DE69627839T2

DE69627839T2 - Caseinphosphopeptide und dasselbe enthaltende casein, sowie verfahren in dessem herstellung

Info

Publication number: DE69627839T2
Application number: DE69627839T
Authority: DE
Inventors: Kee Sang Kwanak-ku HAN; Cheol Yoo Kangdong-ku SHIN
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-03-23
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2016-03-23
Also published as: CA2216250A1; KR960034216A; WO1996029340A1; KR0140248B1; DK0815130T3; CN1182435A; DE69627839D1; JP3128244B2; US5834427A; CN1136228C; EP0815130A1; AU714587B2; JPH11501047A; EP0815130B1; CA2216250C; AU5124696A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen ein Caseinphosphetid mit einer neuen Aminosäurensequenz, ein beta-Casein H enthaltend dasselbe und ein Verfahren zu deren Herstellung. Im besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein Caseinphosphetid mit einer neuen Aminosäurensequenz, die Mineralstoffe löslich macht, um eine Absorption dieser im Verdauungstrakt in Tieren zu unterstützen.
Beschreibung des Standes der Technik
Eine Fettleibigkeit ist eine der gefährlichsten Risiken, die Gesundheit moderner Menschen zu bedrohen, die im wesentlichen von Nahrungsmitteln und Getränken mit vielen Kalorien und unzureichenden Vitaminen und Mineralstoffen herrührt. Es ist bekannt, dass solche unausgewogene Nahrungsmittel für Krankheiten von Er wachsenen, wie z. B. Osteoporosis, verantwortlich sind. Viele Forscher haben versucht, ein oder mehrere unzureichende Mineralstoffe zu den Nahrungsmitteln hinzuzufügen, um ausgewogene Nahrungsmittel herzustellen. Dennoch haben sich die meisten dieser Versuche als nicht erfolgreich herausgestellt, weil die Hinzufügung eines Mineralstoffes zur Absorption, Inhibierung oder zur Abnahme von anderen Mineralstoffen in Tieren führt. Demgemäß ist es erwünscht, die Absorptionsrate der Mineralstoffe in Tieren ohne Zusatz von Mineralstoffen zu den Nahrungsmittel zu erhöhen.
Im allgemeinen sollen Mineralstoffe in einem gelösten Zustand gehalten werden, um in Tieren absorbiert zu werden. Gleichwohl verschiebt sich deren pH von einem neutralen zu einem alkalischen Zustand, da der Inhalt durch den Dünndarm in Tieren wandert. In Übereinstimmung mit dem Wechsel des pH im Dünndarm wird eine große Menge der Mineralstoffe unlöslich, was zu einer Ausfällung führt. In Bezug auf eine Absorption von Calcium, wenn Calcium durch den Dünndarm wandert, nimmt die Menge des gelösten Calciums in umgekehrtem Verhältnis zu einem Anstieg des pH darin ab.
Ein Casein ist eine Art von Protein, das in Rindermilch oder humaner Milch enthalten ist, und von α-, β- und γ-Typen wurde hier berichtet. Insbesondere besitzt β-Casein die Varianten A¹, A², A³, B, C, D, und E, deren primäre Strukturen bereits vorgeschlagen wurden (W. N. Eigel, et al, Nomenclature of Proteins of Cow's milk (5th Revision), J. Dairy Sci. Vol. 67, No. 8, pp. 1607–8 (1984)).
Weiterhin ist ein Caseinphosphetid (im folgenden als „CPP" bezeichnet) in einem Casein, das in Milch angereichert ist, enthalten. Bis heute wurde erkannt, dass CPP eine wichtige Substanz ist, welche die Absorptionsrate von Mineralstoffen in Tieren erhöhen kann.
Da CPP oder ein CPP enthaltendes Casein die Fähigkeit zur Lösung von Mineralstoffen wie Calcium und Eisen in wässriger Lösung hat, sind viele Versuche unternommen worden, ausgewogene Nahrungsmittel oder Getränke durch Verwendung von CPP herzustellen, um eine Unterversorgung mit Mineralstoffen in Tieren zu behandeln oder zu lindern.
Unabhängig von den Varianten A¹, A², A³, B, C, D und E des β-Caseins bleibt deren Struktur und Aminosäurensequenz des hieraus hergestellten CPP gleich, die im folgenden dargestellt ist:
wobei Ser(P) ein phosphoryliertes Serin darstellt.
Wie oben dargestellt, besitzt ein konventionelles CPP 25 Aminosäuren; und drei aufeinanderfolgende Phosphoserine und zwei danach folgende Glutaminreste bilden einen stark negativen Ladungsbereich, wodurch eine aktive Seite im Hinblick auf Calcium bereitgestellt wird (Naito, „The Mechanism of Enhancement in Intestinal Calcium Absorption with Phosphopeptides Derived during Casein Digestion", J. of Japanese Nutr. And Food, Vol. 39, No. 6, pp. 443–439, (1986)). Von Naito wurde vorgeschlagen, dass CPP die Absorption von Eisen genauso wie von Calcium im Dünndarm in Tieren erhöht.
