KR100778103B1

KR100778103B1 - 항고혈압 우유 조성물

Info

Publication number: KR100778103B1
Application number: KR1020060021402A
Authority: KR
Inventors: 도정룡; 조진호; 한찬규; 성기승; 김상교
Original assignee: 주식회사 비락; 한국식품연구원
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2006-03-07
Publication date: 2007-11-28
Also published as: KR20070091809A

Abstract

본 발명은 케이신 가수분해물, 메밀 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항고혈압 우유 조성물을 포함한다. 상기 본 발명의 항고혈압 우유 조성물은 기호성 및 항고혈압 활성이 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 항고혈압 우유조성물은 전체 중량에 대하여 케이신 가수분해물 0.5 내지 10.0중량％, 메밀 가수분해물 1.0 내지 10.0중량% 또는 케이신 가수분해물과 메밀가수분해물의 혼합물 1.0 내지 10.0중량%를 우유에 첨가하고 원료가 잘 혼합되도록 교반하여 제조한 항고혈압 기능성 우유 조성물이다.

본 발명의 목적은 혈압이 높은 사람들에게 혈압을 떨어뜨리는 기능을 가지면서 우유에 풍부한 영양소를 공급할 수 있는 기능성 우유 조성물을 제공하는 것이다.

케이신 가수분해물, 메밀 가수분해물, 항고혈압 활성, 우유제품

Description

항고혈압 우유 조성물 {Antihypertensive Milk Compositions}

도 1은 가수분해 시간과 각 효소의 농도에 따른 케이신 가수분해물의 ACE 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸다. (A: Flavourzyme 500MG＋Protamex), B: Protamex, C: Favourzyme 500MG)

도 2는 각 효소에 의한 케이신 가수분해물의 ACE 저해 활성과 가수분해 수율을 나타낸다. (A: Flavourzyme 500MG, B: Protamex, C: Flavourzyme 500MG ＋Protamex)

도 3은 인공위액 및 장액 조건에서 케이신 가수분해물의 전기영동 결과이다. (A: peptic hydrolysate, B: pancreatin & oxgall treated hydrolysate)

도 4는 인공위액 및 장액 조건에서 케이신 가수분해물의 ACE 저해효과를 나타낸다.

도 5는 각 효소별 가수분해물의 시간에 따른 ACE저해 효과를 측정한 결과이다.

도 6은 케이신을 트립신으로 가수분해한 가수분해물을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.

도 7은 케이신 또는 메밀 가수분해물의 고혈압 쥐에 대한 항고혈압 효과를 실험한 결과이다.

본 발명은 항고혈압 우유 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 케이신 가수분해물, 메밀 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항고혈압 우유 조성물에 관한 것이다.

우리나라 우유소비는 경제개발 5개년 계획이 실시된 1962년 이후 급속히 증대되어, 2000년에는 1인당 우유 소비량이 59.2㎏에 이르렀으며, 총 수요량은 281만 톤에 달했다. 우유소비량 중에서 시유의 소비량이 70∼75%를 차지하고 있으며, 시유의 소비는 올림픽 이전인 1987년까지 급속히 증가했으나, 1988년 이후에는 정체현상을 보였다. 반면에 발효유의 소비는 1987년까지 완만히 증가하다가 올림픽 이후 IMF 사태가 발생한 1997년 까지 급속히 증가했다. 이와 같이 현재는 우유의 기능성을 부여한 가공유의 소비가 증가하는 양상을 보이는 추세이다.

우유에는 3.4% 전후의 단백질이 함유되어 있으며, 그중 약 80%는 케이신(casein)으로 이루어져 있고, 나머지는 유청단백질로 이루어져 있다. 유청단백질에는 α-락트알부민(α-lactalbumin), β-락토글로불린(β-lactoglobulin), 혈청알부민, 면역단백질, 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 등 여러 가지 수용성 단백질이 있다. 케이신은 인산과 칼슘이 결합 되어 만들어진 작은 입자의 형태로 우유에 들어 있으며 치즈를 만들 때에 두부와 같이 엉키는 것이 바로 케이신이다. 우유의 단백질은 각 단백질의 생물학적인 기능은 물론 위와 장에서 소화 되여 우리가 반드시 섭취해야 하는 필수 아미노산을 많이 공급해 주는 영양적인 기능이 매우 높은 중요한 성분이다. 또 우유 단백질의 소화율은 97% 이상으로 알려지고 있어서 다른 식물성 단백질보다 소화가 더 잘되는 단백질이다. 우유에는 주요 단백질 외에도 여러 가지 효소, 항체 등의 단백질과 비단백태 질소화합물도 여러 종류가 있으며 이들도 여러 가지 영양적 및 생물학적 기능을 가지고 있는 것으로 알려지고 있다.

유가공 제품을 제조한 후 생산되는 부산물로부터 케이신 분말, 훼이(whey) 단백질 분말 등의 유단백질 제품과 유당 및 훼이 분말 등이 생산된다. 케이신 분말은 가공식품 및 기타원료로 사용하기 위해 생산되며, 훼이 단백질은 훼이로부터 단백질을 농축하여 생산되며, 훼이로부터 유당을 결정화 시키거나 건조 상태의 훼이분말도 생산된다. 현재 우리가 흔히 먹고 있는 우유는 홀스타인(Holstein)젖소의 우유를 가장 많이 사용하고 섭취하고 있다.

생약재의 생리활성물질 중 혈압상승에 관여하는 angiotensin-1 converting enzyme (ACE)을 억제하고, 고혈압의 발생 기작인 레닌-안지오텐신 시스템(renin-angiotensin system)의 생화학적 기전을 조절하여 혈압강하에 중요한 역할을 하는 물질이 있다는 연구가 보고되고 있다. 인체 내에서 ACE는 레닌(renin)에 의하여 생성된 데카펩티드(decapeptide)인 안지오텐신-I(angiotensinⅠ)으로부터 C-말단의 디펩티드(dipeptide: His-Leu)를 가수분해시킴으로써 강력한 혈관수축작용을 나타내는 안지오텐신 Ⅱ를 생성하고 혈압강하작용을 갖는 브래디키닌(bradykinin)을 분 해하여 불활성화 시킴으로서 고혈압의 원인이 되고 있다. 이러한 ACE의 저해인자로서는 저분자 펩타이드와 그 유도체들, 차(tea)에 존재하는 카테킨(catechin)과 메밀의 루틴(rutin)같은 폴리페놀(polyphenol) 성분들이 대표적으로 알려져 있다.

