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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Reduktion
von neutralem Blutfett.
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STAND DER TECHNIK
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Unter
den Gemüseproteinen
besitzt ein Sojaprotein nicht nur eine ausgezeichnete Ernährungseigenschaft,
sondern es wurde auch kürzlich
herausgefunden, dass es verschiedene physiologische Wirkungen besitzt
und es wurde ein attraktives Nahrungsmittelmaterial als ein physiologisch
funktioneller Wirkstoff.
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Ein
reduzierender Effekt auf das neutrale Blutfett eines Sojaproteins
wurde bereits festgestellt, basierend auf einem körperfettreduzierenden
Effekt des Sojaproteins, und über
seinen Mechanismus wurde durch Iritani et al., (J. Nutr. 126, 380,
1996) berichtet, dass er ein inhibitorischer Effekt auf die Aktivität einer
Fettsäuresynthetase
in einer Leber ist. Zusätzlich
wurde jedes eines ganzen Sojabohnenglobulins, ein 7S-Globulin und
ein 11S-Globulin auf seinen Effekt auf Fett im Blut und der Leber
untersucht, und es wurde berichtet, dass es im allgemeinen in Bezug
auf die Fähigkeit
Blutcholesterin oder neutrales Fett zu reduzieren besser ist, wenn es
mit Kasein, das ein Tierprotein ist, verglichen wird (Okita et al.,
J. Nutr., 27, 379, 1981).
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Es
wurde auch über
eine 11S-Globulin-Defektsojabohne, sprich eine 7S-globulinreiche
Saat, die durch eine Züchtung
erhalten wurde, berichtet (Breeding Science, 46, 11, 1996) zusammen mit
ihrer Nützlichkeit (Breeding
Science, 50, 101, 2000) und ihrem Patent (
US 6,171,640 B1 ).
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Dennoch
ist es von einem Sojaprotein, einschließlich einem 7S-Globulin, bekannt,
dass es einen Komplex mit Phytat bildet, wodurch die Verdauung des
Sojaproteins nachteilig beeinträchtig
wird (M. A. Ritter, et al., J. Food Sci., 52, 325, 1987).
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Es
wurden auch von Sojabohnen stammende Proteine, Proteine mit hohen
Affinitäten
zu polaren Lipiden als Bestandteile einer cytoplasmatischen Membran,
wie auch einer Proteinkörper-
oder Ölkörpermembran identifiziert
und durch Samoto et al., als "Ölkörper-assoziierte
Proteine" bezeichnet.
Ein Ölkörper-assoziiertes Protein
ist eine allgemeine Bezeichnung für die Proteine, die hauptsächlich aus
Membranproteinen bestehen, insbesondere diejenigen, deren Molekulargewichte,
gemessen durch eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, 34 kDa, 24 kDa und 18
kDa betrugen, und die als eine Fraktion bestehen, die ungefähr 10 bis
12 Gew.% polarer Lipide enthält,
die mit einer 2:1 polaren Lösungsmittelmischung
von Chloroform:Ethanol extrahierbar sind, und über die durch Samoto et al.
berichtet wurde, dass sie in einer Menge hergestellt werden, die
so hoch ist wie ungefähr
35 % der industriell hergestellten fraktionierten Sojaproteine (B.B.B.,
62 (5), 935–940
(1998)). Ein Ölkörper-assoziiertes Protein
hat einen schlechten Geschmack und eine hohe Allergenität.
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Dennoch
wird, da ein Ölkörper-assoziiertes
Protein bei einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, die heute
zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Sojaproteins verwendet
wird, nur leicht gefärbt
wird, seine geschätzte
Menge weit weniger als seine tatsächliche Menge oder fast vernachlässigbar.
So konzentriert sich eine konventionelle Fraktionierung nur auf
ein 7S und ein 11S und achtet nicht auf die Ölkörper- assoziierten Proteine, die jede Fraktion
kontaminieren. Von einem physiologischen Standpunkt aus sollte das
Verhalten dieser Ölkörper-assoziierten
Proteine jedoch zum Zwecke des Erhaltens des 7S und des 11S in höheren Reinheiten
mit beachtet werden.
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Ein
7S-Globulin effizient aus einem Sojaprotein herzustellen, während die
Phytatbindung als ein Komplex abgespalten wird und die Kontaminierung
mit dem Ölkörper-assoziierten
Proteinen unterdrückt
wird, wodurch die Reinheit erhöht
wird, ist bei der Verwendung nicht nur als ein extrem sicheres pharmazeutisches
Material zur Senkung von neutralem Blutfett, sondern auch als ein
Nahrungsmittel sehr wichtig.
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EP-A-1,174,516 beschreibt
ein Verfahren zur Fraktionierung von Sojaproteinen in eine 7S-globulinreiche
Fraktion und eine 11S-globulinreiche Fraktion.
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EP-A-992,395 beschreibt
ein Verfahren, das die Beimpfung von Koji-Schimmelpilz ("mould") auf Hülsenfrüchte, um
die Kojivermehrung zu bewirken, und die Hydrolyse des resultierenden
Produkts umfasst. Zwischen den Beimpfungs- und Hydrolyseschritten,
werden Bakterien, die darmregulierende Effekte auf Tiere mit Einzelmagen
ausüben,
zu den Hülsenfrüchte zugegeben.
