DE69733097T2

DE69733097T2 - Mittel zur Verbesserung der Knochenbildung und zur Inhibierung der Knochenresorption

Info

Publication number: DE69733097T2
Application number: DE69733097T
Authority: DE
Inventors: Yukihiro Kawagoe-shi Takada; Junichi Kawagoe-shi Yamamura; Masaaki Shimotsuga-gun GOTO; Seiichiro Sayama-shi Aoe
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1996-02-23
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2017-02-21
Also published as: AU1486997A; JP3018313B2; DE69733097D1; AU730481B2; EP0791601B1; EP0791601A2; US5851986A; JPH09227403A; EP0791601A3; NZ314286A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Mittels, umfassend ein Protein mit einer spezifischen N-terminalen Aminosäuresequenz, wie zum Beispiel HMG-Protein (High-mobility-group Protein) und Amphoterin etc. und/oder dessen Abbauprodukt als wirksamen Bestandteil für die Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Knochenbildung oder Hemmung der Knochenresorption. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung dieses Mittels in Verbindung mit einem Getränk oder Nahrungsmittel.
Hintergrund der Erfindung
Einhergehend mit der Verlängerung der menschlichen Lebenserwartung nahm kürzlich das Auftreten von Krankheiten des Knochenstoffwechsels, wie zum Beispiel Osteoporose, Knochenbruch, Knochenschmerz etc., zu. Im Knochengewebe treten die Knochenbildung und die Knochenresorption stets auf. Während in der Jugend das Gleichgewicht zwischen Knochenbildung und Knochenresorption gehalten wird, übersteigt mit zunehmendem Alter (Entkopplung) die Knochenresorption die Knochenbildung aufgrund verschiedener Ursachen. Und wenn die Knochenresorption über einen längeren Zeitraum anhält, wird das Knochengewebe brüchig, was Krankheiten des Knochenstoffwechsels verursacht, wie zum Beispiel Osteoporose, Knochenbruch, Knochenschmerz etc.. Wenn daher die Entkopplung unterbunden werden kann, so kann man erwarten, Krankheiten des Stoffwechsels, wie zum Bei spiel Osteoporose, Knochenbruch, Knochenschmerz etc. zu verhindern.
Als herkömmliche Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung von Krankheiten des Knochenstoffwechsels durch Hemmung der Entkopplung können folgende Beispiele dienen: (1) Calcium-ergänzende Diäten, (2) leichte Übungen, (3) Sonnenbaden, (4) medizinische Therapie, etc.. Für Calcium-ergänzende Diäten werden Calciumsalze, wie zum Beispiel Calciumcarbonat, Calciumphosphat, etc., sowie eine natürlich vorkommende Calcium-enthaltende Zubereitung, wie zum Beispiel Rinderknochenpulver, Eierschalen, Fischknochenpulver, etc. verwendet. Diese sind jedoch nicht zwangsläufig gut für die orale Aufnahme. Als leichte Übungen können Laufen oder Gehen empfohlen werden. Jedoch sind sie für eine Person mühselig, die schwach wird, und ziemlich schwierig für eine nicht mehr gehfähige ältere Person. Sonnenbaden hält man für gut zur Ergänzung der aktiven Form des Vitamins D3, jedoch ist es nicht ausreichend. Als medizinische Therapie kann 1α-Hydroxy-Vitamin D3 und/oder Calcitonin verwendet werden, und sie sind als wirksam zur Behandlung der Osteoporose bekannt. Jedoch sind diese selbst Arzneimittel und können nicht als Nahrungsmittelquellen verwendet werden.
Andererseits haben die vorliegenden Erfinder danach gesucht, einen Faktor zur Knochenfestigung und zur Hemmung der Knochenresorption zu finden, der in Molkeproteinen vorhanden ist, um Substanzen zu erhalten, die eine Wirkung auf die Knochenfestigung und/oder eine Hemmung der Knochenresorption haben, der für Nahrungsmittel-Rohstoffe nützlich ist. Gegebenenfalls fanden wir heraus, dass ein Protein und/oder eine Peptidmischung, die durch Entfernen des Salzes aus einer wasserlöslichen Fraktion des Molkeproteins durch Behandlung mit Revers-Osmose-Mem bran und/oder Elektrophorese erhalten wurde, eine Wirkung auf die Knochenfestigung hatte (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 183371/1992). Ferner fanden wir heraus, dass