Es ist bekannt, dass, wenn ein Casein enthaltend CPP Tieren zusammen mit Calcium zugeführt wird, das gelöste Calcium im Dünndarm in Tieren im Vergleich zu einer Zufuhr von Calcium alleine signifikant ansteigt. Während ein aktiver Transport im oberen Dünndarm in der Calciumabsorption vorherrscht, dominiert der passive Transport im unteren Dünndarm basierend auf einem Konzentrationsgleichgewicht. Es wird außerdem vorgeschlagen, dass Vitamin D und Lactose die Absorption von Calcium in Tieren weiter verbessert. Obwohl sich eine hohe Absorptionsrate von Calcium im oberen Bereich des Dünndarms, z. B. dem Zwölffingerdarm in Tieren, zeigt, ist die Retentionszeit des Inhalts so kurz, dass die gesamte Menge der Calciumabsorption darin relativ gering ist. Im Gegensatz dazu, aufgrund der langen Retentionszeit der Nahrungskost, ist das im unteren Bereich des Dünndarms angeordnete Ileum ein wichtiger Bereich, in dem eine große Menge von Calcium absorbiert wird. Tatsächlich werden 62 oder 88% Calcium im Ileum von Ratten absorbiert; und die Calciumabsorption in einem menschlichen Körper, aus dem das Ileum herausgeschnitten wurde, nimmt stark ab. Es ist demgemäß verständlich, dass CPP eine wichtige Rolle in der Calciumabsorption spielt (Sato et al., „Casein phosphopeptide contributing to an absorption of Ca in dairy product", Chemistry and Biology, Vol. 23, No. 7, p. 418 (1985)).
Sato et al. haben weiter berichtet, dass eine Serie von Experimenten durchgeführt wurde, um die Bedeutung von Phosphatresten in Casein festzustellen. In den Experimenten wurden vier Gruppen von Ratten mit ein phosphoryliertes Casein enthaltenden Nahrungsmitteln, einem dephosphorylierten Casein, einem Gluten und einer Gelatine gefüttert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Gruppe, die mit einem phosphorylierten Casein gefüttert wurde, die höchste Menge an gelöstem Calcium und den höchsten Wert in der Calciumabsorptionsrate im Dünndarm in den Tieren zeigte. CPP kann auch aus Rindermilch durch tryptischen Verdauung hergestellt werden (Sato et al., „The Necessity for the Phosphate Portion of Casein Molecules to Enhance Ca Absorption from the Small Intestine", Agric. Biol. Chem. Vol. 47, No. 10, pp. 2415–7 (1983)).
Gordon beschrieb ein Verfahren zur Extraktion eines Caseins aus Milch einschließlich: Entfernung des Fetts von der Milch, Zusatz von Salzsäure zum Produkt, um einen pH von 4,6 zu erreichen, Zentrifugation des ausgefällten Caseins und Dehydrierung und Gefriertrocknung des Produkts (W. G. Gordon et al., Fundamentals of Dairy Chemistry, 2th ed., AVI Publishing Co. (1974)). Spellacy schlug ebenfalls ein Verfahren zur Ausfällung eines Caseins aus Milch durch Hinzufügung von Lactamsäure hergestellt aus Streptococcus lactis (J. R. Spellacy, Casein, Dried and Condensed Whey, Lithotype Process Co. (1953)) vor. Fox lehrte die Technologie des Hinzufügens eines Labs um ein Casein aus Milch auszufällen (K. K. Fox, Byproducts from Milk, 2th ed., AVI Publishing Co. (1970)).
Für ein wie oben erhaltenes Casein wurde über verschiedene Verfahren zur Herstellung eines konventionellen CPP berichtet. Peterson lehrte ein Verfahren umfassend: Durchführung einer tryptischen Hydrolyse eines Caseins, Einstellung des pH des Hydrolysats auf 4,7, Entfernung des nicht reagierten Caseins, Zusatz von BaCl₂ und Ethanol zu dem Flüssigkeitsüberstand des Hydrolysats und Gewinnung des CPP (R. F. Peterson et al., J. Amer. Chem. Soc., Vol. 80, p. 95 (1958)).
Naito zeigte ein Verfahren zur Herstellung von CPP umfassend: Aufschluss eines Caseins durch ein verdauendes Enzym, Isolierung des groben CPP durch Gelfiltration von Sephadex G-25 und Reinigung des CPP durch Passieren der groben Mischung durch ein Ionenaustauschharz (Naito et al., Agric. Biol. Chem., Vol. 38, p. 1543. (1974)).
Ebenso offenbart das US-Patent 4,361,587 ein Verfahren zur Herstellung von Phosphopeptiden umfassend: Enzymatische Hydrolyse des Caseins, Gewinnung des resultierenden Hydrolysats, eine erste Membran-Ultrafiltration des besagten Hydrolysats, Gewinnung des Retentats, Aufschluss der darin enthaltenen Phosphopeptide, zweite Membran-Ultrafiltration des die aufgeschlossenen Phosphopeptide enthaltenden Retentats.
Die japanische Patentschrift Nr. Sho 59-159793 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von CPP umfassend: Tryptische Hydrolyse eines Caseins zur Herstellung von CPP, Zusatz eines bivalenten Eisenions zu dem resultierenden Hydrolysat, um CPP auszufällen und zu gewinnen.
Weiterhin zeigt die koreanische Offenlegungsschrift Nr. 93-10190 eine Verwendung von proteolytischen Enzymen erhalten aus Streptococcus faccalis var. liquefaciens.
