WO2004050118A1 - システインプロテアーゼ阻害剤 - Google Patents

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WO2004050118A1
WO2004050118A1 PCT/JP2003/014263 JP0314263W WO2004050118A1 WO 2004050118 A1 WO2004050118 A1 WO 2004050118A1 JP 0314263 W JP0314263 W JP 0314263W WO 2004050118 A1 WO2004050118 A1 WO 2004050118A1
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WO
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casein
cysteine protease
amino acid
peptide
protease inhibitor
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PCT/JP2003/014263
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Nobuhiko Katunuma
Akio Yamada
Yasushi Kawaguchi
Natsuko Takakura
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Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a cysteine proteinase inhibitor containing, as an active ingredient, casein, a partial peptide of casein, or a casein hydrolyzate, and comprises osteoporosis, malignant hypercalcemia, breast cancer, and prostate cancer. It is a cysteine protease inhibitor that can be used in the prevention and treatment of periodontal disease, bacterial-virus infection, and the like, and in foods and drinks and feeds.
  • Proteolytic enzymes having a thiol group in the active center are cysteine proteases (thio
  • Cathepsin L, cathepsin B, and forceepsin K are one of the representative cysteine proteases along with calcium-dependent neutral protease (CAMP) -papain, fusin, bromelain, and the like.
  • CAMP calcium-dependent neutral protease
  • Substances that have an inhibitory effect on cystine proteases include diseases implicated in cystine-oral proteases, such as muscular dystrophy, muscular atrophy, myocardial infarction, stroke, Alzheimer's disease, impaired consciousness and movement during head injury.
  • bone formation by osteoblasts osteoblasts
  • osteoclasts bone resorption by osteoclasts
  • bone loss decreases because bone resorption exceeds bone formation, leading to the onset of osteoporosis.
  • bones Collapse bone resorption
  • This can be further divided into two causes as follows. One is due to calcium absorption and impaired deposition; more specifically, it is related to calcium supply, transfer, absorption, and deposition; vitamin D derivatives, female hormones (estrogens), etc. Is considered to be involved.
  • the other is to promote the degradation of collagen, which is a bone supporting tissue, and it is a type of cysteine proteinase secreted from lysosomes in osteoclasts, and in particular, bone collagen by cathepsin L, cathepsin B, and cathepsin K. Decomposition is the main cause.
  • These cathepsins L and B, secreted from lysosomes in osteoclasts promote the breakdown of collagen in bone tissue, so that old bone is dissolved and calcium is released to the blood along with hydroxyproline.
  • osteoporosis by inhibiting the ability of cathepsin L, cathepsin B, and cathepsin K to degrade collagen, excessive bone breakdown can be prevented, and thus osteoporosis can be treated.
  • Estrogen, anabolic hormone, calcium, vitamin D, calcitonin, bisphosphonate and the like are known as therapeutic agents for these osteoporosis.
  • osteoporosis therapeutic agents whose mechanism of action is the so-called cysteine proteinase inhibition of cathepsin L inhibition, cathepsin B inhibition, or cathepsin K inhibition
  • development of osteoporosis treatment agents using several cysteine proteinase inhibitors has been promoted. Although progress is being made (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 7-179496, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-501502), further development of a therapeutic agent for osteoporosis is desired.
  • Hypercalcemia is a metabolic disorder in which serum calcium levels are above normal levels and are common in oncology patients. If left unchecked, the life expectancy of the patient is said to be about 10 days. Many of the causes are bone metastases of the tumor. When the tumor spreads to bone, bone destruction occurs and calcium is released into the blood. This calcium is processed by the kidney, but when the speed of bone destruction exceeds the processing capacity of the kidney, hypercalcemia occurs.
  • a treatment method a method of promoting excretion of calcium from the kidney by using an infusion of physiological saline combined with furosemide, a method of using calcitonin, a therapeutic agent for osteoporosis, and the like are known. That is, it can be said that a therapeutic agent for osteoporosis that suppresses bone resorption is also effective as a therapeutic agent for malignant neoplastic hypercalcemia.
