JP3018313B2 - 骨形成促進及び骨吸収防止剤 - Google Patents

骨形成促進及び骨吸収防止剤

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JP3018313B2 JP8061987A JP6198796A JP3018313B2 JP 3018313 B2 JP3018313 B2 JP 3018313B2 JP 8061987 A JP8061987 A JP 8061987A JP 6198796 A JP6198796 A JP 6198796A JP 3018313 B2 JP3018313 B2 JP 3018313B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＭＧ proteinや
アンホテリン（Amphoterin）等の特定のＮ末端側アミノ
酸配列を有するタンパク質及び／又はその分解物を有効
成分とする骨形成促進及び骨吸収防止剤に関する。さら
に、本発明は、ＨＭＧ proteinやアンホテリン（Amphot
erin）等の特定のＮ末端側アミノ酸配列を有するタンパ
ク質及び／又はその分解物を配合した飲食品、医薬又は
飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、
腰痛等の各種骨疾患が増加する傾向にある。骨組織にお
いては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時
には骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、加齢
に伴い種々の原因でそのバランスが骨吸収に傾く（アン
カップリング）。そして、この状態が長期間続くと骨組
織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を
生じることになる。このアンカップリングを防止するこ
とができれば、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を
予防することができると考えられている。
【０００３】従来より、アンカップリングを防止し、各
種骨疾患を予防あるいは治療する方法として、（１）食
餌によるカルシウム補給、（２）軽い運動、（３）日光
浴、（４）薬物治療等が行われている。食餌によるカル
シウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等
のカルシウム塩や牛骨粉、卵殻、魚骨粉等の天然カルシ
ウム剤が使用されているが、必ずしも経口摂取に適して
いる素材であるとはいえない。軽い運動はジョギングや
散歩等が良いとされるが、体が弱っている場合は軽い運
動も厄介なものであり、まして寝たきりの老人では殆ど
運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ3 の補給とい
う点では良いとされているが、これだけでは不充分であ
る。薬物投与には、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 、カ
ルシトニン製剤等が使用されており、骨粗鬆症の治療に
は有効であるということが知られている。しかし、これ
らの物質は医薬そのものであり、食品素材として使用可
能なものではない。
【０００４】一方、本発明者らは、食品素材として使用
可能な骨強化作用や骨吸収防止作用を有する物質を得る
ために、乳清タンパク質中に存在する骨強化及び骨吸収
防止因子を探索し続けてきた。その結果、逆浸透膜や電
気透析等の処理により、乳清タンパク質の水溶性画分か
ら乳清由来の塩を除去したタンパク質及びペプチド混合
物に骨強化作用があることを見出した (特開平4-183371
号公報) 。そして、このタンパク質及びペプチド混合物
の水溶液をエタノール処理、加熱処理、加塩処理、限外
濾過膜処理して得られる画分に骨芽細胞増殖促進作用及
び骨強化作用があることを見出した (特開平5-176715号
公報、特開平5-320066号公報) 。また、乳中に微量存在
する塩基性タンパク質に骨芽細胞増殖促進作用、骨強化
作用及び骨吸収防止作用があることを見出した (特願平
7-207509号) 。
【０００５】
【発明が解決しようとしている課題】本発明者らは、乳
から骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を有する活性本
体の分離精製を試みた。そしてこのような作用を有する
物質を分離精製し、その物質を同定したところＨＭＧ
（high-mobility-group) proteinあるいはAmphoterinで
あることが判明した。これらのタンパク質は、乳ばかり
ではなく、哺乳動物胸腺、脳等にも広く分布しており、
これらの組織から分離されたＨＭＧ protein，Amphoter
inについても同様の作用があることを見出した。従っ
て、これらのＨＭＧ protein，AmphoterinはＮ末端側ア
ミノ酸配列が全て同じであることから(Bioscience Repo
rts, vol.4, pp.49-57, 1984及びJ. Biol. Chem., vol.