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J.
Nutr. Sci Vitaminal., 1981, 27(4): 379–388 (Okita Takuo et al.) beschreibt
die Effekte von diätetischen Sojaglobulinen
auf Plasma- und Leberlipide und eine fekale Exkretion von neutralen
Sterolen bei Ratten.
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J
Food Sci 1987, 5112: 325–327
und 341 (Ritter MA et al.) beschreibt die in vitro-Verdaubarkeit
von Phytat-reduzierten und Phenol-reduzierten Sojaproteinisolaten.
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AUFGABEN DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe der Erfindung ist es, aus den Sojaproteinen eine Fraktion
zu erhalten, die eine Fähigkeit zur
Reduktion von neutralem Blutfett aufweist, und diese Fraktion zu
behandeln, um ihre Fähigkeit
zu steigern, wodurch sie als ein Nahrungsmittel oder ein Arzneimittel
bereitgestellt wird. Die Erfindung wird durch die Ansprüche definiert.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Wir
untersuchten intensiv und erhielten die folgenden Ergebnisse.
- (1) Wenn ein 11S-Globulin durch ein Verfahren
von Thahn und Shibasaki, das ein Standardverfahren für die Fraktionierung
der Sojaproteine aus einer entfetteten Sojabohne, gefolgt durch
Fraktionierung eines 7S-Globulins
davon, ist, entfernt wird, ist eine Fraktionierung in einer Reinheit,
die so hoch wie 50 % oder höher
ist, möglich,
ohne dass irgendein Reduzierungsmittel verwendet wird.
- (2) Wenn das oben beschriebene 7S-Globulin und ein 7S-Globulin, das nach
der Abspaltung der Phytatbindung an das 7S-Globulin erhalten wurde
(hier im folgenden als ein Phytat-reduziertes 7S-Globulin bezeichnet),
einer Studie bei Ratten für
21 Tage unter Verwendung von Kasein als einer Referenzkontrolle
unterworfen wurden, zeigten das 7S-Globulin und das Phytat-reduzierte
7S-Globulin bessere
neutrale Blutfett-reduzierende Fähigkeiten,
wenn sie mit dem Kasein verglichen wurden, wobei das Phytat-reduzierte 7S-Globulin
einen besonders hohen Neutralfett-reduzierenden Effekt zeigte.
- (3) In Antwort auf den Beginn dieses Neutralfett-reduzierenden Effektes
wird der Cholesterin-Blutspiegel erniedrigt. Während diese Cholesterin-reduzierende
Fähigkeit
durch sowohl das 7S-Globulin wie auch das Phytat-reduzierte 7S-Globulin
gezeigt wird, wird der HDL-Cholesterin (HDLC)-Spiegel eher durch
das Phytat-reduzierte
7S-Globulin verbessert.
Das HDLC ist das sogenannte gute Cholesterin,
das überschüssige Cholesterine
aufnimmt, und ein verbessertes HDLC führt zu einer großen Reduktion
bei dem arteriellen Skleroseindex, wenn es mit einem Gesamtcholesterin-reduzierenden
Effekt kombiniert wird. Arterieller Skleroseindex
= (Gesamtcholesterin – HDL-Cholesterin)/HDL-Cholesterin)
- (4) Durch weitere Behandlung der Sojaproteine mit einem Phytat-abbauenden
Enzym kann ein Niedrig-Phytin-7S-Globulin,
von dem Phytat abgespalten wurde, fraktioniert werden.
- (5) Durch weitere Entfernung eines Membranprotein-reichen Ölkörper-assoziierten
Proteins, das ein Sojaprotein kontaminiert, kann die Wirksamkeit
des 7S-Globulins als ein aktiver Inhaltsstoff weiter gesteigert werden.
Als ein Ergebnis wurde entdeckt, dass durch Abspaltung von Phytat
von einem 7S-Globulin, von dem angenommen wird, dass es einen neutrales
Blutfett-reduzierenden Effekt aufweist, und durch Entfernung der Ölkörper-assoziierten
Proteine, um die Reinheit zu steigern, eine höhere Wirksamkeit zusammen mit
einer korrespondierenden Reduktion bei der Dosis erreicht werden
kann, wodurch die vorliegende Erfindung festgelegt wurde.