eine Fraktion, die aus einer flüssigen Lösung dieses Proteins und der Peptidmischung durch Ethanolbehandlung, Erwärmen, Zugabe von Salz und Behandlung mit Ultrafiltration erhalten wurde, eine Wirkung auf die Förderung der Osteoblasten-Proliferation und der Knochenfestigung besitzt (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 176715/1993, Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 320066/1993). Zusätzlich fanden wir heraus, dass das basische Protein, das in sehr geringer Menge in Milch vorhanden ist, eine Wirkung auf die Förderung der Osteoblasten-Proliferation, Knochenfestigung und Hemmung der Knochenresorption hat (Japanische Patentanmeldung Nr. 207509/1995). Die vorliegenden Erfinder versuchten, einen wirksamen Bestandteil aus Milch zu isolieren und zu reinigen, der eine Wirkung auf die Förderung der Osteoblasten-Proliferation und der Hemmung der Knochenresorption hat. Schließlich isolierten wir eine solche Substanz mit einer Wirkung wie vorstehend beschrieben, reinigten sie und identifizierten sie als HMG-Protein oder Amphoterin. Diese Proteine wurden nicht nur in Milch, sondern auch im Thymus, Gehirn etc. von Säugern gefunden, und es wurde auch gefunden, dass sie in großem Umfang über den gesamten Körper verteilt sind. Wir fanden ebenfalls, dass das HMG-Protein und Amphoterin, die aus dem vorstehenden Gewebe isoliert wurden, dieselbe Wirkung besaßen, wie jene aus Milch isolierten. Da die Aminosäuresequenz am N-Terminus in diesen HMG-Proteinen und Amphoterinen dieselbe ist (Bioscience Reports, Bd. 4, S. 49–57, 1984, und J. Biol. Chem., Bd. 266, S. 16722–16729, 1991), erwartet man, dass ein Protein mit dieser N-terminalen Aminosäuresequenz dieselbe Wirkung wie oben beschrie ben besitzt. Ferner fanden die vorliegenden Erfinder, dass deren Abbauprodukte ebenfalls dieselbe Wirkung besitzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Mittels zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Knochenbildung oder Hemmung der Knochenresorption, umfassend als wirksamen Bestandteil ein Protein und/oder ein Abbauprodukt desselben, dessen Aminosäuresequenz am N-Terminus ist Gly-Lys-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-Phe-Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Lys-His. Darüber hinaus offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung dieses Mittels in Verbindung mit einem Getränk oder Nahrungsmittel.
Genaue Beschreibung der Erfindung und der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung verwendet ein Mittel als einen wirksamen Bestandteil zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Knochenbildung und zur Hemmung der Knochenresorption, das ein Protein mit der folgenden gemeinsamen Aminosäuresequenz an dessen N-Terminus ist: Gly-Lys-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-Phe-Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Lys-His.
Diese Proteine umfassen HMG-Protein und Amphoterin und besitzen dieselbe N-terminale Aminosäuresequenz, unabhängig von ihrem Ursprung. In der vorliegenden Erfindung können auch deren Abbauprodukte als wirksame Bestandteile verwendet werden.
HMG-Protein, das als ein wirksamer Bestandteil in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine Art von Nicht-Histonprotein, und umfasst eine große Menge basischer Aminosäuren und saurer Aminosäuren als aufbauende Aminosäuren. Ferner besitzt es einen basischen N-Terminus und einen sauren C-Terminus, welcher nicht-symmetrisch ist. Die Bindungsart zwischen dem HMG-Protein und DNA ist ionisch. Es ist bekannt, dass eine Wechselwirkung zwischen der basischen Aminosäure und dem Phosphat der DNA besteht. Dieses HMG-Protein wurde im gesamten Gewebe von höheren Klassen biologischer Organismen gefunden, und ist insofern für eine Ähnlichkeit mit Histon bis zu einem gewissen Ausmaß bekannt (Kaplan, D. J., Duncan, C. H., Nucleic Acid Res., Bd. 16, S. 10375, 1988).
