DE602004012289T2

DE602004012289T2 - Bioaktive peptide, die durch enzymatische hydrolyse aus den proteinen von eiweiss gewonnen werden

Info

Publication number: DE602004012289T2
Application number: DE602004012289T
Authority: DE
Inventors: Marta Miguel Castro; R. Lopez-Alonso Fandino; Maria I. Recio Sanchez; Maria M. Ramos Gonzales; A. Aleixandre De Artinano
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2004-07-23
Publication date: 2009-09-03
Anticipated expiration: 2024-07-24
Also published as: ES2253036B1; EP1661913A1; US20060280804A1; US8227207B2; DE602004012289D1; ES2303090T3; WO2005012355A1; JP2007523045A; ATE388166T1; DK1661913T3; ES2253036A1; WO2005012355B1; EP1661913B1

Description

SPARTE DER TECHNIK
Die Erfindung besteht aus der Produktion bioaktiver Eiprodukte, die von den Proteinen von eiweiß abstammen. Nach einer enzymatischen Behandlung entstehen daraus Peptide mit hemmender Aktivität auf das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE-hemmende Aktivität) in vitro und/oder antihypertensiver Aktivität und/oder antioxidativer Aktivität, die in der Lebensmittelindustrie und der pharmazeutischen Industrie angewendet werden können.
STAND DER TECHNIK
Dem Ei kommt im Rahmen der menschlichen Ernährung eine wesentliche Rolle zu, da es eine nährstoffreiche und gesunde Nahrungsquelle darstellt. Die jüngste Entwicklung neuer biotechnologischer Techniken und Trenntechniken erlaubt die Fraktionierung verschiedener Eibestandteile, um sie für neue Lebensmittel oder Nicht-Lebensmittel zu verwenden, und somit treten neuen Anwendungsbereiche in Erscheinung, die zur Steigerung von deren Konsum beitragen. Deshalb sind verschiedene Unternehmen, die sich mit der Erzeugung einzelner, aus Hühnereifraktionen isolierter Proteine beschäftigen, daran interessiert, die Anwendung einiger Bestandteile, wie beispielsweise Ovalbumin und Ovotransferin zu erhöhen und zu diversifizieren. Dies trifft auf Branchen zu, die sich mit der Produktion von Lysozym beschäftigen, das als antimikrobieller Stoff verwendet wird, welche weitere kostengünstige nitrogenierte Fraktionen als Nebenprodukte erhalten, die im Allgemeinen für Tierfutter oder für die Verwendung als Emulgatoren und Geliermittel in verschiedenen Lebensmittel bestimmt sind.
In den letzten Jahren haben funktionelle Lebensmittel erheblichen Eingang in den Lebensmittelsektor gefunden, was auf das gesteigerte Bewusstsein des Zusammenhangs zwischen Ernährung und Gesundheit seitens der Verbraucher zurückzuführen ist. In funktionellen Bestandteilen, d. h. Bestandteilen, die als Bestandteil von Lebensmitteln diese mit spezifischen biologischen Aktivitäten versehen, die über die reine Ernährung hinausgehen, besetzen bioaktive Peptide aufgrund ihrer Diversität und Multifunktionalität einen besonderen Platz. Bioaktive Peptide entsprechen Fragmenten, die in dem Vorläuferprotein inaktiv sind, aber die mittels Hydrolyse in vivo oder in vitro freigesetzt werden können und auf diese Weise verschiedene physiologische Funktionen in dem Organismus ausüben. Seit ihrer Entdeckung 1979 sind Peptide beschrieben worden, die von Lebensmittelproteinen mit verschiedenen biologischen Aktivitäten abstammen: antihypertensiv, antithrombotisch, betäubend, antioxidativ, immunmodulierend, usw.
Unter den bioaktiven Peptiden ragen solche heraus, die antihypertensive Aktivität ausüben, indem sie das Renin-Angiotensin-System regulieren (T. Takano, Milk derived peptides and hypertension reduction. International Dairy Journal, 1998, 8: 375–381). Die hohe Inzidenz von Erkrankungen der Herzkranzgefäße in der Bevölkerung ist hinlänglich bekannt, und die Behandlung der Hypertension stellt eine der am häufigsten für die Reduzierung des Risikos kardiovaskulärer Erkrankungen angewandte Strategie dar. Der Wirkmechanismus dieser Peptide ist über die Hemmung des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE) erklärt worden, welches die Bildung von Angiotensin II katalysiert, eines Oktapeptids mit starker vasokonstriktiver Aktivität, und das darüber hinaus Bradykinin deaktiviert, das Vasodilatation herbeiführt. Es sind verschiedene Peptide mit ACE hemmender (ACEI) Aktivität entdeckt worden, die aus enzymatischen Hydrolysaten von Molkeproteinen ( WO01/85984 , Enzymatic treatment of whey Proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting products and treatment of hypertension in mammals; Deutsch: Enzymatische Behandlung von Molkeproteinen für die Erzeugung antihypertensiver Peptide, die resultierenden Produkte und Behandlung von Hypertension bei Säugern), Caseinen ( US6514941 , Method of preparing a casein hydrolysate enriched in anti-hypertensive peptides; Deutsch: Verfahren des Herstellens eines Caseinhydrolysats, das mit antihypertensiven Peptiden angereichert ist), usw. erhalten wurden.
Eine weitere Gruppe bioaktiver Peptide großer Bedeutung ist die der Peptide mit antioxidativer Aktivität. Altern und verschiedene Pathologien (neurologische Störungen, Krebs, Katara0kte, usw.) stehen in Zusammenhang mit der Oxidation von Zellbestandteilen wie Lipiden, Proteinen oder DNA, so dass die Ergänzung der Ernährung mit Antioxidanzien präventiv wirkt. Neben ihrer antioxidativen Aktivität können diese Verbindungen die Oxidation von Fetten verhindern, wodurch das Auftreten unangenehmer Gerüche in Lebensmitteln vermieden wird. Einige Wissenschaftler haben gezeigt, dass verschiedene Proteine und deren Hydrolysate eine antioxidative Wirkung ausüben können, entweder indem sie als Fänger freier Radikale wirken (K. Suetsuna. H. Ukeda und H. Ochi, Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein, Journal of Nutritional Biochemistry, 2000, 11: 128–131) oder indem sie Enzyme hemmen, die an der Oxidation von Fetten beteiligt sind (S. G. Rival. S. Fornaroli, C. G. Boeriu und H. J. Wichers, Caseins and casein hydrolysates. I. Lipoxygenase inhibitory properties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49: 287–294). Es ist hervorzuheben, dass Studien des Zusammenhangs zwischen Struktur und Aktivität von ACEI-Peptiden und Antioxidanzien ein Merkmal identifiziert haben, das beiden gemeinsam ist: die Bedeutung bestimmter hydrophober Aminosäuren bei diesen beiden biologischen Aktivitäten (H. M. Chen, K. Muramoto, F. Yamauchi, K. Fujimoto und K. Nokihara. Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of soybean Protein, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998,46: 49–53).
Unter den Strategien, die am häufigsten verwendet werden, um aktive Peptide für die Anwendung in Lebensmitteln zu erhalten, ragen die enzymatische Hydrolyse und Fermentationsverfahren heraus. Überdies sind in den letzten Jahren verschiedene technologische Behandlungen für die Funktionalisierung von Proteinen entwickelt worden. Die Anwendung hoher hydrostatischer Drücke als physikalisches Verfahren für die Denaturalisierung resultiert in einer Modifizierung nicht-kovalenter Bindungen, die für die Struktur der Proteinen verantwortlich sind, woraus sich Konformationsänderungen ergeben, die zu einem aufgefalteten Zustand führen. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass Proteolyse unter hohem Druck schneller abläuft und sich andere Hydrolyseprodukte ergeben als unter atmosphärischem Druck (F. Bonomi, A. Fiocchi, H. Frøkiær, A. Gaiaschi, S. Iametti, C. Poesi, P. Rasmussen, P. Restani und P. Rovere, Reduction of immunoreactivity of bovine ☐-lactoglobulin upon combined physical and proteolytic treatment, Journal of Dairy Research, 2003, 70: 51–59). Es ist außerdem zu berücksichtigen, dass die Mehrzahl von Enzymen ihre Aktivität bis zu 400 MPa beibehalten und bei höheren Drücken inaktiv werden. Dennoch ist die Erzeugung bioaktiver Peptide unter Bedingungen hohen Drucks in der Literatur nicht beschrieben worden.
Im Gegensatz zu anderen Lebensmittelproteinen gibt es sehr wenige Studien in Verbindung mit bioaktiven Peptiden aus Hühnereiproteinen, obgleich das Hühnerei eine wichtige Stickstoffquelle in der Ernährung ist. H. Fujita, K,. Yokoyama und M. Yoshikawa (Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food Proteins, Journal of Food Science, 2000, 65: 564–569) fanden ACEI-Aktivitäten in Ovalbuminhydrolysaten mit Pepsin und Thermolysin mit IC₅₀-Werten (Konzentration, bei der 50% der Aktivität eines Enzyms gehemmt ist) von 45,0 bzw. 83,0 μg/ml. Diese Autoren isolierten sechs Peptide mit ACEI-Aktivität ausgehend von dem Hydrolysat mit Pepsin mit IC₅₀-Werten von 0,4 bis 15 μM, obgleich keines davon, außer dem Dipeptid LW, in spontan hypertonischen Ratten (SHR) antihypertensive Aktivität aufwies. Es wurde postuliert, dass solche Peptide Substrate von ACE, aber keine echten Inhibitoren seien, und deshalb scheinbare ACEI-Aktivitäten in dem In-vitro-Assay zeigten (H. Fujita und M. Yoshikawa, LKPNM: A prodrug-type ACE-inhibitory Peptide derived from fish Protein, Immunopharmacology, 1999, 44: 123–127). Diese Beobachtungen zeigen, dass ACEI-Aktivität in vitro zwar ein guter Ausgangspunkt für weitere Arbeiten darstellt, aber kein alleiniges Auswahlkriterium darstellen kann, da die physiologischen Transformationen in dem Organismus, welche die Bioverfügbarkeit der Peptide (Verdauung und Passage durch die Magen-Darm-Barriere, um das Blut in einer aktiven Form zu erreichen) bestimmen, dabei nicht berücksichtigt werden.
Es sind zwei Peptide mit vasodilatatorischer Aktivität beschrieben worden, die aus der gleichen Region von Ovalbumin stammen, das mit anderen Enzymen hydrolysiert wurde.
