, 2-170, 93-215, 및 85-169는 37℃에서 5시간, 2-44, 45-84, 및 2-62는 15℃에서 하룻밤 진탕 배양 후 집균했다. 발현한 단백질, 펩티드는 SDS-PAGE를 한 뒤 단백 염색하고 태그에 대한 항체 혹은 항 HMGB1 항체에 의한 웨스턴 블롯으로 평가하였다.
각 HMGB1단편(2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 2-170, 및 93-215)의 정제
집균한 균체 세포에 평형 버퍼(PBS(137mM NaCl, 8.1mM Na2HPO4, 2.68mM KCl, 1.47mM KH2PO4), 10mM imidazole; pH7.4) 3ml를 가하였다. 균체 세포를 초음파 파쇄하고 4℃, 15,000 rpm으로 10분간의 원심 분리를 실시하여 상청액을 회수했다. 마이크로 바이오-스핀 컬럼(Bio-Rad사제)에 His-Pur(상표) Ni-NTA Resin(Thermo Scientific사제)를 1ml를 로딩하고 평형 버퍼로 평형화했다. 단백질 용액을 컬럼에 로딩하고 2000rpm에서 2분간 원심 후, 세척 버퍼(PBS, 25mM imidazole; pH 7.4)로 수지를 세척했다. 컬럼을 용출 버퍼(PBS, 250mM 또는 500mM imidazole)로 단계적으로 용출하고 각 분획을 SDS-PAGE(15% e-PAGEL(등록 상표) (ATTO)하여 용출 단백질을 확인했다. 니켈 컬럼에 의한 친화성 정제 후, 2-215는 Q sepharose(상표) Fast Flow(GE healthcare사제)을, 93-215는 Q sepharose(상표) Fast Flow(GE healthcare사제) 및 SP sepharose(상표) Fast Flow(GE healthcare사제)을, 나머지 펩티드는 SP sepharose(상표) Fast Flow(GE healthcare사제)를 이용하여 이온 교환 크로마토그래피를 실시했다.
인간 HMGB1단편(2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 및 2-170)
마이크로 바이오-스핀 컬럼(Bio-Rad사제)에 각각 세파로즈(sepharose)를 1ml씩 충전하고 PBS로 평형화를 실시했다. 친화성 정제한 단백질 용액을 충전 후, 컬럼을 PBS로 세척했다. 용출 버퍼(20mM HEPES, 1 M NaCl; pH 7.5)로 용출하고 각 분획을 SDS-PAGE로 검사했다.
인간 HMGB1단편(93-215)
친화성 정제한 단백질 용액을 Q 및 SP의 sepharose를 이용하여 각각 음이온 및 양이온 교환했다. 다음으로 SP sepharose(상표) Fast Flow으로부터의 통과 분획을 Q sepharose(상표) Fast Flow에 충전하여 음이온 교환을 수행했다. 각 분획을 SDS-PAGE로 검사했다.
인간 HMGB1단편(85-169)
집균한 균체에 각 0.1g당 1ml의 버퍼(PBS, 10mM imidazole; pH7.4)를 가하여 초음파 파쇄하고 4℃, 20,000 rpm으로 1시간 원심 분리하였다. 상청액을 회수하고 BioLogic DuoFlow(Bio-Rad사제)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 우선 Buffer A로서 균체 파쇄 버퍼(PBS, 10mM imidazole(pH7.4))를, Buffer B로서 500mM imidazole 함유 PBS (pH 7.4)을 이용하여 HisTrap(상표)FF 5ml(GE healthcare사제)로 친화성 정제했다. 컬럼을 Buffer A로 평형화 후, 단백질 용액을 충전하여 하기 프로그램에 따라 세척 및 정제했다. 프로그램은 이하 대로로 했다:
Isocratic Flow(Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 20ml)→ Linear Gradient(Buffer A:97%→ 0%, Buffer B:3%→ 100%, 20ml)→ Isocratic Flow(Buffer B:100%, 20ml)→ Fraction Collection(20~40ml를 2ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE로 조사했다.
다음으로 이온 교환 정제했는데 칼럼으로는 85-169는 HiTrap(상표)SP HP 5ml(GE health care사제)을 이용하고 Buffer A에는 PBS(pH 7.4), Buffer B에는 20mM HEPES, 1 M NaCl(pH 7.5)의 버퍼를 사용하였다. 컬럼을 적당량의 Buffer A로 평형화 후, 친화성 정제한 단백질 용액을 충전해 하기 프로그램으로 세척 및 정제했다. 프로그램은 이하 대로 했다:
Isocratic Flow(Buffer A:100%, Buffer B:0%, 10ml)→ Isocratic Flow(Buffer A:50%, Buffer B:50%, 2ml)→ Isocratic Flow(Buffer A:0%, Buffer B:100%, 20ml)→ Fraction Collection(10~32ml을 1ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE로 조사했다.
농도 측정
각 단편의 농도 측정은 브래드포드법(Bio-Rad Protein Assay)을 이용한 BSA환산으로 실시했다.
Migration Assay
골수 중간엽 줄기세포주 MSC-1에 대해 상기의 각 펩티드의 이동 촉진 활성을 확인했다. 500mM NaCl 함유 인산 버퍼내의 각각 단편을 최종 농도 2μM가 되도록 2배의 DMEM으로 희석하고 챔버의 하층에 가하고, 상층에는 10%FBS 함유 DMEM에 현탁된 MSC-1을 두었다. 두 층 사이에는 8μm의 세공을 가지는 폴리카보네이트막을 끼웠다. 37℃, 5% CO2하 인큐베이터에서 4시간 인큐베이션한 뒤 디프-퀵 염색(Diff-Quik stain(상표))를 사용하여 상층으로부터 하층으로 이동한 세포를 검출했다.
결과
2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 2-170, 및 93-215 전부가 골수 중간엽 줄기세포에 대한 이동 촉진 활성을 보였다(도 18b). 2-215의 이동 촉진 활성을 1로 했을 경우 몰 농도당 2-84는 2.37배, 2-44는 1.82배, 45-84는 2.04배의 활성이었고 동질량으로 환산하면 각각 5.5배, 7.1배, 및 8.1배였다(도 18c, d).
고찰
대장균에서 제작한 인간 HMGB1(2-215)의 N말단 쪽을 단편화하는 것으로 이동 촉진 활성이 결과적으로 증강되었다. 게다가 N말단 측에는 적어도 2-44 및 45-84의 2군데에 이동 촉진 활성이 인정되었다. 이는 진핵 생물 세포의 배양(HEK293세포)에서 제작한 HMGB1단편의 결과와 일치하였다. 단편화로 인해 MSC-1상의 수용체에 대해 에피토프가 노출되고 그에 따라 수용체에 결합하기 쉽게 되는 것으로 추정된다. 단백질에 따라서는 단편화에 의해 활성을 잃을 것이 있지만, 본 단백질에서는 단편화에 의해 오히려 활성이 증강하고 있다. HEK293등의 진핵 세포에서 발현되는 단백질은 당쇄 부가 등 번역 후 수식하는 것이 알려져 있다. 그러한 수식이 있으면 수용체 리간드의 활성에 영향을 줄 수도 있다. 따라서 진핵 세포와 똑같은 번역 후 수식이 안 되는 대장균에서 제작한 단백질뿐만이 아니라 대장균에서 생산한 단편에서도 활성을 유지하고 있다는 것은 이들의 단편에 대한 번역 후 수식이 그 단편의 활성을 위해 필수가 아닌 것을 시사하고 있다. 이상로부터 HMGB1의 단편화를 통해 고활성을 갖는 골수 중간엽 줄기세포 동원 약을 개발할 수 있다. 또한 번역 후 수식이 필수가 아니므로 대장균이나 화학 합성을 이용한 생산 방식이 가능하게 되어, 보다 저렴하고 안정된 품질의 제제를 제작할 수 있다. 또, 본 실시예에 기재된 펩티드와 그 밖의 실시예에 기재된 펩티드의 비교(예를 들면 1-44와 2-44비교, 혹은 1-84와 2-84비교)에서 HMGB1 단백질의 첫번째 메티오닌의 유무는 이동 촉진 활성에 영향을 주지 않는 것이 판명되었다. 따라서 어느 펩티드가 이동 촉진 활성을 가지는 경우, 그 펩티드로부터 첫번째 메티오닌을 제거한 펩티드도 또한 이동 촉진 활성을 갖는다고 생각한다. 또는 첫번째 메티오닌이 제거된 펩티드가 이동 촉진 활성을 가지는 경우, 펩티드에 첫번째 메티오닌을 부가한 펩티드도 역시 이동활성을 갖는다고 생각한다.