본 발명의 종래 기술로서, 공개특허 10-2005-0113666 (안지오텐신 전환효소(ACE) 저해제의 제조 방법 및 이의용도)은 대두분의 글리시닌으로부터 유래된 안지오텐신 전환효소 저해제에 관한 것으로, 본 발명의 구성과 다르다.

본 발명은 상기 종래기술이 가지는 한계를 극복하기 위해 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 in vitro 및 in vivo에서의 항고혈압 활성이 우수하여 기능성이 좋은 케이신 가수분해물, 메밀 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항고혈압 우유 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 케이신 가수분해물, 메밀 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항고혈압 우유 조성물을 포함한다.

상기에서, 케이신 가수분해물은 전체 중량에 대하여 0.5~10중량％, 메밀 가수분해물은 1.0~10중량%를 시유에 첨가하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기에서, 가수분해물은 플라보자임(flavourzyme) 500MG, 프로타멕스(protamex), 파파인(papain) 30,000, 프로테아제(protease) NP, GC 106, 멀티펙트 누트랄(multifect nutral), 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alcalase) 효소 가수분해물 중에서 어느 하나 이상 선택되어 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 우유소재와 생약재을 이용하여 부가가치가 높은 항고혈압 기능성 소재 및 우유제품을 개발하기 위하여 탈지분유, 유청단백질, 케이신 등으로부터 항고혈압 활성소재를 조사하였으며, 여러 가지 생약재의 항고혈압 활성을 검색하여 항고혈압 활성이 우수한 메밀을 선정하고 메밀을 원료로 한 항고혈압 소재의 우유 조성물을 개발하였다.

본 발명을 위하여 훼이(whey), 스킴 밀크(skim milk), 카제인은 서울우유와 비락우유 제품을 사용할 수 있다. 메밀은 쓴메밀(fagopyrum tataricum)과 볶은 쓴메밀(roasted fagopyrum tataricum), 단메밀(fagopyrum esculentum)과 볶은 단메밀(roasted fagopyrum esculentum)을 사용할 수 있다.

우유 또는 메밀의 가수분해는 플라보자임(flavourzyme) 500MG(Novo), 프로타멕스(protamex; Novo), 파파인(papain) 30,000(Oka zone international), 프로테아제(protease) NP(Bioland), GC 106(Oka zone international), 멀티펙트 누트랄(multifect nutral; Oka zone international), 뉴트라아제(neutrase; Novo), 알칼라아제(alcalase; Novo) 효소 중에서 어느 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 우유 조성물은 케이신 가수분해물은 전체 중량에 대하여 0.5~10중량％, 메밀 가수분해물은 1.0~10중량%를 시유에 첨가하는 것이 바람직하 고, 결정올리고당 등 식품학적으로 허용 가능한 첨가물을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 케이신 가수분해물의 경우 프로타멕스 효소와 플라보자임 500 MG 효소가 우유소재의 가수분해 효소로 가장 바람직하다. 또한, 케이신 가수분해물의 ACE저해 활성은 프로타멕스 효소의 가수분해물이 ACE저해 활성에 전반적으로 좋은 결과를 나타내고, 혼합 효소(프로타멕스효소＋플라보자임)와 플라보자임 효소가 뒤를 이어 좋게 나타난다.

메밀 가수분해물의 경우, 메밀을 호화시켜 가수분해한 조건의 경우, 멀티펙트(36.3%), 알칼라아제(46.2%), 뉴트라아제(30.6%), 멀티펙트와 파파인 혼합 효소(60.0%)의 수율을 나타낸다. 또한, 메밀 가수분해물을 10㎎/㎖의 농도로 제조하여 ACE저해활성을 확인한 결과 알칼라아제 2.4L FG효소를 첨가한 경우 단메밀은 61.19%, 볶은 단메밀은61.46%, 쓴메밀은94.48%, 볶은 쓴메밀은 34.51%의 높은 ACE저해활성 효과를 나타낸다.

이하 본 발명의 내용을 실시 예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 우유소재의 가수분해조건

실험재료:

실험에 사용한 훼이(whey), 스킴 밀크(skim milk), 케이신은 서울우유와 비 락우유 제품을 사용하였으며, 가수분해에 사용한 효소는 플라보자임(flavourzyme) 500MG(Novo), 프로타멕스(protamex; Novo), 파파인(papain) 30,000(Oka zone international), 프로테아제(protease) NP(Bioland), GC 106(Oka zone international), 멀티펙트 누트랄(multifect nutral; Oka zone international), 뉴트라아제(neutrase; Novo), 알칼라아제(alcalase; Novo) 효소를 사용하였다.

(1)단백질 분해효소의 활성 측정:

실험에 사용한 각 단백질 분해효소의 활성 측정은 다음과 같이 실시하였다. 1% 스킴 밀크, 훼이, 케이신 용액을 pH 7.2로 조정한 후 실험에 사용하였다. 위와 같이 제조한 용액 1㎖를 50℃ 항온수조에서 5분 동안 방치한 후, 100㎎/㎖의 효소용액 1㎖를 넣고 50℃ 항온수조에서 30분간 가수분해 하였다. 위의 가수분해물에 0.4 M TCA(Sigma. USA) 2㎖를 넣고 혼합하여 50℃ 항온 수조에서 25분 동안 방치한 뒤 4000rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 상층액 1㎖를 얻었다. 이에 0.4 M 소디움 카보네이트(sodium carbonate) 5㎖과 50% Folin ＆ Ciocalteu's(Sigma. USA)시약 1 ㎖를 넣고 혼합 후 50℃에서 5분간 방치하여 발색시킨 뒤 660nm(Jasco V-570 Spectrophotometer. Japan)의 흡광도에서 측정하였다. 대조구로서는 1% 케이신 용액 1㎖과 0.4 M TCA 2㎖를 넣고 혼합한 후, 효소 1㎖를 넣고 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하였다. 효소 활성도는 상층액 1㎖의 L-cystein 100㎍에 상당하는 아미노산을 생성하는 효소량을 프로테아제 활성 1단위로 하여 계산하였다.