Das HMG-Protein kann durch verschiedene Arten der Behandlung entrahmter Milch erhalten werden, die aus Milch, wie zum Beispiel Kuhmilch, Brustmilch, Ziegenmilch und Schafmilch, etc. isoliert wurde, und zentrifugiert wurde, wie zum Beispiel durch Erhitzen, Zugabe von Salz, Behandlung mit Ethanol, Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie und weiteren Arten der Chromatographie und Ultrafiltration, etc..
In alternativer Weise ist Amphoterin, das als ein wirksamer Bestandteil in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ein 30 kDa großes Heparin-Bindeprotein und besitzt die Eigenschaft, stark an Zellen im Nervensystem zu binden. Es wird behauptet, Amphoterin sei eine Substanz, die eine Funktion in der Zelladhäsion und/oder den Dendriten der Zellen hat, und eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Hirns spielt.
Amphoterin kann, wie das HMG-Protein, durch verschiedene Arten der Behandlung entrahmter Milch erhalten werden, die aus Milch, wie zum Beispiel Kuhmilch, Brustmilch, Ziegenmilch und Schafmilch, etc. isoliert wurde, und zentrifugiert wurde, wie zum Beispiel durch Erhitzen, Zugabe von Salz, Behandlung mit Ethanol, Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie und andere Arten der Chromatographie und Ultrafiltration, etc..
Die Abbauprodukte des HMG-Proteins und des Amphoterins, welche als wirksame Bestandteile der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind eine Peptidmischung, die durch Abbau des HMG-Proteins oder des Amphoterins mit Trypsin, Chymotripsin, Pepsin, Papain, Kallikrein, Cathepsin, Thermolysin und V8-Protease erhalten werden, deren Molekulargewicht 100–20.000 Dalton (bestimmt durch HPLC-Gelfiltrations-Chromatographie) beträgt.
Die vorliegende Erfindung verwendet ein Mittel zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption, welches als einen wirksamen Bestandteil ein Protein mit einem spezifischen N-Terminus, wie zum Beispiel HMG-Protein oder Amphoterin oder deren Abbauprodukte umfasst. Das Protein mit einem spezifischen N-Terminus oder dessen Abbauprodukte können mit einem Getränk oder Nahrungsmittel, wie zum Beispiel Milch, Milchgetränken, Kaffeegetränken, Saft, Gelee, Cräcker, Brot, Nudeln oder Wurst etc., kombiniert werden, oder kann für ein Arzneimittel als Tablette oder Pulver, etc. verwendet werden. Darüber hinaus kann dessen Wirkung der Förderung der Knochenbildung erhöht werden, indem dieses Mittel mit einem Calcium-Mittel, das eine gute Calciumaufnahmefähigkeit zeigt, kombiniert werden, wie zum Beispiel Calciumchlorid, Calciumcarbonat, Calciumlactat, Eierschalen, Calcium aus Milch etc..
Das Mittel zur Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption, das entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann mehrmals täglich eingenommen werden, getrennt in einer Dosis von 100 ng bis 10 mg pro Tag für eine erwachsene Person. Durch die Einnahme des Mittels zur Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption entsprechend der vorliegenden Erfindung können Krankheiten des Knochenstoffwechsels, wie zum Beispiel Osteoporose, verhindert oder verbessert werden.
In alternativer Weise können diese wirksamen Bestandteile mit Nahrungsmitteln kombiniert werden, so dass die Knochenbildung gefördert werden kann und/oder die Knochenresorption kann bei Vieh und Geflügel gehemmt werden.
Wie vorstehend beschrieben, umfasst das Mittel, das zur Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ein Protein mit einer spezifischen N-terminalen Aminosäuresequenz oder dessen Abbauprodukt, wie zum Beispiel HMG-Protein oder Amphoterin, als einen wirksamen Bestandteil und kann zur Vorbeugung und/oder Verbesserung zahlreicher Arten von Krankheiten des Knochenstoffwechsels, wie zum Beispiel Osteoporose, verwendet werden. Darüber hinaus können Nahrungsmittel oder Getränke, die diese Proteine oder deren Abbauprodukte umfassen, diesen Krankheiten des Knochenstoffwechsels vorbeugen und/oder sie in derselben Weise wie vorstehend beschrieben verbessern.
