KR100470457B1

KR100470457B1 - 혈압 저하 효과가 있는 난백 단백질 분해물 및 그 제조방법

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Publication number: KR100470457B1
Application number: KR10-2001-0039283A
Authority: KR
Inventors: 김동운; 정석근; 인영민; 함준상; 채현석; 안종남; 이종문; 김용곤; 윤상기; 노환국
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2001-07-02
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2005-02-05
Also published as: KR20030003463A

Abstract

본 발명은 안지오텐신 전환효소 저해 효과 뿐만 아니라 실질적으로 생체내에서의 혈압상승 억제 효과가 우수하도록 난백 단백질 수용액에 단백질 분해효소를 0.1 ∼ 5 %의 양으로 첨가하고 온도 30∼50℃, pH 6 ∼ 9 의 조건하에서 4 ∼ 48 시간 반응시키는 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 혈압저하효과가 있는 난백 단백질 분해물에 관한 것으로서 생체내에서의 혈압상승 억제 효과가 우수할 뿐만 아니라 중성에서 작용하는 효소를 사용하여 제조됨으로써 산이나 염기의 첨가없이 간단한 공정을 통하여 제조할 수 있어 생산성이 높고 제조비용이 저렴하다.

Description

혈압 저하 효과가 있는 난백 단백질 분해물 및 그 제조방법{Antihypertensive egg white protein hydrolysate and manufacturing method thereof}

본 발명은 난백 단백질 분해물 및 그 제조방법에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 난백 단백질을 중성에서 작용하는 단백질분해효소를 이용하여 가수분해시켜 제조되는 혈압 저하 효과가 우수한 난백 단백질 분해물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

현대 성인병의 대표적인 질환인 고혈압의 대부분을 차지하는 본태성 고혈압은 그 원인이 정확하게 규명되고 있지 않으나 생체내의 혈압 상승 기작으로는 레닌-안지오텐신 시스템(renin-angiotensin system)이 고혈압 유발과 관계가 깊다.

상기 시스템에서는 폐모세혈관에 존재하는 안지오텐신전환효소(angiotensin-I converting ensyme; ACE)가 불활성상태의 안지오텐신-I(angiotensin-I)의 말단아미노산 2개를 분해함으로써 강한 혈압상승작용을 나타내는 안지오텐신-II(angiotensin-II)로 활성화시킴은 물론 혈압강하작용을 가지는 브래디키닌(bradykinin)을 분해하여 불활성화시킴으로써 고혈압의 원인이 된다고알려져 있다.

상기와 같은 고혈압 환자에게 효과가 있는 ACE 저해제로는 화학합성으로 만들어진 캡토프릴(captoprile), 엔알라프릴(enalapril) 등이 있으나 복용시 호흡이 빨라지고 전신에 힘이 빠지거나 구토, 기침 등의 부작용이 있어 이같은 문제점을 해결하기 위하여 각종 식품으로부터 분리되어 부작용이 없고 가열조건에 안정하며 체내에서의 흡수도 용이한 저분자 물질인 안지오텐신 I 변환효소 활성 저해물질들이 개발되었다.

상기 각종 식품으로부터 분리된 ACE 활성 저해물질들로는 차의 페놀(phenol) 성분, 무화과 유액 및 청주와 그 부산물의 가수분해물, 어육단백질인 정어리 또는 갈치에서 분획한 펩타이드(peptide), 고등어 근육단백질의 가수분해물 등이 있는데, 이들이 ACE 활성 저해 효과를 나타내기는 하나 실질적으로 생체내에서 혈압 저하 효과를 나타내는지의 여부는 확인된 바가 거의 없었다.

일반적으로 단백질 분해물(펩타이드 혼합물)의 경우 안지오텐신전환효소를 억제하는 효과가 있다고 해서 반드시 혈압저하 효과도 있는 것은 아니다.