Ein Casein oder CPP sind in weitem Umfang für verschiedene Zwecke eingesetzt worden. Durch Ausnutzung des Effekts des Auflösens von Mineralstoffen offenbart die japanische Offenlegungsschrift Nr. Hei 5- 336894 Gesundheitsnahrungsmittel angereichert mit CPP. Die japanische Offenlegungsschrift Nr. Hei 5-176712 lehrt außerdem Nahrungsmittel enthaltend CPP und alkalische Phosphatase. Weiterhin zeigt die japanische Offenlegungsschrift Nr. Hei 4-299942 ein verbessertes Vogelfutter enthaltend CPP.
Sowohl die PCT Offenlegungsschrift Nr. WO 94/00146 als auch das US-Patent Nr. 5,015,628 haben eine orale Zusammensetzung vorgeschlagen, die CPP enthält um Zahnstein oder eine dentale Überempfindlichkeit zu verhindern oder zu lindern. Zusätzlich lehrt die japanische Offenlegungsschrift Nr. Hei 1-269499 ein Verfahren zur Herstellung eines Haut- oder eines Haarpflegeprodukts enthaltend CPP.
Zusammenfassung der Erfindung
Die betroffenen Erfinder sind bestrebt gewesen, die Absorption von Mineralstoffen im Dünndarm in Verbin- dung mit CPP zu verbessern und fanden letztlich ein neues CPP, das sich in seiner Struktur und der Aminosäurensequenz von denen eines konventionellen CPPs unterscheidet. Das erfinderische CPP mit einer neuen Aminosäurensequenz, hier bezeichnet als SEQ. ID NO: 1 besitzt 18 Aminosäuren, wobei die 25. Arg des N-Endes im konventionellen CPP durch Cys ersetzt ist. In der korrespondierenden DNA-Sequenz ist Cytosin durch Thymin ersetzt, um den Aminosäurenersatz von Arginin (Arg) durch Cystein (Cys) zu verursachen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist es, dass ein neues Casein einschließlich des löslichen CPP, das von den betroffenen Erfindern als „beta-Casein H" bezeichnet wurde, bereitgestellt wurde.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein neues CPP mit einer Aminosäurensequenz von SEQ. ID NO: 1 bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues beta-Casein H bereitzustellen, das das erfinderische CPP mit der Aminosäurensequenz von SEQ. ID NO: 1 enthält.
Noch einer weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die entsprechenden Verfahren zur Herstellung des erfinderischen CPP und des beta-Caseins bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Zusammensetzungen für verschiedene nützliche Zwecke bereitzustellen, die das erfinderische CPP oder das beta-Casein H enthalten.
Kurze Beschreibung der Figuren
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen offenbart. Hierbei sind:
1 ist eine Fotographie der Elektrophorese im Hinblick auf das beta-Casein H gemäß der vorliegenden Erfindung;
2(a) ist ein Chromatogramm, das den beta-Casein-Peak nach Passieren des Caseins einer Anionaustauschersäule zeigt;
2(b) ist ein Chromatogramm, das den spezifischen beta-Casein H-Peak nach Passieren des beta-Caseins von 2(a) durch eine erste Ka tionaustauschersäule;
2(c) ist ein Chromatogramm, das den spezifischen beta-Casein-Peak nach Passieren des beta-Casein-H von 2(b) durch eine zweite Kationaustauschersäule zeigt;
3 ist ein HPLC-Chromatogramm, das den spezifischen Peak von CPP gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt; und
4 ist ein Diagramm, das einen Teil der DNA-Sequenz des CPP gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Proteine und Mineralstoffe tendieren im allgemeinen dazu, aneinanderzubinden, wobei die Arten und Stärke solcher Bindungen stark von deren höherer Struktur, z. B. der sekundären oder tertiären Struktur abhängig ist (Naito, „The Mechanism of Enhancement in Intestinal Calcium Absorption with Phosphopeptides Derived during Casein Digestion", J. of Japanese Nutr. and Food, Vol. 39, No. 6, pp. 433, 436, (1986)). Aufgrund der Unterschiede der Aminosäurensequenz und der primären Struktur zeigen das erfinderische CPP und das das CPP enthaltende beta-Casein H eine verbesserte Fähigkeit, die Mineralstoffe einschließlich Calcium im Dünndarm zu lösen; und daher bringt dies natürlicherweise eine Verbesserung der Absorption von Mineralstoffen in Tieren mit sich.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neues CPP bereitgestellt mit einer neuen Aminosäurensequenz von SEQ. ID NO: 1. In der vorliegenden Sequenz ist das 25. Arg des konventionellen CPP durch Cys ersetzt. Zusätzlich hat das neue CPP drei Aminosäuren von Isoleucin (Ile), Asparagin (Asn) und Lysin (Lys) nach dem 25. Zystein; daher hat das erfinderische CPP 28 Aminosäuren. Aufgrund des Cys tendieren die neuen CPPs untereinander zur Bildung eines Dimers über eine Disulfid-Bindung.
Wie bereits vorgeschlagen, bilden drei aufeinanderfolgende Phosphoserine (17. bis 19.) und zwei Glutaminsäurereste (20. und 21.) einen stark negativen Ladungsbereich, der eine aktive Seite in Hinblick auf ein Calcium darstellt (Naito, supra). Es ist so zu verstehen, dass ein Dimer der neuen CPPs eine Stabilität des zuvor genannten aktiven Bereiches von drei Phosphoserinen und zwei Glutaminsäuren schützt; und dass daher das erfinderische CPP eine verbesserte Fähigkeit zur Lösung von Mineralstoffen hat.