Anschließend wird die vorliegende Erfindung durch Beispiele und Testbeispiele beschrieben. Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll durch solche Beispiele jedoch nicht beschränkt werden.
Beispiel 1
Eine Säule, die mit sulfoniertem Chitopearl (Fuji-boseki) gepackt ist, wird mit entionisiertem Wasser und mit einem ausreichenden Volumen an kationisiertem Wasser gewaschen. Auf das Kationenaustauscher-Harz werden 300 1 entrahmte Milch aufgetragen, und das Harz wird ausreichend mit entionisiertem Wasser gewaschen. Das darauf adsorbierte basische Protein wird mit einem linearen Gradienten von 0,1–1 M NaCl in 0,02 M Carbonatpuffer-Lösung eluiert und wiedergewonnen. Anschließend wird die eluierte Fraktion, die das HMG-Protein enthält, weiter auf eine S-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,5) äquilibriert wurde, und mit einem linearen Gradienten von 0,1–1,0 M NaCl eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde bei 90°C 10 Minuten lang erhitzt und zentrifugiert, um ein Präzipitat hiervon zu entfernen. Ferner wurde diese Fraktion auf eine Mono Q Ionenaustauscher-Säule aufgetragen, die mit 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,5) äquilibriert wurde, und mit einem linearen Gradienten von 0,1 –1,0 M NaCl eluiert. Anschließend wurde die Fraktion auf eine Sepharose 12 Gelfiltrations-Säule aufgetragen und fraktioniert. Schließlich wurde die Fraktion durch eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter Verwendung einer C4-Reversphase-Chromatographie gereinigt, um 135 mg HMG-Protein zu ergeben.
Beispiel 2
Die Herstellung des HMG-Proteins aus Schweinethymus wurde gemäß dem Verfahren von Y. Adachi (J. Chromatography, 530, 39–46 (1990)) durchgeführt.
Chromatin aus ausgeschnittenem Thymus (253 g) wurde in 0,35 M NaCl mit einem Homogenisator vom Topf-Typ homogenisiert und zentrifugiert (5000 × g, 20 min) und anschließend gegen 10 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,8) über Nacht dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine PBB 94-Säule aufgetragen, die mit 10 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,8) äquilibriert wurde, und mit einem linearen Gradienten von 0,1–1,0 M NaCl eluiert, um 25 mg HMG-Protein zu ergeben.
Beispiel 3
Amphoterin wurde entsprechend dem Verfahren von R. Heikki (Heikki, R., Riitta, P., J. Biol. Chem., Band 262, S. 16625–16635, 1987) hergestellt. Das bedeutet, 112,7 g ausgeschnittenes Hirn aus SD-Ratten wurde in 100 ml eisgekühlter PBS (137 mM Natriumchlorid, 27 mM Kaliumchlorid, 8,1 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 1,5 mM Kaliumdihydrogenphosphat, pH 7,4) homogenisiert und zentrifugiert (100.000 × g, 1 Stunde), um das Präzipitat wiederzugewinnen. Anschließend wurde dieses Präzipitat in 50 mM Octylglucosid aufgelöst, das 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) und 5 mM EDTA enthält, 1 Stunde lang gerührt und zentrifugiert (100.000 × g, 1 Stunde), um ein Präzipitat zu entfernen. Der Überstand wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 2 M Natriumchlorid eluiert, gefolgt von einer Superose 12 Gelfiltrations-Chromatographie und einer Lyophilisation, um 12 mg Amphoterin zu ergeben.
Beispiel 4
HMG-Protein (50 mg), das nach Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in 10 ml Wasser suspendiert, und Trypsin wurde zugegeben, so dass die Endkonzentration 0,01% beträgt. Der enzymatische Ab bau wurde bei 37°C 1 Stunde lang durchgeführt und durch Inaktivierung des Enzyms bei 90°C für 5 Minuten gestoppt, gefolgt von einer Lyophilisation, um 43 mg des Abbauprodukts von HMG-Protein zu ergeben. Das Molekulargewicht dieses Abbauprodukts wurde zu 100–18.000 Da durch HPLC Gelfiltrations-Chromatographie (Tosoh) bestimmt.
Beispiel 5