이는 안지오텐신 전환효소 자체가 펩타이드의 말단에 존재하는 특정 아미노산을 잘라주는 효소이므로 생체내에서 단백질 가수분해물에 존재하는 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드가 분해되어 그 효과를 발휘하지 못하는 경우가 대부분이기 때문이다(식품과 개발, 1995년, Vol. 31, No. 8, p 50∼52).

따라서, ACE 활성 저해물질로서 혈압저하효과가 있는 지의 여부는 생체내에서의 혈압저하효과를 측정하여야 알 수 있으나 상기 안지오텐신 전환효소 저해활성을 가지는 단백질 분해물들을 직접 생체내에 투여하여 혈압저하효과를 확인한 경우는 거의 없었다.

본 발명은 안지오텐신 전환효소 저해작용 뿐만 아니라 실질적으로 생체내에서의 혈압상승 억제 효과가 우수한 난백 단백질 분해물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 쓴 맛이 없고 풍미(??味)가 좋은 혈압상승 억제 효과가 있는 난백 단백질 분해물을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적들은 난백 단백질을 단백질 분해효소를 이용하여 가수분해시켜 제조되는 난백 단백질 분해물을 제공함으로써 달성되는데, 상기 난백 단백질 분해물은 풍미가 개선되어 복용이 용이하며, 생화학적 실험에서 안지오텐신 전환효소를 저해함은 물론 생체내에서도 안지오텐신 전환효소에 의해 분해되지 않고 저해작용을 하기 때문에 혈압상승 억제 효과가 우수하다.

본 발명은 난백 단백질을 단백질 분해효소를 이용하여 가수분해시켜 제조되는, 혈압저하효과가 있는 난백 단백질 분해물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 난백 단백질 분해물은 난백 단백질 수용액에 단백질 분해효소를 0.1 ∼ 5 %의 양으로 첨가하고 온도 30∼50℃, pH 6 ∼ 9 의 조건하에서 4 ∼ 48시간 반응시키는 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

상기 단백질분해효소는 프로타맥스{protamex, 바실러스(Bacillus) 유래}, MP{아스퍼질러스 멜레우스(Aspergillus melleus)}, LP{Aspergillus oryzae(아스퍼질러스 오리재)}, 플라보르자임{flavourzyme, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)}, 뉴트라제(neutrase), 알카라제{alcalase, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)}, 프로모드 192{promod 192, 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래}로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, 그 중에서도 프로타맥스를 단독으로 사용하는 것이 가장 바람직하다.

이하, 본 발명의 혈압저하효과가 있는 난백 단백질 분해물 및 그 제조방법을 실시예를 들어 상세하게 설명하면 다음과 같다.

실시예 1

1. 난백을 55∼60℃로 가온한 물에 녹여 난백 단백질 수용액을 만들었다.

2. 상기 난백 단백질 수용액을 약 40℃로 냉각하여 pH를 7로 조정한 다음 프로타멕스(protamex)를 1% 첨가하였다.

3. 상기 용액을 약 5분간 교반하면서 반응시킨 다음 47℃ 수조(water bath)에서 28시간 반응시켰다.

4. 상기 반응이 끝나면 90℃에서 약 15분간 유지시켜 효소를 불활성화시켰다.

5. 상기 용액을 냉각시킨 후 원심분리하고 상등액만을 회수하여 건조기에서건조시켜 난백 단백질 분해물을 제조하였다.

실시예 2∼7

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하되 난백 단백질 용액의 pH를 6∼9로 조정한 후 단백질 분해효소로 MP, LP, 플라보르자임(flavourzyme), 뉴트라제(neutrase), 알카라제(alcalase), 프로모드 192(promod 192)를 각각 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4 %로 첨가하고 30∼50℃에서 4∼48 시간 반응시켜 난백 단백질 분해물을 제조하였다.

실시예 8∼10

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하되 난백 단백질 용액의 pH를 6∼9로 조정한 후 단백질 분해효소로 프로타맥스(protamex) 1%에 각각 프로모드 192(promod 192), MP, LP 0.5%를 혼합하여 첨가하고 45℃에서 24시간 반응시켜 난백 단백질 분해물을 제조하였다.