226, pp.16722-16729, 1991 参照）、このＮ末端側アミ
ノ酸配列をもつタンパク質が前記作用を奏するものと判
断される。さらに、本発明者らはこれらの分解物、特に
該タンパク質をプロテアーゼで限定分解し、分子量100
〜20,000 Da(HPLCゲル濾過クロマトグラフィー法によ
る)としたペプチド混合物についても同様の作用を有す
ることを見出した。従って、本発明は、ＨＭＧ protein
やAmphoterin等の特定のＮ末端側アミノ酸配列を有する
タンパク質及び／又はその分解物を有効成分とする新規
な骨形成促進又は骨吸収防止剤を提供することを課題と
する。また、本発明は、ＨＭＧ proteinやAmphoterin等
の特定のＮ末端側アミノ酸配列を有するタンパク質及び
／又はその分解物を配合した新規な飲食品、医薬又は飼
料を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の骨形成促進及び
骨吸収防止剤の有効成分は、ＨＭＧ proteinやAmphoter
inに共通の次のＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質
である。 Gly-Lys-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-Phe- Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Lys-His- 及びこのようなタンパク質にはＨＭＧ proteinやAmphot
erinであり、これらはその由来にかかわらず、同一のＮ
末端アミノ酸配列をもつ。また、本発明ではこれらの分
解物も有効成分として用いることができる。本発明にお
ける分解物は、該タンパク質をプロテアーゼで限定分解
し、分子量100 〜20,000 Da(HPLCゲル濾過クロマトグラ
フィー法による) としたペプチド混合を意味する。
【０００７】本発明の有効成分のＨＭＧ proteinは、非
ヒストンタンパク質の一種であり、その構成アミノ酸と
して塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸を高比率で含有して
いる。そして、Ｎ末端側が塩基性領域であり、Ｃ末端側
が酸性領域である非対称構造を有している。また、ＨＭ
Ｇタンパク質とＤＮＡとの結合様式は、イオン性であ
り、塩基性アミノ酸とＤＮＡリン酸との間の相互作用が
あることが知られている。このＨＭＧ proteinは、現在
までのところ、全ての高等生物の組織で見出されてお
り、ヒストンともある程度の類似性があることが知られ
ている(Kaplan,D.J., Duncan,C.H., Nucleic Acid Re
s., vol.16, p.10375, 1988)。このＨＭＧ proteinは、
牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等の乳を遠心分離して得た脱
脂乳を加熱処理、加塩処理、エタノール処理、イオン交
換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等
の各種クロマト処理、限外濾過膜処理等を行うことによ
り得ることができる。
【０００８】また、本発明の有効成分のAmphoterinは、
30kDaのヘパリン結合性タンパク質であり、神経系の細
胞に強く結合する性質がある。また、細胞の接着性や細
胞突起に関わる物質であるとも言われており、脳の発達
に何らかの重要な役割を演じていると言われている。こ
のAmphoterinもＨＭＧ proteinと同様に、牛乳、人乳、
山羊乳、羊乳等の乳を遠心分離して得た脱脂乳を加熱処
理、加塩処理、エタノール処理、イオン交換クロマトグ
ラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマ
ト処理、限外濾過膜処理等を行うことにより得られる。
【０００９】さらに本発明の有効成分のＨＭＧ protein
分解物及びAmphoterin分解物は、ＨＭＧ protein又はAm
photerinをトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パ
パイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、
Ｖ８プロテアーゼ等のプロテアーゼで限定分解し、分子
量 100〜20,000Da（HPLCゲル濾過クロマトグラフィーに
よる）としたペプチド混合物である。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の骨形成促進及び骨吸収防
止剤は、ＨＭＧ proteinやAmphoterin等の特定のＮ末端
を有するタンパク質あるいはその分解物を有効成分とす
る。この特定のＮ末端を有するタンパク質あるいはその
分離物を、牛乳、乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、ゼ
リー、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品に
配合しても良いし、錠剤や粉末等の医薬としても良い。
さらに、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシ
ウム、卵殻、牛乳由来のカルシウム等の吸収性が良好な
カルシウム剤を併用することにより、骨形成促進作用を