H. Fujita. H. Usui, K. Kurahashi und M. Yoshikawa (Isolation and characterization of ovokinin, a bradykinin B1 agonist peptide derived from ovalbumin, Peptides, 1995, 16: 785–790, und JP5331190 ) stellten fest, dass Ovokinin, ein aus einem mit Pepsin hydrolysierten Ovalbumin isoliertes Oktapeptid (FRADHPFL) vasorelaxierende (gefäßentspannende) Aktivität in den mesenterischen Arterien des Hundes zeigten, aber keine ACEI-Aktivität besaßen. Ovokinin besitzt antihypertensive Aktivität, wenn es in Dosen zu 100 mg/kg oral an spontan hypertensive Ratten (SGR) verabreicht wird. (H. Fujita, R. Sasaki und M. Yoshikawa, Potentiation of the antihypertensive activity of orally administered ovokinin, a vasorelaxing peptide derived from albumin, by emulsification in egg phosphatidyl-choline, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1995, 59; 2344–2345). N. Matoba, H. Usui, H. Fujita und M. Yoshikawa (A novel anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin induces nitric Oxide-mediated vasorelaxation in an isolated SHR mesenteric artery, FEBS Letters, 1999, 452: 181–184) reinigten ausgehend von einem Hydrolysat von Ovalbumin mit Chymotrypsin ein Hexapeptid, das einem 2–7-Fragment of Ovokinin entspricht (RADHPF, Ovokinin (2–7)) und bei SHR in Dosen zu 10 mg/kg starke vasodilatatorische Aktivität ausübte.
Später wurden Analoge von Ovokinin (2–7) mit dem Ziel synthetisiert, dessen anti-hypertensive Aktivität zu erhöhen. Unter diesen wiesen RPFHPF und RPLKPW nach Verabreichung an SHR eine 10 bzw. 100 Mal höhere Aktivität als Ovokinin (2–7) auf (Mindestwirkdosis von 1 und 0,1 mg/kg), was einer höheren Resistenz des Verdauungstraktes gegenüber Proteasen zugeschrieben wurde (N. Matoba, Y. Yamada, H. Usui, R. Nakagiri und M. Yoshikawa, Designing potent derivatives of ovokinin (2–7), an anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2001, 65: 736–739, und Y. Yamada, N. Matoba, H. Usui und K. Onishi, Design of a highly potent anti-hypertensive Peptide based an ovalbumin (2–7), Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2002, 66: 1213–1217). Es ist hervorzuheben, dass, diesen Autoren zufolge und im Gegensatz zu der Mehrzahl antihypertensiver Peptide aus Lebensmitteln, weder Ovokinin (2–7) noch seine Derivate RPFHPF bzw. RPLKPW ACEI-Aktivität besitzen. Es wurde postuliert, dass sie über ihre Interaktion mit Rezeptoren des Magendarmtraktes oder aufgrund der Auswirkungen im zentralen Nervensystem den arteriellen Druck senken.
In Anbetracht der hohen biologischen Qualität von Eiproteinen ist es von großem Interesse, davon abstammende bioaktive Peptide zu erhalten, die, wenn im Rahmen der Ernährung konsumiert, nicht nur ihre grundlegenden Ernährungsfunktionen ausüben würden, sondern auch in der Lage wären, metabolische oder physiologische Effekte hervorzurufen, die bei der Erhaltung der Gesundheit nützlich sind. Die Produktion bioaktiver Peptide aus Eiweißproteinen würde neue Einsatzmöglichkeiten für Hühnereier über ihren klassischen Lebensmittelwert hinaus eröffnen, einschließlich die Produktion medizinischer Bioprodukte und von „Neutraceutical"-Bioprodukten (Lebensmittelbioprodukte mit Zusatzstoffen, die pharmakologische Wirkung aufweisen). Dies würde bei der Entwicklung gesunder, sicherer und hochwertiger Nahrungsmittel helfen, womit sie zur Nutzung und Neubeurteilung von Eiprodukten beitragen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung besteht aus der Produktion von Eiprodukten, die bioaktive Peptide mit ACEI-Aktivität in vitro und/oder antihypertensiver Aktivität und/oder antio xidativer Aktivität mittels enzymatischer Hydrolyse von Ovalbumin.
Die bioaktiven Peptide werden mittels Hydrolyse von mindestens einem Protein, Peptid oder Fragmenten davon, welche die Aminosäuresequenz von Ovalbumin enthalten, hergestellt, wobei Enzyme (vorzugsweise Pepsin) und Hydrolysebedingungen verwendet werden, welche das Aufbrechen einer jeden Proteinkette an den richtigen Stellen zu deren Freisetzung gestattet. Sie können auch mittels chemischer oder enzymatischer Synthese oder mittels rekombinanter Verfahren erhalten werden. Die Peptide können als solche konsumiert werden oder auf Basis ihrer Rohhydrolysate, niedermolekularer Konzentrate oder anderer aktiver Teilfraktionen, die mithilfe von Größentrennverfahren oder Chromatographieverfahren erhalten werden.
Solche Hydrolysate, deren Fraktionen oder die Peptide könnten nicht nur Nahrungsmittelprodukte, sondern auch einen Teil pharmazeutischer Produkte bilden. Damit könnten sie bei der Behandlung und Prävention von Erkrankungen helfen, insbesondere bei der Kontrolle des arteriellen Drucks. Die Erfindung erweitert die Anwendungen von Hühnereiproteinen, womit sie zu deren Nutzung und Neubeurteilung beitragen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Erzeugen aktiver Peptide ausgehend von Ovalbumin bereit. Diese bioaktiven Peptide sind durch die in SEQ-ID Nr. 1, SEQ-ID Nr. 4, SEQ-ID Nr. 6, SEQ-ID Nr. 7 und SEQ-ID Nr. 8 (Tabelle 1) gezeigten Aminosäuresequenzen identifiziert, die in vitro ACEI-Aktivität und/oder in vivo antihypertensive Aktivität und/oder antioxidative Aktivität aufweisen.
Das Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung wäre jedes geeignete Substrat, welches mindestens ein Protein oder Peptid tierischer Herkunft oder aus Mikroorganismen aufweist, dessen Aminosäuresequenz die Sequenz von Aminosäuren der relevanten bioaktiven Peptide aufweist (SEQ-ID Nr. 1, SEQ-ID Nr. 4, SEQ-ID Nr. 6, SEQ-ID Nr. 7 und SEQ-ID Nr. 8, Tabelle 1). In Anbetracht dessen, dass sie alle zu der Ovalbuminsequenz zählen, ist es augenscheinlich, dass jede Zubereitung, die Ovalbumin oder Peptide oder Fragmente von Ovalbumin beliebiger Größe verwendet werden könnte, entweder allein oder mit anderen Proteinen gemischt. Beispielsweise: reines Ovalbumin, Eiweiß und Vollei und ihren unterschiedlichen Präsentationsformen, Eiprodukte, die für die Gastronomie und den Gastronomiehandel bestimmt sind, Nahrungsergänzungsmittel für Sportler oder Eiprodukte für Tierfutter.
Das Ausgangsmaterial ist in einer geeigneten Konzentration und mit einem für die Wirkung des proteolytischen Enzyms geeigneten pH-Wert in Wasser oder einer Pufferlösung gelöst oder verteilt. Es kann jedes proteolytische Enzym verwendet werden, das in der Lage ist, das in dem Ausgangsmaterial vorhandene Protein aufzubrechen und die relevanten Peptide bereitzustellen, wenngleich Pepsin bei einem pH-Wert von 2,0 bis 3,0 bevorzugt ist. Es könnten auch proteolytische Mikroorganismen verwendet werden, die eine Fermentation des Substrates durchführen.
Die Hydrolysebedingungen: pH-Wert, Temperatur, Druck, Enzym/Substrat-Verhältnis, Unterbrechung der Reaktion, usw. werden mit dem Ziel optimiert, die aktivsten Hydrolysate auszuwählen. In einer bestimmten Ausführungsform werden bioaktive Peptide erhalten, indem Pepsin bei einem pH-Wert von 2,0 in einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:100 Gew.:Gew. Verwendet und die Hydrolyse bei 37°C unter atmosphärischem Druck (0,1 MPa) für einen Zeitraum zwischen 10 Minuten und 24 Stunden durchgeführt wird, wenngleich ein Zeitraum von weniger als 3 Stunden bevorzugt ist. Die Verwendung eines hohen hydrostatischen Drucks von bis zu 400 MPa beschleunigt die Hydrolyse des Substartes, ohne das proteolytische Enzym zu hemmen, und modifiziert das Profil der erhaltenen Peptide.
Wenn als Nächstes die bioaktiven Peptide eingeengt werden sollen, und in Anbetracht dessen, dass Peptide mit ACEI-Aktivität etwa 3 bis 6–7 Aminosäuren enthalten (A. Pihlanto-Lippälä, T. Rokka und H. Korhonen, Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk Proteins, International dairy Journal, 1998, 8: 325–331), lassen sich unter Anwendung von Verfahren wie Ultrafiltration, Dialyse, Elektrodialyse mit Membranen der richtigen Porengröße, Gelfiltration, Chromatographie usw. niedermolekulare Fraktionen erhalten. In einer speziellen Ausführungsform werden mithilfe von Ultrafiltration durch eine hydrophile Membran von 3000 Da Fraktionen der Hydrolysate mit einem Molekulargewicht unter 3000 erhalten. Diese Fraktionen weisen eine höhere ACEI-Aktivität und antihypertensive Aktivität auf als die Ausgangshydrolysate. Mit den niedermolekularen Fraktionen der Hydrolysate als Ausgansmaterial lassen sich mittels Chromatographie auf Basis hydrophober Wechselwirkungen (Hydrophobic-action Chromatography), Ionenaustauschchromatographie oder vorzugsweise Umkehrphasen-Hochleistungschromatographie (Reverse Phase High Performance Chromtography) aktive Teilfraktionen isolieren.
Außer den vollständigen Hydrolysaten und ihren Fraktionen besitzen die in Tabelle 1 und mit SEQ-ID Nr. 1, SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3, SEQ-ID Nr. 4, SEQ-ID Nr. 5, SEQ-ID Nr. 6, SEQ-ID Nr. 7 und SEQ-ID Nr. 8 bezeichneten Peptide bioaktive Eigenschaften, grundsätzlich ACEI- und/oder antihypertensive und/oder antioxidative Aktivität und sind auch in der vorliegenden Erfindung beschrieben. Insbesondere zeigen die durch die Sequenzen SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3, SEQ-ID Nr. 5 und SEQ-ID Nr. 6 identifizierten Peptide eine starke ACEI-Aktivität in vitro und die Sequenzen SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3 und SEQ-ID Nr. 6 besitzen bei spontan hypertensiven Ratten (SHR), aber nicht bei normotensiven Wistar-Kyoto-Ratten (WKY-Ratten) nach oraler Verabreichung antihypertensive Aktivität. Darüber besitzt mindestens das als SEQ-ID Nr. 6 identifiziert Peptid antioxidative Aktivität gegenüber freien Radikalen. Es ist zu unterstreichen, dass es sich dabei um natürliche Peptide handelt, bei denen wenige Nebenwirkungen und gute Verträglichkeit zu erwarten sind.
Entsprechend lassen sich durch chemische und/oder enzymatische Synthese von Peptiden oder durch Rekombinationsverfahren in den Hydrolysaten identifizierte Peptide (SEQ-ID Nr. 1, SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3, SEQ-ID Nr. 4, SEQ-ID Nr. 5, SEQ-ID Nr. 6, SEQ-ID Nr. 7 und SEQ-ID Nr. 8) erhalten. Tabelle 1. Sequenzen identifizierter bioaktiver Peptide