시험예 1

안지오텐신 전환효소 저해율 측정

가. 통상법(Cushman과 Cheung의 방법)에 의한 측정

1. 상기 실시예 1∼10에서 제조된 각 난백 단백질 분해물 50㎕에 기질(hippuric-His-Leu) 100㎕를 가한 후 혼합하여 5분간프리인큐베이션(preincubation)하였다.

2. 상기 용액에 ACE 효소 용액 150㎕를 가하고 약 1시간동안 약 37℃에서 반응시켰다.

3. 상기 반응액에 0.5N HCl 250㎕를 넣어 반응을 종료시킨 후 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 1.5㎖를 넣고 혼합하였다.

4. 상기 혼합액을 2800 rpm에서 10분간 원심분리한 후 1㎖ 취하여 건조시킨 다음 1M NaCl 3㎖에 녹여 228㎚에서 흡광도를 측정하였다.

나. 전처리법에 의한 측정

1. 상기 실시예 1∼10에서 제조된 각 난백 단백질 분해물 50㎕에 ACE 효소 용액 150㎕를 가하고 약 2시간동안 약 37℃에서 반응시켰다.

2. 상기 용액에 기질(hippuric-His-Leu) 100㎕를 가하여 혼합하고 약 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다.

3. 상기 용액에 0.5N HCl 250㎕를 넣어 반응을 종료시킨 다음 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 1.5㎖를 넣고 혼합하였다.

4. 상기 혼합액을 2800rpm에서 10분간 원심분리한 후 1㎖를 취하여 건조시킨 다음 1M NaCl 3㎖에 녹인 후 228㎚에서 흡광도를 측정하였다.

상기 시험예 1에서 측정된 흡광도로부터 하기 식을 이용하여 본 발명 난백 단백질 분해물의 ACE 저해율을 계산하여 하기 표 1 및 2에 나타내었다.

E_c: 시료대신 증류수를 넣었을 때의 흡광도

E_s: 시료첨가시의 흡광도

E_b: 반응정지 후 시료 첨가한 것의 흡광도

단일효소 사용시의 난백 단백질 분해물의 안지오텐신 전환효소 저해활성

실시예	효 소	통상법IC_50-value(㎍/㎖)	전처리법IC_50-value(㎍/㎖)
실시예 1	protamex	283.73	598.63
실시예 2	MP	286.33	652.39
실시예 3	LP	331.25	746.62
실시예 4	Flavorzyme	477.68	1140.56
실시예 5	Neutrase	301.67	615.75
실시예 6	Alcalase	878.35	1803.43
실시예 7	Promod192	500.38	1029.34.

IC₅₀값은 안지오텐신 전환효소의 활성을 50% 저해할 수 있는 시료의 농도로서, 그 값이 작을수록 안지오텐신 전환효소의 활성 저해 효과가 우수하며 강한 혈압강하 효과를 나타낼 수 있다.

일반적으로 ACE저해활성을 나타내는 가수분해물(펩타이드)을 찾기 위한 실험에서는 통상법을 사용하는데 이때 동시에 전처리법으로도 측정해보면 가짜 ACE저해활성 펩타이드(in vitro 실험에서는 안지오텐신 전환효소 저해활성이 높지만, 막상 in vivo 실험에서는 혈압저하효과가 없는 것)가 포함된 가수분해물을 구별할 수 있다. 전처리법은 가수분해물(펩타이드)과 안지오텐신 변환효소만을 먼저 넣고 반응시키므로 가짜 안지오텐신 변환효소 저해펩타이드의 경우 안지오텐신 변환효소에 의해 분해되어 안지오텐신 전환효소를 저해하는 능력이 낮아지기 때문이다. 따라서 통상법과 전처리법에서 모두 낮은 IC₅₀값을 나타내는 가수분해물이 생체내에서도 혈압저하효과가 높을 가능성이 높다.