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Die
Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Reduktion von neutralem
Blutfett bereit, deren aktive Inhaltsstoffe 7S-globulinreiche Phytat-reduzierte Sojaproteine
sind. Es wird auch eine neutrales Blutfett-reduzierende Zusammensetzung
bereitgestellt, deren aktiver Inhaltsstoff ein Phytat-reduziertes hochgereinigtes 7S-Globulin
ist, das ein 7S-globulinreiches
Sojaprotein ist, das durch Reinigung einer Fraktion, die einen großen Anteil
eines 7S-Globulins als einen Hauptbestandteil der Sojaproteine enthält, auf
eine Proteinreinheit (auf der Basis von SPE, unten beschrieben)
von so viel wie 50 % oder höher
erhalten wird, worin die Chloroform:Methanol-extrahierbaren polaren
Lipide als die Indizes des Ölkörper-assoziierten
Proteins auf einen Spiegel von 1/3 oder weniger reduziert wurden
und worin der Phytatgehalt, der bei ungefähr 2 % liegt, basierend auf
den Proteinen in einem kommerziellen Sojaproteinprodukt, auf einen
Spiegel von 0,2 % oder weniger durch Abspaltung von Phytat reduziert
wurde, basierend auf den Proteinen. So kann mit Hilfe einer Fraktionierung, die
eine Suppression der Kontaminierung mit den Membranprotein-reichen Ölkörper-assoziierten Protein
so weit wie möglich
und eine Abspaltung von Phytat involviert, eine Zusammensetzung
zur Reduktion von neutralem Blutfett mit einer weiter gesteigerten
Wirksamkeit bereitgestellt werden. Auf der anderen Seite wird durch
Anwendung eines Phytat-abbauenden Enzyms während des Herstellungsverfahrens
eines Sojaproteins die Fraktionierung eines 7S-Globulins erleichtert,
wodurch eine Zusammensetzung zur Reduktion von neutralem Blutfett
bereitgestellt wird, die als einen aktiven Inhaltsstoff ein hochgereinigtes
Phytat-reduziertes
7S-Globulin enthält,
resultierend aus einer Reduktion im Phytat auf 0,2 % oder weniger,
basierend auf den Proteinen, und aus einer Reduktion bei den Ölkörper-assoziierten Proteinen
auf 10 % oder weniger. Ebenfalls bereitgestellt wird eine Zusammensetzung
zur Reduktion von neutralem Blutfett, die ohne Verwendung irgendwelcher Reduktionsmittel
während
des Herstellungsprozesses, der oben beschrieben wird, hergestellt
wird.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSARTEN
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Bei
dieser Erfindung bedeutet ein 7S-Globulin ein Globulin, dessen Ultrazentrifugations-Sedimentationskoeffizient
unter den löslichen
globulären
Proteinen, die allgemein als Globuline bezeichnet werden, 7S ist. Basierend
auf der Molekulargewichtsverteilung werden die Globuline in 2S,
7S, 11S und 15S klassifiziert, unter denen von 7S und 11S bekannt
ist, dass sie in den Depot-Proteinen einer Hülsenfrucht, wie einer Sojabohne, reichlich
vorkommen. Das 7S-Globulin einer Sojabohne ist im wesentlichen das
gleiche wie β-Conglycinin,
was ein immunologischer Begriff ist.
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Bei
dieser Erfindung wird eine 7S-globulinreiche Fraktion, die aus Sojaproteinen
erhalten wird, als ein Inhaltsstoff verwendet. Der erste Schritt
für die
Fraktionierung des 7S-Globulins
aus den Sojaproteinen involviert die Entfernung eines 11S-Globulins.
Diese Entfernung kann durch en Verfahren von Thahn und Shibasaki (Thahn,
V.H., und Shibasaki, K., J. Agric. Food Chem., 24, 117, 1976), das
in diesen Tagen für
den Erhalt von jeder Globulinfraktion breit angewendet wird, wie
auch ein Kälte-unlösliche Fraktion
(CIF)-Verfahren, das Kryopräzipitation
verwendet (Briggs, D. R., und Mann, R.L., Cereal Chem, 27, 243,
1950) und eine Fraktionierung mit der Zugabe von 0,1 N Kalziumchlorid,
das durch Wolf et al. (Wolf, W.J. und Sly, D.A., Cereal Chem, 44, 653,
1967) vorgeschlagen wird, hervorgerufen werden. Eine Fraktion, die
von dem 11S und den Ölkörper-assoziierten
Proteinen durch das Verfahren, das unten in Herstellungsbeispiel
2 beschrieben wird, befreit wurde, kann auch verwendet werden.
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Nach
der Entfernung des 11S-Globulins durch irgend eines der Verfahren,
die oben beschrieben werden, wird ein 7S-Globulin durch ein gewöhnliches
Verfahren zur Herstellung eines isolierten Sojaproteins fraktioniert.
Bei einem solchen Verfahren kann ein 7S-Globulin mit einer Reinheit,
die ausreichend akzeptabel für die
Verwendung ist, in der Abwesenheit eines Reduktionsmittels erhalten
werden und eine solche Abwesenheit eines Reduktionsmittels ist für eine breitere
Anwendung, auch wenn es als ein Neutralfett-reduzierender Wirkstoff verwendet wird,
vorzuziehen. Es kann ein 7S-globulinreiches Sojaprotein erhalten
werden, dessen Proteinreinheit (auf der Basis von SPE) 50 % oder
mehr, vorzugsweise 60 % oder mehr, mehr vorzuziehen 80 % oder mehr,
insbesondere 85 % oder mehr beträgt.
Die so erhaltene 7S-globulinreiche
Fraktion wird weiter einer Behandlung mit einem Enzym unterworfen,
das eine Phytat-abbauende Wirkung aufweist, wie Phytase oder Phosphatase
oder eine Formulierung davon, wodurch Phytat abgespalten wird. Als
ein Ergebnis wird die neutrales Blutfett-reduzierende Fähigkeit,
die ein Phytat-reduziertes 7S-Globulin, das man durch Abspaltung
von Phytat auf einen Spiegel von 0,2 % oder weniger, vorzugsweise
0,1 % oder weniger, mehr vorzuziehen 0,05 % oder weniger, basierend
auf den Proteinen, erhält,
natürlich
besitzt, gesteigert.