一層高めることができる。さらに、ビタミンＤ等を併用
することもできる。
【００１１】本発明の骨形成促進及び骨吸収防止剤は、
成人の場合、その有効成分を１日当たり 100ng〜10mgを
数回に分けて摂取すれば良い。このように、本発明の骨
形成促進及び骨吸収防止剤を摂取することにより、骨粗
鬆症等の各種骨疾患を予防又は改善することができる。
また、これらの有効成分を飼料に含有させて、家畜や家
禽等の骨形成を促進させたり、骨吸収を防止させること
もできる。
【００１２】次に、実施例をあげて本発明を説明する。
【実施例１】スルホン化キトパール3,000g（富士紡績
製）を充填したカラムを脱イオン交換水で充分に洗浄
し、陽イオン水で充分に洗浄し、陽イオン交換樹脂に脱
脂乳 300リットルを通液し、脱イオン交換水で充分洗浄
した後、 0.02M炭酸緩衝液（pH6.7)で樹脂に吸着した塩
基性タンパク質を0.1M〜1.0MのNaClで直線濃度勾配で溶
出し、回収した。そして、ＨＭＧ-proteinを含む溶出画
分を0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5)で平衝化させた S-Sepha
rose陽イオン交換クロマトグラフィーで0.1M〜1.0MのNa
Clで直線濃度勾配で溶出させて分画し、得られた画分を
90℃で10分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱
を除去した。さらに、この画分を0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.5)で平衝化させたMono Qイオン交換クロマトグラフィ
ーで0.1M〜1.0MのNaClで直線濃度勾配で溶出させて分画
し、0.1Mリン酸緩衝液 (pH6.5)で平衝化させたSepharos
e 12ゲル濾過クロマトグラフィーでさらに分画した。最
後にC4逆相クロマトグラフィーを使用した高速液体クロ
マトグラフィーで処理し、ＨＭＧ-protein 135mgを得
た。
【００１３】
【実施例２】ブタの胸腺からのＨＭＧ-proteinの調製
は、Y. Adachi の方法（J. Chromatography. 530, 39-4
6(1990))に基づいて行った。摘出した胸腺のクロマチン
253gを0.35M NaCl中でポッター型ホモゲナイザーで破砕
し、遠心分離(5,000×ｇ、20分間）した。一晩、10mMリ
ン酸緩衝液 (pH7.8)で透析し、PBB-94カラムにて分画し
10mMリン酸緩衝液 (pH7.8)で吸着させ、0.1M〜1.0MのNa
Clで直線濃度勾配で溶出させて分画し、ＨＭＧ-protein
25mg を得た。
【００１４】
【実施例３】Heikki,R.らの方法(Heikki,R., Riitta,
P., J. Biol. Chem., vol.262, pp.16625-16635, 1987)
に従い、Amphoterinを調製した。すなわち、ＳＤラッ
トから摘出した脳112.7gにＰＢＳ(137mM塩化ナトリウ
ム、27mM塩化カリウム、 8.1mMリン酸水素二ナトリウ
ム、 1.5mMリン酸二水素カリウム、pH7.4) 100mlを加
え、氷冷中でホモゲナイズした後、遠心分離(100,000×
g 、１時間) し沈澱を回収した。次に、この沈澱を1mM
ＰＭＳＦ(phenylmethylsulfonyl fluoride) 及び5mM Ｅ
ＤＴＡを含む 50mM octyl glucoside で溶解し、１時間
撹拌した後、遠心分離(100,000×g 、１時間) し沈澱を
除去した。そして、Heparine-Sepharoseカラムを使用し
て2M塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した後、Supe
rose12ゲル濾過カラムで分画し、凍結乾燥してAmphoter
in 12mg を得た。
【００１５】
【実施例４】実施例１で得られたＨＭＧ protein 50mg
を水10mlに懸濁し、最終濃度が0.01％となるようトリプ
シンを加えて、37℃で１時間酵素処理した。そして、90
℃で５分間の加熱処理をして酵素を失活させた後、凍結
乾燥しＨＭＧ protein分解物43mgを得た。この分解物の
分画分子量をHPLCゲル濾過クロマトグラフィー（東ソ
ー）で測定したところ 100〜18,000Daを示した。
【００１６】
【実施例５】実施例３で得られたAmphoterin 5mgを水10
mlに懸濁し、最終濃度が 0.001％となるようパンクレア
チンを加えて、37℃で５時間酵素処理した。そして、90
℃で５分間の加熱処理をして酵素を失活させた後、凍結
乾燥しAmphoterin分解物 4.3mgを得た。この分解物の分
画分子量をHPLCゲル濾過クロマトグラフィー（東ソー）
で測定したところ 200〜20,000Daを示した。
【００１７】
【試験例１】実施例１〜５で得られた物質について骨芽
細胞増殖作用を調べた。すなわち、骨芽細胞MC3T3-E1細
胞を10％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地(Flow Labola
tories社製) で96穴プレートに２×104/mlの細胞数で播
種した。次に、５％ＣＯ2 存在下、37℃で24時間培養し
試験用培養細胞とした。そして、培地を牛胎児血清を含
まないα−ＭＥＭ培地に交換し、実施例１〜５で得られ