  • cysteine protease inhibition that can be used for such a purpose
  • the following are already disclosed as agents.
  • protease inhibitors contained in breast milk include anti-chymotrypsin and 1-antitrypsin, and hinyuichi ⁇ 2-trypsin inhibitor, 2-antiplasmin, and 2-Minor milk contains trace amounts of inhibitors such as macroglobulin, antithrombin III, and anti-leucoprotease (Isao Kiyozawa, "Nutrition of Breast Milk", Kanehara Publishing, pp. 80-81).
  • a novel cysteine protein having a sugar chain derived from bovine colostrum and a molecular weight of about 57 kDa.
  • Novel protein having a molecular weight of 16 ⁇ 2 kDa or 13 ⁇ 2 kDa derived from human milk and a method for producing the same (JP-A-10-80281)
  • Proteins contained in large amounts in mammalian milk include lactofurin and / or casein.
  • Casein is classified into s-casein, casein, and zein. Most of the casein in human milk is 5-casein, and s-casein is absent or only traces are present.
  • the power of milk, zein contains ccs-casein and almost equal amounts of casein.
  • casein has recently been spotlighted as a bioactive peptide that has the potential to promote the absorption of potassium and the ability to activate macrophage phagocytosis, which are potentially contained in the primary structure of the protein. ing.
  • casein has a high nutritional value and is included in various foods such as cheese, yogurt, and skim milk as a raw material for dairy products, and contributes to our diet.
  • JP-A-8-818308 As an invention utilizing casein, the present applicant has already disclosed an arteriosclerosis inhibitor (JP-A-81838) containing one casein or a hydrolyzate of / c-casein as an active ingredient. ing.
  • the present invention can be widely used as a food material, and is used for prevention and treatment of osteoporosis, malignant neoplastic hypercalcemia, breast cancer, prostate cancer, periodontal disease, or bacterial and viral infections, and various other agents.
  • An object of the present invention is to provide a versatile cysteine protease inhibitor that can be used in foods and drinks and feeds.
  • the present inventors have intensively searched for a cysteine protease inhibitor that can be used as a safe material without antigenicity, and as a result, it has been found that casein, a protein derived from milk, partial peptide of casein, and hydrolysis of casein are derived from milk. Degradation products in cysteine protease They have found that they have inhibitory activity, and have completed the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows (1) to (24).
  • a cystine protease inhibitor containing casein or a partial peptide thereof as an active ingredient (1) A cystine protease inhibitor containing casein or a partial peptide thereof as an active ingredient.
  • a peptide having cystine protease inhibitory activity comprising:
  • a cysteine protease inhibitor comprising, as an active ingredient, casein or a partial peptide thereof shown in (C) or (D) below.
  • (C) A peptide having at least the amino acid sequence of amino acids 142 to 160 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • a cysteine proteinase inhibitor which can be obtained by hydrolyzing casein with a hydrolase, and which comprises, as an active ingredient, a casein hydrolyzate having a cysteine proteinase inhibitory action.
  • cysteine protease inhibitor according to any one of (1) to (9), which is an agent for preventing or treating a disease associated with cysteine protease.
  • a food or drink composition or feed composition comprising the cysteine protease inhibitor according to any one of (1) to (11).
  • a method for treating a disease associated with cysteine protease which comprises administering the cysteine protease inhibitor according to any one of (1) to (11) to a patient.
  • (C) A peptide having at least the amino acid sequence of amino acids 142 to 160 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • hydrolase is one or more kinds selected from animal or microorganism-derived hydrolases.
  • cysteine protease inhibitor is an agent for preventing or treating a disease associated with cysteine protease.
  • Fig. 1 is a diagram (photograph) showing the detection of reverse zymography of the milk protein of the red pepper.
  • FIG. 2 is a diagram showing the amino acid sequences of ⁇ casein and ⁇ case force peptide.
  • FIG. 3 is a graph showing the cysteine protease inhibitory effect of caseins on papain.
  • FIG. 4 is a diagram showing the spectrum of cystine protease inhibitory activity of casein.