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Ein
Verfahren zur Fraktionierung des Phytat-reduzierten 7S-Globulins, das man
durch Abspaltung von Phytat, wie oben beschrieben, erhält, kann
gleichzeitig mit einer Entfernung eines 11S-Globulins erreicht werden,
indem man ein Sojaprotein direkt mit einem Enzym behandelt, das
eine Phytat-abbauende Wirkung aufweist, wie Phytase und Phosphatase,
wie auch eine Formulierung davon.
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Weiter
kann durch Entfernung der Ölkörper-assoziierten
Proteine die neutrales Blutfett-reduzierende Fähigkeit des Phytat-reduzierten
7S-Globulins weiter gesteigert werden. Für diesen Zweck können die Ölkörper-assoziierten
Proteine als eine Präzipitation
bei pH 5,6 bis 6,8 nach Erhitzung (30 bis 75°C) bei einem schwach sauren
pH (pH 3,8 bis 6,8), bei dem sie dazu neigen, unlöslich zu
sein, entfernt werden.
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Eine
Zusammensetzung der Erfindung kann als eine orale Zusammensetzung
formuliert sein, deren aktiver Inhaltsstoff eine Fraktion ist, die
wie oben beschrieben erhalten wird, oder ein Sojaprotein und sie
kann in verschiedene Dosierungsformen, wie Pulver, Zucker-beschichtete
Tabletten und Granulate durch bekannte Verfahren wahlweise zusammen
mit anderen Arzneiträgern
und Zusatzstoffen formuliert werden.
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Eine
Fraktion oder ein Sojaprotein, das als ein aktiver Inhaltsstoff
gemäß der Erfindung
verwendet wird, ist ein sicheres essbares Material, dessen Menge,
die in einer Zusammensetzung enthalten sein wird, oder die aufgenommen
werden soll, nicht besonders begrenzt ist und es kann aufgenommen
werden wie es ist oder es kann in ein Nahrungsprodukt für eine diätetische
Therapie eingeschlossen sein. Eine bevorzugte Menge, die pro kg
Körpergewicht
aufgenommen werden kann, liegt bei 50 bis 500 mg, vorzugsweise bei
100 bis 300 mg als 7S-globulinreiche Phytat-reduzierte Sojaproteine.
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BEISPIELE
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Die
Nützlichkeit
der vorliegenden Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen
diskutiert.
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Die
hauptsächlichen
analytischen Verfahren, die bei dieser Erfindung Verwendung finden,
werden unten beschrieben.
- – Rohprotein; basierend auf
einem Kjeldahl-Verfahren, wurde ein Stickstoffgehalt bestimmt und
mit dem Koeffizient 6,25 multipliziert, um in ein Rohprotein zu
konvertieren.
- – SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese;
basierend auf einem Verfahren von Laemmli (Nature, 227, 680 (1970))
wurde eine Analyse mit einer Gradientengelkonzentration von 10 bis
20 % durchgeführt.
Die Menge einer aufgetragenen Probe betrug 10 μg.
- – Phytat;
es wurde ein Verfahren von Alii Mohamed (Cereal Chemistry 63, 475–478, 1986)
verwendet.
- – Chloroform-Methanol-extrahierbare Ölfraktion;
eine getrocknete Probe wurde mit einem ungefähr 50-fachen Volumen einer
Mischung aus Chloroform und Methanol (2:1 Volumen/Volumen) verbunden
und das Gewichtsverhältnis
der Feststoffe, die durch Rückfluss
extrahiert wurden, wurden als ein Chloroform·Methanol-extrahierbarer Ölanteil
bestimmt.
- – Reinheit
(SPE-Standard); das Muster der Banden, die bei der oben beschriebenen
SDS-Polyacrylamidelektrophorese erhalten wurden, wurde durch ein
Densitometer gemessen und ein Prozentbereich der korrespondierenden
Bande, basierend auf dem Gesamtbereich, wurde als eine Reinheit
(auf der Basis von SPE) dargestellt. Ein hier erwähnter 7S-Globulingehalt
bedeutet die Gesamtmenge von α,α' und β-Untereinheiten,
während
ein 11S-Globulingehalt die Gesamtmenge von sauren Polypeptiden (A)
und basischen Polypeptiden (B) bedeutet.
- – Korrigierte
Reinheit; basierend auf einer Reinheit (auf Basis von SPE), die
oben erhalten wurde, und Annahme irgendwelcher kontaminierender Ölkörper-assoziierter
Proteine, wurde eine korrigierte Reinheit berechnet, wie unten beschrieben
wird. So wird die Reinheit einer Probe (auf Basis von SPE) als A
% dargestellt und eine Reinheit wird als ein Wert berechnet, basierend
auf den Gesamtproteinen, einschließlich dem 7S-Globulin, den 11S-Globulinen
und den Ölkörper-assoziierten
Proteinen, da die Probe die Ölkörper-assoziierten
Proteine in einer Menge von mindestens dem 10-fachen des Chloroform·Methanol-extrahierbaren Ölanteils
zusätzlich
zu dem 7S-Globulin und dem 11S-Globulin enthält. Korrigierte
Reinheit (%) = (100 (%) – Chloroform·Methanol-extrahierbarer Ölanteil
(%) ·10)·A(%)/100
- – Neutralfette,
Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterine (HDLC); es wurde ein DRYCHEM-Modell
5500, hergestellt durch Fuji Film, in einem Festphasenverfahren
angewendet.