Amphoterin (5 mg), das nach Beispiel 3 erhalten wurde, wurde in 10 ml Wasser suspendiert, und Pankreatin wurde dazu gegeben, so dass dessen Endkonzentration 0,001% beträgt. Der enzymatische Abbau wurde bei 37°C 5 Stunden lang durchgeführt, und durch Inaktivierung des Enzyms bei 90°C für 5 Minuten gestoppt, gefolgt von einer Lyophilisation, um 4,3 mg des Abbauproduktes von Amphoterin zu ergeben. Das Molekulargewicht dieses Abbauprodukts wurde zu 200–20.000 Da durch HPLC Gelfiltrations-Chromatographie bestimmt.
Testbeispiel 1
Substanzen, die gemäß den Beispielen 1–5 erhalten wurden, wurden in Bezug auf ihre Wirkung der Förderung der Osteoblasten-Proliferation untersucht. Das heißt, 2 × 10⁴ Zellen/ml der Maus-Osteoblasten-Zelllinie MC3T3-E1 in einem α-modifizierten essentiellen Minimalmedium (α-MEM), das 10% fötales Kälberserum (Flow Laboratories) enthielt, wurden in jeden Napf einer 96-Napfplatte überimpft und bei 37°C für eine Testkultur kultiviert. Anschließend wurde das Medium gegen α-MEM ausgetauscht, welches kein fötales Kälberserum enthielt, zu denen die in den Beispielen 1–5 erhaltenen Fraktionen gegeben wurden, so dass deren Endkonzentration 10 μg/ml betrug, und bei 37°C 18 Stunden lang kultiviert. Anschließend wurden die Zellen 2 Stunden nach Zugabe von 0,02 MBq ³H-Thymidin auf einem Filterpapier mit einem Zellernter gesammelt, und die in den Zellen eingelagerte Radioaktivität wurde mit einem Flüssigszintillations-Zähler gezählt, um die Wirkung auf die Osteoblasten-Proliferation zu bestimmen. Als Kontrollgruppe wurde eine Kultur ohne Zugabe verwendet. Die proliferative Wirkung wurde in jedem Fall berechnet, indem jene Gruppe als „100%" definiert wurde in dem Fall, in welchem keine Zugabe zur Kultur erfolgte, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Im Vegleich zur proliferativen Wirkung der Gruppe, der nicht zugegeben wurde, war jene einer jede Gruppe, der eine in den Beispielen 1–5 erhaltene Substanz zugesetzt wurde, höher, was zeigt, dass sie eine Wirkung zur Förderung der Osteoblasten-Proliferation besitzen. Und ähnliche Ergebnisse wurden im Fall der Testkultur unter Verwendung der anderen Osteoblasten-Zelllinie UMR erhalten.
Testbeispiel 2
Die in den Beispielen 1–5 erhaltenen Substanzen wurden in Bezug auf deren hemmende Wirkung auf die Knochenresorption untersucht. Lange Knochen wurden aus 10–20 Tage alten ICR-Mäusen präpariert, und die gesamten Knochemarkszellen, einschließlich der Osteoblasten, wurden durch Entfernung des weichen Gewebes aus den Knochen und durch mechanisches Zerhacken der Knochen in α-MEM erhalten, das 5% fötales Kälberserum enthielt. Etwa 2 × 10⁶ dieser Zellen in α-MEM, das 5% fötales Kälberserum enthielt, wurden auf ein Stück Dentin platziert. 2 Stunden später wurde eine Testprobe in α-MEM, das 5% fötales Kälberserum enthielt, hierzu zugegeben, so dass deren Endkonzentration 10 μg/ml betragen würde, und sie wurde 5 Tage kultiviert, und die Aktivität der Knochenosteoblasten-Resorption wurde untersucht. Die Analyse der Knochenresorption wurde ausgeführt, indem die Zellen von einem Stück Dentin nach dessen Kultivierung entfernt wurden, sie mit Hämatoxylinfarbstoff gefärbt und die Anzahl der durch Knochenresorption erzeugten Löcher durch morphometrische Analyse mit PIAS LA-555 gezählt wurden. Als Kontrollgruppe wurde eine Kultur ohne Zugabe verwendet. Die knochenresorbierende Aktivität eines jeden Falles wurde berechnet, indem jene Gruppe als „100%" definiert wurde in dem Fall, in welchem nichts zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Im Vergleich der knochenresorbierenden Wirkung derjenigen Gruppe, der nichts zugegeben wurde, war diejenige Wirkung einer jeden Gruppe, der eine in den Beispielen 1–5 erhaltene Substanz zugegeben wurde, stärker gehemmt. Daher wurde gefunden, dass sie eine Wirkung der Hemmung der Knochenresorption hatten.
Beispiel 6
Ein Getränk mit der Wirkung der Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption wurde hergestellt, indem die in Tabelle 3 aufgeführten Ausgangsmaterialien gemischt, in ein Behältnis zusammengepresst und durch Erhitzen sterilisiert wurden. Tabelle 3