Während das vorliegende CPP 28 Aminosäurenreste hat, ist es empfänglich für eine proteolytische Hydrolyse, insbesondere zwischen der 3. Leu und der 4. Glu, und zwischen der 6. Leu und der 7. Asn vom N-Ende. Demgemäß können zwei Typen von Fragmenten im Dünndarm in Tieren hergestellt werden, z. B. hat der eine 25 Reste, wobei Arg-Glu-Leu entfernt ist, und der andere hat 22 Reste, wobei Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Reste vom N-Ende entfernt sind. Jedoch hat jeder Typ von Fragmenten, der durch Hydrolyse hergestellt wurde, eine CPP-Funktion, Mineralstoffe im Dünndarm zu lösen, solange sie die aktive Seite (17. bis 21. Rest) haben. Demgemäß ist es anerkannt, dass alle Fragmente, die die aktive Seite (17. bis 21. Rest) und das 25. Cys in der Peptidsequenz von SEQ. ID NO: 1 in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen sollen.
In der vorliegenden Erfindung wird ein beta-Casein H bereitgestellt, das das erfinderische CPP enthält, welches eine aktive Seite gegenüber Mineralstoffen besitzt; und das daher das beta-Casein H auch Mineralstoffe im Dünndarm in Tieren löst.
Es sollte beachtet werden, dass das erfinderische CPP oder das beta-Casein H an sich verwendet werden kann oder in der Form seines Alkalimetall-, Erdalkalimetall- oder Übergangsmetallsalzes. Typische Beispiele sind ein Natrium-, Calcium-, Calciumphosphat-, Calciumfluoridphosphat-, Eisen-, Zink-, Kalium- und Magnesium-Salz.
Als weiterer Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von beta-Casein H enthaltend das CPP mit der Aminosäurensequenz von SEQ. ID NO: 1 bereitgestellt, umfassend die Schritte: Auswahl von Milch enthaltend das beta-Casein H, Zusatz einer Säure oder eines Labs zur Milch zur Ausfällung, und Gewinnung des ausgefällten beta-Casein H.
In dem Verfahren wird die Auswahl der Milch enthaltend ein beta-Casein H durch eine Elektrophorese durchgeführt, welche eine charakteristische Bande in 1 zeigt. Repräsentative Beispiele von Säuren, die vorzugsweise der Milch zugefügt werden können, schließen Salzsäure und Lactamsäure ein. Das ausgefällte beta-Casein H kann durch Chromatographie wiedergewonnen werden. Es ist bevorzugt, dass eine Anionenaustauscher-Chromatographie und anschließend eine Kationenaustauscher-Chromatographie durchgeführt wird.
Nach noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Er findung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Caseinphosphopeptids mit einer Aminosäurensequenz von SEQ. ID NO: 1 bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst: Auswahl eines beta-Caseins H, Hydrolyse des beta-Caseins H durch Zusatz von einem oder mehreren Proteasen, Zusatz von einem oder mehreren anorganischen Ionen zum Hydrolysat zur Ausfällung eines Peptids, und Wiedergewinnung des ausgefällten Phosphopeptids.
Das beta-Casein H kann durch die eigentümliche Bande, wie sie in 1 als Ergebnis einer Elektrophorese dargestellt ist, identifiziert werden.
In den obigen Verfahren können verschiedene Typen von Proteasen verwendet werden, typische Beispiele hierfür sind Trypsin, Pancreatin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Pronase und Thermolysin. Die Protease wird bevorzugt in einer Menge zwischen 0,001 bis 2 Gew.-%, bezogen auf das Casein, zugemischt.
Das anorganische Ion wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fe, Ca, Ba, Cu, Zn, Mn und Co. Unter diesen ist das Eisenion bevorzugt, für das FeCl₃ als Quelle benutzt wird. Wenn die Konzentration des anorganischen Ions erhöht wird, steigt der Ausfällungsanteil: Jedoch kann sich die Reinheit von CPP verschlechtern. Demgemäß liegt die bevorzugte Konzentration des anorganischen Ions zwischen 5 bis 50 mMol. Wenn Ethanol zusammen mit dem anorganischen Ion zugesetzt wird, setzt sich die Ausfällung von CPP effektiv fort.
Anstelle des Zusatzes eines anorganischen Ions kann das Hydrolysat einer Chromatographie, wie einer HPLC oder Gelfiltration-Chromatographie unterzogen werden.
Zusätzlich kann das CPP in Übereinstimmung mit der vorliegende Erfindung durch eine chemische Synthese betreffend deren Aminosäurensequenz von SEQ. ID NO: 1 hergestellt werden. Weiterhin kann ein Mikroorganismus, der die genetische Information von SEQ. ID NO: 1 enthält, durch ein konventionelles Transformationsverfahren für die Herstellung des zu erzeugenden CPP hergestellt werden. Weiterhin kann ein transgenes Tier durch Einführung der genetischen Information von SEQ. ID NO: 1 in das Tier, das ein anderes als ein Rind ist, wie ein Schaf und eine Ziege, gezüchtet werden. Da der Gegenstand CPP oder das beta-Casein H aus das beta-Casein H enthaltender Milch hergestellt wird, ist es erforderlich, Milch, die das beta-Casein H enthält, in großen Mengen herzustellen. Zu diesem Zweck wird ein Verfahren zur Herstellung von Milch, die ein beta-Casein H enthält, bereitgestellt, das die Schritte umfasst: Auswahl eines individuellen Rindes, das das beta-Casein H enthaltende Milch liefert, Hybridisierung des besagten Rindes mit einer anderen Rinderrasse, die viel Milch liefern, zum Erhalt von F1-Abkömmlingen, Auswahl einer Kuh unter den besagten F1-Abkömmlingen, die beta-Casein H-haltige Milch liefert, und Gewinnung von beta-Casein Hhaltiger Milch von der besagten Kuh.