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Bevorzugte
Ausführungsarten
der Erfindung werden unten beschrieben.
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HERSTELLUNGSBEISPIEL 1 (Herstellung von
7S-Globulin = "7S" und Phytat-reduziertem
7S-Globulin = "7S-PH")
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Eine
entfettete Sojabohne wurde mit Wasser in einem Gewichtsverhältnis von
1:10 verbunden und unter Einstellung auf einen pH 7,0 für 1 Stunde
gerührt
und dann zentrifugiert (4.000 Umdrehungen/min, 20°C, 10 Minuten),
um ein Präzipitat
zu entfernen. Der resultierende Überstand
wurde auf pH 6,4 eingestellt, man ließ in bei 4°C über Nacht stehen und er wurde
zentrifugiert (4.000 Umdrehungen/min, 4°C, 10 Minuten), um das Präzipitat
zu entfernen. Der resultierende Überstand
wurde auf pH 4,5 eingestellt und zentrifugiert (4.000 Umdrehungen/min,
4°C, 10
Minuten) und das resultierende Präzipitat wurde als ein käsiger 7S-Globulin-Niederschlag gewonnen.
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Dieser
käsige
7S-Globulin-Niederschlag wurde mit einem 4-fachen Volumen an Wasser kombiniert, auf
pH 6,0 eingestellt, mit Phytase (NOVO, PHYTASE NOVO L) bei 0,2 %,
basierend auf den Proteinen, ergänzt
und dann ließ man
ihn bei 40°C
für 1 Stunde
reagieren. Die Reaktionsmischung wurde auf pH 5,0 eingestellt, zentrifugiert
(4.000 Umdrehungen/min, 20°C,
10 Minuten), um eine Molkefraktion zu entfernen, wodurch ein Phytat-reduzierter
käsiger
7S-Globulin-Niederschlag erhalten wurde. Sowohl der käsige 7S-Globulin-Niederschlag,
wie auch der Phytat-reduzierte käsige
7S-Globulin-Niederschlag
wurden hydriert und dann bei pH 7,0 neutralisiert, bei 140°C für 15 Sekunden
sterilisiert und dann schnell sprühgetrocknet, um ein 7S-Globulin
und ein Phytat-reduziertes 7S-Globulin zu erhalten. Jedes der so
erhaltenen 7S-Globuline und der Phytat-reduzierten 7S-Globuline wurde einer
SDS-Polyacrylamidgel-Elektorphorese unterworfen und die Intensität der Farbe
einer gefärbten
Proteinbande enthüllte,
dass die Reinheit 80 % betrug. Die Phytatgehalte in beiden betrugen
1,8 % bzw. 0,05 % was enthüllte,
dass die Phytasebehandlung in einer fast vollständigen Spaltung des Phytats
resultierte. Der Chloroform-Methanol-extrahierbare Ölanteil
dieser Probe betrug 2,8 %. Auf der anderen Seite betrug die Gesamtmenge
der Schwefel-enthaltenen Aminosäuren,
Cystin und Methionin, 25 mg/g Protein, was höher war als 5 mg/g Protein,
was natürlicherweise
durch ein gereinigtes 7S gezeigt wird, was nahe legt, dass eine
wesentliche Menge an Unreinheiten weiter verblieb.
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HERSTELLUNGSBEISPIEL 2 (Herstellung von
hoch gereinigtem Phytat-reduziertem 7S-Globulin: "7S-PH-LP")
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Ein
Gewichtsanteil einer niedrig-modifizierten entfetteten Sojabohne
wurde mit 10 Gew.-Anteilen von Extraktionswasser bei 40°C verbunden
und auf pH 5,3 mit Salzsäure
eingestellt. Diese Lösung
wurde mit 8 Einheiten pro Protein Phytase (NOVO, PHYTASE NOVO L)
ergänzt
und einer Proteinextraktion gleichzeitig mit einer Enzymreaktion
für 30
Minuten bei 40°C
unterworfen, um einen enzymbehandelten Aufschlämmungsextrakt zu erhalten.
Dieser enzymbehandelte Aufschlämmungsextrakt
wurde auf ungefähr
25°C abgekühlt, auf pH
6,1 mit Salzsäure
eingestellt und unter Verwendung einer Chargentyp-Zentrifuge zentrifugiert
(3.000 G). Dabei wurde eine diskrete Trennung zwischen einer löslichen
Fraktion und einer unlöslichen
Fraktion beobachtet. Die Lösungstemperatur
dieser Zentrifuge betrug ungefähr
25°C. Darauffolgend
wurde die lösliche
Fraktion auf pH 4,9 mit Salzsäure
eingestellt und zentrifugiert, um einen käsigen Präzipitat-Niederschlag zu erhalten.
Der käsige
Präzipitat-Niederschlag
wurde mit einem 10-fachen Volumen an Wasser gewaschen, hydriert (auf
das 4-fache Gewicht),
mit Natriumhydroxid neutralisiert, bei 140°C für 15 Sekunden sterilisiert
und dann schnell sprühgetrocknet,
um ein Phytase-behandeltes 7S-globulinreiches
fraktioniertes Sojaprotein ("7S-PH-LP") zu erhalten.