  • FIG. 5 is a diagram showing the amino acid sequences of human casein and human casein peptide.
  • the present invention relates to a cysteine protease inhibitor containing casein, a partial peptide of casein, or a casein hydrolyzate as an active ingredient.
  • the casein used in the present invention may be any of a variety of commercially available caseins or those isolated from milk of humans, pests, pomas, sheep, goats, etc. by a conventional method (eg, isoelectric focusing method). Or may be produced by genetic recombination technology or the like.
  • Casein is classified into 1 casein, 1 casein, and 1 casein, and any casein can be used in the present invention, and preferably /?-Casein or 1 casein can be used.
  • human casein for example, human casein having the amino acid sequence described in Swiss-Prot Accession No .: P05814
  • human casein for example, Swiss-Prot Accession No .: P05814
  • human casein for example, Swiss-Prot Accession No .: P05814
  • Accession No .: P-casein having the amino acid sequence described in P02666 is preferred. More specifically, the amino acid sequence of human /?-Isuzu zein is shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of ⁇ -casein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the partial peptide of casein used in the present invention can be obtained, for example, by hydrolyzing casein with an acid or a protease by a known method, and purifying the generated partial peptide.
  • casein is digested with lysyl peptidase in 10 O mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) for more than 35 hours with lysyl peptidase, and the resulting partial peptide is purified by high-speed chromatography. It can be produced by purification.
  • casein or casein partial peptide that can be used in the present invention is human zein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or at least of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Peptides having the amino acid sequence of amino acid numbers 133 to 151 can be exemplified.
  • bovine ⁇ -casein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a peptide having at least the amino acid sequence of amino acids 142 to 160 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may also be exemplified. it can.
  • SEQ ID No. 1 in the sequence listing Among the amino acid sequences described above and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, amino acid numbers 1 to 15 are signal sequences.
  • caseins or casein partial peptides have a cysteine protease inhibitory activity, they can be used for the cysteine protease inhibitor of the present invention.
  • full-length casein since full-length casein has cysteine protease inhibitory activity, it contains amino acids 133-15-1 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and is N-terminal side or C-terminal side or both.
  • a peptide having an amino acid sequence obtained by extending the sequence of SEQ ID NO: 2, and amino acids 142-160 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the sequence is extended to the N-terminal side or the C-terminal side or both. It is considered that peptides having the amino acid sequence also have cysteine protease inhibitory activity.
  • peptides can be obtained, for example, by chemical synthesis based on the amino acid sequence containing the cysteine protease-inhibiting activity region according to the present invention, or can be obtained by genetic recombination technology or the like. You can also.
  • an appropriate primer is prepared based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence containing the region, and the primers are used to amplify the nucleotide sequence by PCR using the cDNA containing the target nucleotide sequence as type III Then, it can be obtained by expressing the obtained nucleotide sequence using an appropriate expression system.
  • a gene usually has mutations such as substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or more bases at one or more positions depending on the species, genus, individual, etc. Since mutations may occur in the amino acids of the protein encoded by the gene having such a mutation, the casein and the casein partial peptide which can be used in the present invention also impair the cysteine protease inhibitory activity. It is possible to include such mutations to the extent that they are not affected.
  • the casein or casein partial peptide which can be used in the present invention is a peptide having at least the amino acid sequence of 133 to 151 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a peptide having an amino acid sequence of amino acids No. 142 to 160, comprising one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions, and having cysteine protease inhibitory activity Is exemplified.
  • “multiple” refers to SEQ ID No. 1 in the sequence listing.
  • the amino acids of amino acids Nos. 133 to 151, and the amino acids of amino acids Nos. 142 to 160 among the amino acids of SEQ ID No. 2 in the sequence listing Although it differs depending on the position and type in the three-dimensional structure of the protein, for example, the number is 2 to 5, preferably 2 to 3.
  • amino acids in the range other than amino acids 133 to 151, or in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing amino acid number 1 Amino acids in the range other than 42 to 160 amino acids may include one or more substitutions / deletions. In this case, the number of amino acids varies depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but is, for example, 2 to 10, preferably 2 to 5.