방법
인간 HMGB1의 N말단 측의 메티오닌(M)을 삭제하고 대신 MKHHHHHHENLYFQ(서열번호:11)을 N말단에 부가했다. HHHHHH(서열번호:12)는 발현한 단백질 또는 펩티드를 니켈 컬럼을 이용하여 정제를 하기 위한 태그(6xHis tag)이며, ENLYFQG(서열번호:13)는 TEV protease가 인식하는 서열이다(도 18A). 또 T7 promoter 및 lac operator의 하류에 목적하는 단백질 또는 펩티드(89-215, 89-205, 89-195, 및 89-185)을 코딩하는 cDNA를 삽입하고 약물 내성 유전자는 카나마이신 내성 유전자를, 복제 개시점은 pBR322 ori 및 f1 ori인 벡터를 구축했다. 상기 발현 벡터를 이용하여 수득한 단백질 또는 펩티드를 TEV protease로 제거하면 2번의 아미노산부터 시작되는 인간 HMGB1의 단백질 또는 펩티드를 제작할 수 있다.
제작한 플라스미드를 이용하여 BL-21(DE3)을 형질 전환했다. 카나마이신 함유 LB배지 중, 37℃에서 상기 균체를 하룻밤 진탕 배양하고 균체 현탁액 5ml을 100ml의 LB배지에 옮기고, 37℃, 140 rpm에서 진탕 배양했다. 탁도계로 탁도를 측정하고, OD 0.5~0.7이 되면 최종 농도 1mM이 되도록 Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)을 가했다. 인간 HMGB1단편 (89-215, 89-205, 89-195, 및 89-185)는 15℃에서 하룻밤 진탕 배양 후 집균했다. 발현한 단백질, 펩티드는 SDS-PAGE를 한 뒤 단백 염색하고 태그에 대한 항체 혹은 항 HMGB1항체에 의한 웨스턴 블롯으로 조사하였다.
각 HMGB1단편(89-215, 89-205, 89-195, 및 89-185)의 정제
집균한 균체 각 0.1g당 1ml의 버퍼(PBS, 10mM imidazole; pH7.4)를 가하여 초음파 파쇄하고 4℃, 20,000 rpm으로 1시간 원심 분리하였다. 상청액을 회수하고 BioLogic DuoFlow(Bio-Rad사제)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제했다.
인간 HMGB1단편(89-215)
집균한 균체 각 0.1g당 1ml의 버퍼(PBS, 10mM imidazole; pH7.4)를 가하여 초음파 파쇄하고 4℃, 20,000 rpm으로 1시간 원심 분리하였다. 상청액을 회수하고 BioLogic DuoFlow(Bio-Rad사제)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 우선 Buffer A로서 균체 파쇄 버퍼(PBS, 10mM imidazole(pH7.4))를, Buffer B로서 500mM imidazole 함유 PBS (pH 7.4)을 이용하여 HisTrap(상표)FF 5ml(GE healthcare사제)로 친화성 정제했다. 컬럼을 Buffer A로 평형화 후, 단백질 용액을 충전하여 하기 프로그램에 따라 세척 및 정제했다. 프로그램은 이하 대로로 했다:
Isocratic Flow(Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 20ml)→ Linear Gradient(Buffer A:97%→ 0%, Buffer B:3%→ 100%, 20ml)→ Isocratic Flow(Buffer B:100%, 20ml)→ Fraction Collection(20~40ml를 2ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE로 조사했다.
다음으로 이온 교환 정제했는데 칼럼으로는 89-215에 대해 HiTrap(상표)SP HP 5ml(GE health care사제)을 이용하고 Buffer A에는 PBS(pH 7.4), Buffer B에는 20mM HEPES, 1 M NaCl(pH 7.5)의 버퍼를 사용하였다. 컬럼을 적당량의 Buffer A로 평형화 후, 친화성 정제한 단백질 용액을 충전해 하기 프로그램에 따라 세척 및 정제했다. 프로그램은 이하대로 했다:
Isocratic Flow(Buffer A:100%, Buffer B:0%, 10ml)→ Isocratic Flow(Buffer A:50%, Buffer B:50%, 2ml)→ Isocratic Flow(Buffer A:0%, Buffer B:100%, 20ml)→ Fraction Collection(10~32ml을 1ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE로 조사했다.
인간 HMGB1단편(89-205, 89-195, 및 89-185)
가용성 단백질 용액의 조제는 인간 HMGB1단편(89-215)와 동일하게 실시하였고 이후 각각의 컬럼 크로마토그래피는 다음과 같이 농도구배 용리를 했다.
우선 HisTrap(상표)FF 5ml, Buffer A(PBS, 10mM imidazole(pH7.4)), 및 Buffer B(PBS, 500mM imidazole(pH 7.4)을 이용하여 친화성 정제했다. 컬럼을 Buffer A로 평형화 후, 단백질 용액을 충전해 하기 프로그램으로 세척 및 정제했다. 프로그램은 이하 대로 했다:
→ Isocratic Flow(Buffer A:97%, Buffer B:3%, 50ml)→ Linear Gradient(Buffer A:97%→ 0%, Buffer B:3%→ 100%, 120ml)→ Fraction Collection(50~170ml를 5ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE로 조사했다.
다음으로 이온 교환 정제했다. 칼럼에는 인간 HMGB1단편(89-215) 및 (89-205)는 HiTrap(상표)Q HP 5ml을 이용하고 나머지 단편은 HiTrap(상표)SP HP 5ml을 이용하였다. Buffer A로는 PBS(pH 7.4), Buffer B로는 7x PBS(pH 7.4)을 사용하였다. 컬럼을 적당량의 Buffer A로 평형화 후, 친화성 정제한 단백질 용액을 충전해 하기 프로그램에 따라 세척 및 정제했다. 프로그램은 이하 대로 했다:
Isocratic Flow(Buffer A:100%, Buffer B:0%, 50ml)→ Linear Gradient(Buffer A:100%→ 0%, Buffer B:0%→ 100%, 50ml)→ Isocratic Flow(Buffer A:0%, Buffer B:100%, 5ml)→ Fraction Collection(50~105ml을 3ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE로 조사했다.
농도 측정
각 단편의 농도 측정은 브래드포드법(Bio-Rad Protein Assay)을 이용한 BSA환산으로 실시했다.