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Das
Phytat-reduzierte 7S-Globulin, das so erhalten wurde, wurde einer
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen und die Farbintensität einer
gefärbten
Proteinbande enthüllte,
dass die Reinheit 95 % betrug. Der Phytatgehalt betrug 0,05 % basierend
auf den Proteinen, was eine fast vollständige Spaltung des Phytats
anzeigt. Auf der anderen Seite war der Chloroform·Methanol-extrahierbare Ölanteil
dieser Probe 0,5 %, was wesentlich niedriger ist, wenn es mit Herstellungsbeispiel
1 verglichen wird. Die Gesamtmenge der Schwefel-enthaltenden Aminosäuren, Cystin
und Methionin, betrug 12 mg/g Protein, was darauf hinweist, dass ein
hoch gereinigtes 7S erhalten wurde, dessen Unreinheiten im Hinblick
auf den Wert 5 mg/g Protein, der natürlich durch ein gereinigtes
7S gezeigt wird, substantiell niedrig waren.
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BEISPIEL 1 (Verifikation von neutralem
Blutfett-reduzierendem
Effekt bei Ratten)
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Ein
neutrales Blutfett-reduzierender Effekt wurde bei Ratten verifiziert.
Jedes Futter, das hier verwendet wurde, enthielt als ein diätetisches
Protein das Sojaprotein, das in dem oben beschriebenen Herstellungsbeispiel
2 erhalten wurde, oder Kasein (vitaminfreies Kasein, ORIENTAL YEAST)
als eine Kontrolle in einer Konzentration von 20 %, zusammen mit
0,5 % Cholesterin und 0,125 % Natriumcholat, wie auch einer 1:2-Mischung von Saccharose
und Maisstärke.
Eine typische Formulierung wird in Tabelle 1 dargestellt, die unten gezeigt
wird. TABELLE 1 Futterformulierung von jeder
Behandlungsgruppe
| Bestandteil | Zusammensetzung
(%) |
| Protein | Eingestellt
auf 20 % als Rohprotein mit α-Maisstärke |
| Saccharose | 20,0 |
| Maisöl | 5,0 |
| Vitaminmix | 1,0 |
| Mineralmix | 3,5 |
| Pulverisierte
Cellulose | 5,0 |
| Cholinhydrogentartrat | 0,2 |
| Cholesterin | 0,5 |
| Natriumcholat | 0,125 |
| α-Maisstärke | auf
insgesamt 100 |
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Die
Versuchstiere waren 5 Wochen alte (Wachstumsperiode) und 20 Wochen
alte (Reifeperiode) männliche
Wistar-Ratten (Gewicht von 100 bis 120 g, und 330 bis 360 g), wurden
von NIPPON SLC erworben, und erhielten ein kommerzielles Festfutter
(ORIENTAL YEAST, CRF-1) vorläufig
für 1 Woche
und sie wurden dann in zwei Behandlungsgruppen eingeteilt, von denen
jede aus 6 Tieren ohne Abweichung in den Körpergewichten zwischen den
Gruppen bestand, und die Tiere wurden für 10 Tage mit Testfuttern aufgezogen.
Jede Ratte wohnte in einem individuellen Käfig bei einer Temperatur von
23±1°C und einer
Feuchtigkeit von 55±5 %
bei einem 12 Stunden Beleuchtungszeitraum (7:00 morgens bis 7:00
abends). Während
der Aufzuchtperiode ließ man
die Tiere Wasser und Futter ad libitum erhalten.
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Die
Behandlungsperiode betrug 10 Tage, während denen das Körpergewicht
beobachtet wurde. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 2 und 3,
die unten gezeigt werden, dargestellt. Es wurde kein signifikanter Unterschied
in der Gewichtszunahme zwischen den Gruppen beobachtet. TABELLE 2 Änderung
im Körpergewicht
bei der Behandlungsgruppe von 5 Wochen alten Ratten, Einheit: g
| Behandlungsgruppe | Kasein | Phytat-reduziertes
7S-Globulin (7S-PH) |
| Beginn
der Behandlung | 153,3±1,3 | 153,3±1,3 |
| Ende
der Behandlung | 201,7±1,3 | 192,0±1,5 |
| Gewichtszunahme | 48,4±1,3 | 38,7±1,6 |
TABELLE 3 Änderung
im Körpergewicht
bei der Behandlungsgruppe von 20 Wochen alten Ratten, Einheit: g
| Behandlungsgruppe | Kasein | Phytat-reduziertes
7S-Globulin (7S-PH) |
| Beginn
der Behandlung | 357,2±2,7 | 356,4±5,8 |
| Ende
der Behandlung | 358,7±3,7 | 352±10,3 |
| Gewichtszunahme | 0,3±2,1 | 4,4±4,6 |
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Nach
der 10-tägigen
Behandlungsperiode ließ man
jedes Tier für
7 Stunden vom Morgen an (8:00 morgens) an dem 11. Tag fasten und
dann wurde es einer Laparotomie unter einer Anästhesie mit Nembutal unterworfen
und es wurde Blut aus der abdominellen Aorta über eine heparinisierte Spritze
abgenommen. Das Blut wurde zentrifugiert (3.000 Umdrehungen/min,
5°C für 15 Minuten),
um Plasma zu trennen, welches auf die Neutralfette und die Cholesterine
untersucht wurde. Es wurde das Mittel und die Standardabweichung
der Daten in jeder Gruppe berechnet und eine statistische Signifikanz
wurde unter Verwendung von Duncan's multiplem Range-Test analysiert. Die
Ergebnisse werden in Tabellen 4 und 5 gezeigt. In den Tabellen sind