YQIGL SEQ-ID Nr. 1

IVF⁺ SEQ-ID Nr. 2

RADHPFL⁺ SEQ-ID Nr. 3

FSL SEQ-ID Nr. 4

FRADHPFL^*+ SEQ-ID Nr. 5

YAEERYPIL SEQ-ID Nr. 6

RDILNQ SEQ-ID Nr. 7

SALAM SEQ-ID Nr. 8

⁺Sequenzen sind nur zur Veranschaulichung aufgeführt.
^*Sequenz wurde bereits als Ovokinin identifiziert (H. Fujita, H. Usui, K. Kurahashi und M. Yoshikawa, Isolation and characterization of ovokinin, a bradykinin B 1 agonist peptide derived from ovalbumin, Peptides, 1995, 16: 785–790). Es ist zu unterstreichen, dass diese Autoren die vasodilatatorische Aktivität dieses Peptids in den mesenterischen Arterien beim Hund überprüft haben, sie geben aber an, dass es keine ACEI-Aktivität besitzt.

Die Gewinnung bioaktiver Peptide aus Hydrolysaten von Eiweiß mithilfe von Pepsin wurde noch nicht beschrieben, wenngleich die ACEI-Aktivität von Ovalbuminhydrolysaten in vitro bereits aufgezeigt worden ist (H. Fujita, K. Yokoyama und M. Yoshikawa (Classification and antihypertensive activity of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory Peptides derived from food Proteins, Journal of Food Science, 2000, 65: 564–569). Eiweiß erweist sich als billiges und leicht zugängliches Proteinsubstrat für die Erzeugung bioaktiver Peptide. Darüber hinaus wurde auch die anti-hypertensive Aktivität von Ovalbuminhydrolysaten in vivo nicht aufgezeigt. Wie bereits erläutert, ist zu unterstreichen, dass viele Peptide, die sich in vitro als starke Inhibitoren von ACE erweisen, häufig ihre gesamte Aktivität oder einen Teil davon verlieren, wenn sie in vivo getestet werden, bzw. dass selbst Peptide, die in vitro keine große Aktivität als ACE-Inhibitoren aufweisen, in vivo aufgrund der Aktion von Verdauungsenzymen eine solche Aktivität annehmen (M. Maeno, N. Yamamoto und T. Takano, Identification of an anti-hypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a Proteinase from Lactobacillus helveticus CP790, Journal of Dairy Science, 1996, 79: 1316–1321).
Diese Eiprodukte, die kompletten Hydrolysate, deren niedermolekularen Fraktionen bzw. mindestens einer der darin enthaltenen bioaktiven Peptide (einschließlich ihrer Derivate, ihrer annehmbaren pharmazeutischen Salze und deren Gemisch) könnten als therapeutische Substanzen mit ACEI-Aktivität und/oder mit anti-hypertensiver Aktivität und/oder mit antioxidativer Aktivität verwendet werden. Solche Eiprodukte können einer Wärmebehandlung wie beispielsweise einer Pasteurisierung unterzogen oder getrocknet, gefriergetrocknet usw. werden, um als funktionelle Lebensmittelprodukte, als Nahrungszusatzstoffe oder -bestandteile oder als pharmazeutische Produkte für die Behandlung und/oder Prävention einer arteriellen Hypertension in jeglicher Form hauptsächlich beim Menschen, wenngleich auch bei Tieren, verwendet zu werden. Die Menge an Hydrolysaten, niedermolekularen Fraktionen, Peptiden, ihrer Derivate oder pharmazeutisch annehmbarer Salze und Gemische und ihre Dosierung für die Behandlung jeder bestimmten Pathologie variieren in Abhängigkeit zahlreicher Faktoren, wie beispielsweise dem Alter, der Intensität der Pathologie bzw. Funktionsstörung, der Verabreichungsart und der Dosishäufigkeit. Diese Verbindungen können in jeder Verabreichungsform, fest oder flüssig, dargereicht und auf jedem geeigneten Weg, oral, durch Einatmen, rektal oder topisch angewendet werden, wenngleich sie insbesondere für die Anwendung als Feststoff oder Flüssigkeit auf dem oralen Weg konzipiert sind.
Allgemein lässt sich der Vorgang des Erhaltens dieser Eiprodukte: der kompletten Hydrolysate, ihrer niedermolekularen Fraktionen und ihrer Peptidbestandteile, optimieren, indem versucht wird, die größtmögliche Menge an bioaktiven Peptiden zu erzeugen oder das Auftreten von Bitterkeit, wie sie normalerweise durch eine hohe Konzentration von Peptidzwischenverbindungen oder niedermolekularen hydrophoben Peptiden verursacht wird, so weit wie möglich zu kontrollieren.
Analyseverfahren
Messung der inhibitorischen Aktivität des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACEI-Aktivität)
Die inhibitorische Aktivität des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE) wird in vitro nach dem Verfahren von D. W. Cushman und H. S. Cheung gemessen (Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung. Biochemical Pharmacology, 1971, 20: 1637–1648), das später von Y. K. Kim, S. Yoon, D. Y. Yu, B. Lonnerdal und B. H. Cheung modifiziert wurde (Novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from recombinant human a_S1-casein expressed in Escherichia coli, Journal of Dairy Research 1999, 66, 431–439).
Das Substrat Hippurylhistidylleucin (HHL, Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO, USA) wird in einem 0,1 M Boratpuffer mit 0,3 M NaCl pH 8,3 gelöst, um eine Endkonzentration von 5 mM zu erhalten. Zu 100 μl Substrat werden 40 μl jeder Probe gegeben, deren ACEI-Aktivität bestimmt werden soll. Das in 50% Glycerol gelöste und zum Zeitpunkt der Durchführung des Tests 1 zu 10 in doppelt destilliertem Wasser verdünnte ACE-Enzym (EC 3.4.15.1, Sigma) wird zugegeben. Die Reaktion wird 30 Minuten lang bei 37°C im Wasserbad durchgeführt. Das Enzym wird deaktiviert, indem der pH-Wert mit 150 μl 1 N HCl gesenkt wird. Die gebildete Hippursäure wird mit 1000 μl Ethylacetat extrahiert. Nach Rühren auf dem Vortex für 20 Sekunden wird der Ansatz bei 4000 Umdrehungen pro Minute (UpM) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Es werden 750 μl der organischen Phase entnommen und durch 10-minütiges Erhitzen bei 95°C verdampft. Der Hippursäurerückstand wird in 800 μl doppelt destilliertem Wasser wieder gelöst, und nach 20-sekündigem Rühren wird die Absorption in einem Dur-70-Spektrophotometer von Beckman Instruments, Inc., Fullerton, USA, bei 228 nm gemessen.
Zur Berechnung der prozentualen ACEI-Aktivität wird folgende Formel verwendet: %ACEI = (AKontrolle – Aprobe/AKontrolle – ALeerwert)·100
Der Leerwert dient der Korrektur der Hintergrundabsorption. Sie enthält Substrat, Enzym und 20 μl doppelt destilliertes Wasser anstelle der Probe, und die Reaktion wird zum Zeitpunkt Null gestoppt. Die Kontrolle repräsentiert eine Enzymwirkung von einhundert Prozent auf das Substrat in Abwesenheit von Inhibitoren, enthält 20 μl Wasser anstelle der Probe und wird auf dieselbe Weise wie die Probe inkubiert.
Die Ergebnisse sind als IC₅₀-Wert (μM oder μg/ml) oder als die Konzentration angegeben, bei der 50% der Aktivität des Enzyms gehemmt sind. Die Proteinkonzentration wird mithilfe des Bicinchoninsäure-Tests (BSA-Test) (Pierce, Rockford, IL, USA) mit Rinderserumalbumin als Referenz ermittelt.
Messung der antioxidativen Aktivität
Zur Messung der antioxidativen Aktivität wird das von R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang und C. Rice-Evans (Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay, Free Radical Biological Medicine, 1999, 26: 1231–1237) entwickelte Verfahren angewendet. Das Verfahren beruht auf dem Verschwinden des Radikals ABTS⁺ (2,2-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfon)säure) infolge der Reduktionswirkung verschiedener Proben mit antioxidativer Aktivität. Das Radikal ABTS⁺ hat eine maximale Absorption bei 734 nm. Die antioxidative Aktivität wird durch den Abfall der Absorptionszeit bei 734 nm ermittelt.
Zur Erzeugung des Radikals ABTS⁺ wird die Verbindung ABTS (Sigma) in einer Konzentration von 7 mM in Wasser gelöst, in einem Verhältnis von 1:2 für 24 Stunden in Abwesenheit von Licht in Berührung mit 2,45 mM Kaliumpersulfat gebracht. Nach 24 Stunden wird die Absorption bei 734 nm mit 5 mM Phosphatpuffersalz (PBS), 138 mM NaCl, pH 7,4, auf einen Wert von 0,70 ± 0,02 gebracht. In einem Standardexperiment wird 1 ml dieser Lösung zu 10 μl der in 0,02 M Natriumphosphatpuffer pH 6,5 gelösten Probe (1,5 mM) gegeben. Das Experiment wird mit Dreifachbestimmungen durchgeführt, wobei jede Probe 10 Minuten lang bei 37°C mit dem Radikal ABTS⁺ inkubiert wird und wobei die Absorption bei 734 nm nach 1, 6 und 10 Minuten gemessen wird. Als Leerwert wird 0,02 M Natriumphosphatpuffer pH 6,5 verwendet, und gleichzeitig mit der Inkubation der Proben wird das Radikal ABTS⁺ ohne jegliches Antioxidans (Kontrolle) inkubiert. Die antioxidative Aktivität einer jeden Probe wird unter Bezugnahme auf die Absorption bei 734 nm der Kontrolle berechnet. Die antioxidative Aktivität der Probe wird relativ zu der antioxidativen Aktivität von Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure) (Sigma), analog zu Vitamin E mithilfe eines TEAC-Wertes (TEAC = Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) zu einem bestimmten Zeitpunkt, ausgedrückt.