  • casein or partial casein peptide that can be used in the present invention has at least the amino acid sequence of amino acids 133-151 among the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence encoding a protein or peptide substantially identical to the casein protein or the peptide as described above may be obtained by substituting, deleting, inserting, or It can be obtained by modifying the base sequence to include addition or inversion. Further, the modified base sequence can be obtained by a conventionally known mutation treatment. The nucleotide sequence having the mutation is expressed in an appropriate cell, and the cysteine protease inhibitory activity is measured by the cysteine protease inhibitory activity measurement method described in Examples of the present invention, whereby the casein or the peptide is substantially eliminated. A base sequence encoding the same protein or peptide is obtained.
  • a casein hydrolyzate can also be used. Casein used for the hydrolysis may be the same as described above. A casein hydrolyzate can be obtained by hydrolyzing these caseins with a hydrolase as follows.
  • the above-mentioned casein is first dispersed in water or hot water and dissolved.
  • concentration of the lysate it is usually preferable to set the concentration in the range of about 5 to 15% in terms of protein in terms of efficiency and operability. It is desirable to heat sterilize the obtained solution containing casein at 70 to 90 ° C. for about 10 to 15 seconds from the viewpoint of preventing deterioration due to bacterial contamination.
  • an alkaline agent or an acid agent to the casein-containing solution to adjust the pH to or near the optimal pH of the hydrolase to be used.
  • the alkaline agent or acid agent used in the method of the present invention may be any alkaline agent or acid agent as long as it is acceptable for foods or pharmaceuticals.
  • examples of the alkaline agent include sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate and the like
  • examples of the acid agent include hydrochloric acid, citric acid, phosphoric acid, acetic acid and the like.
  • the hydrolase is not particularly limited as long as it is an enzyme that hydrolyzes a protein, and is preferably an enzyme derived from an animal or a microorganism.
  • the enzyme is endopeptidase.
  • various enzymes such as pancreatin, pepsin, trypsin, and elasase can be used.
  • the term “origin” originally means that the above-mentioned organisms retain the organism, but does not mean the source of the collection.
  • a protease produced by introducing a gene encoding a protease produced by Bacillus subtilis into Escherichia coli and expressing the gene is “derived” from Bacillus subtilis.
  • the hydrolase is preferably added at a rate of 20 to 200 active units per gram of casein (this unit will be described later).
  • the activity unit can be measured, for example, by the following method. That is, an enzyme solution is prepared by dispersing or dissolving a protease-containing powder at a rate of 0.2 g / 100 ml in 0.1 mol phosphate buffer (pH 7.0). Meanwhile, a 2 mM substrate solution was prepared by dissolving leucyl paranitroanilide (manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd .; hereinafter, referred to as Leu-pNA) in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0). I do.
  • the activity unit of protease can be determined by the following formula, defining the amount of enzyme necessary for decomposing l / mol of Leu_pNA per minute as one activity unit.
  • Activity unit (per g of powder) 2 O x (A / B)
  • a and B represent the absorbance of the sample and the absorbance of 0.25 mM para-nitroanilin at a wavelength of 41 Onm, respectively.
  • the hydrolase used in the present invention may be one kind or two or more kinds. When two or more enzymes are used, the respective enzyme reactions may be performed simultaneously or separately.
  • the solution to which the enzyme has been added is kept at an appropriate temperature according to the type of the enzyme, for example, at 30 to 60 ° C, preferably at 45 to 55 ° C, to start hydrolysis of casein.
  • the reaction is continued until the desired decomposition rate is reached, while monitoring the decomposition rate of the enzymatic reaction.
  • the decomposition rate of the casein hydrolyzate is particularly preferably from 6 to 45%.
  • the casein hydrolyzate has a decomposition rate of 6% or more, it is considered that the decomposition is more advanced. That is, if the decomposition rate is less than 6%, it is possible that undegraded casein which does not undergo the enzymatic reaction may remain, so the decomposition rate is preferably 6% or more.