Protease 활성(Unit/g) = (At-Ao)×F×1/100×n

F : L- 시스테인(cystein)의 흡광도가 1.000일 때의 Y = 2.8116X + 0.0835 (R²=0.9996)식으로부터 얻어진 L-시스테인의 양×효소 희석 배수(㎍)

n : 시료용액의 희석배수

그 결과 프로타멕스 효소가 비락우유 케이신 제품에서 77.03unit/g을 나타냈으며, 서울우유 케이신 제품에서 76.56unit/g으로 가장 높은 활성도를 나타내었으며, 뒤이어 플라보자임 500 MG효소가 65.08unit/g, 63.47unit/g 을 나타내었다. 또한 스킴 밀크의 경우 프로타멕스 효소가 45.83unit/g, 48.53unit/g을 나타냈으며, 플라보자임 효소는 36.50unit/g, 35.98unit/g의 활성을 나타내었다. 이에 반해 액상 형태의 효소에서는 분말형태의 단백질 분해 효소에 비해 대체적으로 낮은 활성도를 나타내었다. 케이신의 경우 GC 160 효소가 52.11 unit/g, 53.76unit/g, 알칼라아제 효소에서 41.22unit/g, 42.81unit/g의 활성도를 나타내었으며, 스킴 밀크의 경우 알칼라아제 효소에서 25.16unit/g, 26.08 unit/g, GC 160효소에서 32.71 unit/g, 39.72unit/g의 활성도를 나타내었다(표 1). 이와 같은 결과를 토대로 프로타멕스 효소와 플라보자임 500 MG 효소를 우유소재의 가수분해 효소로 선정하였다.

<표 1> 단백질분해효소의 활성 (unit/g)

Enzymes	Enzyme activity
Enzymes	Whey	Skim milk V	Skim milk S	Casein Na V	Casein Na S
Flavourzyme 500 MG	22.25	36.5	35.98	65.08	63.47
Protamex	21.22	45.83	48.53	77.03	76.56
Papain 3000	9.15	13.33	21.95	43.34	33.33
Protease NP	1.25	9.93	11.4	36.23	43.4
GC 160	14.24	32.71	39.72	53.76	52.11
Multifect Nutral	5.52	17.14	7.56	41.55	38.53
Neutrase	5.31	16.41	17.58	41.62	39.37
Alcalase	15.79	25.16	26.08	42.81	41.22

(2) 효소농도에 따른 케이신 가수분해

효소의 엔도펩티다아제 활성 결과를 토대로 프로타멕스 효소와 플라보자임 500MG효소를 선정하여 카제인을 가수분해 하였다. 1% 케이신 용액을 제조한 후, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%(v/w)의 효소를 첨가하여 50℃의 수조에서 24시간 동안 교반 가수분해 하였다. 또한, 혼합물(프로타멕스, 플라보자임 500MG, 1:1비율)을 0.5%, 1%, 1.5%, 2%의 효소를 첨가한 후, 위와 같은 방법으로 가수분해 하였다. 이와 같이 분해한 1㎖의 가수분해물과 0.4M TCA(trichloro acetic acid) 1㎖를 혼합하여 3000rpm에서 20분 원심분리 하여 280㎚의 흡광도로 측정하였다.

그 결과 프로타멕스, 플라보자임 500MG와 두 가지의 효소를 1:1의 비율로 혼합하여 효소 0.5%, 1%, 1.5%, 2%의 효소농도에 따라 가수분해 한 결과 가수분해 정도는 큰 차이를 보이지 않았으며, 가수분해 시간에 따른 가수분해 정도는 0시간부터 1시간까지가 가장 큰 변화를 보였으며, 가수분해 1시간 이후에는 큰 변화를 보이지 않았다.

(3) 케이신 농도에 따른 가수분해

케이신을 1%, 5%, 10%농도로 제조하여, 플라보자임 500MG와 프로타멕스 효소를 단독처리구와 혼합 처리구 두 종류로 1% 첨가한 후 pH 6.8, 온도 50℃에서 24시간 동안 교반 가수분해 하였다. 가수분해도 측정은 추출물을 30분 동안 원심분리 한 후, 동결건조 하였다.

<표 2> 가수분해물의 회수율

Sample Concentration	Enzyme	Recovery rate(%)
케이신 1% 농도 (2g/200㎖)	flavourzyme 500MG	85.5
	protamex	88.5
	mixture	93.5
케이신 5% 농도 (10g/200㎖)	flavourzyme 500MG	79.1
	protamex	86.0
	mixture	90.5
케이신 10% 농도 (20g/200㎖)	flavourzyme 500MG	73.0
	protamex	76.6
	mixture	88.1

[실시예 2] 케이신 가수분해물의 ACE 저해 활성 측정

(1) 가수분해시간에 따른 ACE 저해 활성 및 추출 수율

케이신을 5% 용액으로 제조하여 프로타멕스 효소와 플라보자임을 1%(v/w)농도로 각각 첨가하여 50℃의 수조에서 24시간 동안 교반 가수분해하였다. 또한 프로타멕스와 플라보자임을 1:1 비율로 혼합한 효소를 첨가하여 위와 같은 조건에서 가수분해하였다. 이와 같이 분해한 1㎖의 가수분해물과 0.4 M TCA 용액 1㎖를 혼합하 여 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 280nm 의 흡광도에서 가수분해 정도를 측정하였다. 그 결과 시간에 따른 가수분해 정도는 0시간부터 1시간 까지가 가장 큰 변화를 보였다(도 1).

