JP3129523B2 - 新規ペプチド及びその製造方法 - Google Patents
新規ペプチド及びその製造方法Info
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- leu
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、動脈弛緩作用やアンギ
オテンシン変換酵素阻害作用を持ち血圧降下剤として有
用な新規ペプチド及びその製造方法に関する。
オテンシン変換酵素阻害作用を持ち血圧降下剤として有
用な新規ペプチド及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品中に含まれる蛋白質は栄養効果ばか
りでなく種々の生理活性を有することが知られている。
例えば血圧を降下する活性を示すものとしていくつかの
ペプチドがある。かかる作用は主として血管を弛緩させ
たりアンギオテンシン変換酵素を阻害させることによっ
て生起される。前者の血管弛緩作用をもつペプチドとし
ては例えば牛血清アルブミン由来のペプチドが公知であ
る（特開平４−９９７９８号公報）。
りでなく種々の生理活性を有することが知られている。
例えば血圧を降下する活性を示すものとしていくつかの
ペプチドがある。かかる作用は主として血管を弛緩させ
たりアンギオテンシン変換酵素を阻害させることによっ
て生起される。前者の血管弛緩作用をもつペプチドとし
ては例えば牛血清アルブミン由来のペプチドが公知であ
る（特開平４−９９７９８号公報）。
【０００３】一方、アンギオテンシン変換酵素は、主と
して肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンギ
オテンシンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌ
ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用
して、アンギオテンシンＩのＣ末端よりジペプチド（Ｈ
ｉｓ9−Ｌｅｕ10）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を
有するアンギオテンシンＩＩを生成させる酵素である。
また、この酵素は生体内降圧物質であるブラジキニンを
破壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与し
ている。 従来より、アンギオテンシン変換酵素の活性
を阻害すれば降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、
治療に有効であると考えられている。
して肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンギ
オテンシンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌ
ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用
して、アンギオテンシンＩのＣ末端よりジペプチド（Ｈ
ｉｓ9−Ｌｅｕ10）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を
有するアンギオテンシンＩＩを生成させる酵素である。
また、この酵素は生体内降圧物質であるブラジキニンを
破壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与し
ている。 従来より、アンギオテンシン変換酵素の活性
を阻害すれば降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、
治療に有効であると考えられている。
【０００４】最近ではプロリン誘導体であるカプトプリ
ルが合成され、降圧活性が確認されて以来、種々のアン
ギオテンシン変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであ
り、又天然物からの取得も試みられているところであ
る。従って、動脈弛緩作用やアンギオテンシン変換酵素
阻害作用をもつペプチドで食品あるいは食品原料から得
られる天然物由来のものは、低毒性で安全性の高い降圧
剤となることが期待される。
ルが合成され、降圧活性が確認されて以来、種々のアン
ギオテンシン変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであ
り、又天然物からの取得も試みられているところであ
る。従って、動脈弛緩作用やアンギオテンシン変換酵素
阻害作用をもつペプチドで食品あるいは食品原料から得
られる天然物由来のものは、低毒性で安全性の高い降圧
剤となることが期待される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、かかる
活性をもつペプチドが天然物中に見出されることは極め
てまれで、アンギオテンシン変換酵素阻害剤としては僅
かにブラジル産や日本産蛇毒より得られたテプロタイド
（ノナペプチド，ＳＱ２０８８１）等や、ストレプトミ
セス属に属する放線菌の代謝産物ＩＳ８３（特開昭５８
−１７７９２０号公報）が知られているに過ぎない。
活性をもつペプチドが天然物中に見出されることは極め
てまれで、アンギオテンシン変換酵素阻害剤としては僅
かにブラジル産や日本産蛇毒より得られたテプロタイド
（ノナペプチド，ＳＱ２０８８１）等や、ストレプトミ
セス属に属する放線菌の代謝産物ＩＳ８３（特開昭５８
−１７７９２０号公報）が知られているに過ぎない。
【０００６】また、天然物を酵素処理して得られたアン
ギオテンシン変換酵素阻害物質としては、牛乳カゼイン
をトリプトシンにより分解して得たペプチド類等が知ら
れているが（特開昭５８−１０９４２５号、同５９−４
４３２３号、同５９−４４３２４号、同６１−３６２２
６号、同６１−３６２２７号）新規な阻害物質の開発が
望まれているところである。
ギオテンシン変換酵素阻害物質としては、牛乳カゼイン
をトリプトシンにより分解して得たペプチド類等が知ら
れているが（特開昭５８−１０９４２５号、同５９−４
４３２３号、同５９−４４３２４号、同６１−３６２２
６号、同６１−３６２２７号）新規な阻害物質の開発が
望まれているところである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、かかる課
題を解決すべく天然物質で副作用の少ない動脈弛緩作用
及びアンギオテンシン変換酵素阻害作用をもつ物質を鋭
意探索した結果、蛋白質特に卵白を特定の酵素で加水分
解した組成物中にかかる活性を有する物質の存在をつき
とめ、該物質が Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ
−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨである構造の
ペプチドであることを見出し本発明を完成した。
題を解決すべく天然物質で副作用の少ない動脈弛緩作用
及びアンギオテンシン変換酵素阻害作用をもつ物質を鋭
意探索した結果、蛋白質特に卵白を特定の酵素で加水分
解した組成物中にかかる活性を有する物質の存在をつき
とめ、該物質が Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ
−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨである構造の