Migration Assay
골수 중간엽 줄기세포주 MSC-1에 대해 상기 각 펩티드의 이동 촉진 활성을 확인했다. 500mM NaCl 함유 인산 버퍼내의 각각 단편을 최종 농도 2μM가 되도록 2배의 DMEM으로 희석하고 챔버의 하층에 가하고, 상층에는 10%FBS 함유 DMEM에 현탁된 MSC-1을 두었다. 두 층 사이에는 8μm의 세공을 가지는 폴리카보네이트막을 끼웠다. 37℃, 5% CO2하 인큐베이터에서 4시간 인큐베이션한 뒤 디프-퀵 염색(Diff-Quik stain(상표))를 사용하여 상층으로부터 하층으로 이동한 세포를 검출했다.
결과
인간 HMGB1단편(89-215)을 니켈 컬럼으로 친화성 정제한 후 이온 교환 크로마토그래피(Q컬럼)을 이용하여 염 농도를 서서히 올리는 것에 따라 농도구배 용리를 했다. 분획 6 및 7에서는 15.5kDa의 펩티드가, 분획 8 및 9에서는 15.5, 16, 17kDa의 펩티드가, 분획 10 및 11에서는 16, 17kDa의 펩티드가 분획수득되었다(도 19A).
분획 6과 7를 혼합한 샘플(6+7)과 분획 9및 10의 골수 중간엽 줄기세포(MSC-1)에 대한 이동 촉진 활성을 조사했는데 분획 6과 7를 혼합한 샘플(6+7)의 활성은 강하였지만 분획 9와 10의 활성은 약했다(도 19B).
인간 HMGB1단편(89-205)을 니켈 컬럼으로 친화성 정제 한 후 이온 교환 크로마토그래피(Q컬럼)을 이용하여 염 농도를 서서히 올리는 것에 따라 농도구배 용리를 했다. 분획 6에서 가장 짧은 단편(*4)부터 용출돼 분획 7에서는 다음으로 짧은 단편(*5), 다음으로 가장 긴 단편(*6)이 용출됐다. 한편 89-195 및 89-185는 니켈 컬럼을 이용한 친화성 정제에 따라 단일의 단편으로 정제할 수 있었다(도 19C).
분획 6, 7, 및 8의 골수 중간엽 줄기세포(MSC-1)에 대한 이동 촉진 활성을 조사했는데 분획 6은 강한 활성을 나타냈지만 분획 번호가 증가함에 따라 그 활성은 감소했다. 한편 89-195 및 89-185는 89-215 사이의 어느 단편보다 강한 활성을 보여주었다(도 19D).
고찰
인간 HMGBN1단편(89-215,89-205,89-195, 및 89-185)을 대장균을 이용하여 제작했다. 89-215, 및89-205의 골수 중간엽 줄기세포 이동 촉진 활성은 미미했지만 대장균에서 유래된 프로테아제로 인한 것으로 보이는 절단(도 19A, C)을 겪은 후의 짧은 단편은 강항 활성을 보여주었다(도 19B, D). 한편 89-195 및 89-185는 골수 중간엽 줄기세포에 대해 강한 이동 촉진 활성을 보여주었다(도 19C, D). HMGB1의 C말단 186~215번의 아미노산에는 글루타민과 아스파르트산의 반복 서열이 존재한다. 이들의 서열은 단백질의 안정화에 기여한다고 한다. 본 연구에 의해 처음 이 부분이 HMGB1단편(89-215)의 이동 촉진 활성을 억제하고 있으며 이 서열을 제거함으로써 HMGB1단편(89-215)의 이동 촉진 활성을 증강할 수 있다고 밝혔다. 또한 HMGB1의 C말단에 존재하는 글루탐산/아스파르트산의 반복 서열(186 내지 215번의 아미노산 서열)은 “산성꼬리(acidic-tail)”로 불리는데 RAGE의 결합에 필수적이라고 보고되어 있다. 한편, RAGE는 수지상 세포 등이 HMGB1이 개재되어 이동할 때의 수용체이므로 이동 촉진 활성을 발휘하려면 C말단 및 RAGE 리간드 부분이 필수적이라고 예상됐지만 실제로는 놀랍게도 골수 중간엽 줄기세포에 대한 이동 촉진의 활성에는 C말단이 없는 것이 유리한 것으로 나타났다. 이것은 대장균에서 C말단을 함유하는 HMGB1단편을 제작했을 때 대장균 유래의 프로테아제(단백질 분해 효소)에 의하여 분해되었다고 생각되는 분해 산물이, 분해되지 않은 HMGB1단편보다 강한 이동촉진활성을 발휘하고 C말단을 결여한 HMGB1단편을 제작한 결과 C말단을 가지는 HMGB1단편보다 강한 활성을 발휘했던 것에서 처음으로 밝혀졌다. 통상은 단백질의 특정 활성에 기여하는 부위는 1곳이지만, 놀랍게도 HMGB1의 골수 중간엽 줄기세포에 대한 이동 촉진 활성에 기여하는 부분은 여러 부위이다. 더 놀랍게도 각각의 부위의 활성은 같은 분자 수 당 전장 HMGB1의 약 2배의 활성을 가지고 있었다. 또, 일반적으로 생리 활성을 갖는 펩티드는 길이가 짧아질수록 불안정화하고 활성이 낮아지는데 놀랍게도 짧은 단편이 긴 단편 이상의 강한 활성을 갖는 것이 존재했다.
방법
인간 HMGB1의 N말단 측의 메티오닌(M)을 삭제하고 대신 MKHHHHHHENLYFQ(서열번호:11)을 N말단에 부가했다. HHHHHH(서열번호:12)는 발현한 단백질 또는 펩티드를 니켈 컬럼을 이용하여 정제를 하기 위한 태그(6xHis tag)이며, ENLYFQG(서열번호:13)는 TEV protease가 인식하는 서열이다(도 18A). 또 T7 promoter 및 lac operator의 하류에 목적하는 단백질 또는 펩티드(85-169, 2-215)을 코딩하는 cDNA를 삽입하고 약물 내성 유전자는 카나마이신 내성 유전자를, 복제 개시점은 pBR322 ori 및 f1 ori인 벡터를 구축했다. 상기 발현 벡터를 이용하여 수득한 단백질 또는 펩티드를 TEV protease로 제거하면 2번의 아미노산부터 시작되는 인간 HMGB1의 단백질 또는 펩티드를 제작할 수 있다.
제작한 플라스미드를 이용하여 BL-21(DE3)을 형질 전환했다. 카나마이신 함유 LB배지 중, 37℃에서 상기 균체를 하룻밤 진탕 배양하고 균체 현탁액 5ml을 100ml의 LB배지에 옮기고, 37℃, 140 rpm에서 진탕 배양했다. 탁도계로 탁도를 측정하고, OD 0.5~0.7이 되면 최종 농도 1mM이 되도록 Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)을 가했다. 인간 HMGB1단편 (85-169)는 15℃에서 하룻밤 진탕 배양 후 집균했다. 발현한 단백질, 펩티드는 SDS-PAGE를 한 뒤 단백 염색하고 태그에 대한 항체 혹은 항 HMGB1항체에 의한 웨스턴 블롯으로 조사하였다.