Gemischter isomerisierter Zucker 15,0 (Gew.-%)

Fruchtsaft 10,0

Zitronensäure 0,5

die in Beispiel 3 erhaltene Substanz 0,0005

Geschmacksstoff 0,1

Calcium 0,5

Wasser 73,9
Beispiel 7
Eine Tablette mit der Wirkung der Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption wurde hergestellt, indem die in Tabelle 4 aufgeführten Ausgangsmaterialien gemischt und unter Druck formuliert wurden. Tabelle 4

Kristallines Glucosehydrat 93,5 (Gew.-%)

die in Beispiel 2 erhaltene Substanz 0,05

Calcium 5,0

Zuckerester 1,0

Geschmacksstoff 0,5
Beispiel 8
Ein Cräcker mit der Wirkung der Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption wurde hergestellt, indem die in der Tabelle 5 aufgeführten Ausgangsmaterialien gemischt, ein Teig hergestellt, formuliert und dieser gebacken wurde. Tabelle 5

Weizenmehl 50,0 (Gew.-%)

Zucker 20,0

Natriumchlorid 0,5

Margarine 12,5

Ei 12,1

Wasser 3,7

Natriumbicarbonat 0,1

Ammoniumbicarbonat 0,2

Calciumcarbonat 0,1

die in Beispiel 2 erhaltene Substanz 0,005
Beispiel 9
Ein Gelee mit der Wirkung der Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption wurde hergestellt, indem die in der Tabelle 6 aufgeführten Ausgangsmaterialien gemischt, in einem Behältnis zusammengepresst und durch Erhitzen sterilisiert wurden. Tabelle 6