ペプチドであることを見出し本発明を完成した。
【０００８】本発明のＨ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａ
ｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨなるペプ
チドは文献未載の新規なペプチドであり、卵白オボアル
ブミンをペプシンによって加水分解することによって製
造され、実用にあたっては組成物をそのまま用いても良
く、あるいは必要に応じて精製して使用される。更には
ペプチド合成の常套手段を適用して合成することによっ
て製造することもできる。上記でいうＰｈｅはフェニル
アラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｌａはアラニン、Ａ
ｓｐはアスパラギン酸、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｐｒｏは
プロリン、Ｌｅｕはロイシンを意味し、かかるアミノ酸
はいずれもＬ−体である。
ｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨなるペプ
チドは文献未載の新規なペプチドであり、卵白オボアル
ブミンをペプシンによって加水分解することによって製
造され、実用にあたっては組成物をそのまま用いても良
く、あるいは必要に応じて精製して使用される。更には
ペプチド合成の常套手段を適用して合成することによっ
て製造することもできる。上記でいうＰｈｅはフェニル
アラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｌａはアラニン、Ａ
ｓｐはアスパラギン酸、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｐｒｏは
プロリン、Ｌｅｕはロイシンを意味し、かかるアミノ酸
はいずれもＬ−体である。
【０００９】本発明のペプチドは蛋白質をペプシンで加
水分解することによっても、ペプチド合成法でも取得で
きる。蛋白質をペプシンで加水分解するには、蛋白質の
性状により処法が異なるが、難溶性の場合には熱水に蛋
白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズし、所定量のペ
プシンを加え温度１０〜８５℃程度で０．１〜４８時間
反応を行う。蛋白質としては、動物由来や微生物由来のも
の等が任意に用いられ、特に有用なものは卵白であり、
カツオブシ、イワシ等の魚類が安価で有用である。
水分解することによっても、ペプチド合成法でも取得で
きる。蛋白質をペプシンで加水分解するには、蛋白質の
性状により処法が異なるが、難溶性の場合には熱水に蛋
白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズし、所定量のペ
プシンを加え温度１０〜８５℃程度で０．１〜４８時間
反応を行う。蛋白質としては、動物由来や微生物由来のも
の等が任意に用いられ、特に有用なものは卵白であり、
カツオブシ、イワシ等の魚類が安価で有用である。
【００１０】単離する場合は加水分解液を遠心分離等の
公知の操作で濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを
適用した後、あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤
に対する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あ
るいは溶解度の差、２種の混ざり合わない液相間におけ
る分配の差、分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液
からの析出性あるいは析出速度の差などを利用する手段
を適用して目的物を単離するのが好ましい。これらの方
法は必要に応じて単独に用いられ、あるいは任意の順序
に組合せ、また反復して適用される。
公知の操作で濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを
適用した後、あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤
に対する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あ
るいは溶解度の差、２種の混ざり合わない液相間におけ
る分配の差、分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液
からの析出性あるいは析出速度の差などを利用する手段
を適用して目的物を単離するのが好ましい。これらの方
法は必要に応じて単独に用いられ、あるいは任意の順序
に組合せ、また反復して適用される。
【００１１】本発明のペプチドはペプチド合成に通常用
いられる方法、即ち液相法または固相法でペプチド結合
の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に
相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方の
フラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料と
をカルボジイミド法、活性エステル法等を用いて縮合さ
せ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基
を除去させることによっても製造し得る。
いられる方法、即ち液相法または固相法でペプチド結合
の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に
相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方の
フラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料と
をカルボジイミド法、活性エステル法等を用いて縮合さ
せ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基
を除去させることによっても製造し得る。
【００１２】この反応工程において反応に関与すべきで
ない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保
護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル、ｔ−
ブチルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロ
オキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル等が挙げられる。カルボキシル基の保護基として
は例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成
し得る基が挙げられるが固相法の場合は、Ｃ末端のカル
ボキシル基はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ
−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合し