집균한 균체 각 0.1g당 1ml의 버퍼(PBS, 10mM imidazole; pH7.4)를 가하여 초음파 파쇄하고 4℃, 20,000 rpm으로 1시간 원심 분리하였다. 상청액을 회수하고 BioLogic DuoFlow(Bio-Rad사제)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 우선 Buffer A로서 균체 파쇄 버퍼(PBS, 10mM imidazole(pH7.4))를, Buffer B로서 500mM imidazole 함유 PBS (pH 7.4)을 이용하여 HisTrap(상표)FF 5ml(GE healthcare사제)로 친화성 정제했다. 컬럼을 Buffer A로 평형화 후, 단백질 용액을 충전하여 하기 프로그램에 따라 세척 및 정제했다. 프로그램은 이하 대로 했다:
Isocratic Flow(Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 20ml)→ Linear Gradient(Buffer A:97%→ 0%, Buffer B:3%→ 100%, 20ml)→ Isocratic Flow(Buffer B:100%, 20ml)→ Fraction Collection(20~40ml를 2ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE로 조사했다.
농도 측정
각 재조합 단백질의 농도 측정은 브래드포드법(Bio-Rad Protein Assay)을 이용한 BSA환산으로 실시했다.
Migration Assay
골수 중간엽 줄기세포주 MSC-1에 대해 상기의 각 펩티드의 이동 촉진 활성을 확인했다. 500mM NaCl 함유 인산 버퍼내의 각각 단편을 최종 농도 2μM가 되도록 2배의 DMEM으로 희석하고 챔버의 하층에 가하고, 상층에는 10%FBS 함유 DMEM에 현탁된 MSC-1을 두었다. 두 층 사이에는 8μm의 세공을 가지는 폴리카보네이트막을 끼웠다. 37℃, 5% CO2하 인큐베이터에서 4시간 인큐베이션한 뒤 디프-퀵 염색(Diff-Quik stain(상표))를 사용하여 상층으로부터 하층으로 이동한 세포를 검출했다.
결과
인간 HMGB1단편(85-169)는 인간 HMGB1단편(2-215)보다 골수 중간엽 줄기세포에 대해 강한 이동 촉진 활성을 나타냈다(도 20A). 이동 촉진 활성을 1로 했을 경우 몰 농도당 1.59배, 같은 질량으로 환산하면 각각 3.6배였다.(도 20B, C)
고찰
인간 HMGB1단편(85-169)도 (89-195)와 (89-185)와 마찬가지로 (2-215)보다 골수 중간엽 줄기세포에 대한 강한 이동활성을 보여주었다. 상기 발견으로부터 85~185번의 아미노산 서열 중에 골수 중간엽 줄기세포 동원 활성을 갖는 서열이 적어도 한군데 존재한다고 추정된다. 실시예 1에서는 HEK293에서 생산한 HMGB1단편 85-169이 이동 촉진 활성을 보여주지 않았다. 그러나 본 실시예에서는 대장균에서 생산한 HMGB1단편 85-169이 이동 촉진 활성을 나타내고 있다. 이 차이는 생산 방법의 차이에 따라 이동 촉진 활성이 매우 감쇠했는지 혹은 소실한 것으로 추측된다. HEK293 같은 진핵 생물과 대장균 같은 원핵 생물에서는 번역 후 수식(post-translational modification)이나 접힘(folding) 등에 차이가 있기 때문에 같은 단백질과 펩티드를 생산해도 성질이 다른 일이 종종 있다.
본 연구를 통해 HMGB1의 아미노산 서열 중에는 적어도 3개의 골수 중간엽 줄기세포 동원 활성 서열이 존재하고 이들 활성은 C말단의 글루탐산, 아스파르트산의 반복 서열에 의해 억제함으로써 제어되고 있는 것이 밝혀졌다. C말단 억제 서열을
제거한 HMGB1단편을 제작함으로써 골수 줄기세포 동원 작용을 갖는 매우 활성이 강한 제제를 만들 수 있게 된다.
마우스 중간엽 줄기세포 이동 촉진 활성 1
방법
HMGB1단편의 정제
KOD-Plus-ver.2(Toyobo사제)을 이용하여 inverse PCR을 실시했다. 상술한 인간 HMGB1의 2 내지 215번째까지의 아미노산을 포함한 HMGB1단편용 발현 벡터를 주형 플라스미드로 사용했다. 2 내지 205번의 아미노산, 2 내지 195번의 아미노산, 2 내지 185번의 아미노산 각각을 코딩하는 cDNA를 N말단 히스티딘 태그, TEV 프로테아제 인식 서열, 및 플라스미드 골격과 함께 PCR법으로 증폭했다. 이 PCR산물에서 제작되는 유전자 산물은 히스티딘 태그, TEV프로테아제 인식 서열, 및 인간 HMGB1단편이 탠덤으로 배열한 단백질이다. PCR산물에 제한 효소 DpnI(Toyobo사제)를 첨가함으로써 주형 플라스미드를 소화했다. 다음으로 T4 Polynucleotide kinase(NEB사제)을 이용하여 PCR산물을 인산화하고 ligase(2x Quick Ligase;NEB사 or Ligation Convenience kit;Nippongene사제)을 이용하여 self-ligation을 하였다. 이러한 산물을 대장균 JM109주에 형질 전환하고 카나마이신 선택을 통해 콜로니를 얻었다. GenElute Plasmid Miniprep kit(SIGMA-ALDRICH사제)을 이용하여 플라스미드를 추출하고 서열 분석에 의해 염기 서열을 확인 후, 대장균 BL21(DE3)에 그 플라스미드를 형질 전환해 콜로니를 얻었다.
발현 유도
각각의 콜로니를 최종 농도 50mg/l 카나마이신 함유 LB배지 중 37℃에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 균체 현탁액 5ml을 100ml의 LB배지에 옮기고, 37℃, 140 rpm에서 진탕 배양했다. 탁도계로 탁도를 측정하고, OD 0.5-0.7이 되었을 때 최종 농도 1mM이 되도록 Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 가하였다. 15℃에서 하룻밤 진탕 배양 후 집균했다.
재조합 단백질의 정제
집균한 균체에 평형 버퍼(PBS(137mM NaCl, 8.1mM Na2HPO4, 2.68mM KCl, 1.47mM KH2PO4), 10mM imidazole; pH7.4)를 12ml(25-50 mg/ml), Leupeptin hydrochloride를 마지막 농도 5μg/ml가 되도록 가하고 초음파 파쇄한 후 4℃, 15,000 rpm에서 60분간 원심 분리하였다. 상청액을 회수하고 그 일부에 대해 항 인간 HMGB1항체를 사용한 웨스턴 블롯팅 검사법을 적용하여 목적 단백의 발현을 확인했다. 나머지 상청액은 0.45-μm의 필터를 통해 살균했다. 목적 단백질은 BioLogic DuoFlow(Bio-Rad사제)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
우선 우선 HisTrap(상표)FF 5ml, Buffer A(PBS, 10mM imidazole(pH7.4)), 및 Buffer B(PBS, 500mM imidazole(pH 7.4)을 이용하여 친화성 정제했다. 컬럼을 Buffer A로 평형화 후, 단백질 용액을 충전해 하기 프로그램으로 세척 및 정제했다. 프로그램은 이하 대로 했다:
Isocratic Flow(Buffer A:97%, Buffer B:3%, 50ml)
Linear Gradient(Buffer A:97%→ 0%, Buffer B:3%→ 100%, 120ml)
Fraction Collection(50~170ml를 5ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE(e-PAGEL(등록 상표) 5-20%(ATTO))로 조사했다.
다음으로 이온 교환 정제했는데 칼럼으로는 GNX-E-022만 HiTrap(상표)Q HP 5ml을 이용하고 나머지는 HiTrap(상표)SP HP 5ml을 이용하였다. Buffer A로는 PBS(pH 7.4), Buffer B로는 7xPBS(pH 7.4)을 사용하였다. 컬럼을 적당량의 Buffer A에서 평형화 후, 친화성 정제한 단백질 용액을 충전해 하기 프로그램에 따라 세척 및 정제했다.