Um ein individuelles Rind des beta-Caseins H auszuwählen, wird von einem Rind extrahiertes DNA enthaltendes Material, wie Blut, Gewebe und Samen, hinsichtlich der DNA-Sequenz analysiert, um diese mit der hier betroffenen Sequenz von SEQ. ID NO: 1 zu vergleichen. Als Alternative kann eine Elektrophorese der Milch durchgeführt werden, um eine eindeutige Bande wie in 1 gezeigt, zu finden. Das ausgewählte, individuelle Rind des beta-Casein H wird dann mit einer anderen Rinderspezies gepaart, die viel Milch liefert, z. B. der Holstein-Spezies. Es wurde erkannt, dass einige davon erhaltene Abkömmlinge (F1) eine genetische Information des beta-Casein H enthalten, die Milch liefern, die das gewünschte beta-Casein H enthält. Ein derart ausgewähltes, verbessertes Rinderindividuum liefert das beta-Casein H enthaltende Milch mit einer hohen Ergiebigkeit, was am besten für die Massenherstellung des beta-Casein H gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung für Gesundheitsnahrungsmittel oder Gesundheitsgetränke bereit, die das CPP oder das beta-Casein H und genießbare Träger umfasst. Die Zusammensetzung kann weiterhin Vitamin D und Lactose umfassen, um eine Absorption der Mineralstoffe zu fördern. Die Zusammensetzung kann vorzugsweise Mineralstoffe wie Eisen und Calcium umfassen, um Tieren Mineralstoffe zuzuführen. Beispiele der Zusammensetzung schließen ein: Milch, Milchpulver für Babys oder Patienten, Joghurts (flüssiger, cremiger oder gefriergetrockneter Typus), Käse, Entwöhnungsdiät, Süßwaren, Brote, Eiscremes, Bohnenquark, Süßigkeiten, gefrorene Süßigkeiten, öl- und honighaltiges Gebäck, Schokolade, Karamell, natürliche und künstliche Säfte, gekochte Fischpaste, Durstlöscher (isotonische Sportgetränke), Teepulver, Mayonnaise, Dressings und ähnliches.
Insbesondere wird das CPP oder das beta-Casein H gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zu Lactose-freien Nahrungsmitteln für Kinder oder Erwachsenen, die darauf allergisch reagieren, zugesetzt. Als weiterer Aspekt dieser Erfindung wird eine medizinische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein beta- Casein H oder ein CPP mit einer Aminosäurensequenz von SEQ. ID NO: 1 in einer wirksamen Menge für die Vorbeugung, Behandlung oder Linderung einer durch eine Unterversorgung mit Mineralstoffen in Tieren begründete Krankheit sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält. Die durch eine Unterversorgung mit Mineralstoffen begründete Krankheit, wie Osteoporosis oder Anemia, kann durch orale Verabreichung der obigen medizinischen Zusammensetzung behandelt oder gelindert werden. Das CPP oder das beta-Casein H in der medizinischen Zusammensetzung kann in einer Menge von 0,1 g bis 100 g pro Tag verabreicht werden. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise Mineralien wie Eisen oder Calcium.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine orale Zusammensetzung bereit, die das erfinderische CPP oder das beta-Casein H und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Die orale Zusammensetzung schließt ein: eine wässrige, wässrig-alkoholische oder alkoholische Lösung oder Dispersion des Caseins oder des CPPs in der Form eines Mundwassers, Zahnreinigungsmittels, Zahnpaste, Zahnpulvers, Gels, Pastille, Tablette, Kaugummi, oder jeder anderen geeigneten Form einer oralen Zusammensetzung. Der pH der Zubereitung liegt vorzugsweise im Bereich von 2 bis 10. Die bevorzugte orale Zusammensetzung kann auch eine wirksame Menge eines Phosphatase-Inhibitors oder eines Phosphopeptid stabilisierendes Reagenzes wie Karrageen (Irisches Moos) und anionischem Polymer enthalten.
Das erfinderische CPP oder das dasselbe enthaltene Casein kann zu einer Zusammensetzung, z. B. Haut- oder Haarpflegemittel, oder einer Futterzusammensetzung in einer wirksamen Menge zur Steigerung der Ab sorption von Mineralstoffen in Tieren, sowie verträglichen Trägern zugesetzt werden.
Aufgrund der ausreichenden Fähigkeit, Mineralstoffe in Tieren zu lösen, zeigen die vorliegenden Zusammensetzungen einschließlich des vorliegenden CPP oder des beta-Casein H verbesserte Eigenschaften gegenüber den vorherigen Zusammensetzungen einschließlich des konventionellen CPP oder des Caseins.
Weil das CPP oder das beta-Casein H eine höhere Eignung zur Lösung von Mineralstoffen besitzt, wird es natürlich für jeglichen oben genannten Zweck verwendet, wodurch die Produkte, die dieselben einschliessen, effektiver werden.