ACE 저해활성 측정은 Cushman 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉, ACE 저해활성은 0.3 M NaCl을 함유한 0.1 M 소디움 보레이트 버퍼(pH 8.3)에 rabbit lung acetone powder(Sigma. USA)를 1g/10㎖(w/v)의 농도로 4℃에서 24시간 동안 추출한 후, 4℃, 4,000rpm 에서 40분간 원심 분리하여 ACE조효소액을 얻었다. ACE저해 활성은 10㎎/㎖의 농도로 제조한 시료 50㎕에 0.1M 소디움 보레이트 버퍼(pH 8.3) 100㎕ 와 ACE 조효소액 50㎕를 가한 다음 37℃에서 5분간 예비반응시킨 후, 0.3M NaCl이 함유된 0.1M 소디움 보레이트 버퍼(pH 8.3) 5㎖에 HHL(hippuryl- histidyl-leucine) 25㎎을 첨가하여 만든 기질 50㎕를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이에 1N HCl 250 ㎕를 가하여 반응을 정지시킨 후, 에틸아세테이트 1.5 ㎖를 가해 15초간 교반한 후 원심분리(3000rpm, 5분, 4℃)하여 상층액 1㎖를 얻었다. 이 상층액을 120℃에서 30분간 완전히 건조시켜 증류수 3㎖를 가한 다음 다시 용해하여 228nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 대조구로서는 추출물 대신 추출용매 50㎕를 가해 실험하였으며, ACE저해활성효과는 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.

그 결과 프로타멕스효소의 가수분해물이 ACE저해 활성에 전반적으로 좋은 결과를 나타내었으며, 혼합 효소(프로타멕스효소＋플라보자임)와 플라보자임 효소가 뒤를 이어 좋게 나타났다. 즉, 케이신을 0, 1, 2, 3, 4, 6, 24시간으로 교반 가수분해 하여 얻은 시료를 ACE저해 활성 측정한 결과, 프로타멕스 효소는 0시간(1.7%), 1시간(74.5%), 2시간(77.9%), 3시간(80.4%), 4시간(82.7%), 6시간(83.9%)및 24시간(84.6%)을 나타내었으며, 혼합 효소에서는 0시간(1.5%), 1시간(61.8%), 2시간(62.1%), 3시간(67.9%), 4시간(72.7%), 6시간(73.8%)및 24시간(74.1%)나타내었다. ACE저해 활성이 가장 낮은 플라보자임 효소는 0시간(1.6%), 1시간(43.4%), 2시간(47.3%), 3시간(49.1%), 4시간(51.2%), 6시간(56.9%)및 24시간(60.9%)을 나타내었다(도 2).

(3) 가수분해 수율에 대한 영향

예비실험을 거쳐 계획된 범위 내에서 효소농도(0.25-1.25%), 케이신 농도(2.5-12.5%) 및 가수분해시간(20-100분)에 대하여 가수분해 수율을 측정한 반응표면 회귀식은 아래와 같다. 즉, 효소농도 0.64%, 케이신 농도 8.38%, 가수분해시간 55.81분에서 가수분해 수율이 가장 좋게 나타났다. 또한 가수분해 수율에 대한 R²값은 0.9751로 1% 이내의 유의성이 인정되었다(표 3).

Y=56.8557+35.3010X₁-2.3748X₂+0.1837X₃-12.8173X₁ ²-0.4200X₂X₁+0.0458X₂ ²+0.0675X₃ X₁+0.0057X₃X₂-0.0014X₃ ²(R²=0.9751)

<표 3> 가수분해 수율

반 응	R2	Pro>F	효소 농도(%)	케이신 농도(%)	가수분해 시간(%)	Maximum	Morphology
가수분해 수율 (%)	0.9751	0.0001	0.6409	8.3870	55.81	3.9965	saddle point
ACE 저해 활성(%)	0.8398	0.0387	0.8698	5.9732	63.86	77.6647	saddle point

(4) ACE 저해활성에 대한 영향

독립변수인 효소농도(0.25-1.25%), 케이신 농도(2.5-12.5%) 및 가수분해시간(20-100분)에 대하여 ACE 저해활성을 측정한 반응표면 회귀식은 아래와 같다. 즉, 효소농도 0.86%, 케이신 농도 5.97%, 가수분해시간 63.86분에서 가장 좋은 ACE 저해활성을 나타내었다. 또한 ACE 저해활성에 대한 R2값은 0.8398으로 5% 이내의 유의성이 인정되었다.

Y=58.6166+48.455X₁-1.7729X₂+0.0596X₃-193086X₁ ²-1.0300X₂X₁+0.0905X₂ ²-0.0372X₃X₁ +0.0122X₃X₂-0.0005X₃ ²(R²=0.8398)

(5) 케이신 가수분해물의 농축, 건조법 및 분리 조건

식품 단백질 중 ACE 저해활성이 높은 펩타이드의 분자량은 주로 1,000Da 이하라는 보고가 있다. 케이신을 유산균으로 발효한 후, 펩신(pepsin), 트립신 (trypsin)으로 분해하였을 때 αs1-casein 분획에서 ACE저해 활성이 높았고, 이들 가수분해물의 분자량은 1,000Da 이하이었다. 또한, κ-casein을 트립신으로 가수분해한 결과 분자량 1,000Da 이하의 분획에서 IC50 값이 115 ㎍/㎖ 이었으나 3,500Da인 분획에서는 238㎍/㎖ 로 증가하여 1,000Da 이하의 분획에서 ACE 저해활성이 높은 것에 대해 보고한 바 있다. 이와 같은 결과를 토대로 본 실험에서는 산업적으로 이용 가능한 효소로 가수분해하여 500Da, 1,000Da, 3,000Da의 멤브레인(membrane)으로 한외여과(ultrafiltration)를 실시한 결과 1,000Da 이하의 분획물에서 가장 뛰어난 ACE저해활성을 나타내었다. 케이신 200g을 증류수 2L에 용해시킨 후, 프로타멕스 1%를 첨가하여 3시간 동안 1차 가수분해 하였다. 1차 가수분해물 100㎖에 플라보자임효소를 1, 0.75, 0.5, 0.25% 첨가하고, 1시간 동안 2차 가수분해하여, 3kDa, 1kDa의 멤브레인을 아미콘(amicon) 여과 장치에 장착하여 분자량별로 분획하였다. 그 결과 1,000Da 이하에서 대부분을 차지하였으며, 플라보자임 효소의 농도가 증가할수록 높게 나타났다(표 4). 또한 10㎎/㎖의 농도로 제조하여 분획물의 ACE저해활성을 실험한 결과, 분자량과 효소첨가량에 따른 차이는 크게 나타나지 않았다(표 5).