프로그램:
Isocratic Flow(Buffer A:100%, Buffer B:0%, 50ml, 4ml/min)
Linear Gradient(Buffer A:100%→ 0%, Buffer B:0%→ 100%, 50ml, 4ml/min)
Isocratic Flow(Buffer A:0%, Buffer B:100%, 5ml, 4ml/min)
Fraction Collection(50~105ml을 3ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE, 겔의 단백질 염색하여 정제 단백질을 확인했다.
농도 측정
재조합 단백질의 농도 측정은 브래드포드법(Bio-Rad Protein Assay)을 이용한 BSA환산으로 실시했다.
Migration Assay
골수 중간엽 줄기세포주 MSC-1에 대해 상기의 각 펩티드의 이동 촉진 활성을 확인했다. 500mM NaCl 함유 인산 버퍼내의 각각 단편을 최종 농도 2μM가 되도록 2배의 DMEM으로 희석하고 챔버의 하층에 가하고, 상층에는 10%FBS 함유 DMEM에 현탁된 MSC-1을 두었다. 두 층 사이에는 8μm의 세공을 가지는 폴리카보네이트막을 끼웠다. 37℃, 5% CO2하 인큐베이터에서 4시간 인큐베이션한 뒤 디프-퀵 염색(Diff-Quik stain(상표))를 사용하여 상층으로부터 하층으로 이동한 세포를 검출했다.
결과
2-215의 단편 및 2-205의 단편에 비해 2-195의 단편 및 2-185의 단편에서 강한 이동 촉진 활성이 나타났다(도 21a의 A).
고찰
186 내지 215번째까지의 단편은 총 30아미노산의 아스파르트산/글루타민산 반복 서열이며, “산성꼬리”로 불린다. 상기 데이터는 HMGB1의 골수 중간엽 줄기세포에 대한 이동 촉진 활성은 산성꼬리에 의해 강하게 억제되고 있으며 특히 C말단 측 20아미노산의 서열이 억제에 관여한 것을 시사한다. 상술한 데이터에 따르면 HMGB1의 골수 중간엽 줄기세포에 대한 이동 활성 작용의 활성 도메인은 복수 개소 동정되었다. 산성꼬리가 이러한 모든 활성 도메인을 억제하는지 규명하기 위해서는 더 상세한 실험이 필요하다.
인간 중간엽 줄기세포 이동 촉진 활성 2
방법
인간 HMGB1단편(2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 85-169, 89-185, 89-195, 및 89-205)에 대해서는 상기 실시예 14, 15, 및 16과 마찬가지로 대장균에서 생산하고 적절한 칼럼을 이용하여 정제했다. 다만, 89-215에 대해서는 실시예 15의 89-205와 같은 방법으로 정제했다.
농도 측정
각 단편의 농도 측정은 브래드포드법(Bio-Rad Protein Assay)을 이용한 BSA환산으로 실시했다.
Migration Assay
각 단편에 대해 상술한 마우스 유래 골수 중간엽 줄기세포(MSC-1)에 대한 이동 촉진 분석과 마찬가지로 사람 유래 골수 중간엽 줄기세포를 이용하여 조사했다. 상기 단편은 최종 농도 2μM에서 사용했다. 사용된 사람 유래 골수 중간엽 줄기세포는 4계대째 hMSC(human Mesenchymal Stem Cell, Takara사제)이었다. 증식용 배지는 중간엽 줄기세포 증식 배지(MF medium, TOYOBO사제)을 사용하고 세포를 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 배양했다. 2-4일마다 신선한 배지로 교체하여 80% 세포밀도에 도달 시점에서 계대를 실시했다.
결과
인간 HMGB1단편(2-215, 2-84, 2-44, 및 45-84)과 관련하여 실시예 14에서와 마찬가지로 인간 HMGB1단편(2-215)보다 HMGB1단편(2-84, 2-44, 및 45-84)이 더 강한 활성이었다. 인간 HMGB1단편(89-185, 89-195, 89-205, 및 89-215)에 대해서는 실시예 15와 마찬가지로 단축된 C말단 산성꼬리를 갖는 활성 인간 HMGB1단편(89-185 및 89-195)이 더 강한 활성을 나타냈다. 한편 인간 HMGB1단편(85-169)에 대해서는 실시예 16과 마찬가지로 인간 HMGB1단편(2-215)보다 강한 활성이 인정되었다(도 21a의 B).
고찰
사람 유래 골수 중간엽 줄기세포에서도 마우스 유래 골수 중간엽 줄기세포와 같은 이동 촉진 활성이 각각의 단편에서 보여졌다. 적어도 인간 HMGB1단편(2-44, 45-84, 및 85-169)에 인간 골수 중간엽 줄기세포에 대한 이동 촉진 활성을 가지는 독립적 도메인이 존재한다는 사실이 제시되었다. 이는 전형적으로 단백질의 특정 활성을 가지는 도메인은 오직 1곳이기 때문에, 복수의 활성 부위의 존재는 놀라운 결과였다. 또한 각 단편의 활성이 전장에 가까운 서열(2-215)의 활성보다 강한 것도 놀라운 것이었다. 한편 RAGE 결합부위는 150 내지 183번째까지의 아미노산 서열이지만 89 내지 169번의 아미노산 서열에도 활성이 있다는 것은 골수 중간엽 줄기세포에 대한 이동 촉진 활성은 RAGE를 필요로 하지 않을 가능성을 시사했다. 인간 HMGB1단편(89-185, 89-195, 89-205, 및 89-215)과 관련하여 마우스 유래의 세포의 경우와 마찬가지로 C말단 산성꼬리를 결여한 단편이 더 강한 활성을 보여주었다. 이것은 사람의 골수 중간엽 줄기세포의 이동 촉진에 있어서도, C말단은 이동 촉진 활성을 억제하며 C말단 산성꼬리를 짧게 하거나, 결여함으로써 보다 강한 활성의 HMGB1단편을 제작할 수 있게 된다고 생각된다.
인간 HMGB1의 단편 2-84에 인간 HMGB1의 Acidic tail의 단편 186-215, 186-205, 또는 186-195를 부가한 융합 단편의 변형된 이동 촉진 활성
방법
인간 HMGB1단편 2-84의 C말단에 인간 HMGB1의 단편 186-215, 186-205 또는 186-195가 부가되도록 융합 cDNA를 제작했다. 또한 상술한 바와 같이, 대장균에서 발현되는 단편이 인간 HMGB1의 N말단 측의 메티오닌(M)을 삭제하고 대신 MKHHHHHHENLYFQ(서열번호:11)을 N말단에 부가하도록 발현 벡터를 디자인했다. HHHHHH(서열번호:12)는 발현한 단백질 또는 펩티드를 니켈 컬럼을 이용하여 정제를 하기 위한 태그(6xHis tag)이며, ENLYFQG(서열번호:13)는 TEV protease가 인식하는 서열이다(도 18). 또 T7 promoter 및 lac operator의 하류에 목적하는 단백질 또는 펩티드(85-169, 2-215)을 코딩하는 cDNA를 삽입하고 약물 내성 유전자는 카나마이신 내성 유전자를, 복제 개시점은 pBR322 ori 및 f1 ori인 벡터를 구축했다. 상기 발현 벡터를 이용하여 수득한 단백질 또는 펩티드를 TEV protease로 제거하면 2번의 아미노산부터 시작되는 인간 HMGB1의 단백질 또는 펩티드를 제작할 수 있다.