Es sind verschiedene Möglichkeiten zur Berechnung des TEAC-Wertes entwickelt worden. Wir verwenden das von F. W. P. C. van Overlveld, G. R. M. M. Haenen, J. Rhemrev, J. P. W. Vermeiden und A. Bast beschriebene Verfahren (Tyrosine as important contributor to the antioxidant capacity of seminal plasma, Chemical and Biological Interactions, 2000, 127: 151–161), das für die Berechnung des TEAC-Wertes einer reinen Verbindung geeignet ist, die eine Verringerung der Absorption bewirkt, welche bei Erhöhung der Konzentration linear ansteigt. In diesem Fall wäre es lediglich erforderlich, eine bestimmte Konzentration einer Verbindung zu berechnen, um ihren TEAC-Wert errechnen zu können. TEACVerbindung = Variation in Abs734 nm/0,28045 × [Konzentration der Verbindung]
Der Wert 0,2845 gibt die Verringerung der Absorption durch 1 mM Trolox wieder.
Isolation von Peptidfragmenten mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC) im semipräparativen Maßstab
Die verwendete Ausrüstung besteht aus zwei programmierbaren Pumpen, Modell Delta 600 von Waters, einem Detektor, Modell 966, mit ausgerichteten Dioden, einem automatischen Injektor, Modell 717 plus und einem automatischen Fraktionssammler (Waters Corp, Mildford, MA, USA). Es wird eine C₁₈-Prep NovaPack^® HR, 7,8 × 300 mm und Porengröße 6 μm (Waters) verwendet, mit einer C₁₈-Kartusche (Waters) als Vorsäule. Die Analyse wird bei 30°C und die Detektion bei 214 und 280 nm durchgeführt. Die Datenerhebung erfolgt mithilfe der Software Millennium, Version 3.2 (Waters). Zur Elution der Proben werden ein binärer Gradient, der aus Wasser (Phase A) und Acetonitril (Phase B) mit jeweils 0,1% TFA besteht, und ein Fluss von 4 ml/Min. verwendet. Phase B weist einen Gradienten von 2% bis 10% in 15 Min., von 10% bis 20% in 35 Minuten, von 20% bis 30% in 20 Minuten auf. Die Säule wird mit 70% B gewaschen und schließlich unter Startbedingungen 15 Minuten lang konditioniert. Das injizierte Probenvolumen beträgt 200 μl. Vor der Injektion werden die Proben durch einen Millipore-Filter (Waters) mit 0,45 μm geleitet.
Analyse mittels Tandem-Massenspektrometrie (offline)
Es wird eine Ionenfalle vom Typ Esquire 3000 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland) verwendet. Die Probe wird mit einem Fluss von 4 μl/Min. in den Electropray-Sprayer injiziert, wobei eine Spritzenpumpe vom Typ 22 (Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA) verwendet wird. Die Ausrüstung verwendet Stickstoff als Sprayer und Trockengas und arbeitet mit einem Heliumdruck von 5 × 10^–3 bar. Die Massenspektren werden in einem Abstand von 50–1500 m/z und bei einer Geschwindigkeit von 13000 Da/Sekunde erfasst. Die Auswertung der Tandem-MS-Spektren für die Identifizierung der Peptidsequenzen erfolgt mit dem Programm Biotools 2.1 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland).
Analyse mittels RP-HPLC, gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (RP-HPLC-MS/MS)
Es wird die Ausrüstung Esquire-LC (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland) verwendet. Die HPLC-Ausrüstung (Serie 1100) besteht aus einer quaternären Pumpe, einem automatischen Injektor, einem Entgasungssystem für Eluate und einem Ultraviolettdetektor mit variabler Wellenlänge (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland), der in-line mit einem Ionenfallen-Massenspektrometer Esquire 3000 (Bruker Daltonik) gekoppelt ist. Bei der Säule handelt es sich um eine Hi-Pore C18-Säule (250 × 4,6 mm ID, Partikelgröße 5 μm) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). Lösungsmittel A ist ein Gemisch aus Wasser und Trifluoressigsäure (1000:0,37) und Lösungsmittel B ist ein Gemisch aus Acetonitril und Trifluoressigsäure (1000:0,27). 50 μl Probe wird in einer Konzentration von 1–2 mg/ml injiziert. Es wird ein Fluss von 0,8 ml/Minute mit einem linearen Gradienten von 0% bis 30% Lösungsmittel B in A in 25 Minuten verwendet. Das Eluat wird bei 214 nm unter denselben Bedingungen wie im vorherigen Abschnitt beschrieben massenspektrometrisch kontrolliert, außer dass die Injektion der Probe durch den Sprayer bei 60 μl/Min. erfolgt.
Studie der antihypertensiven Aktivität bei spontan hypertensiven Ratten
Untersucht wird der Effekt verschiedener identifizierter Peptide und einiger Produkte, die diese Peptide enthalten (beispielsweise Eiweiß, das 3 Stunden lang mit Pepsin hydrolysiert wurde, und dessen Fraktion von weniger als 3000 Da), auf den arteriellen Druck spontan hypertensiver Ratten (SHR) und von Wistar-Kyoto-Ratten (WKY), die als normotensive Kontrollen für die SHR dienen.
Diese Studie wird mit 17–24 Wochen alten SHR (10) und WKY mit einem Gewicht zwischen 300 und 350 g durchgeführt, die von Charles River Laboratories Espana, S. A. stammten. Die Ratten werden zu je fünf in einem Käfig bei einer stabilen Temperatur von 25°C mit Licht-Dunkel-Zyklen von 12 Stunden mit frei verfügbarem Trinkwasser und Futter gehalten. Zur Durchführung der Messung des systolischen arteriellen Drucks (SAP) wird das „Tail-Cuff"-Experiment (Experiment mit Schwanzarterienmanschette) verwendet (Le5001, Letica), das automatisch einen digitalen Wert des SAP liefert und die Bestimmung der Herzfrequenz der Tiere ermöglicht bzw. diese aufzeichnet. Es werden verschiedene Messungen durchgeführt, und der Mittelwert all dieser Messungen ermittelt, um einen zuverlässigen Wert des SAP zu erhalten. Vor dem Anbringen der Manschette und des Messfühlers am Schwanz der Ratten werden diese einer Temperatur von fast 30°C ausgesetzt, damit sich die Schwanzarterie aufweiten kann. Zur Sicherstellung der Zuverlässigkeit der Messung werden die Tiere außerdem in den zwei Wochen vor der Durchführung des jeweiligen fraglichen Tests an die Vorgehensweise gewöhnt.
Die Verabreichung des zu testenden Produktes erfolgt mittels einer Magensonde in einem Zeitfenster zwischen 9 und 10 Uhr morgens. Die für die Studie verwendeten SHR hatten SAP-Werte zwischen 230 und 280 mmHg. Die zu diesem Zeitpunkt für die Studie verwendeten WKY hatten SAP-Werte zwischen 160 und 200 mmHg. Die Messung des SAP erfolgte regelmäßig alle 2 Stunden bis zu 8 Stunden nach Verabreichung der zu testenden Produkte; darüber hinaus wurde eine SAP-Messung 24 Stunden nach Gabe dieser Produkte durchgeführt. Als Negativkontrolle (zur Feststellung der zirkadianen Schwankung des SAP der untersuchten Ratten) wurden die Messungen des SAP solcher Ratten herangezogen, welchen 1 ml Wasser über die Magensonde verabreicht worden war. Als Positivkontrolle dienten die Messungen des SAP bei Ratten, denen 50 mg Captopril pro kg (ACEI-Prototypwirkstoff) über eine Magensonde verabreicht worden war. Diese Captopril-Dosis wurde jeder Ratte in einem Volumen von 1 ml verabreicht. Zur Feststellung des Effektes des nicht-hydrolysierten Eiweißes auf den arteriellen Druck der Tiere wurden ähnliche Tests wie die oben beschriebenen durchgeführt, bei denen die Tiere mit 200 mg/kg von zuvor gefriergetrocknetem Eiweiß (Referenz) unter Anwendung derselben Vorgehensweise behandelt wurden.
Die erzielten Resultate wurden nach Gruppen geordnet, und es wurden der Mittelwert ± Standardfehler der Messung (SEM) für mindestens 9 homogene Tests ermittelt. Die Daten der behandelten Tiere wurden stets mit den als Negativkontrolle herangezogenen Daten verglichen. Zu deren Vergleich und zur Ermittlung der statistischen Signifikanz wurde der Student-t-Test für nicht-paarige Daten herangezogen, und ein Unterschied mit Werten von p < 0,05 wurde als signifikant erachtet.