ている。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在
下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプ
チド活性エステルを用いて実施する。
ない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保
護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル、ｔ−
ブチルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロ
オキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル等が挙げられる。カルボキシル基の保護基として
は例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成
し得る基が挙げられるが固相法の場合は、Ｃ末端のカル
ボキシル基はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ
−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合し
ている。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在
下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプ
チド活性エステルを用いて実施する。
【００１３】縮合反応終了後、保護基は除去されるが、
固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合
を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従
い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、
逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー等が挙げられる。
固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合
を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従
い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、
逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー等が挙げられる。
【００１４】本発明で使用するペプチドの投与経路とし
ては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでも
よいが、経口投与が好ましい。本発明のペプチドの投与
量は化合物の種類、投与方法、患者の症状・年令等によ
り異なるが、通常１回０.００１〜１０００ｍｇ、好ま
しくは０．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回であ
る。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調
製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製
剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応
しない物質が用いられる。
ては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでも
よいが、経口投与が好ましい。本発明のペプチドの投与
量は化合物の種類、投与方法、患者の症状・年令等によ
り異なるが、通常１回０.００１〜１０００ｍｇ、好ま
しくは０．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回であ
る。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調
製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製
剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応
しない物質が用いられる。
【００１５】具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マン
ニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプ
ン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケ
イ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチル
セルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロ
ース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケ
イ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガン
ト、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン
脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリ
ン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセ
ロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、
ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボ
ン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等
が挙げられる。
ニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプ
ン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケ
イ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチル
セルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロ
ース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケ
イ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガン
ト、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン
脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリ
ン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセ
ロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、
ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボ
ン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等
が挙げられる。
【００１６】剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム
剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。
これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤
にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸
濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方
法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発
明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応
じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム
剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。
これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤
にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸
濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方
法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発
明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応
じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１７】これらの製剤は、本発明のペプチドを０．
０１％以上、好ましくは０．５〜７０％の割合で含有す
ることができる。これらの製剤はまた、治療上価値ある
他の成分を含有していてもよい。
０１％以上、好ましくは０．５〜７０％の割合で含有す
ることができる。これらの製剤はまた、治療上価値ある
他の成分を含有していてもよい。
【００１８】
【作 用】本発明のペプチドは、新規なペプチドであ
り優れた動脈弛緩作用及びアンギオテンシン変換酵素阻
害作用を有し、血圧降下活性、ブラジキニン不活化抑制
活性を示し、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧
などの高血圧症の予防、治療剤、これらの疾患の診断剤
や各種の病態において用いられる血圧降下剤、狭心症や
心筋梗塞の治療薬、うっ血性心不全における病態の改善
剤として有用である。
り優れた動脈弛緩作用及びアンギオテンシン変換酵素阻
害作用を有し、血圧降下活性、ブラジキニン不活化抑制
活性を示し、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧
などの高血圧症の予防、治療剤、これらの疾患の診断剤
や各種の病態において用いられる血圧降下剤、狭心症や
心筋梗塞の治療薬、うっ血性心不全における病態の改善
剤として有用である。
【００１９】
【実施例】次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明
する。 実施例１ 〔ペプチドの抽出〕鶏卵白を蒸留水で５倍に希釈した後
１Ｎ塩酸でＰＨ１．６に調整した溶解液（２０ｍｇ／ｍ
ｌの蛋白質を含む）にペプシン０．２ｍｇ／ｍｌ（シグ
マ社製）を添加して３７℃で３時間加水分解反応を行っ
た。冷却後遠心分離して濃縮し、高速液体クロマトグラ
フィー（ＯＤＳ−，Ｐｈ−及びＣＮ−カラム）により精
製し、ペプチドを得た。本品を気相プロテインシーケン
サー（アプライド バイオシステムズ社製４７７ Ａ
型）を用いる自動エドマン分解法を適用してアミノ酸配
列を分析し、下記の構造を得た。 Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ 該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。
する。 実施例１ 〔ペプチドの抽出〕鶏卵白を蒸留水で５倍に希釈した後
１Ｎ塩酸でＰＨ１．６に調整した溶解液（２０ｍｇ／ｍ
ｌの蛋白質を含む）にペプシン０．２ｍｇ／ｍｌ（シグ
マ社製）を添加して３７℃で３時間加水分解反応を行っ
た。冷却後遠心分離して濃縮し、高速液体クロマトグラ
フィー（ＯＤＳ−，Ｐｈ−及びＣＮ−カラム）により精
製し、ペプチドを得た。本品を気相プロテインシーケン
サー（アプライド バイオシステムズ社製４７７ Ａ
型）を用いる自動エドマン分解法を適用してアミノ酸配
列を分析し、下記の構造を得た。 Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ 該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。
【００２０】ＴＬＣ［ｎ−ブタノール：酢酸：ピリジ
ン：水＝１５：３：１０：２］ （シリカゲルプレート，ニンヒドリン発色） Ｒｆ：０.４４ ｍ．ｐ：１７８〜１８２℃ 元素分析 Ｃ48Ｈ67Ｎ13Ｏ11・０.５Ｈ2Ｏとして
ン：水＝１５：３：１０：２］ （シリカゲルプレート，ニンヒドリン発色） Ｒｆ：０.４４ ｍ．ｐ：１７８〜１８２℃ 元素分析 Ｃ48Ｈ67Ｎ13Ｏ11・０.５Ｈ2Ｏとして
【００２１】〔ペプチドの合成〕市販のＢｏｃ（ブトキ
シカルボニル）−Ｌｅｕ（クロロベンジルオキシカルボ
ニルで保護）−Ｏ−Ｒｅｓｉｎ〔ベンジル樹脂（置換率
０．５５ｍｅｑ／ｇ）〕０．５５ｇをバイオサーチ社の
ペプチド合成装置ＳＡＭ２の反応槽に分取し、以下のよ
うに合成を行った。４５％トリフルオロ酢酸、２．５％
アニソールを含む塩化メチレン中、２５分間の反応によ
り、Ｂｏｃ基を除去したのち、塩化メチレンによる洗
浄、１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチ
レンによる中和、及び塩化メチレンによる洗浄を行っ
た。これと５ｍｌの０．４Ｍ Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ｏＢｚ
（ベンジルエステル）のジメチルホルムアミド溶液、５
ｍｌの０．４Ｍジイソプロピルカルボジイミドの塩化メ
チレン溶液とを混合した後、反応槽に加え、室温にて２
時間撹拌反応させた。
シカルボニル）−Ｌｅｕ（クロロベンジルオキシカルボ
ニルで保護）−Ｏ−Ｒｅｓｉｎ〔ベンジル樹脂（置換率
０．５５ｍｅｑ／ｇ）〕０．５５ｇをバイオサーチ社の
ペプチド合成装置ＳＡＭ２の反応槽に分取し、以下のよ
うに合成を行った。４５％トリフルオロ酢酸、２．５％
アニソールを含む塩化メチレン中、２５分間の反応によ
り、Ｂｏｃ基を除去したのち、塩化メチレンによる洗
浄、１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチ
レンによる中和、及び塩化メチレンによる洗浄を行っ
た。これと５ｍｌの０．４Ｍ Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ｏＢｚ