た画分を最終濃度10μg/mlとなるよう培地に添加して、
37℃で18時間培養した。これに 3Ｈ−チミジン0.02MBq
を添加して２時間経過後、セルハーベスターで細胞を濾
紙に集め、液体シンチレーションカウンターで細胞増殖
活性を測定した。また、対照として、無添加のものを用
い、無添加のものの細胞増殖活性を 100％としたときの
それぞれの細胞増殖活性 (％) で表した。その結果を表
１に示す。
【００１８】
【表１】 ──────────────── 画分 細胞増殖活性 ──────────────── 実施例１ 189±25 (％) 実施例２ 183±29 実施例３ 140±19 実施例４ 153±15 実施例５ 143±16 ────────────────
【００１９】実施例１〜５で得られた物質を添加した群
はいずれも無添加群に比べ細胞増殖活性が増加してお
り、骨芽細胞増殖作用を有することが判った。なお、骨
芽細胞ＵＭＲ株を使用して行った試験においても、同様
の結果が得られた。
【００２０】
【試験例２】実施例１〜５で得られた物質について骨吸
収防止作用を調べた。すなわち、生後10〜20日齢のＩＣ
Ｒ系マウスの長管骨を摘出し、軟組織を除去した後、５
％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液中で骨を機械的に細
切し、破骨細胞を含む全骨髄細胞を得た。この細胞を象
牙片の上に約２×106 細胞を５％牛胎児血清を含むα−
ＭＥＭ溶液でスポットした。２時間後、試験試料が最終
濃度で10μg/mlとなるよう５％牛胎児血清を含むα−Ｍ
ＥＭ溶液を加え、５日間培養し、既存の破骨細胞の骨吸
収活性を調べた。
【００２１】骨吸収防止作用の評価は、培養後、象牙片
上の細胞を剥がしてヘマトキシリン染色し、PIASLA-555
により画像解析して骨吸収窩(pit) の数を測定すること
により行った。また、対照として、無添加のものを用
い、無添加のものの骨吸収活性を 100％としたときのそ
れぞれの骨吸収活性 (％) で表した。その結果を表２に
示す。
【００２２】
【表２】 ───────────────── 骨吸収活性 ───────────────── 実施例１ 70.7±5.7 (％) 実施例２ 79.9±5.7 実施例３ 77.9±8.6 実施例４ 75.4±8.6 実施例５ 85.4±8.6 ─────────────────
【００２３】実施例１〜５で得られた物質を添加した群
は、いずれも無添加群に比べ骨吸収活性が抑制されてお
り、骨吸収防止作用を有することが判った。
【００２４】
【実施例６】表３に示した配合で原料を混合した後、容
器に充填し、加熱滅菌して、骨形成促進作用及び骨吸収
防止作用を賦与した飲料を製造した。
【００２５】
【表３】 ────────────────────── 混合異性化糖 15.0 (重量％) 果汁 10.0 クエン酸 0.5 実施例３で得られた物質 0.0005 香料 0.1 カルシウム 0.5 水 73.9 ──────────────────────
【００２６】
【実施例７】表４に示した配合で原料を混合した後、加
圧成型して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与
した錠剤を製造した。
【００２７】
【表４】 ─────────────────────── 含水結晶ブドウ糖 93.5 (重量％) 実施例２で得られた物質 0.05 カルシウム 5.0 シュガーエステル 1.0 香料 0.45 ───────────────────────
【００２８】
【実施例８】表５に示した配合で原料を混合し、ドウを
作成して成型した後、焙焼して、骨形成促進作用及び骨
吸収防止作用を賦与したビスケットを製造した。
【００２９】
【表５】 ────────────────────── 小麦粉 50.0 (重量％) 砂糖 20.0 食塩 0.5 マーガリン 12.5 卵 12.1 水 3.7 炭酸水素ナトリウム 0.1 重炭酸アンモニウム 0.2 炭酸カルシウム 0.5 実施例２で得られた物質 0.005 ──────────────────────
【００３０】
【実施例９】表６に示した配合で原料を混合した後、容
器に充填し、加熱滅菌して、骨形成促進作用及び骨吸収
防止作用を賦与したゼリーを製造した。
【００３１】
【表６】 ────────────────────── 果糖 20.0 (重量％) グラニュー糖 15.0 水飴 5.0 寒天 1.0 実施例４で得られた物質 0.0005 香料 0.11 カルシウム 0.1 水 58.39 ──────────────────────
【００３２】
【実施例１０】表７に示した配合で原料を混合した後、
85℃で乳化して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を
賦与したプロセスチーズを製造した。
【００３３】
【表７】 ────────────────────── ゴーダチーズ 43.0 (重量％) チェダーチーズ 43.5 クエン酸ナトリウム 2.0 実施例１で得られた物質 0.005 乳由来カルシウム 1.0 水 10.5 ──────────────────────
【００３４】
【実施例１１】12重量％還元脱脂乳を90℃で20分間加熱
殺菌した後、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactoba
cillus acidophilus)及びストレップトコッカス・サー
モフィルス(Streptococcus thermophilus) をそれぞれ
接種し、２種類のスターターカルチャーを得て両者を等
量混合した。そして、表８に示した配合で原料を混合し
た後、発酵させて、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用
を賦与したヨーグルトを製造した。
【００３５】
【表８】 ─────────────────────── ヨーグルトミックス 97.0 (重量％) スターターカルチャー 3.0 実施例１で得られた物質 0.0005 ───────────────────────
【００３６】
【実施例１２】表９に示した配合で原料を混合し、骨形
成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与した乳児用調製粉
乳を製造した。
【００３７】
【表９】 ──────────────────────── 脱脂乳 75.61 (重量％) 乳清タンパク質濃縮物 2.36 乳糖 13.86 ミネラル混合物 0.32 水溶性ビタミン混合物 0.32 脂溶性ビタミンを含む脂肪 7.53 実施例１で得られた物質 0.001 ────────────────────────
【００３８】
【実施例１３】表１０に示した配合で原料を混合して、
骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与したイヌ飼育
用飼料（ドッグフード）を製造した。
【００３９】
【表１０】 ────────────────────── 大豆粕 12.0 (重量％) 脱脂粉乳 14.0 大豆油 4.0 コーン油 2.0 パーム油 28.0 トウモロコシ澱粉 15.0 小麦粉 9.0 ふすま 2.0 ビタミン混合物 9.0 ミネラル混合物 2.0 セルロース 3.0 実施例１で得られた物質 0.001 ──────────────────────
【００４０】
【発明の効果】本発明のＨＭＧ proteinあるいはAmphot
erinのような特定のＮ末端アミノ酸配列を有するタンパ
ク質あるいはその分解物を有効成分とする骨形成促進剤
及び骨吸収防止剤は、骨粗鬆症等の各種骨疾患の予防や
改善に有用である。また、これらのタンパク質あるいは
その分解物を含有する飲食品、医薬又は飼料は各種の骨
疾患を同様に予防したり改善したりすることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/18 (56)参考文献 特開 平４−183371（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−176715（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−320066（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 38/00 A23K 1/16 303 A23L 1/305 C07K 14/47 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｎ末端側アミノ酸配列がGly-Lys-Gly-As
    p-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-
    Phe-Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Ly
    s-His-であるタンパク質及び／又は該タンパク質をプロ
    テアーゼで限定分解し、分子量100 〜20,000 Da(HPLCゲ
    ル濾過クロマトグラフィー法による)としたペプチド混
    合物を有効成分とする骨形成促進又は骨吸収防止剤。
  2. 【請求項２】 Ｎ末端側アミノ酸配列がGly-Lys-Gly-As
    p-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-
    Phe-Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Ly
    s-His-であるタンパク質が、ＨＭＧ（high-mobility-gr
    oup) proteinである請求項１記載の剤。
  3. 【請求項３】 Ｎ末端側アミノ酸配列がGly-Lys-Gly-As
    p-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-
    Phe-Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Ly
    s-His-であるタンパク質が、アンホテリン（Amphoteri
    n）である請求項１記載の剤。
  4. 【請求項４】 Ｎ末端側アミノ酸配列がGly-Lys-Gly-As
    p-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-
    Phe-Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Ly
    s-His-であるタンパク質及び／又はその分解物を配合し
    た飲食品、医薬又は飼料。
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