Fructose 20,0 (Gew.-%)

Granulierter Zucker 15,0

Miller-Gelee 5,0

Agar 1,0

die in Beispiel 4 erhaltene Substanz 0,0005

Geschmacksstoff 0,11

Calcium 0,1

Wasser 58,39
Beispiel 10
Ein verarbeiteter Käse mit der Wirkung der Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption wurde hergestellt, indem die in Tabelle 7 aufgeführten Ausgangsmaterialien gemischt und bei 85°C emulgiert wurden. Tabelle 7

Gouda-Käse 43,0 (Gew.-%)

Cheddar-Käse 43,5

Natriumcitrat 0,2

die in Beispiel 1 erhaltene Substanz 0,005

Calcium aus Milch 1,0

Wasser 10,5
Beispiel 11
Nach dem Sterilisieren einer um 12 Gew.-% reduzierten entrahmten Milch bei 90°C für 20 Minuten wurden Lactobacillus acidophilus und Streptococcus thermophilus darauf überimpft, um zwei Arten von Starterkulturen zu ergeben, welche im gleichen Ausmaß gemischt wurden. Ein Joghurt mit der Wirkung der Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption wurde hergestellt, indem die in Tabelle 8 aufgeführten Ausgangsmaterialien gemischt und fermentiert wurden. Tabelle 8

Joghurtmischung 97,0 (Gew.-%)

Starterkultur 3,0

die in Beispiel 1 erhaltene Substanz 0,0005
Beispiel 12

Eine Trockenmilch für Kleinkinder mit der Wirkung der Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption wurde hergestellt, indem die in Tabelle 9 aufgeführten Ausgangsmaterialien gemischt wurden. Tabelle 9

entrahmte Milch	75,61 (Gew.-%)
Molkenprotein-Kondensat	2,36
Lactose	13,86
Mineralmischung	0,32
wasserlösliche Vitaminmischung	0,32
Fett mit fettlöslichem Vitamin	7,53
die in Beispiel 1 erhaltene Substanz	0,001

Beispiel 13

Ein Hundefutter mit der Wirkung der Förderung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption wurde hergestellt, indem die in Tabelle 10 aufgeführten Ausgangsmaterialien gemischt wurden. Tabelle 10

Sojabohnenkuchen	12,0
Magenmilchpulver	14,0
Sojabohnenöl	4,0
Maisöl	2,0
Palmöl	28,0
Maisstärke	15,0
Weizenmehl	9,0
Weizenkleie	2,0
Vitaminmischung	9,0
Mineralmischung	2,0
Cellulose	3,0
die in Beispiel 1 erhaltene Substanz	0,001

Claims

Verwendung eines Mittels, umfassend als wirksamen Bestandteil ein Protein und/oder ein Abbauprodukt desselben, dessen N-terminale Aminosäuresequenz Gly-Lys-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-Phe-Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Lys-His ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Knochenbildung oder Inhibierung der Knochenresorption.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Protein, dessen N-terminale Aminosäuresequenz Gly-Lys-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-Phe-Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Lys-His ist, das HMG (high-mobility-group) Protein ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Protein, dessen N-terminale Aminosäuresequenz Gly-Lys-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met-Ser-Ser-Tyr-Ala-Phe-Phe-Val-Gln-Thr-Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Lys-His ist, Amphoterin ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Protein und/oder das Abbauprodukt desselben mit Calcium kombiniert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das Abbauprodukt des Proteins eine Peptidmischung mit einem Molekulargewicht von 100–20.000 Da (bestimmt durch HPLC-Gelpermeationschromatographie) ist, erhalten aus dem begrenzten Abbau von HMG Protein oder Amphoterin durch Protease.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mittel mit einem Getränk oder Nahrungsmittel kombiniert wird.