（ベンジルエステル）のジメチルホルムアミド溶液、５
ｍｌの０．４Ｍジイソプロピルカルボジイミドの塩化メ
チレン溶液とを混合した後、反応槽に加え、室温にて２
時間撹拌反応させた。
【００２２】得られた樹脂をジメチルホルムアミド、塩
化メチレン、１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む
塩化メチレン、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメ
チルホルムアミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ
（ｏＢｚｌ）−Ｌｅｕ（Ｃｌ−ｚ）−樹脂を得た。引き
続き同様のＢｏｃ基の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカップ
リングを繰り返しＰｈｅ（ｏＢｚｌ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ
トシル基）−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（ｏＢｚｌ）−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ｏＢｚｌ）−Ｌｅｕ（Ｃｌ−ｚ）−樹
脂を得た。該樹脂を２０ｍｌの１０％アニソールを含む
フッ化水素中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂か
ら遊離させた。フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０％
酢酸で抽出し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。これを
ＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ18）による逆相
クロマトグラフィーにより精製し、Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−
ＯＨを得た。本品を前記と同一のプロテインシーケンサ
ーにより分析した結果、上記の組成であることが判明し
た。
化メチレン、１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む
塩化メチレン、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメ
チルホルムアミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ
（ｏＢｚｌ）−Ｌｅｕ（Ｃｌ−ｚ）−樹脂を得た。引き
続き同様のＢｏｃ基の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカップ
リングを繰り返しＰｈｅ（ｏＢｚｌ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ
トシル基）−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（ｏＢｚｌ）−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ｏＢｚｌ）−Ｌｅｕ（Ｃｌ−ｚ）−樹
脂を得た。該樹脂を２０ｍｌの１０％アニソールを含む
フッ化水素中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂か
ら遊離させた。フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０％
酢酸で抽出し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。これを
ＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ18）による逆相
クロマトグラフィーにより精製し、Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−
ＯＨを得た。本品を前記と同一のプロテインシーケンサ
ーにより分析した結果、上記の組成であることが判明し
た。
【００２３】該ペプチドの物性値は上記と同一であっ
た。 （イヌ腸間膜動脈弛緩作用の測定）イヌより摘出した腸
間膜動脈のらせん条片を高木等らの方法（高木等編、薬
物学実験、９４〜９９ペ−ジ、南山堂）に従って処理
し、標本をマグナス管中で等長性トランスジュ−サ−に
接続した。０．５μＭのプロスタグランジンＦ2αによ
って収縮させた腸間膜動脈に対して本ペプチドは弛緩作
用を示した。その際のＥＤ50（５０％弛緩）は２２．６
μＭであった。
た。 （イヌ腸間膜動脈弛緩作用の測定）イヌより摘出した腸
間膜動脈のらせん条片を高木等らの方法（高木等編、薬
物学実験、９４〜９９ペ−ジ、南山堂）に従って処理
し、標本をマグナス管中で等長性トランスジュ−サ−に
接続した。０．５μＭのプロスタグランジンＦ2αによ
って収縮させた腸間膜動脈に対して本ペプチドは弛緩作
用を示した。その際のＥＤ50（５０％弛緩）は２２．６
μＭであった。
【００２４】（アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測
定）アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定は、Ｃｈ
ｅｕｎｇ Ｃｕｓｈｍａｎの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ ２０，１６３７
(１９７１)〕に準じて以下の方法で行った。 酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ （８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵 素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製） （１ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕した
後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μｌ、酵素溶液を１２μｌ及び
上記で得た上澄液を所定濃度混合し、水で全体を２５０
μｌとした後３７℃で３０分間反応を行った。
定）アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定は、Ｃｈ
ｅｕｎｇ Ｃｕｓｈｍａｎの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ ２０，１６３７
(１９７１)〕に準じて以下の方法で行った。 酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ （８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵 素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製） （１ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕した