Die folgenden Beispiele sind nur zum Zweck der Illustrierung angegeben und bezwecken nicht den Schutzbereich der Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1: Herstellung von beta-Casein H gemäß der vorliegenden Erfindung
Rindermilch wurde bei 5000 U/min 20 min lang zentrifugiert, worauf die Entfernung der über der Flüssigkeit stehenden Fettschicht folgte. Das Produkt wurde zu einem Stärkegel (Connought Medical Research Lab) zugesetzt; eine Elektrophorese wurde bei 150 V über 12 Stunden durchgeführt, wobei ein Puffer (pH: 1,5) bestehend aus 850 ml entionisiertem Wasser, 100 ml Essigsäure und 50 ml Ameisensäure eingesetzt wurde. Das Gel wurde 30 min lang mit einer 10%igen Nigrosin-Lösung kontrastiert und dann 5 Stunden lang durch Zusatz von 50% Methanol entkontrastiert. Die sich hieraus ergebende Elektrophorese-Fotographie ist in 1 dargestellt, wobei das beta-Casein H durch seine spezifische Bande identifiziert ist.
Rindermilch, bei der sich herausgestellt hatte, dass sie das obige beta-Casein H enthält, wurde dann zentrifugiert, gefolgt von einer Entfernung der Fettschicht von der überstehenden Flüssigkeit. Das Casein-Protein wurde durch Zusatz von Salzsäure ausgefällt und einer Gefriertrocknung unterzogen. 10 g des Caseins wurden unter Erhalt des gereinigten beta-Caseins durch eine Anionenaustauschersäule (Modell: Mono Q 5/5 hergestellt von Pharmacia Co.) geschickt, wobei 20 mMol eines Imidazol-HCl-Puffers (pH 7,0) verwendet wurde. Das Chromatogramm ist in 2(a) gezeigt.
Das resultierende beta-Casein wurde durch eine erste Kationenaustauschersäule (Modell: Mono S 5/5 hergestellt von Pharmacia Co.) geschickt, wobei 50 mMol eines Natriumacetatpuffers (pH 5,0) verwendet wurde, um das beta-Casein H zu erhalten. Das Ergebnis ist in 2(b) gezeigt. Das Casein wurde durch eine zweite Kationenaustauschersäule geschickt und es ergaben sich 1,5 g des beta-Casein H in reiner Form. Das Chromatogramm ist in 2(c) gezeigt.
Beispiel 2: Herstellung des erfinderischen CPP durch Trypsin-Hydrolyse
Zu dem in Beispiel 1 erhaltenen beta-Casein H wurden 0,01 Gew.-% von Trypsin (hergestellt von Sigma Co.) zugesetzt. Die Mischung wurde in einem Phosphatpuffer zur Hydrolyse bei einer Temperatur von 37°C über 12 Stunden aufgelöst. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Hydrolysat auf 90°C 30 min lang erhitzt, um die darin enthaltenen Enzyme zu deaktivieren. Der pH der Mischung wurde auf 4,6 eingestellt und anschliessend die nicht reagierte Ausfällung entfernt. Das Hydrolysat wurde durch eine HPLC (RP-Säule hergestellt von Merk) mit einem Acetonitril-Puffer geschickt, um reines CPP (Reinheit: 99%) zu erhalten. Das Chromatogramm ist in 3 dargestellt, das einen spezifischen Peak des beta-Caseins H in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung zeigt.
Das gereinigte CPP wurde gefriergetrocknet und dann einem Proteinsequenzer (Applied-Bio System Co.) zugeführt, um die Aminosäurensequenz von SEQ. ID NO: 1 zu erhalten.
Beispiel 3: Herstellung des erfinderischen CPP durch Zusatz eines Eisenions
10 g des beta-Caseins H, das gemäß dem gleichen Prozess wie in Beispiel 1 erhalten wurde, und 0,1 g Trypsin wurden in 100 ml Phosphat zur Hydrolyse bei 37°C über 12 Stunden aufgelöst. Zur resultierenden Lösung wurde FeCl₃ zugesetzt, um eine Konzentration von 20 mMol Fe⁺⁺ der Lösung zu erhalten und es wurden 50% (v/v) Ethanol zugesetzt, um ein Peptid auszufällen. Das so ausgefällte Peptid wurde gefriergetrocknet und dann einer Gelfiltrationschromatographie unterzogen, wobei 1,2 g des CPP (Reinheit: 90%) erhalten wurden.
Beispiel 4: DNA-Analyse des beta-Caseins H
20 ml Blut wurden von einem in Korea einheimischen Rind extrahiert und dann wurde eine DNA gemäß einem konventionellen Verfahren, vorgeschlagen von Sambrook (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. Press, (1989)), gereinigt.