상기 제작한 플라스미드로 BL-21(DE3)을 형질 전환했다. 카나마이신 함유 LB배지 중, 37℃에서 상기 균체를 하룻밤 진탕 배양하고 균체 현탁액 5ml을 100ml의 LB배지에 옮기고, 37℃, 140 rpm에서 진탕 배양했다. 탁도계로 탁도를 측정하고, OD 0.5~0.7이 되면 최종 농도 1mM이 되도록 Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)을 가했다. 15℃에서 하룻밤 진탕 배양 후 집균했다.
각각의 HMGB1단편(2-84+186-215, 2-84+186-205, 2-84+186-195)의 정제
집균한 균체 세포에 평형 버퍼(PBS(137mM NaCl, 8.1mM Na2HPO4, 2.68mM KCl, 1.47mM KH2PO4), 10mM imidazole; pH7.4)을 최종 농도 5μg/ml가 되도록 가하였다. 초음파 파쇄 후 4℃, 15,000 rpm에서 60분간의 원심 분리를 실시하였다. 상청액을 회수하고 나머지 상청액을 0.45-μm 필터를 통해 살균했다. 목적 단백질은 BioLogic DuoFlow(Bio-Rad사제)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제했다.
다음으로 2-84+186-215, 2-84+186-205, 및 2-84+186-195에 대해 이온 교환 정제했는데 칼럼으로는 HiTrap(상표)Q HP 5ml(GE healthcare사제)를 사용하였다. Buffer A로는 PBS(pH 7.4), Buffer B로는 7xPBS(pH 7.4)을 사용하였다. 컬럼을 적당량의 Buffer A에서 평형화 후, 친화성 정제한 단백질 용액을 충전해 하기 프로그램에 따라 세척 및 정제했다. 사용한 프로그램은 다음과 같다:
Isocratic Flow(Buffer A:100%, Buffer B:0%, 50ml, 4ml/min)
Linear Gradient(Buffer A:100%→ 0%, Buffer B:0%→ 100%, 50ml, 4ml/min)
Isocratic Flow(Buffer A:0%, Buffer B:100%, 5ml, 4ml/min)
Fraction Collection(50~105ml을 3ml씩)
각 분획은 SDS-PAGE, 겔의 단백질 염색으로 조사하여 정제 단백질을 확인했다.
각 단편은 인간 HMGB1을 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯함으로써 목적하는 단편인지여부를 확인했다.
MSC-1을 이용한 HMGB1단편(2-84) 및 HMGB1융합 단편(2-84+186-215,2-84+186-205,2-84+186-195)의 이동 분석
상술한 방법으로 제작한 단편을 이용하여 골수 중간엽 줄기세포주 MSC-1을 사용한 이동 촉진 분석을 실시했다. 이동 분석은 상기와 마찬가지로 수행했다.
결과
단편 2-84는 이동 촉진 활성을 나타냈지만, 산성꼬리 서열의 10아미노산, 20아미노산, 또는 30아미노산을 갖는 인간 HMGB1융합 단편은 모두 이동 촉진 활성을 나타내지 않았다(도 21b의 C).
고찰
상기한 실시예에서 보는 바와 같이 인간 HMGB1단편 89-215는 중간엽 줄기세포에 대해 극히 약한 이동 촉진 활성만을 갖지만, C말단 옆에 존재하는 산성꼬리를 깎아 가면 이동 촉진 활성이 증가한다. 상기 발견된 사실 및 본 실시예에 따르면 Acidic tail에는 2-84의 단편 및 89-185의 단편이 가지는 이동 촉진 활성을 감쇠하는 기능을 가지고 있는 것을 나타낸다. 또, 2-84의 단편에는 복수의 이동 촉진 활성의 핵심 영역이 존재한다. 2-84의 단편에 186-215의 단편을 융합하면 이동 촉진 활성이 거의 소실되므로 2-84에 존재하는 코어 영역 모두에 대해 억제되고 있다고 추정된다. HMGB1이라는 하나의 분자 속에 적어도 3곳 이상의 골수 중간엽 줄기세포에 대한 이동 촉진 활성의 코어 서열이 존재한다는 발견은 놀라운 일이다. 또 C말단에 존재하는 불과 30 아미노산의 산성꼬리가 HMGB1의 N말단 측의 2-84의 단편에 적어도 2개소 존재하는 코어 서열의 이동 촉진 활성을 거의 완전히 억제하고 85-185의 단편에 존재하는 코어 서열의 이동 촉진 활성에 대해서도 억제하고 있어 HMGB 1 전체 이동 촉진 활성을 감소시킨다는 발견도 매우 놀라운 일이다. HMGB1의 1-85단편은 LPS(리포폴리사카라이드)등 에 의해 유도되는 염증에 대한 소염 효과가 있다고 알려져 있다. Wei Gong 등은 1-85의 단편에 186-215조각을 융합한 단편은 1-85의 단편보다 LPS 투여에 의한 사망률을 감소시킨다는 점을 보고하였다(Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2010, Article ID 915234, doi:10.1155/2010/915234). Wei Gong 등의 논문에서는 1-85의 소염 효과의 증강을 위해서는 산성꼬리가 필요함을 제안하고 있지만, 본 발명에서는 골수 중간엽 줄기세포 이동은 산성꼬리가 오히려 저해한다는 것을 제시한다. 본 발명의 관점에 따르면 골수 중간엽 줄기세포 투여에 의하여 치료 효과를 볼 수 있는 질환에서는 산성꼬리를 짧게 하든지 완전히 삭제하는 것이 치료 효과를 더 개선할 것으로 기대된다.
방법
실험 동물은 SD래트(수컷, 8주령)를 사용했다. 이소플루레인 흡입으로 깊은 마취를 시행한 뒤 등에 가로 3cm x 세로 7cm의 직사각형 모양의 피부 절개를 제작했다. 다만 머리 측의 한 변은 절제하지 않고 피부는 피하의 조직에서 완전히 떼어냈다. 절개한 3변을 주위의 피부와 4호 견사를 이용하여 봉합하고 테가덤(3M사제)으로 보호하여 세균 감염을 예방했다.
HEK293에서 제작한 마우스 전장 HMGB1(100μg/투여/일), 화학 합성한 HMGB1펩티드(1~44 아미노산, 50μg/투여/일)을 인산 버퍼로 200μL로 희석하여 꼬리 정맥을 통해 래트에 투여했다. 제1회 투여는 수술 후 6시간에, 이후 24시간마다 총 5회 약제를 투여하고 음성 대조군으로는 인산 완충 생리 식염수를 투여했다. 1주일 후 테가덤을 제거하고 1주일마다 상처 부위를 관찰하여 괴사 부분, 궤양 형성 부분의 면적을 측정했다.
결과
수술 후 1주에 음성 대조군의 5마리 중 4마리에 피부 괴사가 발생했다. 전장 HMGB1투여군에서는 5마리 중 3마리에 피부 괴사가 발생했다. HMGB1펩티드(1~44 아미노산)군에서는 5마리 중 1마리에 피부 괴사가 발생했다. 수술 후 7주에는 음성 대조군의 5마리 중 4마리에서 피부의 강한 구축(contracture)이 일어나고 있는 것에 반하여 전장 HMGB1투여군에서는 5마리 중 3마리로, HMGB1펩티드(1~44 아미노산)군에서는 5마리 중 2마리로 구축이 보였다(도 24).