ein % Neutralfettreduktion und ein % Cholesterinreduktion die Verhältnisse
(%) der Differenz bei den jeweiligen Daten zwischen der Kaseingruppe
und der Behandlungsgruppe, basierend auf den Daten in der Kaseingruppe. TABELLE 4 Änderung
der neutralen Blutfette bei der Behandlungsgruppe von 5 Wochen alten
Ratten
| Behandlungsgruppe | Kasein | Phytat-reduziertes
7S-Globulin (7S-PH) |
| Neutralfettspiegel | 176,2±10,9 | 89,1±5,7 |
| %-Neutralfettreduktion | | 49,6 |
| Gesamtcholesterinspiegel | 144,1±6,0 | 93,5±2,9 |
| %-Cholesterinreduktion | | 35,1 |
- Einheit; (Spiegel) mg/dl, (Verhältnis) %
TABELLE 5 Änderung
der neutralen Blutfette bei der Behandlungsgruppe von 20 Wochen
alten Ratten | Behandlungsgruppe | Kasein | Phytat-reduziertes
7S-Globulin (7S-PH) |
| Neutralfettspiegel | 261,2±22,5 | 108,6±21,6 |
| %-Neutralfettreduktion | | 58,4 |
| Gesamtcholesterinspiegel | 132,5±3,5 | 92,8±14,5 |
| %-Cholesterinreduktion | | 30,0 |
- Einheit; (Spiegel) mg/dl, (Verhältnis) %
-
Wie
aus den oben gezeigten Daten offensichtlich ist, zeigte das Phytat-reduzierte
7S-Globulin deutliche Cholesterin- und neutrales Blutfett-reduzierende
Effekte sowohl in der Wachstumsperiode (5 Wochen alt) wie auch der
Reifeperiode (20 Wochen alt).
-
VERGLEICHSBEISPIEL 1 (Verifikation des
neutrales Blutfett-reduzierenden
Effekts bei Ratten)
-
Ähnlich zu
Beispiel 1 wurde ein neutrales Blutfett-reduzierender Effekt bei Ratten verifiziert.
Ein Behandlungsfutter besaß eine
Zusammensetzung, die der in Beispiel 1 ähnlich war, außer, dass
als ein Sojaprotein das 7S-Globulin (7S), das in Herstellungsbeispiel
1 erhalten wurde, verwendet wurde.
-
Die
Versuchstiere waren 5 Wochen alte männliche Wistar-Ratten (Gewicht
von 90 bis 110 g), erworben von NIPPON SLC, und sie erhielten ein
kommerzielles Festfutter (ORIENTAL YEAST, CRF-1) vorläufig für 1 Woche
und dann wurden sie in zwei Behandlungsgruppen aufgeteilt, die jeweils
insgesamt aus 6 Tieren ohne Abweichung in dem Körperwicht zwischen den Gruppen
bestand, und die Tiere wurden für
3 Wochen mit Testfuttern aufgezogen. Jede Ratte wurde in einem individuellen
Käfig bei
einer Temperatur von 23±1°C und einer Feuchtigkeit
von 55±5
% bei einem 12-ständigen
Beleuchtungszeitraum (7:00 morgens bis 7:00 abends) untergebracht.
Während
der Aufzuchtperiode ließ man
die Tiere Wasser und Futter ad libitum erhalten.
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Der
Behandlungszeitraum betrug 21 Tage, während denen das Körpergewicht
beobachtet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6, die unten
gezeigt wird, dargestellt. Es wurde kein signifikanter Unterschied
bei der Gewichtszunahme zwischen den Gruppen beobachtet. Tabelle 6 Gewichtsveränderung bei der Behandlungsgruppe;
Einheit: g
| Behandlungsgruppe | Kasein | 7
Globulin (7S-PH) |
| Behandlungsbeginn | 151,0±1,3 | 151,1±0,9 |
| Ende
der Behandlung | 243,8±1,6 | 240,8±5,5 |
| Gewichtszunahme | 92,7±1,5 | 89,7±6,0 |
-
Nach
dem 21-tägigen
Behandlungszeitraum ließ man
jedes Tier für
6 Stunden von dem Morgen (8:00 morgens) an dem 22. Tag an fasten
und dann wurde es einer Laparotomie unter einer Anästhesie
mit Nembutal unterworfen und es wurde Blut aus der abdominellen
Aorta über
eine heparinisierte Spritze abgenommen. Das Blut wurde zentrifugiert
(3.000 Umdrehungen/min, 5°C
für 10
Minuten), um Plasma abzutrennen, was auf die Neutralfette und die
Cholesterine untersucht wurde. Das Mittel und die Standardabweichung
der Daten in jeder Gruppe wurden berechnet und eine statistische
Signifikanz wurde unter Verwendung von Duncan's multiplem Range-Test analysiert. Die
Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt. Jedes % Reduktion wurde
durch ein Verfahren bestimmt, das demjenigen von Tabelle 4 und 5
in Beispiel 1 ähnlich
war. Tabelle 7 Änderung
bei den neutralen Blutfetten in der Behandlungsgruppe; Einheit:
g
| Behandlungsgruppe | Kasein | 7S-Globulin
(7S-PH) |
| Neutralfettspiegel | 190,4±12,2 | 122,7±6,6 |
| Neutralfettreduktion | | 35,6 |
| Gesamtcholesterinspiegel | 118,7±4,5 | 109,9±5,8 |
| Cholesterinreduktion | | 7,4 |
- Einheit: (Spiegel) mg/dl, (Verhältnis) %
-
Wenn
mit den Cholesterin- und Neutralfett-reduzierenden Effekten des
Phytat-reduzierten 7S-Globulins, das in Beispiel 1 verwendet wurde,
relativ zu Kasein verglichen wurde, war der reduzierende Effekt
des 7S-Globulins im Vergleichsbeispiel 1 niedriger, was offen legt,
dass das Phytat-reduzierte 7S-Globulin einen höheren Blutfett-verbessernden Effekt
besitzt, wenn es mit dem 7S-Globulin verglichen wird.