Zur Amplifizierung eines DNA-Fragments, enthaltend die substituierte Aminosäure in dem beta-Caseins, wurde ein Primer gemäß einem Verfahren, vorgeschlagen durch Bosing (Bosing et al., Complete Nucleotide Sequence of the Bovine Beta-casein Gene, Aust, J. Biol. Sci., Vol. 41, p. 527 (1988)), hergestellt. Die DNA-Sequenz des hergestellten Primers lautet wie folgt:
Es wurden 0,5 μg der gereinigten DNA, 0,5 μl jedes Primers (100 pmol/μl), 5 μl dNTP, 5 μl 10XPuffer, 1 μl Tag Polymerase (1 Einheit) und 33 μl destilliertes Wasser gemischt. Die DNA wurde durch 5-minütiges Temperieren auf 94°C denaturiert. Anschließend wurden die PCR(Poylmerase-Kettenreation)-Zyklen 30mal für 60 Sekunden bei 94°C, 60 Sekunden bei 57°C und 60 Sekunden bei 72°C wiederholt. Nach Abschluss der PCR-Reaktion wurde eine 5-minütige Verlängerung festgelegt, um doppelsträngige Helices aus den amplifizierten DNA-Fragmenten zu bilden.
Die amplifizierte DNA wurde durch eine Elektrophorese unter Verwendung von 2% Agarose (Gibco Co.) gereinigt und dann die DNA-Sequenz mittels eines automatischen DNA-Sequenzierers (Applied Bio System Co.) analysiert. Die analysierte DNA-Sequenz für den Teil des CPP, der den substituierten Aminosäurenrest aufweist, ist folgende:
Das Diagramm für die DNA-Sequenzierung ist in 4 dargestellt.
Wie oben gezeigt, ist für die 13. Base in exon 5 das Cytosin durch Thymin ersetzt, was die Ersetzung der Aminosäure von Arg durch Cys im CPP in der vorliegenden Erfindung zeigt.
Beispiel 5: Massenherstellung des beta-Caseins H durch Sekretion der Tiere
Für die Massenherstellung des beta-Caseins H auf dem Wege der Sekretion der Tiere wurde ein koreanischer Bulle (A¹H-Typ), der die genetische Information des durch das in Beispiel 4 gezeigte Verfahren identifizierte beta-Casein H aufweist, mit fünf Holstein-Kühen (zwei vom A¹A¹-Typ, zwei vom A¹A²-Typ und eines com A²A²-Typ) gepaart, um zwei männliche Kälber und drei weibliche Kälber zu gebären. Die DNA-Analysen für die drei weiblichen Kälber wurden durchgeführt und ergaben ein weibliches Kalb (A¹H) und ein männliches Kalb (A²H) des beta-Caseins H als Heterozygote.
Das so erhaltene weibliche Kalb (F1) mit der genetischen Information des beta-Caseins H (A¹H) wurde gezüchtet und wurde 28 Monate nach seinem Geburtstag trächtig. Bei der hierdurch gelieferten Milch wurde festgestellt, dass diese beta-Casein H mit einer Ausbeute von ungefähr 4,5 kg pro Tag enthält. Das ist eine Milchproduktivität der Kuh (F1), die dreimal höher ist als die des vorherigen koreanischen Rindes des beta-Casein H.
Beispiel 6: Wirksamkeitstest für den Calcium-lösenden Effekt In vivo
Vierzig Wister-Ratten mit einem Gewicht von etwa 120 g im Durchschnitt wurden mit einer kontrollierten Diät bestehend aus 24 Gew.-% roher Proteine, 5 Gew.-% rohen Fetts, 60 Gew.-% Stärke, 5 Gew.-% roher Fasern, 5 Gew.-% Mineralstoffen und 1 Gew.-% Vitaminen für eine Woche versorgt und dann 24 Stunden lang unterfüttert. Die Ratten wurden in vier Gruppen eingeteilt, jede Gruppe bestehend aus zehn Ratten.
Ratten der ersten Gruppe wurden mit einer kontrollierten Diät einschließlich 10 Gew.-% des beta-Caseins H über 1,5 Stunden versorgt.
Ratten der zweiten Gruppe wurden mit einer kontrollierten Diät einschließlich 10 Gew.-% eines konventionellen beta-Caseins für 1,5 Stunden versorgt.
Ratten der dritten Gruppe wurden mit einer kontrollierten Diät einschließlich 1 Gew.-% des CPP gemäß der Erfindung für 1,5 Stunden versorgt.
Ratten der vierten Gruppe wurden mit einer kontrollierten Diät einschließlich 1 Gew.-% des konventio nellen CPP für 1,5 Stunden versorgt.
Allen Ratten wurde ermöglicht, eigenmächtig von der kontrollierten Diät soviel wie möglich zu sich zu nehmen. Eine Stunde nach Beendigung der obigen Fütterung wurden alle Ratten anästhetisiert und die Dünndärme aus ihnen herausgeschnitten. Die Dünndärme wurden mit einer salzhaltigen Lösung gewaschen und dann in zwei Teile aufgeteilt, z. B. den oberen Teil und den unteren Teil.
Anschließend wurde der Inhalt der Dünndärme isoliert, homogenisiert und zentrifugiert. Im Flüssigkeitsüberstand wurde Calcium dreimal mittels eines Atomabsorptionsspektrometers (Perkin Elmer Co.) gemessen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 und 2 dargestellt.
Tabelle 1: Calciumkonzentration im Dünndarm im Fall der Fütterung mit Casein
Tabelle 2: Calciumkonzentration im Dünndarm im Fall der Fütterung mit CPP
Wie oben in Tabelle 1 und 2 gezeigt, ist die durchschnittliche Konzentration des gelösten Calciums in der ersten Gruppe der Ratten, die mit dem beta-Casein H versorgt wurden, bei 58,48 ppm, was in etwa einer Verbesserung von 15% der Menge gegenüber der Ratten der zweiten Gruppe, die mit dem herkömmlichen Casein versorgt wurden, entspricht.