Kurzbeschreibung des Inhalts der Figuren
1 gibt den Abfall des systolischen arteriellen Drucks (SAP) wieder, der bei spontan hypertensiven Ratten nach Verabreichung von 1 ml Wasser (o), 50 mg/kg Captopril (☐), 200 mg/kg Eiweiß (EW) (X) und verschiedenen Dosen von Eiweißhydrolysat (EWH): 100 mg/kg (♦), 150 mg/kg (
), 200 mg/kg (
) und 400 mg/kg (Δ), über eine Magensonde erhalten wurde. Die Daten geben den Mittelwert ± SEM von mindestens 9 Tieren wieder. Die Abszisse gibt an, wie viel Zeit (in Stunden) seit der Verabreichung verstrichen ist.
2 gibt den Abfall des systolischen arteriellen Drucks (SAP) wieder, der bei spontan hypertensiven Ratten nach Verabreichung von 1 ml Wasser (o), 50 mg/kg Captopril (☐) und verschiedenen Dosen der Fraktion von Eiweißhydrolysat von unter 3000 Da (F < 3000 Da): 25 mg/kg (♦), 50 mg/kg (
) und 100 mg/kg (
), über eine Magensonde erhalten wurde. Die Daten geben den Mittelwert ± SEM von mindestens 9 Tieren wieder. Die Abszisse gibt an, wie viel Zeit (in Stunden) seit der Verabreichung verstrichen ist.
3A ist ein Chromatogramm, das unter Anwendung von RP-HPLC (Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography) im präparativen Maßstab für die Fraktion unter 3000 Da erhalten wurde, die nach 3-stündiger Hydrolyse von Eiweiß mit Pepsin und anschließender Auswahl von 9 Fraktionen (F1–F9), die automatisch gesammelt wurden, erhalten worden war. Die Abszisse gibt die Zeit in Minuten wieder.
3B gibt die ACEI-Aktivität wieder, ausgedrückt als die Proteinkonzentration, die erforderlich ist, um 50% des Enzyms zu hemmen (IC₅₀), entsprechend jeder der mittels RP-HPLC im präparativen Maßstab gesammelten 9 Fraktionen.
4 gibt den Abfall des systolischen arteriellen Drucks (SAP) wieder, der bei spontan hypertensiven Ratten nach Verabreichung von 1 ml Wasser (o), 50 mg/kg Captopril (☐) und verschiedenen Dosen der Fraktion des Peptids YAEERYPIL: 0,5 mg/kg (♦), 1 mg/kg (
) und 2 mg/kg (
), über eine Magensonde erhalten wurde. Die Daten geben den Mittelwert ± SEM von mindestens 9 Tieren wieder. Die Abszisse gibt an, wie viel Zeit (in Stunden) seit der Verabreichung verstrichen ist.
5 gibt den Abfall des systolischen arteriellen Drucks (SAP) wieder, der bei spontan hypertensiven Ratten nach Verabreichung von 1 ml Wasser (o), 50 mg/kg Captopril (☐) und verschiedenen Dosen der Fraktion des Peptids RADHPFL: 0,5 mg/kg (♦), 1 mg/kg (
) und 2 mg/kg (
), über eine Magensonde erhalten wurde. Die Daten geben den Mittelwert ± SEM von mindestens 9 Tieren wieder. Die Abszisse gibt an, wie viel Zeit (in Stunden) seit der Verabreichung verstrichen ist.
6 gibt den Abfall des systolischen arteriellen Drucks (SAP) wieder, der bei spontan hypertensiven Ratten nach Verabreichung von 1 ml Wasser (o), 50 mg/kg Captopril (☐) und verschiedenen Dosen der Fraktion des Peptids IVF: 1 mg/kg (♦), 2 mg/kg (
) und 4 mg/kg (
), über eine Magensonde erhalten wurde. Die Daten geben den Mittelwert ± SEM von mindestens 9 Tieren wieder. Die Abszisse gibt an, wie viel Zeit (in Stunden) seit der Verabreichung verstrichen ist.
7 gibt den Abfall des systolischen arteriellen Drucks (SAP) wieder, der bei spontan hypertensiven Ratten nach Verabreichung von 1 ml Wasser (o), 50 mg/kg Captopril (☐), 200 mg/kg EW (X), 400 mg EWH (⦁), 100 mg/kg der Fraktion von EWH unter 3000 Da (F < 3000 Da) (Δ), 2 mg/kg des Peptids YAEERYPIL (♦), 2 mg/kg des Peptids RADHPFL (
) und 4 mg/kg des Peptids IVF (
), über eine Magensonde erhalten wurde. Die Daten geben den Mittelwert ± SEM von mindestens 9 Tieren wieder. Die Abszisse gibt an, wie viel Zeit (in Stunden) seit der Verabreichung verstrichen ist.
BEISPIELE DER AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, wenngleich sie nicht als einschränkend gegenüber deren Umfang zu verstehen sind.
Beispiel 1. Erhalten bioaktiver Peptide mit ACEI-Aktivität und antihypertensiver Aktivität ausgehend von mit Pepsin bei atmosphärischem Druck hydrolysiertem Eiweiß
Das Hydrolysat wurde erhalten, indem Hühnereiweiß aus frischen Eiern als Substrat erhalten, vom Dotter getrennt und gefriergetrocknet wurde. Pepsin (E. C. 3.4.23.1 Typ A, 10000 E/mg Protein) aus Schweinemagen (Sigma) wurde als Enzym verwendet. Das Substrat wurde in einer Konzentration von 100 mg/ml in Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. Es wurde Pepsin zugegeben (Enzym/Substrat-Verhältnis: 1:100, Gew./Gew.). Die Hydrolyse wurde bei einer Temperatur von 37°C für 24 Stunden bei atmosphärischem Druck (0,1 MPa) durchgeführt. Die Deaktivierung des Pepsins wurde erreicht, indem der pH-Wert mit 1 N NaOH auf 7,0 erhöht wurde.
Die ACEI-Aktivität wurde in Aliquots gemessen, die zu folgenden verschiedenen Hydrolysezeitpunkten abgenommen wurden, nämlich nach 0 und 30 Minuten sowie nach 3, 5, 8 und 24 Stunden. Die Ergebnisse zeigten, dass nicht hydrolysiertes Eiweiß keine ACEI-Aktivität besaß (IC₅₀ > 750 μg/ml), aber nach folgenden Hydrolysezeiten mit Pepsin ACE aktiv hemmt, wobei die größte Hemmung nach 3-stündiger Hydrolyse erreicht war (IC₅₀ = 200,9 ± 1,5 μg/ml, 55,3 ± 2,1 μ/ml, 72,2 ± 2,3 μg/ml, 43,07 ± 1,4 μg/ml, 40,2 ± 0,9 μg/ml nach 30 Min., 3, 5, 8 bzw. 24 Stunden).
Die Fraktion unter 3000 Da von mit Pepsin 3 Stunden hydrolysiertem Eiweiß wurde mittels Ultrafiltration durch eine hydrophile Membran mit 3000 Da (Centriprep, Amicon, Inc., Beverly, MA, USA), Zentrifugieren bei 1900 g für 40 Minuten erhalten. Die ACEI-Aktivität wurde im Retentat (Fraktion der Größe > 3000 Da) und im Permeat (Fraktion der Größe < 3000 Da) gemessen. Die IC₅₀-Werte waren 298,4 bzw. 34,5 μg/ml. Dies zeigt, dass das Permeat etwa 10 Mal mehr ACEI-Aktivität aufweist, und daher ist die Aktivität grundsätzlich Peptiden mit kleiner Größe zuzuschreiben.
Die anti-hypertensive Aktivität von mit Pepsin 3 Stunden hydrolysiertem Eiweiß und seiner Fraktion unter 3000 Da wurde bei spontan hypertensiven Ratten (SHR) und bei normotensiven Wistar-Kyoto-Ratten (WKY) untersucht. Den Tieren wurden verschiedene Konzentrationen von gefriergetrockneten Eiprodukten verabreicht, die im Falle des Hydrolysats zwischen 100 und 400 mg/kg und im Falle der Fraktion unter 3000 Da zwischen 25 und 100 mg/kg lagen.
1 bzw. 2 zeigen den Abfall des SAP in SHR zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung verschiedener Dosen von mit Pepsin 3 Stunden hydrolysiertem Eiweiß und nach der Verabreichung verschiedener Dosen der Fraktion unter 3000 Da dieses Hydrolysats. Das Ergebnis dieser Tests mit nicht-hydrolysiertem Eiweiß (Referenz) (200 mg/kg) sind in 1 dargestellt. Darin ist zu sehen, dass die SAP-Werte, die der Referenz entsprechen, den SAP-Werten der Tiere gleichen, denen Wasser verabreicht wurde. Diese Figuren enthalten auch den Abfall des SAP, der nach Verabreichung von Captopril beobachtet wurde. Captopril bewirkt einen deutlichen Abfall des SAP bei SHR. Der Abfall des SAP erreicht 6 Stunden nach Verabreichung des Wirkstoffes einen Höchstwert. Das Eiweißhydrolysat und die Fraktion unter 3000 Da verursachen erhebliche dosisabhängige Verringerungen des SAP bei den Tieren. Die niedrigeren SAP-Werte nach Verabreichung von Eiweißhydrolysat und der Fraktion unter 3000 Da werden auch 6 Stunden nach deren Verabreichung beobachtet. Die 24 Stunden nach den unterschiedlichen Verabreichungen beobachteten Werte gleichen denen, welche die Tiere davor aufgewiesen hatten.
Mit dem Ziel der Identifizierung der für die ACEI-Aktivität und/oder die antihypertensive Aktivität verantwortlichen Peptide wurde die Fraktion unter 3000 Da, die nach Hydrolyse des Eiweißes mit Pepsin für 3 Stunden erhalten wurde, gefriergetrocknet und in Wasser bei einer Konzentration von 50 mg/ml gelöst und mittels RP-HPLC im semipräparativen Maßstab fraktioniert. Wie in 3A gezeigt, wurden 9 Fraktionen gesammelt (nach etwa 10–12 Analysen), die eingefroren, gefriergetrocknet und bis zum Gebrauch bei –20°C aufbewahrt wurden. Jede Fraktion wurde in Milli-Q-Wasser gelöst und die ACEI-Aktivität wurde gemessen.