단일효소를 사용하여 상기 실시예 1 내지 7에서 제조된 난백 단백질 분해물의 안지오텐신 전환효소 저해활성을 측정한 결과 상기 표 1에 나타난 바와 같이 프로타맥스(protamex), MP, LP, 플라보르자임(flavourzyme), 뉴트라제(neutrase), 알카라제(alcalase), 프로모드 192(promod 192) 모두 안지오텐신 전환효소 저해활성이 양호하였으며, 특히 프로타맥스(protamex) 효소로 처리한 실시예 1의 IC₅₀값이 전처리법, 통상법 모두에서 가장 낮은 수치를 보여 본 발명에 있어서 가장 바람직한 단백질 분해효소는 프로타맥스(protamex)인 것으로 나타났다.

복합효소 사용시의 난백 단백질 분해물의 안지오텐신 전환효소 저해활성

실시예	효 소	통상법IC_50-value(㎍/㎖)	전처리법IC_50-value(㎍/㎖)
실시예 8	protamex 1% + Promod 192 0.5%	333.97	753.86
실시예 9	protamex 1%+ MP 0.5%	281.26	769.07
실시예 10	protamex 1%+ LP 0.5%	274.24	820.57

복합효소를 사용하여 상기 실시예 8 내지 10에서 제조된 난백 단백질 분해물의 안지오텐신 전환효소 저해활성을 측정한 결과 상기 표 2에 나타난 바와 같이 전반적으로 양호한 IC₅₀값을 나타내었으나 프로타맥스(protamex)효소를 단독으로 사용한 실시예 1의 경우보다는 안지오텐신 전환효소 저해활성이 떨어지는 것으로 나타났다.

실시예 11∼20

상기 실시예 1와 동일한 방법으로 실시하되, 프로타맥스(protamex)의 첨가량을 각각 0.001%, 0.1%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0%, 5.0%로 달리하여 난백 단백질 분해물을 제조하였다.

시험예 2

상기 실시예 11∼20에서 제조된 난백 단백질 분해물에 대하여 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 안지오텐신전환효소 저해활성을 측정하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

프로타맥스 효소량에 따른 안지오텐신전환효소 저해활성

실시예	효소량(%)	통상법IC_50-value(㎍/㎖)	전처리법IC_50-value(㎍/㎖)
실시예 11	0.001	3118.99	ND
실시예 12	0.1	1117.22	ND
실시예 13	0.3	401.89	ND
실시예 14	0.5	331.28	ND
실시예 15	0.7	315.88	ND
실시예 16	1.0	278.85	629.55
실시예 17	2.0	257.03	612.58
실시예 18	3.0	259.17	621.67
실시예 19	4.0	260.01	571.55
실시예 20	5.0	257.55	539.51

상기 시험 결과 통상법의 경우에는 효소의 첨가량을 0.7로 하였을 때 IC₅₀값이 315㎍/㎖ 으로 나타났으나 전처리법에서는 측정되지 않았다. 또한 효소를 1% 첨가하였을 경우에 통상법의 IC₅₀값이 278㎍/㎖ 이었고, 전처리법에서는 629 ㎍/㎖이었다. 따라서 효소의 첨가량이 증가할수록 전처리법에서의 IC₅₀값이 감소함을 알 수 있었다.

실시예 21∼25

상기 실시예 1와 동일한 방법으로 프로타맥스를 1% 첨가하여 실시하되, 반응시간을 각각 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간으로 달리하여 난백 단백질 분해물을 제조하였다.