고찰
HEK293에서 생성한 전장 HMGB1 투여군 및 HMGB1펩티드(1~44 아미노산) 투여군에서 1주일 후의 괴사 조직 축소 효과가 관찰되었는데 HMGB1펩티드(1~44 아미노산)군에서 보다 더 축소 효과가 인정되었다. 1주 후, 2주 후, 3주 후에 창상 면적이 모두 음성 대조군의 절반의 면적으로 줄었다. 3주 이후에는 HMGB1펩티드(1~44 아미노산)투여군이 다른 2군에 비해 더 상처 면적이 축소되어 있었다. 7주일의 치유 과정에서도 HMGB1펩티드(1~44 아미노산)군이 상처 면적이 더 작은 편이었다. 7주일 후의 상처 부분의 구축에서도 HMGB1펩티드(1~44 아미노산)들이 구축이 경미하였다. 골수 중간엽 줄기세포는 저 산소 조건에서 피부 세포의 증식을 촉진하는 것이 알려져 있으며, HMGB1에 의해 동원된 골수 중간엽 줄기세포가 피부판 생성에 의해 발생한 저영양, 저산소에 따른 피부 괴사의 확대를 억제함으로써 상처 치유를 촉진했다고 추정된다. 이러한 효과는 피부의 허혈, 외상, 수술에 의한 손상 확대 억제뿐만 아니라 치유 후 미용 면에서도 유리하다는 점을 시사한다.
방법
실험 동물은 15마리의 SD래트(수컷, 8주령)를 사용했다. 이소플루레인 흡입으로 깊은 마취를 시행한 뒤 등에 가로 3cm x 세로 7cm의 직사각형 모양의 피부 절개를 제작했다. 다만 머리 측의 한 변은 절제하지 않고 피부는 피하의 조직에서 완전히 떼어냈다. 절개한 3변을 주위의 피부와 4호 견사를 이용하여 봉합하고 테가덤(3M사제)으로 보호하여 세균 감염을 예방했다.
화학적으로 합성한 BHMG1(1~44 아미노산, 50μg/투여/일) 혹은 HMGB1펩티드(17~25 아미노산, 50μg/투여/일)을 인산 버퍼로 200μL로 희석하여 실험적 상처를 갖는 래트에 투여했다. 제1회 투여는 수술 후 6시간에, 이후 24시간마다 총 5회 약제를 투여하고 음성 대조군으로는 인산 완충 생리 식염수를 투여했다. 1주일 후 테가덤을 제거하고 상처 생성 후 2주에 상처 부위를 관찰하였다. 비치유 부분(궤양 및 괴사)의 면적을 측정했다.
결과
피부판 생성 2주 후 피부판 전체 면적에 대한 비치유 부분의 면적의 비율(%)을 산출했다. HMGB1펩티드(1~44 아미노산)군에서는 비치유 면적은 평균 14.1%이고 HMGB1펩티드(17~25 아미노산, 50μg/투여/일)군에서는 평균 9.1%였다. 또한 피부판 제작 6주 후 피부판 전체 면적에 대한 비유 부분의 면적의 비율(%)은 HMGB1펩티드(1~44아미노산)군에서는 평균 4.1%이고 HMGB1펩티드(17~25아미노산, 50μg/투여/일)군에서는 평균 3.5%이었다(도 26).
[0256]
고찰
실시예 19의 피부 손상 모델의 시험에 있어서 손상 1주 후부터 7주까지 치유 과정에서 HEK293에서 생성한 전장 HMGB1투여군에 비해 화학 합성한 HMGB1펩티드(1~44 아미노산)투여군이 상처 면적이 더 작은 편이었다. 또한 본 실시예의 시험에 따르면 화학 합성한 HMGB1펩티드(17~25아미노산)군은 HMGB1펩티드(1~44 아미노산, 50μg/투여/일)군과 동등 이상의 피부 손상의 개선 효과가 나타났다. In vitro의 골수 중간엽 줄기세포 동원 활성 부위(코어 서열)은 여러 군데 있지만, 현 시점에서 판명된 가장 짧은 서열은 17 내지 25번의 아미노산의 9개의 아미노산으로 이루어진 서열이다. 중간엽 줄기세포 동원 활성을 갖는 다른 코어 서열은 30 아미노산의 길이 혹은 85아미노산의 길이가 필요하다. 본 실시예에 따르면 in vitro뿐만이 아니라 in vivo에서도 불과 9개의 아미노산으로 이루어진 HMGB1펩티드(17~25아미노산) 투여군에도 피부 손상의 개선 효과가 인정되어 9아미노산을 코어 도메인으로 포함한 펩티드는 HEK293등의 진핵 생물 유래의 배양 세포에서 제작하는 단백질 제제에 비해 훨씬 저렴한 가격에 안정된 생산이 가능한 것이 기대된다.
본 발명은 약 200아미노산으로 이루어진 전장 HMGB1 단백질에 비해 예를 들면, 분자량이 10분의 1이하인 PDGFRα 양성 세포 동원 활성을 보유한 펩티드를 제공한다. 이러한 펩티드는 대장균, 또는 진핵 생물 유래 배양 세포를 이용한 생산 방법 외에 펩티드 합성기를 사용한 화학적 합성에 의해 생산이 가능해서 펩티드를 의약품으로서 제조하는 경우 정제 순도의 향상, 안정적 생산, 비용 절감을 기대할 수 있다.
나아가 대장균, 또는 배양 세포 내에서 재조합 펩티드를 생산할 경우 전장 HMGB1에 비해 몰 당 또는 질량 당 각각 약 2배, 또는 약 6배 정도 활성이 향상된 것을 보여주었다. 따라서 의약품으로서 임상 응용시에는 투여량을 줄이는 것이 가능하므로 비용 절감 외에 부작용의 억제 효과도 기대할 수 있다.
게다가 전장 HMGB1은 내독소(endotoxin)의 일종인 LPS(Lipopolysaccharide)에 결합 활성을 갖는 것이 알려져 있으며, HMGB1을 1부터 79번의 아미노산 서열이나 88에서 162번의 아미노산 서열의 HMGB1단편으로 하면, LPS의 결합 활성이 없어진다는 보고가 있다(Youn et al,. J Immunol 2008;180;5067-5074).
의약품에 LPS가 소량이라도 섞이면 발열 등을 일으키고 종종 위독한 부작용으로 이어지므로 의약품에 대한 LPS의 오염은 엄격하게 규제되고 있다. HMGB1이 LPS와 친화성을 가지므로 의약품에 오염된 LPS를 완전히 제거하는 것은 어렵다. 그러나 펩티드로 전환하면 LPS와의 친화성이 저하되므로 의약품에 대한 LPS의 오염이 줄어들 수 있을 것으로 기대된다. 그러므로 본 발명에서 특정된 PDGFRα 양성 세포 동원 부분으로 이루어진 펩티드를 이용하여, 더 안전한 의약품 개발이 가능하게 된다.
재생이 필요한 조직, 또는 그 근방 조직에 본 발명의 펩티드를 직접 투여함으로써, 해당 조직 재생을 유도 또는 촉진할 수 있다. 또한 정맥 내 투여 등의 방법으로 재생이 필요한 조직과 다른 조직에 본 발명의 펩티드를 투여함으로써 재생이 필요한 조직 재생을 유도 또는 촉진할 수 있다. 예를 들면 뇌 경색과 같은 체내 깊숙이 자리한 장기의 질환을 치료하는 경우 손상 부위(뇌)에 대한 치료약의 직접 투여는 어렵다. 한편, 본 발명은 일반 진료에서 널리 시행되고 있는 정맥 투여에 의해 그러한 치료를 가능하게 하므로 치료약을 임의의 횟수, 농도로 안전하고 간편하게 투여할 수 있게 되고 이는 종래의 치료 방법에 비해 탁월한 효과이다.