Wie in 3B gezeigt, waren die Teilfraktionen 6, 7 und 8 am aktivsten und mittels Tandem-Massenspektrometrie analysiert, um ihre Peptidbestandteile zu bestimmen. Mit diesem Ziel wurden die Peptidteilfraktionen 6, 7 und 8, die mittels präparativer RP-HPLC aufgefangen wurden, gefriergetrocknet und bei einer Konzentration von 5–10 μg/ml in einem Gemisch von 50% Acetonitril in Wasser, das 0,3% Ameisensäure enthielt, gelöst. Die identifizierten Peptide sind in Tabelle 2 gezeigt. Es ist darauf hinzuweisen, dass alle Peptide von Ovalbumin stammten. Tabelle 2. In den Teilfraktionen 6, 7 und 8 der Fraktion unter 3000 Da von mit Pepsin 3 Stunden lang hydrolysiertem Eiweiß identifizierte Peptide

Fraktion Nr.	Experimentelle Masse	Theoretische Masse	Protein	Position	Aminosäuren	Sequenz Nr.
6	592.3	592.32	Ovalbumin	212–216	YQIGL⁺	SEQ-ID Nr. 1
6	377.2	377.23	Ovalbumin	178–180	IVF+	SEQ-ID Nr. 2
6	854.4	854.44	Ovalbumin	359–365	RADHPFL⁺	SEQ-ID Nr. 3
6	365.2	365.20	Ovalbumin	99–101	FSL	SEQ-ID Nr. 4
7	721.3	721.37	Ovalbumin	256–261	ESIINF⁺
7	1001.4	1001.51	Ovalbumin	358–365	FRADHPFL⁺	SEQ-ID Nr. 5
7	1152,3	1152.58	Ovalbumin	106–114	YAEERYPIL	SEQ-ID Nr. 6
8	757,2	757.41	Ovalbumin	84–89	RDILNQ	SEQ-ID Nr. 7
8	1040,2	1040.58	Ovalbumin	243–252	VLLPDEVSGL⁺
8	491,1	491.24	Ovalbumin	36–40	SALAM	SEQ-ID Nr. 8
8	487,1	487.26	Ovalbumin	144–147	ELIN⁺
8	1164.2	1164.59	Ovalbumin	125–134	YRGGLEPINF⁺