Ebenso ergab die mittlere Konzentration des gelösten Calciums in der dritten Gruppe der Ratten, die mit dem gegenwärtigen CPP versorgt wurden, 68,20 ppm, was einer Verbesserung von 23% der Menge gegenüber der der vierten Gruppe der Ratten, die mit dem herkömmlichen CPP versorgt wurden, entspricht.
Sinngemäß zeigt sich, dass das erfinderische CPP und das beta-Casein H einen unerwarteten, überraschenden Calcium-stabilisierenden Effekt in vivo gegenüber dem konventionellen Casein und CPP zeigt.
Während die Erfindung in Bezug auf eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, sollte es für die Fachleute offensichtlich sein, dass viele Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Geist und Schutzbereich der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.
Sequenz-Protokoll

Claims

Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1.
Casein enthaltend ein Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 (ein beta-Casein H).
Verfahren zur Herstellung eines Caseins enthaltend ein Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 (ein beta-Casein H) mit den Schritten: i) Auswahl von das beta-Casein enthaltender Milch; ii) Zusatz einer Säure oder eines Labferments zu der Milch zur Ausfällung; und iii) Rückgewinnung des ausgefällten beta-Caseins enthaltend ein Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurenfrequenz der SEQ ID NO 1.
Verfahren zur Herstellung eines Caseins enthaltend ein Caseinphophopeptid mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 (ein beta-Casein H) nach Anspruch 3, wobei der Schritt der Auswahl der das beta-Casein enthaltenden Milch mittels einer Elektrophorese durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Caseins enthaltend ein Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO1 (ein beta-Casein H) nach Anspruch 3, wobei der Schritt der Rückgewinnung des ausgefällten beta-Caseins H nachein ander durch Anionenaustausch-Chromatographie und Kationenaustausch-Chromatographie durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Caseinphosphopeptids mit einer Aminosäurenfrequenz der SEQ ID NO 1 mit den Schritten: i) Erhalt eines beta-Caseins in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 3–5; ii) Das beta-Casein H wird einer Hydrolyse durch Hinzugabe von wenigstens einer Protease ausgesetzt; iii) Zusatz von wenigstens einem anorganischen Ion zu dem erhaltenen Hydrolysat zur Ausfällung von Peptiden; und iv) Rückgewinnung des ausgefällten Caseinphosphopeptids.
Verfahren zur Herstellung eines Caseinphosphopeptids mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 nach Anspruch 6, wobei die besagte Protease ausgewählt ist aus der Gruppe Trypsin, Pancreatin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Pronase und Thermolysin.
Verfahren zur Herstellung eines Caseinphosphopeptids mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 nach Anspruch 6, wobei das besagte anorganische Ion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fe-, Ca-, Ba-, Cu-, Zn-, Mn- und Co-Ion.
Verfahren zur Herstellung eines Caseinphosphopeptids mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 nach Anspruch 8, wobei das anorganische Ion ein Fe-Ion ist, für das FeC₁₃ als Quelle verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung eines Caseinphosphopeptids mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 nach Anspruch 6 enthaltend als weiteren Schritt den Zusatz von Ethanol zusammen mit dem anorganischen Ion.
Verfahren zur Herstellung von Milch enthaltend ein ein Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 (ein beta-Casein H) enthaltendes Casein mit den Schritten: i) Auswahl eines individuellen Rindes, das das beta-Casein H enthaltende Milch liefert; ii) Hybridisierung des besagten Rindes mit einer anderen Rinderrasse, die viel Milch sekretieren, zum Erhalt von F1-Abkömmlingen; iii) Auswahl einer Kuh, die beta-Casein H haltige Milch liefert, unter den besagten F1-Abkömmlingen; und iv) Gewinnung von beta-Casein H haltiger Milch von der besagten Kuh.
Verfahren zur Herstellung von ein beta-Casein enthaltender Milch nach Anspruch 11, wobei der Schritt der Hybridisierung zwischen einem in Korea einheimischen Rind und einem Holstein-Rind erfolgt.
Zusammensetzung für Gesundheits-Nahrungsmittel oder -getränke enthaltend ein Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 oder ein Casein enthaltend ein Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 (beta-Casein H) in einer wirksamen Konzentration zur Steigerung der Calcium-Absorption in Menschen und genusstauglichen Trägern.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 enthaltend weiter Calcium oder Eisen.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 enthaltend weiter Vitamin D oder Lactose.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 enthaltend Milch, Milchpulver für Babys oder Patienten, Joghurts (flüssiger, cremiger oder gefriergetrockneter Typus), Käse, Entwöhnungsdiät, Süßwaren, Brote, Eiscremes, Bohnenquark, Süßigkeiten, gefrorene Süßigkeiten, Öl und honighaltiges Gebäck, Schokolade, Karamell, natürliche und künstliche Säfte, gekochte Fischpaste, Durstlöscher (isotonische Sportgetränke), Teepulver, Mayonnaise oder Dressings.
Oral verabreichbare Zusammensetzung zur Behandlung einer Überempfindlichkeit des Dentums enthaltend eine eine Überempfindlichkeit des Dentums reduzierende oder lindernde Konzentration an Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurensequenz der SEQ ID NO 1 oder einem Casein enthaltend ein Caseinphosphopeptid mit einer Aminosäurensequenz oder SEQ ID NO 1 (ein veta-Casein H) und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.