시험예 3

상기 실시예 21∼25에서 제조된 난백 단백질 분해물에 대하여 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 안지오텐신전환효소 저해활성을 측정하고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

반응시간에 따른 안지오텐신전환효소 저해활성

실시예	반응시간(h)	통상법IC_50-value(㎍/㎖)	전처리법IC_50-value(㎍/㎖)
실시예 21	4	256.35	2014.86
실시예 22	8	261.29	1695.24
실시예 23	12	260.94	1244.72
실시예 24	24	260.60	682.62
실시예 25	48	265.38	670.22

상기 시험 결과 효소반응시간을 4시간에서 48시간으로 증가시켜도 통상법에서의 IC₅₀값은 거의 변화가 없었다. 그러나 전처리법에서의 IC₅₀값은 반응시간을 증가시킴에 따라 감소함을 알 수 있었다.

이러한 결과로서 난백 유래 ACE저해 가수분해물 제조시 프로타맥스(protamex) 효소의 첨가량은 1%, 45℃에서 반응시간은 24시간이 적당하였다.

본 발명은 상기 표 1 및 2에서 알 수 있듯이 안지오텐신 전환효소의 활성 저해 효과가 우수한 것으로 나타났으나 실제로 생체내에서 안지오텐신 전환효소에 의해 분해되지 않고 혈압 강하 효과를 나타내는 지를 알아보기 위하여 고혈압쥐를 사용하여 본 발명에 의한 혈압 저하 정도를 측정하였다.

시험예 4

고혈압쥐의 혈압저하 정도 측정

1. 7주령의 고혈압 유발쥐(SHR) 수컷을 (주)삼육실험동물연구소로부터 분양받아 5마리를 한군으로 하여 사료와 물을 자유 급식하면서 2주의 적응기간을 거친 후 상기 실시예 1에서 제조된 난백 단백질 분해물을 zonde로 강제 경구 투여하였다.

2. 상기 고혈압 유발쥐를 38∼40℃의 보온상자에서 5∼15분 가온 후 홀더에 넣고 고정시킨 다음 비혈관식 혈압측정장치(PowerLab 800/ADInstruments)를 사용하여 테일 커프(tail cuff)법에 따라 꼬리 동맥압을 측정하였다.

상기 측정치는 쥐가 정지상태에 있을 때 SBP(systolic blood pressure; 수축기혈압)를 5회 이상 측정하여 평균값을 사용하였다.

하기 표 5의 측정결과는 고혈압쥐에 상기 실시예 1에서 제조된 난백 단백질 분해물을 각각 300, 600㎎/㎏을 경구투여하고 3시간 후 혈압을 측정한 것으로 각각 6%, 6.9% 혈압이 낮아졌다.

난백 단백질 분해물의 혈압저하 효과

구 분	경구투여 후 혈압저하(3시간후)
300㎎/㎏	- 6 %
600㎎/㎏	- 6.9 %

시험예 5

상기 시험예 4와 동일한 방법으로 시험하되 상기 실시예 1에서 제조된 난백 단백질 분해물을 물에 녹여 난황(계란노른자)을 30%가 되도록 첨가하고 울트라소닉 클리너(ultrasonic cleaner)를 사용하여 5분 동안 유화시킨 다음 고혈압 유발쥐에게 투여하였다.

난황으로 처리한 난백 단백질 분해물을 경구투여 한 결과 하기 표 6에 나타난 바와 같이 300mg/kg을 경구 투여 후 3시간 후에 수축기 혈압은 11.1%가 감소되었으며, 600mg/kg을 경구투여한 경우에는 13.9%가 감소되었다.

난황처리한 난백 단백질 가수분해물의 혈압저하 효과

구 분	경구투여 후 혈압저하(3시간후)
300㎎/㎏	- 11.1 %
600㎎/㎏	- 13.9 %

상기 시험예 4와 5의 결과에서 난백 단백질 분해물을 난황으로 유화시킨 경우의 혈압 저하 효과가 더 우수하게 나타난 것은 난황에 함유된 인지질이 가수분해물을 감싸게 되어(코팅) 가수분해물을 복용하였을 경우 위의 소화효소인 펩신이나, 소장에서 분비되는 트립신, 키모트립신 등의 단백질분해효소의 작용을 적게 받으면서 소장하부에 까지 이동하여 몸안(혈관)으로 흡수될 수 있기 때문이다.