⁺Sequenzen sind nur zur Veranschaulichung aufgelistet.

Beispiel 2. Durch chemische Synthese erhaltene Peptide mit ACEI-Aktivität und anti-hypertensiver Aktivität
Alle in Tabelle 2 von Beispiel 1 identifizierten Peptide wurden mithilfe des Fmoc-Verfahrens in der Festphase mit einer Synthesemaschine Modell 431A von Applied Biosystems Inc. (Obertingen. Deutschland) chemisch synthetisiert. Die Reinheit der synthetischen Peptide wurde mittels RPHPLC-MS/MS überprüft.

Es wurde die ACEI-Aktivität der synthetischen Peptide gemessen. Die festgestellte Aktivität ist in Tabelle 3 angegeben. Herausragende Aktivität zeigten 8 Peptide mit einem IC₅₀-Wert unter 450 μM und vor allem die Sequenzen SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3, SEQ-ID Nr. 5 und SEQ-ID Nr. 6 mit einem IC₅₀-Wert unter 34 μM. Tabelle 3. ACEI-Aktivität von Peptiden, die in Teilfraktion 6, 7 und 8 der Fraktion unter 3000 Da von mit Pepsin für 3 Stunden hydrolysiertem Eiweiß identifiziert wurden

Sequenz Nr.	Aminosäuren	IC₅₀ (μM)
SEQ-ID Nr. 1	YQIGL	173,8
SEQ-ID Nr. 2⁺	IVF	33,9
SEQ-ID Nr. 3⁺	RADHPFL	6,2
SEQ-ID Nr. 4	FSL	172,9
	ESIINF⁺	> 1000
SEQ-ID Nr. 5⁺	FRADHPFL	3,2
SEQ-ID Nr. 6	YAEERYPIL	4,7
SEQ-ID Nr. 7	RDILNQ	435,7
	VLLPDEVSGL⁺	> 1000
SEQ-ID Nr. 8	SALAM	229,1
	ELIN⁺	> 1000
	YRGGLEPINF⁺	> 1000

⁺Sequenzen sind nur zur Veranschaulichung aufgelistet.