<표 4> 한외여과 후 케이신 가수분해물의 회수율

Concentration (%)	Recovery rates (%)
Concentration (%)	3,000 Da 이상	3,000 - 1,000 Da	1,000 Da 이하
1	21.56	26.70	51.73
0.75	21.39	38.05	40.55
0.5	23.59	34.95	41.44
0.25	28.12	35.95	35.92

<표 5> 한외여과 후 ACE저해활성

Concentration (%)	ACE inhibitory activity (%)
Concentration (%)	3,000 Da 이상	3,000 - 1,000 Da	1,000 Da 이하
1	78.16	81.11	82.34
0.75	80.51	80.14	84.21
0.5	79.54	82.42	82.13
0.25	79.22	82.35	82.21

[실시예 3] 메밀소재의 가수분해조건

(1) 실험재료:

메밀은 총 4종으로 (주)한국야쿠르트에서 제공한 쓴메밀(fagopyrum tataricum)과 볶은 쓴메밀(roasted fagopyrum tataricum) 그리고 동아제분에서 구입한 단메밀(fagopyrum esculentum)과 볶은 단메밀(roasted fagopyrum esculentum)을 사용하였으며 단메밀과 쓴메밀의 일반성분은 표 6과 같다. 가수분해에 사용한 효소는 단백질 분해효소와 전분분해효소로 총 12종을 사용하였다. 단백질 분해효소는 프로타멕스, 파파인 30000, GC 106, 뉴트라아제 0.8L, 알칼라아제 2.4L FG, 플라보자임 500MG, 멀티펙트 뉴트랄, 프로테아제 N.P로서 총 8종이였으며 전분 분해효소는 Novo사의 비스코자임(Viscozyme) L, A.M.G 300L, 펙티넥스(Pectinex) 5XL, 셀루클라스트(Celluclast) 1.5L FG로서 총 4종을 사용하였다.

<표 6> 메밀의 성분 (Unit: %)

sample	Moisture	protein	Lipids	Non-fibrous	Fiber	Ash
FE(단메밀)	6.89	9.88	2.18	73.04	6.31	1.70
FT(쓴메밀)	7.24	9.53	2.26	73.49	5.82	1.66

(2) 추출조건에 따른 메밀 가수분해물의 ACE저해 활성 효과

메밀은 블렌더를 이용하여 마쇄한 후, 200g을 2L의 증류수에 첨가하여 1시간 동안 비등점에서 교반, 호화시켰다. 메밀을 호화시킨 후, 200 ㎖씩 나누어 담은 후, 멀티펙트, 알칼라아제, 누트라아제, 혼합(papain/multifect) 효소를 1% 접종하여 50℃에서 4시간 동안 가수분해하였다. 또한, 분쇄한 메밀 20g을 200mL의 증류수에 첨가한 후, 멀티펙트, 알칼라아제, 누트라아제, mixture효소를 1% 접종하여 50℃에서 4시간동안 가수분해 하였다. 가수분해물은 여과포를 이용하여 여과한 후, 동결건조 하였다. 그 결과 메밀을 호화시켜 가수분해한 조건의 경우, 멀티펙트(36.3%), 알칼라아제(46.2%), 누트라아제(30.6%), 혼합(60.0%)의 수율을 나타내었으며, 분쇄하여 가수분해한 경우는 멀티펙트(24.2%), 알칼라아제(12.2%), 누트라아제(14.2%), 혼합(20.1%)의 수율을 나타내었다(표 7). 메밀을 호화 및 분쇄조건으로 효소 추출한 가수분해물에 대한 ACE저해활성을 측정한 결과 호화 시켜 가수분해한 메밀에 비해 분쇄하여 가수분해한 메밀에서 멀티펙트(4.5%), 알칼라아제(26.4%), 누트라아제(10.3%), 혼합(23.7%)으로 좋은 활성을 나타내었다(표 8).

<표 7> 메밀의 가수분해 수율 (%)

Enzyme	Hydrolysis rates (%)
Enzyme	Gelatinization	Pulverization
Alcalase	46.2	12.2
Nutrase	30.6	14.2
Multifect	36.3	24.2
Mixture (multifect/papain)	60.0	20.1

<표 8> 메밀 가수분해물의 ACE저해 활성 (%)

Enzyme	ACE inhibitory activity (%)
Enzyme	Gelatinization	Pulverization
Alcalase	8.3	26.4
Nutrase	3.2	10.3
Multifect	5.5	4.5
Mixture (multifect/papain)	5.1	23.7

(3) 효소에 따른 메밀 가수분해물의 ACE저해 활성 효과

단메밀(Fagopyrum escylentum)을 분쇄기를 사용하여 분쇄한 후 20g을 100㎖의 증류수에 첨가한 후, 각각의 효소 2%를 첨가하여 50℃ 4시간 동안 가수분해 하였다. 가수분해물을 원심분리기를 이용하여 5,000 RPM에서 원심분리 하여 상등액을 동결건조 하였다. 그 결과 단백질 분해효소를 첨가한 가수분해물의 경우 멀티펙트 뉴트랄(25.95%), 알칼라아제 2.4 FG(18.65%), 프로테아제 N.P(21.90%)의 수율을 나타내었으며, 전분 분해효소를 첨가한 가수분해물의 경우 10% 미만의 낮은 수율을 나타내었다.

메밀 가수분해물을 10㎎/㎖의 농도로 제조하여 ACE저해활성을 확인한 결과 전분 분해효소인 알칼라아제2.4L FG(88.55%)효소를 첨가한 가수분해물에서 가장 좋 은 활성을 나타내었으며, 전분 분해효소를 첨가한 가수분해물은 비스코자임 L(0.57%), AMG 300L(2.57), 펙티낵스 5XL(7.02%), 셀루클라스트 1.5L(3.69%)의 낮은 ACE저해활성을 나타내었다(표 9, 표 10).