본 발명은 상기 표 5 및 6에 나타난 바와 같이 고혈압을 유발시킨 실험용 쥐에게 투여한 결과 최고 14 % 정도의 혈압강하효과를 나타내었으며, 이로써 본 발명의 난백 단백질 분해물이 안지오텐신 전환효소에 의해 분해되지 않고 안지오텐신 전환효소의 활성을 저해함을 확인 할 수 있었다.

시험예 6

난백 단백질 분해물의 분자량 측정

상기 실시예 1에서 제조된 난백 단백질 분해물의 분자량을 TSKgel G3000PWXL(7.8㎜×30㎝) 칼럼이 2개 연결된 HPLC를 사용하여 측정하였다.

표분분자량 측정에 사용된 표준물질은β-lactogloblin(분자량 : 18,400), aprotinin(6500), insulin B fragment(3,450), bradykinin(1,060), glutathione(307), tyrosine(181)이며, 용출용액은 0.1% TFA : acetonitril(50:50)을 사용하였고 유량은 0.3㎖/분, 검출은 220㎚의 자외선 흡수에 의해 측정하였다.

하기 표 7은 본 발명의 난백 단백질 분해물의 분자량분포와 평균분자량을 나타낸 것으로 난백단백질이 분해되어 저분자 펩타이드화 되고, 난백 단백질 분해물의 평균분자량이 2,432 달톤(dalton)인 것으로 나타났다.

난백분해물의 분자량 분포 및 평균분자량

효 소	분자량분포(dalton)	평균분자량(dalton)
효 소	≥3,000	평균분자량(dalton)	3,000∼2,000	2,000∼1,000	1,000∼500	≤500
protamex	17.5027	7.4096	14.1299	27.3179	33.6399	2,432

본 발명의 난백 단백질 분해물은 안지오텐신 전환효소의 저해 활성이 우수할 뿐 아니라 안지오텐신 전환효소에 의해 분해되지 않으므로 생체내에서의 혈압 저하 효과도 우수하다.

또한, 본 발명의 난백 단백질 분해물은 중성에서 작용하는 효소를 사용하여 제조됨으로써 산이나 염기의 첨가없이 간단한 공정을 통하여 제조할 수 있어 생산성이 높고 제조비용이 저렴하다.

그리고, 본 발명은 천연의 달걀에 존재하는 난백 단백질을 이용하여 제조되어 화학합성으로 제조된 혈압저하제와는 달리 기침, 구토 등의 부작용이 없고 안전성이 높으며, 물에 잘 녹고 저분자 물질로 체내에 흡수된 다음에도 다른 효소에 의해 잘 분해되지 않으므로 소화흡수가 용이한 장점이 있다.

따라서 본 발명은 우유나 다른 우유 가공품, 계란 등에 첨가하여 식품으로서 섭취가 용이하며, 각종 스포츠음료, 피로회복 및 의료용 단백질 공급원, 노령자영양식품 등에도 다양하게 이용될 수 있다.

Claims

난백 단백질을 프로타맥스{protamex, 바실러스(Bacillus) 유래} 단백질 분해효소를 이용하여 가수분해시켜 제조되는 평균분자량이 2,432 달톤(dalton)인, 혈압저하효과가 있는 난백 단백질 분해물.
제1항에 있어서, 난백 단백질 수용액에 상기 프로타맥스 단백질 분해효소를 1 %의 양으로 첨가하고 온도 약 47℃, pH 7 의 조건하에서 약 28 시간동안 반응시키는 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 혈압저하효과가 있는 난백 단백질 분해물.
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난백 단백질 수용액에 프로타맥스 단백질 분해효소를 1 %의 양으로 첨가하고 온도 약 47℃, pH 7 의 조건하에서 약 28 시간동안 반응시키는 단계를 포함하여 구성되는, 혈압저하효과가 있는 난백 단백질 분해물의 제조방법.
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