-
BEISPIEL 2
-
Es
wurde der neutrales Blutfett-reduzierende Effekt des hoch gereinigten
Phytat-reduzierten 7S-Globulins (7S-PH-LP), das in Herstellungsbeispiel
2 hergestellt wurde, untersucht. Als Kontrollen wurde das Kasein,
das in Beispiel 1 verwendet wurde, das 7S-Globulin (7S), das Phytat-reduzierte
7S-Globulin (7S-PH)
und ein kommerziell getrenntes Sojaprotein (SPI) verwendet. Die
Zusammensetzung von jedem Protein wird in Tabelle 8 gezeigt. TABELLE 8 Einheit: %
| | SPI | 7S | 7S-PH | 7S-PH-LP |
| Rohprotein | 86,2 | 88,0 | 90,5 | 92,3 |
| Reinheit
(auf der Basis von SPE) | | 80,0 | 82,2 | 95,7 |
| Chloroform·Methanolextrahierbare Ölfraktion | 3,2 | 2,8 | 2,8 | 0,5 |
| Phytat | 1,8 | 1,8 | 0,05 | 0,05 |
| Korrigierte
Reinheit | | 57,6 | 59,2 | 90,9 |
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Es
wurden 5 Wochen alte Ratten, die denjenigen von Beispiel 1 ähnlich waren,
als Versuchstiere verwendet und für 2 Wochen aufgezogen, während denen
das Körpergewicht
unter den Bedingungen, die denjenigen von Beispiel 1 ähnlich waren,
beobachtet wurde. Nach dem Behandlungszeitraum wurde Blut ähnlich Beispiel
1 entnommen und auf die Neutralfette und die Cholesterine untersucht.
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Die
Ergebnisse beinhalteten die Änderung
in dem Körpergewicht,
gezeigt in Tabelle 9, und die Neutralfette, das Cholesterin, HDLC
und den arteriellen Skleroseindex, der daraus berechnet wird, gezeigt
in Tabelle 10. TABELLE 9 Einheit: g
| | Kasein | SPI | 7S | 7S-PH | 7S-PH-LP |
| Behandlungsbeginn | 138,5 | 138,7 | 135,8 | 135,5 | 137,8 |
| Ende
der Behandlung | 210,2 | 212,9 | 206,9 | 179,6 | 206,5 |
| Gewichtszunahme | 71,7 | 74,3 | 71,1 | 44,0 | 68,8 |
TABELLE 10 Einheit: mg/dl
| | Kasein | SPI | 7S | 7S-PH | 7S-PH-LP |
| Neutralfettspiegel | 178,3 | 120,0 | 105,0 | 92,7 | 91,0 |
| Gesamtcholesterinspiegel | 125,6 | 88,3 | 88,3 | 90,8 | 87,3 |
| HDLC | 37,1 | 36,8 | 34,2 | 43,5 | 44,0 |
| Arterieller
Skleroseindex | 2,39 | 1,40 | 1,58 | 1,09 | 0,98 |
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Basierend
auf den Ergebnissen, die oben beschrieben werden, waren die Neutralfett-
und die Cholesterin-reduzierenden Effekte in der Reihenfolge, die
unten gezeigt wird, höher,
Kasein<<PI=7S<7S-PH<7S-PH-LP und es
wurde gezeigt, dass HDLC in einer Phytat-freien Gruppe verbessert
war. So zeigte das hoch gereinigte Phytat-reduzierte 7S-Globulin, das man durch
Entfernung von Phytat und auch durch Entfernung der Ölkörper-assoziierten
Proteine erhielt, den offensichtlichsten Serumlipid-verbessernden Effekt,
insbesondere einen arteriellen Skleroseindex-reduzierenden Effekt.
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GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
eine effiziente Reduktion bei dem Blutspiegel von Neutralfett und eine
Zusammensetzung der Erfindung, die sehr sicher ist, ist nicht nur
als ein prophylaktisches oder therapeutisches Mittel für den Zweck
der Reduktion des Neutralfett-Blutspiegels wesentlich, sondern auch
in der Lage als ein Nahrungsprodukt für solche Zwecke zu dienen.