<표 9> 단백질 분해효소에 따른 단메밀 가수분해물의 ACE저해 활성

Enzymes
Enzymes	ACE inhibitory activity (%)	Hydrolysis rate (%)
Protamex	71.58	12.35
Papain 30000	71.75	8.80
GC 106	46.56	6.75
Nutrase 0.8l	73.72	11.30
Alcalase 2.4L FG	88.55	18.65
Falvourzyme 500MG	37.99	8.75
Multifect Neutral	44.59	25.95
Protease N.P	21.90	20.55

<표 10> 전분 분해효소에 따른 단메밀 가수분해물의 ACE저해 활성

Enzymes
Enzymes	ACE inhibitory activity (%)	Hydrolysis rate (%)
Viscozyme L	0.57	8.90
AMG 300L	2.57	6.50
Pectinax 5XL	7.02	6.30
Celluclast 1.5l	3.69	7.10

(4) 전분 분해효소에 따른 쓴메밀과 단메밀 가수분해물의 ACE저해 활성 효과

메밀은 분쇄기로 분쇄하여 50 mesh sieve로 통과한 분말을 사용하였다. 각각의 시료 20g에 증류수 100㎖를 취한 후 비스코자임 L, A.M.G 300L, 펙티넥스 5XL, 셀루클라스트 1.5L, 알칼라아제 2.4L FG, 뉴트라아제 0.8L, GC 106, 멀티펙트 뉴트랄 효소는 각각 2%(v/w), 프로타멕스, 파파인 30000, 플라보자임 500MG, 프로테아제 N.P 효소는 2%(w/w)를 첨가하였으며 대조구는 효소대신 증류수 2%를 첨가하여 50℃에서 4시간동안 가수분해 하였다. 가수분해물은 원심분리기를 이용하여 5,000 RPM에서 20분 동안 원심 분리하였으며 상등액을 동결 건조하였다. 그 결과 쓴메밀 보다는 단메밀 가수분해물의 수율이 높게 나왔으며 생메밀이 볶은 메밀보다 높게 나왔다. 전분 분해효소에 따른 단메밀 가수분해물의 경우 비스코자임 L(24.65%), A.M.G 300L(14.20%), 펙티넥스 5XL(15.45), 셀루클라스트 1.5L(15.10%)의 수율을 나타내었다(표 12). 효소 대신 증류수를 첨가한 메밀 가수분해물의 ACE저해활성 효과 결과 쓴메밀(67.58%), 단메밀(11.82%), 볶은 단메밀(9.86%), 볶은 쓴메밀(3.08%)을 나타내었다(표 11). 효소를 첨가한 쓴메밀 가수분해물의 경우 10% 미만의 낮은 ACE저해활성 효과를 나타내었다(표 13).

<표 11> 효소 대신 증류수를 첨가한 메밀 가수분해물의 ACE저해활성 효과 (Unit: %)

sample
sample	ACE inhibitory activity	Hydrolysis rate
FE	11.82	7.92
RFE	9.86	7.62
FT	67.58	3.17
RFT	3.08	4.21

FE:Fagopyrum esculentum(단메밀), RFE:Roasted fagopyrum esculentum(볶은 단메밀)

FT:Fagopyrum tataricum(쓴메밀), RFT:Roasted fagopyrum tataricum(볶은 쓴메밀)

<표 12> 전분 분해효소에 따른 단메밀 가수분해물의 ACE저해활성 효과 (Unit: %)

Enzymes	ACE inhibitory activity		Hydrolysis rate
Enzymes	단메밀	볶은 단메밀	단메밀	볶은 단메밀
Viscozyme L	1.15	1.92	24.65	24.2
AMG 300L	2.94	4.28	14.20	17.6
Pectinex 5×L	9.30	1.78	15.45	16.8
Celluclast 1.5L	7.47	1.71	15.10	16.8

<표 13> 전분 분해효소에 따른 쓴메밀 가수분해물의 ACE저해활성 효과 (Unit: %)

Enzymes	ACE inhibitory activity		Hydrolysis rate
Enzymes	쓴메밀	볶은 쓴메밀	쓴메밀	볶은 쓴메밀
Viscozyme L	1.49	0.97	22.10	30.30
AMG 300L	2.95	5.74	15.90	41.45
Pectinex 5×L	4.43	0.71	12.15	19.80
Celluclast 1.5L	5.02	0.23	9.75	14.60

(5) 단백질 분해효소를 이용한 쓴메밀과 단메밀 가수분해물의 ACE저해 활성 효과

메밀은 분쇄기로 분쇄하여 50 mesh sieve로 통과한 분말을 사용하였다. 각각 의 시료 20g에 증류수 100㎖를 취한 후 비스코자임 L, A.M.G 300L, 펙티넥스 5ㅧL, 셀루클라스트 1.5L, 알칼라아제 2.4L FG, 뉴트라아제 0.8L, GC 106, 멀티펙트 뉴트랄 효소는 각각 2%(v/w), 프로타멕스, 파파인 30000, 플라보자임 500MG, Protease N.P효소는 2%(w/w)를 첨가하였으며 대조구는 효소대신 증류수 2%를 첨가하여 50℃에서 4시간 동안 가수분해 하였다. 가수분해물은 원심분리기를 이용하여 5,000 RPM에서 20분 동안 원심 분리하였으며 상등액을 동결 건조하였다.

그 결과 알칼라아제 2.4L효소를 첨가한 가수분해물의 경우 단메밀(18.70%), 볶은 단메밀(22.20%), 쓴메밀(19.45%), 볶은 쓴메밀(31.88%)의 수율을 나타내었으며, 멀티펙트 뉴트랄 효소를 첨가한 가수분해물의 경우 단메밀(22.29%), 볶은 단메밀(27.50%), 쓴메밀(30.00%), 볶은 쓴메밀(39.64%)의 수율을 나타냈다.

메밀 가수분해물을 10㎎/㎖의 농도로 제조하여 ACE저해활성을 확인한 결과 알칼라아제 2.4L FG 효소를 첨가한 경우 단메밀(61.19%), 볶은 단메밀(61.46%), 쓴메밀(94.48%), 볶은 쓴메밀(34.51%)의 높은 ACE저해활성 효과를 나타냈다(표 14, 표 15).