後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μｌ、酵素溶液を１２μｌ及び
上記で得た上澄液を所定濃度混合し、水で全体を２５０
μｌとした後３７℃で３０分間反応を行った。
【００２５】反応は１Ｎ−塩酸２５０μｌを用いて終了
させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶｏ
ｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢酸エ
チル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを留去
し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽出
された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ228）を
測定した。阻害率はペプチドなしで反応したときのＯＤ
228を１００％とし、反応時間０分のときのＯＤ228を０
％として求め阻害率５０％の時のペプチドの濃度ＩＣ50
で活性を表示したところ、２．１μＭであった。
させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶｏ
ｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢酸エ
チル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを留去
し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽出
された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ228）を
測定した。阻害率はペプチドなしで反応したときのＯＤ
228を１００％とし、反応時間０分のときのＯＤ228を０
％として求め阻害率５０％の時のペプチドの濃度ＩＣ50
で活性を表示したところ、２．１μＭであった。
【００２６】（血圧変動の測定） 観血法 １５〜２０週令の自然発症性高血圧ラットを尾静脈より
麻酔した後、大腿部静脈にサンプル注入用カテ−テルを
挿入し、１０ｍｇ／ｋｇのサンプルを投与し圧トランス
ジュ−サ−により観血的に血圧を測定した。血圧の低下
は約３０ｍｍＨｇであった。
麻酔した後、大腿部静脈にサンプル注入用カテ−テルを
挿入し、１０ｍｇ／ｋｇのサンプルを投与し圧トランス
ジュ−サ−により観血的に血圧を測定した。血圧の低下
は約３０ｍｍＨｇであった。
【００２７】非観血法（経口投与） 上記のラットに卵黄でエマルジョン化したサンプルを１
００ｍｇ／ｋｇの割合でゾンデ針を使用して強制経口投
与した。そして尾動脈部の血圧をｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法
にて経時的に測定し収縮期血圧における最大降圧値を測
定したところ、２５ｍｍＨｇであった。
００ｍｇ／ｋｇの割合でゾンデ針を使用して強制経口投
与した。そして尾動脈部の血圧をｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法
にて経時的に測定し収縮期血圧における最大降圧値を測
定したところ、２５ｍｍＨｇであった。
【００２８】
【発明の効果】本発明は、卵白等の天然物を加水分解す
ることにより調製でき、殊に血圧降下剤又は血圧降下食
品として有用である新規ペプチドが製造できる。
ることにより調製でき、殊に血圧降下剤又は血圧降下食
品として有用である新規ペプチドが製造できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｋ 37/18 Ｃ１２Ｎ 9/99 37/64 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 7/06 C12P 21/00 - 21/06 C12N 9/99 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨで示される新規
ペプチド。 - 【請求項２】 蛋白質をペプシンで加水分解することを
特徴とするＨ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨで示される新規ペプ
チドの製造方法。 - 【請求項３】 蛋白質として卵白を使用する請求項２記
載の製造方法。 - 【請求項４】 卵白として鶏卵白を使用する請求項３記
載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04163532A JP3129523B2 (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 新規ペプチド及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04163532A JP3129523B2 (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 新規ペプチド及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05331190A JPH05331190A (ja) | 1993-12-14 |
| JP3129523B2 true JP3129523B2 (ja) | 2001-01-31 |
Family
ID=15775670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04163532A Expired - Lifetime JP3129523B2 (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 新規ペプチド及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3129523B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100470457B1 (ko) * | 2001-07-02 | 2005-02-05 | 대한민국 | 혈압 저하 효과가 있는 난백 단백질 분해물 및 그 제조방법 |
| ES2253036B1 (es) * | 2003-07-31 | 2007-07-16 | Consejo Sup. Investig. Cientificas | Peptidos bioactivos derivados de proteinas de la clara de huevo mediante hidrolisis enzimatica. |
| EP1685764A1 (en) * | 2005-01-27 | 2006-08-02 | Globus Egg Sciences B.V. | Anti-hypertensive functional food products |
-
1992
- 1992-05-29 JP JP04163532A patent/JP3129523B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05331190A (ja) | 1993-12-14 |
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