Die anti-hypertensive Aktivität der Peptide SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3 und SEQ-ID Nr. 6 wurde getestet. Dafür wurden verschiedene Dosen davon an SHR und WKY-Ratten verabreicht, wobei die jeweils verwendete Höchstdosis in Einheiten von ACEI-Aktivität zu der Dosis von 50 mg/kg der Fraktion unter 3000 Da des Eiweißhydrolysats äquivalent war. Die Peptide wurden in destilliertem Wasser gelöst, und die entsprechende Dosis wurde jeder Ratte in einem Volumen von 1 ml verabreicht.
4, 5 und 6 zeigen den Abfall des SAP, der zu verschiedenen Zeitpunkten nach Verabreichung verschiedener Dosen der Peptide SEQ-ID Nr. 6, SEQ-ID Nr. 3 und SEQ-ID Nr. 2 bei SHR erhalten wurde. Es wird deutlich, dass die Verabreichung dieser Peptide einen erheblichen dosisabhängigen Abfall des SAP bei diesen Tieren verursacht. Der Abfall des SAP ist 6 Stunden nach der Verabreichung dieser Peptide am stärksten, und der erhaltene maximale Abfall ist für die anderen Peptide ähnlich.
7 zeigt die Veränderungen des SAP bei WKY-Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten nach Verabreichung der folgenden Verbindungen: 400 mg Eiweißhydrolysat pro kg, 100 mg der Fraktion unter 3000 Da des Hydrolysat pro kg, 2 mg des Peptids SEQ-ID Nr. 6 pro kg, 2 mg des Peptids SEQ-ID Nr. 3 pro kg und 4 mg des Peptids SEQ-ID Nr. 2 pro kg. Enthalten sind auch die Ergebnisse, die nach Verabreichung von 50 μg Captopril pro kg erhalten wurden. Es ist deutlich, dass keine dieser Verbindungen des SAP bei WKY-Ratten modifiziert, wenn die höchste verwendete Dosis verabreicht wird. Diese Ergebnisse bedeuten, dass mögliche unerwünschte Auswirkungen der getesteten Produkte auf den arteriellen Druck normotensiver Individuen zu vernachlässigen sind.
Die präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die durch die Sequenzen SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3 und SEQ-ID Nr. 6 identifizierten Peptide einen deutlichen und ausgeprägten anti-hypertensiven Effekt haben, welcher nach deren akuter Verabreichung einem Zeitverlauf folgt, der dem nach Verabreichung von Eiweißhydrolysat oder der Fraktion unter 3000 Da dieses Hydrolysats beobachteten anti-hypertensiven Effekt gleicht.
Beispiel 3. Durch chemische Synthese erhaltene Peptide mit antioxidativer Aktivität
Die antioxidative Aktivität eines der identifizierten Peptide, insbesondere der Sequenz SEQ-ID Nr. 6, erwähnt in Beispiel 1, wurde gemessen. Die festgestellte Aktivität ist unten gezeigt: TEACYAEERYPIL(1 MINUTE) = 0,8 TEACYAEERYPIL(6 MINUTEN) = 1,2 TEACYAEERYPIL(10 MINUTEN) = 1,3
Die Ergebnisse zeigen daher, dass 1 mg von YAEERYPIL (SEQ-ID Nr 6) 1,3 Mal mehr antioxidative Aktivität als 1 mg Trolox aufweist.
Beispiel 4. Erhalten bioaktiver Peptide ausgehend von mit Pepsin bei atmosphärischem Druck hydrolysiertem Ovalbumin
Das Hydrolysat wurde erhalten, indem Ovalbumin, Grad IV (99% Reinheit) (Sigma) als Substrat verwendet wurde. Das Substrat wurde bei einer Konzentration von 100 mg/ml in Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. In dieser besonderen Ausführungsform der Erfindung wurde Pepsin (E. C. 3.4.23.1, Typ A, 10000 E/mg Protein) aus Schweinemagen (Sigma) in einem Enzym:Substrat-Verhältnis von 1:100, Gew.:Gew. verwendet. Die Hydrolyse wurde 3 Stunden lang bei atmosphärischem Druck (0,1 MPa) bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt. Die Deaktivierung des Pepsins wurde erreicht, indem der pH-Wert mit 1 N NaOH auf 7,0 erhöht wurde.
Die Messung der ACEI-Aktivität zeigte, dass nicht-hydrolysiertes Ovalbumin keine ACEI-Aktivität besitzt (IC₅₀ > 750 μg/ml), aber nach 3-stündiger Hydrolyse mit Pepsin das Enzym hemmt (IC₅₀ = 129,0 ± 0,6 μg/ml). Das so erhaltene Hydrolysat wurde mittels RP-HPLC-MS/MS analysiert. Es wurden mindestens folgende Sequenzen gefunden: SEQ-ID Nr. 1, SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3, SEQ-ID Nr. 4, SEQ-ID Nr. 5, SEQ-ID Nr. 6, SEQ-ID Nr. 7 und SEQ-ID Nr. 8. Unter den Sequenzen besitzen SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3, SEQ-ID Nr. 5 und SEQ-ID Nr. 6 einen IC₅₀-Wert unter 34 μM (Beispiel 2). SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 3 und SEQ-ID Nr. 6 besitzen auch anti-hypertensive Aktivität bei Ratten (Beispiel 2) und SEQ-ID Nr. 6 besitzt antioxidative Aktivität gegenüber freien Radikalen (Beispiel 3)
Beispiel 5. Erhalten bioaktiver Peptide ausgehend von mit Pepsin unter hohem hydrostatischem Druck hydrolysiertem Ovalbumin
Das Hydrolysat wurde erhalten, indem Ovalbumin, Grad IV (99% Reinheit) (Sigma) als Substrat verwendet wurde. Als Enzym wurde Pepsin (E. C. 3.4.23.1, Typ A, 10000 E/mg Protein) aus Schweinemagen (Sigma) verwendet. Das Substrat wurde bei einer Konzentration von 2 mg/ml in Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. Es wurde Pepsin zugegeben (Enzym:Substrat-Verhältnis: 1:20, Gew.:Gew.). Die Hydrolyse wurde 30 Minuten lang bei verschiedenen hydrostatischen Drücken (100, 200, 300 und 400 MPa) bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt. Die Deaktivierung des Pepsins wurde erreicht, indem der pH-Wert mit 1 N NaOH auf 7,0 erhöht wurde.
Die Behandlungen unter hohem Druck wurden in einer Ausrüstung mit diskontinuierlichem hydrostatischem Druck (900 HP Eurotherm Automation) mit einem Fassungsvermögen von 2350 ml durchgeführt, die einen Druck von 500 MPa erzielt. Die Hochdruckkammer besteht aus einem Zylinder aus rostfreiem Edelstahl, der mit Druckübertragungsmedium (Wasser) gefüllt ist und in den das Gemisch aus Substrat und Enzym, eingeschlossen in einem Eppendorf-Kunststoffröhrchen ohne verbleibende Luftkammer, eingeführt wird. Die Ausrüstung erreicht den gewünschten Druck mit einer Geschwindigkeit von 2,5 MPa/Sekunde und wird nach der Behandlung mit derselben Geschwindigkeit wieder auf Null gebracht. Die Ausrüstung wird von einem Behelfsbad begleitet, das durch die Zirkulation von Wasser durch einen Außenmantel, der den Zylinder umgibt, eine Behandlung bei Temperaturen von –20°C bis 95°C ermöglicht. Die Temperatur des Vorgangs wird mithilfe eines in das Druckübertragungsmedium eingetauchten Thermoelements gesteuert.
Die so erhaltenen Hydrolysate wurden mittels RP-HPLC-MS/MS analysiert. Es wurden mindestens folgende Sequenzen festgestellt: SEQ-ID Nr. 2, SEQ-ID Nr. 5 und SEQ-ID Nr. 6, welche, wie in Beispiel 2 angegeben, einen IC₅₀-Wert unter 7 μM besitzen. SEQ-ID Nr. 3 und SEQ-ID Nr. 6 besitzen außerdem anti-hypertensive Aktivität bei Ratten (Beispiel 2), und SEQ-ID Nr. 6 besitzt antioxidative Aktivität gegen freie Radikale (Beispiel 3). Dieses Beispiel zeigt, wie es die Anwendung eines hohen hydrostatischen Drucks ermöglicht, dass Hydrolysate, die aktive Peptide enthalten, schneller erhalten werden, als wenn die Hydrolyse unter atmosphärischem Druck durchgeführt wird. Man kann darauf hinweisen, dass SEQ-ID Nr. 2 unter diesen Bedingungen nicht erhalten wurde, was ggf. Konsequenzen für die industrielle Anwendbarkeit der Hydrolysate hat.
SEQUENZLISTE

Claims

Bioaktives Produkt, nach enzymatischer Hydrolyse von Ovalbumin identifiziert, dadurch gekennzeichnet, dass: – es ACEI-Aktivität in vitro und/oder antihypertensive Aktivität in vivo und/oder antioxidative Aktivität besitzt und – es aus Region 36 bis 216 von Ovalbumin stammt, ein Molekulargewicht zwischen 365,2 und 1152,58 hat und aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: SEQ-ID-NO 1, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 und SEQ ID NO 8.
Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Peptid, das in Anspruch 1 definiert ist, oder Kombinationen der besagten Peptide enthält.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels eines chemischen oder enzymatischen Syntheseverfahrens oder mittels rekombinanter Verfahren gewonnen wird.
Verfahren zum Herstellen eines oder einer jeden der bioaktiven Produkte oder Zusammensetzungen, die in den Ansprüchen 1 und 2 beschrieben sind, dadurch gekennzeichnet, dass a. sie durch Hydrolyse des Ausgangsmaterials gewonnen werden, welches irgendein Substrat sein kann, das Ovalbumin oder ein oder mehrere Proteine oder Peptide von tierischem Ursprung oder von Mikroorganisme herruhrend enthält, deren Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz der bioaktiven Peptide von Interesse, die in Anspruch 1 angegeben sind, beinhaltet, b. man besagtes Ausgangsmaterial bei einer geeigneten Konzentration in Wasser oder einer Pufferlösung auflöst oder dispergiert, bei einem fur die Aktivität des proteolytischen Enzyms geeigneten pH, c. man irgendein proteolytisches Enzym, das imstande ist, das im Ausgangsmaterial vorhandene Protein zu spalten und die Peptide von Interesse bereitzustellen, oder proteolytische Mikroorganismen, die eine Fermentation des Substrats bewirken, verwendet und d. die Reaktionszeit zwischen 10 Minuten und 24 Stunden betragen kann.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Substrat aus Schritt a) ausgewählt ist aus reinem Ovalbumin, Eiweiß und Vollei in seinen unterschiedlichen Darreichungsformen oder aus Eiprodukten, die fur die Lebensmittelversorgung und das Gaststättengewerbe vorgesehen sind, aus Nahrungsergänzungsmitteln fur Sportler und aus Eiprodukten fur Tiernahrung.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes proteolytisches Enzym aus Schritt b) Pepsin bei pH 2,0–3,0 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionszeit aus Schritt d) zwischen 10 Minuten und 3 Stunden beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass hohe hydrostatische Drucke zwischen 100 und 1000 MPa verwendet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass besagter hoher hydrostatischer Druck 400 MPa beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie das gesamte enzymatische Hydrolysat, irgendwelche seiner Fraktionen oder eine Aufreinigung davon umfasst, wobei die Zusammensetzung mindestens eines der in Anspruch 1 beschriebenen Peptide enthält.
Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Peptide oder pharmazeutisch annehmbare Salze oder ihre Gemische von irgendwelchen der Peptide, die in Anspruch 1 beschrieben sind, umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eines der Peptide mit ACEI Aktivität in vitro und/oder antihypertensiver Aktivität in vivo und/oder antioxidativer Aktivität, die in Anspruch 1 beschrieben sind, umfasst.
Funktioneller Lebensmittelzusatz, -bestandteil oder funktionelle Nahrungsergänzung, dadurch gekennzeichnet, dass er/sie mindestens eines der Peptide mit ACEI-Aktivität in vitro und/oder antihypertensiver Aktivität in vivo und/oder antioxidativer Aktivität, die in Anspruch 1 beschrieben sind, umfasst.
Funktionelles Nahrungsprodukt, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eines der Peptide mit ACEI-Aktivität in vitro und/oder antihypertensiver Aktivität in vivo und/oder antioxidativer Aktivität, die in Anspruch 1 beschrieben sind, umfasst.
Verwendung der in Anspruch 12 beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Bluthochdruck.
Verwendung eines funktionellen Lebensmittelzusatzes, -bestandteils oder einer funktionellen Nahrungsergänzung, der/die in Anspruch 13 beschrieben ist, bei der Herstellung eines funktionellen Nahrungsprodukts, das zum Senken von Bluthochdruck gunstig ist.