<표 14> 단백질 분해효소를 이용한 단메밀 가수분해물의 ACE저해 활성 (Unit: %)

Enzymes	ACE inhibitory activity (%)		Hydrolysis rate (%)
Enzymes	단메밀	볶은 단메밀	단메밀	볶은 단메밀
Protamex	45.74	37.93	17.49	20.64
Papain 30000	32.33	15.00	13.16	13.00
GC 106	22.45	0.04	8.78	9.36
Neutrase 0.8L	51.92	33.83	15.64	17.69
Alcalase 2.4L FG	61.19	61.46	18.70	22.69
Falvourzyme 500MG	36.77	13.35	13.40	22.20
Multifect Neutral	30.88	22.37	22.29	27.50
Protease N.P	27.57	16.22	19.88	24.31

<표 15> 단백질 분해효소를 이용한 쓴메밀 가수분해물의 ACE저해 활성 (Unit: %)

Enzymes	ACE inhibitory activity (%)		Hydrolysis rate (%)
Enzymes	쓴메밀	볶은 쓴메밀	쓴메밀	볶은 쓴메밀
Protamex	58.88	24.27	11.78	38.80
Papain 30000	81.65	34.01	6.09	6.00
GC 106	64.72	14.19	4.55	5.57
Neutrase 0.8L	69.32	25.54	10.40	22.83
Alcalase 2.4L FG	94.48	34.51	19.45	31.88
Falvourzyme 500MG	32.87	25.34	8.98	20.95
Multifect Neutral	41.90	11.24	30.00	39.64
Protease N.P	42.11	11.20	21.19	36.65

[실시예 4] 인공 위액과 장액 및 기타 단백질 분해효소에 의한 케이신 가수분해 조건 검토

(1) 인공 위액과 장액 및 기타 단백질 분해효소에 의한 케이신 가수분해

카제인이 소화조건에서 어떻게 가수분해 되는지 알아보기 위하여 인공위액과 장액의 조건에서 가수분해 실험을 하였다. 인공위액에서의 가수분해조건은 5% 농도의 케이신 용액에 펩신(pepsin)(E:S=1:2,000)을 첨가한 후 37℃에서 반응시켰고 0시간, 30분, 1시간, 2시간, 3시간 간격으로 가수분해 시료를 취하였다. 이렇게 취 한 시료는 80℃에서 15분간의 열처리로 불활성화 시켜서 실험에 사용하였다. 인공장액의 가수분해 조건은 5% 농도의 케이신 용액에 옥스갈(oxgall)과 판크레아틴(pancreatine)(E:S=1:10,000)을 첨가하였고, 반응실험조건은 인공위액에서와 동일하게 실시하였다.

인공위액 및 장액 조건에서 케이신 가수분해물의 정기영동 결과와 가수분해물의 ACE 저해효과를 도 3, 4에 표시하였다. 도 3의 결과를 보면 펩신에 의한 케이신의 분해는 시간이 지남에 따라 약간 분해되는 것을 볼 수 있었으나 판크레아틴과 옥스갈에 의한 가수분해물에서는 거의 분해가 되지 않는 것으로 관찰되었다. 이 결과를 도 4의 ACE저해효과와 연관시켜 보면 다소 분해가 이루어진 펩신 가수분해물에서 시간이 지남에 따라 ACE저해효과가 증가하는 것으로 관찰되는 반면 전기영동에서 거의 분해가 되지 않았던 판크레아틴과 옥스갈의 가수분해물은 ACE 저해효과 역시 3시간 분해 후에도 20% 미만으로 측정되었다.

(2) 각종 단백분해 효소들과 기질인 케이신의 가수분해 패턴 확인 및 최적 조건 설정

Sigma사의 트립신(trypsin)과 Novozymes사, 성우화학의 식품용 단백분해효소들을 이용하여 케이신을 가수분해 하였다.

도 5는 각 효소별 가수분해물의 시간에 따른 ACE저해효과를 측정한 결과이다. 효소와 케이신이 반응하자마자 모든 효소에서 90% 이상의 높은 ACE 저해효과를 보여주었다. 그러나 알칼라아제, 플라보자임, 프로테아제는 큰 수치는 아니지만 가 수분해 시간이 지나면서 저해효과가 약간씩 저하하는 경향을 보여주었다. 이는 지나친 가수분해가 가수분해물 중 ACE 저해에 관여하는 펩타이드(peptide)를 절단하여 그 기능성을 상실하게 하는 것으로 여겨진다. 도 6은 케이신을 트립신을 이용한 가수분해물을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. A는 트립신으로 E:S 비율을 1 : 50,000으로 가수분해한 결과로 시간이 지남에 따라 큰 분자량을 가진 밴드부분이 사라지고 분자량이 작은 아래쪽의 밴드가 두터워지는 것을 확인 할 수 있었다. B는 도 5의 (A)(E:S=1 : 10,000)를 전기 영동한 것으로 반응 1시간부터 원래의 분자량을 지닌 성분들은 대부분 저분자 물질로 분해되었고 5시간째부터는 15% 젤로는 측정이 불가능한 상태의 작은 분자량을 지니게 되어 밴드의 존재조차 육안으로는 확인하기 어려웠다.