또 최근 개발된 골수 세포를 사용한 뇌 경색의 치료법으로서, 환자 자신의 골수에서 세포를 채취하여 혈류 중에 다시 투여하는 방법이 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나, 골수 세포 채취 시에는 체내 깊숙이 자리한 골수에 굵은 침을 찔러 흡인할 필요가 있기 때문에 큰 침습을 수반하는 것이 불가피하다. 이에 반해 본 발명은 약제를 정맥 내에 투여해 골수 세포를 직접 혈류 중에 동원하는 것이 가능하다. 따라서 뇌 경색의 환자에게 빈번히 투여해도 큰 침습을 수반하는 것이 없다.
골수 유래 다능성 줄기세포는 중간엽계, 상피계, 및 신경계 등 다양한 세포로 분화하는 잠재 능력을 갖지만, 손상 부위로 이동한 후에는 손상 부위 주변의 틈새(niche) 환경에 따라 분화하고 조직 수복을 유도한다고 생각된다. 재생 의료나 세포 치료에서는 희귀한 골수 다능성 줄기세포를 생체 밖에서(ex vivo) 배양하여 증식시킨 뒤 치료에 이용하지만 이는 기존의 의약품과 달리, 배양 과정에서 일어날 수 있는 세포의 퇴화(암화 및 세균, 바이러스 등의 오염)의 위험이 있기 때문에 충분한 안전 관리가 필요하다. 한편 본 발명은 세포를 체외로 꺼내 인공적 조작을 가하는 것은 하지 않기 때문에 안전성이 매우 높다.
SEQUENCE LISTING <110> GENOMIX CO., LTD. OSAKA UNIVERSITY <120> PEPTIDE FOR INDUCING REGENERATION OF TISSUE AND USE THEREOF <130> G6-X1001Y1P <150> JP 2011-098270 <151> 2011-04-26 <150> JP 2011-219454 <151> 2011-10-03 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile 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Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 4 <211> 648 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 atgggcaaag gagatcctaa aaagccgaga ggcaaaatgt cctcatatgc attctttgtg 60 caaacttgcc gggaggagca caagaagaag cacccggatg cttctgtcaa cttctcagag 120 ttctccaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagaaaa ggggaaattt 180 gaagatatgg caaaggctga caaggctcgt tatgaaagag aaatgaaaac ctacatcccc 240 cccaaagggg agaccaaaaa gaagttcaag gaccccaatg cacccaagag gcctccttcg 300 gccttcttct tgttctgttc tgagtaccgc cccaaaatca aaggcgagca tcctggctta 360 tccattggtg atgttgcaaa gaaactagga gagatgtgga acaacactgc agcagatgac 420 aagcagccct atgagaagaa agctgccaag ctgaaggaga agtatgagaa ggatattgct 480 gcctacagag ctaaaggaaa acctgatgca gcgaaaaagg gggtggtcaa ggctgaaaag 540 agcaagaaaa agaaggaaga ggaagatgat gaggaggatg aagaggatga ggaagaggag 600 gaagaagagg aagacgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648 <210> 5 <211> 215 <212> 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<211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 6xHis-tag <400> 12 His His His His His His 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TEV protease recognition site <400> 13 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 14 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant hsHMGB1 with 6xHis-tag and TEV protease recognition site <400> 14 Met Lys His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Lys 1 5 10 15 Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe 20 25 30 Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser 35 40 45 Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr 50 55 60 Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp 65 70 75 80 Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly 85 90 95 Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro 100 105 110 Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly 115 120 125 Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu 130 135 140 Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys 145 150 155 160 Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg 165 170 175 Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu 180 185 190 Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu 195 200 205 Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp 210 215 220 Asp Asp Asp Glu 225

Claims (29)

  1. 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 물질을 포함하는, 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 조성물:
    (a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
    (b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
    (c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
  2. 하기 (a) 내지 (c) 중 하나의 물질을 포함하는, 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하기 위해 이용되는 조성물:
    (a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
    (b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
    (c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
  3. 하기 (a) 내지 (c) 중 하나의 물질을 포함하는, 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물:
    (a) HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드;
    (b) (a)의 펩티드를 분비하는 세포; 및
    (c) (a)의 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 이동이 자극되거나, 또는 골수로부터 말초 혈액으로 동원되는 세포가 PDGFRα-양성 세포인 것인 조성물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 이동이 자극되거나, 또는 골수로부터 말초 혈액으로 동원되는 세포가 줄기세포인 것인 조성물.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 이동이 자극되거나, 또는 골수로부터 말초 혈액으로 동원되는 세포가 골수 세포인 것인 조성물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 이동이 자극되거나, 또는 골수로부터 말초 혈액으로 동원되는 세포가 골수 중간엽 줄기세포인 것인 조성물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 서열번호:1, 3, 및 5중 어느 하나의 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어지고, 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드인 것인 조성물.
  9. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드인 것인 조성물:
    (1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
    (2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
    (3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
    (4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
    (5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
  10. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드가 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드인 것인 조성물:
    (1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
    (2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
    (3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
    (4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
    (5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
  11. 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함하는, 세포 이동을 자극하기 위해 이용되는 조성물:
    (1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
    (2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
    (3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
    (4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
    (5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
  12. 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함하는, 세포를 골수로부터 말초혈액으로 동원하기 위해 이용되는 조성물:
    (1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
    (2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
    (3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
    (4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
    (5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
  13. 다음 중 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드를 포함하는, 조직을 재생하기 위해 이용되는 조성물:
    (1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
    (2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
    (3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
    (4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
    (5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 합성된 펩티드인 것인 조성물.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 세포를 이용하여 제조된 펩티드인 것인 조성물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 태그가 부가된 펩티드인 것인 조성물.
  17. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 태그 유래의 펩티드 단편이 부가된 펩티드인 것인 조성물.
  18. HMGB1 단백질의 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 것인 펩티드.
  19. 청구항 18에 있어서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어지고 세포 이동 자극 활성을 갖는 것인 펩티드.
  20. 청구항 18에 있어서, 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 것인 펩티드:
    (1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
    (2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
    (3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
    (4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
    (5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
  21. 청구항 18에 있어서, 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 195번의 아미노산 서열 혹은 1 내지 185번의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 이루어진 펩티드로서, 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드:
    (1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
    (2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
    (3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
    (4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
    (5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
  22. 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고 세포 이동 자극 활성을 갖는 펩티드:
    (1) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 17 내지 25번의 아미노산 서열;
    (2) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 45 내지 74번의 아미노산 서열;
    (3) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 55 내지 84번의 아미노산 서열;
    (4) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 85 내지 169번의 아미노산 서열; 및
    (5) 서열번호:1, 3, 및 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 89 내지 185번의 아미노산 서열.
  23. 청구항 18 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 합성 펩티드인 것인 펩티드.
  24. 청구항 18 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 세포를 이용하여 제조된 펩티드인 것인 펩티드.
  25. 청구항 18 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 태그가 부가된 펩티드.
  26. 청구항 18 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 태그 유래의 펩티드 단편이 부가된 펩티드인 것인 펩티드.
  27. 청구항 18 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 코딩하는 DNA.
  28. 청구항 27에 기재된 DNA를 포함하는 벡터.
  29. 청구항 27에 기재된 DNA 또는 청구항 28에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 세포.
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