[실시예 5] 본태성 고혈압쥐를 이용한 케이신 및 메밀 가수분해물의 항고혈압활성

케이신 및 메밀 가수분해물을 사용하여 항고혈압활성을 조사하였다. 케이신 가수분해물은 상기 실시예 2에서 제조한 5% 케이신 용액에 프로타멕스 효소와 플라보자임을 1%(v/w)농도로 각각 첨가하여 50℃의 수조에서 24시간 동안 교반 가수분해한 것을 사용하였다. 메밀 가수분해물은 상기 실시예 3에서 제조한 분쇄한 메밀 20g을 200mL의 증류수에 첨가한 후, 알칼라아제 효소를 1% 접종하여 50℃에서 4시간 동안 가수분해한 것을 사용하였다.
본태성 고혈압쥐를 이용하여 카제인 및 메밀 가수분해물의 항고혈압 효과를 살펴본 결과(도 7), 케이신 가수분해물을 경구 투여한 경우 케이신 가수분해물을 경구투여하지 않은 대조군에 비해 혈압이 29mmHg감소하는 효과를 확인할 수 있었으며, 메밀 가수분해물을 경구 투여한 경우 메밀 가수분해물을 경구투여하지 않은 대조군에 비해 혈압이 38mmHg감소하는 효과를 확인할 수 있었다. 즉, 대조구는 일반 식이와 물을 섭취한 군으로 0주 200.53mmHg의 수축기 혈압을 시작으로 3주에 209.0mmHg으로 혈압이 조금씩 상승하다가 4주에서 219.27mmHg로 10mmHg정도 혈압이 높아졌고, 5주에는 222.40mmHg으로 상승했다. 우유를 1일 2㎖씩 매일 경구 투여한 실험군에서는 0주 198.63mmHg에서 4주 209.0mmHg으로 혈압이 높아지다 5주에서는 215.44mmHg로 혈압이 상승했다. 카제인 가수분해물을 우유에 10%첨가, 혼합하여 2㎖씩 매일 경구 투여한 실험군에서는 0주 197.67mmHg에서 1주에는 3mmHg정도 상승한 197.5mmHg였으나 2주에서 183.38mmHg로 혈압이 14mmHg정도 낮아졌고, 그 후 다시 조금씩 혈압이 상승해 5주에는 195.67mmHg로 혈압이 상승하였다. 메밀(Fagopyrum tataricum) 가수분해물을 우유에 10%첨가, 혼합하여 2㎖씩 매일 경구투여 한 실험군에서는 0주 200.38mmHg이었으나 경구투여한지 2주째 측정에서 198.86mmHg으로 약 1.5mmHg정도 혈압이 낮아졌고, 2주에서는 168.89mmHg로 약 30mmHg정도 혈압이 급격히 낮아졌다. 3주에서 18mmHg정도 다시 올라갔고, 5주에서 194mmHg로 올라갔다.

[실시예 6] 케이신 및 메밀 가수분해물의 관능검사

실험 재료로 사용한 볶은 메밀은 (주)한국야쿠르트에서 제공한 것을 사용하였으며, 단백질 분해효소인 알칼라아제 2.4L과 전분 분해효소인 비스코자임 L은 Novozymes사에서 구입한 효소를 사용하였다. 메밀 가수분해물을 제조한 방법으로는 볶은 메밀을 체로 처서 껍질을 제거한 뒤 분쇄기로 분쇄하여 50mesh sieve로 통과한 분말을 사용하였다. 메밀분말 4kg에 증류수 20L(5배)을 첨가한 후 알칼라아제 2.4L와 멀티펙트 효소를 첨가하여 가수분해하였다. 먼저 56℃, pH 6.3인 메밀 용액에 단백질 분해효소인 알칼라아제 2.4L을 2%(v/w) 첨가하여 가수분해하였으며, 이 때 관능적인 면에서 맛과 향이 메밀의 고유특성을 내어 고소했다. 2시간 가수분해를 마친 후 전분 분해효소인 멀티펙트를 2%(v/w) 첨가하여 가수분해하였다. 2시간 가수분해 후 효소의 반응정지를 위하여 80℃에서 5분간 열처리하였다. 원심분리가 잘 일어날 수 있도록 4℃에서 냉각시킨 후 5,000 RPM(3300×g)에서 15분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리한 상층액을 취하여 325 mesh sieve로 불순물을 제거한 후, 70℃에서 농축한 후 동결 건조하였다.

관능검사

메밀과 케이신 가수분해물을 농도(1. 3, 5, 7, 10%)별로 제조하여 관능검사를 9점(매우우수)평점 법으로 실시하였다. 관능검사 결과 메밀가수분해물의 경우 5% 첨가 하였을 때 향과 색에서 가장 우수한 것으로 평가되었고, 케이신 가수분해물의 경우 1% 첨가하였을 때 가장 우수한 것으로 평가되었다. 그리고 케이신 가수분해물과 메밀 가수분해물을 2:8로 혼합한 혼합물의 경우 1% 첨가하였을 때 가장 우수한 것으로 평가되었다(표 16).

<표 16> 메밀 가수분해물과 케이신 가수분해물을 첨가한 우유의 관능검사

sample	Concentration (%)	Sensory attribute
sample	Concentration (%)	Tast	Flavor	Color	Overall palatability
BW¹ ⁾	10	6.7	5.7	6.0	6.3
	7	7.7	6.7	7.3	7.7
	5	7.3	6.9	7.4	7.8
	3	7.0	5.7	6.3	7.3
	1	7.3	5.3	6.3	7.0
CS² ⁾	10	1.0	2.5	3.7	1.3
	7	1.3	1.8	5.3	2.0
	5	2.3	3.5	6.0	3.0
	3	4.8	5.5	6.8	5.7
	1	5.5	6.2	7.8	6.5
BC³ ⁾	10	1.0	2.0	4.7	1.7
	7	2.0	3.0	4.5	3.2
	5	3.5	4.3	5.3	4.3
	3	5.8	6.2	6.7	6.2
	1	7.7	6.8	7.3	7.3

¹⁾BW : 메밀 가수분해물

²⁾CS : 케이신 가수분해물

³⁾BC : 케이신 가수분해물과 메밀 가수분해물을 2:8로 혼합한 혼합물

본 발명에 의하면 관능적인 특성이 우수하며 in vitro 및 in vivo에서의 항고혈압활성이 우수하여 기능성이 좋은 천연소재를 이용한 저분자 케이신 가수분해물, 메밀 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항고혈압 우유 조성물을 제공할 수 있다.

Claims

뉴트라아제(neutrase) 및 알칼라아제(alcalase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질분해효소에 의한 메밀 가수분해물; 또는 상기 메밀 가수분해물과 뉴트라아제(neutrase) 및 알칼라아제(alcalase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질분해효소에 의한 케이신 가수분해물을 포함하는 항고혈압 우유 조성물.
제 1항에 있어서, 케이신 가수분해물은 전체 중량에 대하여 0.5~10중량％, 메밀 가수분해물은 1.0~10중량%를 시유에 첨가하는 것을 특징으로 하는 항고혈압 우유 조성물.
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