  • the protein degradation rate can be calculated by, for example, the Kjeldahl method (edited by the Japan Food Industry Association, “Food Analysis Method”, p. 102, Korin Co., Ltd., Showa 59).
  • the amount of formol nitrogen in the sample was measured using the formol titration method (Mitsuda et al., Ed., “Food Engineering Experiments,” Vol. 1, p. 474, Yokendo, 1970). From these measured values, the decomposition rate can be calculated by the following equation.
  • Termination of the hydrolysis reaction is carried out by deactivating the enzyme in the hydrolyzed solution, and can be carried out by a conventional heat deactivation treatment.
  • the heating temperature and the holding time of the heat inactivation treatment can be set as appropriate under conditions that allow sufficient inactivation in consideration of the thermal stability of the enzyme used. It can be carried out with a holding time of 30 minutes to 2 seconds in the temperature range.
  • the pH of the obtained reaction solution may be adjusted to 5.5 to 7 with an acid such as citric acid, if necessary.
  • the number-average molecular weight refers to a document relating to the number-average molecular weight (edited by The Society of Polymer Science, “Basics of Polymer Science”, pp. 116-119, Tokyo Chemical Co., Ltd., 19
  • the average value of the molecular weight of the polymer compound is shown based on different indices as follows. That is, a polymer compound such as a protein hydrolyzate is a heterogeneous substance and has a molecular weight distribution. The molecular weight must be indicated by the average molecular weight in order to be treated physicochemically.
  • the number average molecular weight (hereinafter sometimes abbreviated as Mn) is an average of the number of molecules, and the peptide chain If the molecular weight of i is Mi and the number of molecules is N i, it is defined by the following general formula I.
  • the number average molecular weight is calculated by measuring the molecular weight distribution by high performance liquid chromatography and analyzing the data from the calibration curve using a GPC analysis system. can do.
  • Specific conditions for high-performance liquid chromatography include polyhydroxyshetyl asno and lyreamide columns [Po1y Hydroxye thyl Aspart amide Column: PO1y1 (Po1y). Ii) Made by the company. 4.6 mm x 400 mm] and elution with 20 mM sodium chloride and 50 mM formic acid at an elution rate of 0.5 ml / min.
  • the molecular weight distribution is measured using a UV detector (Shimadzu Corporation, 215 nm), a calibration curve is created using a sample with a known molecular weight, and data is analyzed using a GPC analysis system (wavelength 215 nm: Shimadzu Corporation). Then, the number average molecular weight can be determined.
  • the number average molecular weight of the casein hydrolyzate is particularly preferably from 200 to 5,000 daltons.
  • the number average molecular weight of the casein hydrolyzate is 5,000 daltons or less, undecomposed casein that is not subjected to the hydrolysis reaction is not included, and the casein hydrolyzate, which is an active ingredient of the present invention, can be more reliably obtained. Therefore, the number average molecular weight is preferably 5,000 daltons or less.
  • the solution containing the casein hydrolyzate obtained can be used as it is, and if necessary, a concentrated solution obtained by concentrating the solution by a known method, and further, a concentrated solution obtained by using a known method. It can also be used as a dry powder, depending on the method.
  • the casein hydrolyzate obtained as described above has a cysteine protease inhibitory action. Therefore, using the cysteine protease inhibitory action as an index, The conditions for producing casein hydrolyzate can be set as appropriate.
  • casein, a casein partial peptide or a hydrolyzate can be used alone, or two or more of these can be used in combination. Further, the casein partial peptide and hydrolyzate can be used alone or in combination of two or more.
  • the casein, the partial peptide of casein, or the casein hydrolyzate which can be used in the present invention has an inhibitory activity against cysteine proteases such as cathepsins B, L and papain.
  • the cysteine protease inhibitory activity can be measured according to the method of Barrett et al. [Methods in Enzymology, Vol. 80, Vol. 535-561, pp. 1981]. .
  • Z-Phe-Arg-MCA Benzyloxycarbonyl-L-Phenylalanylyl
  • the cysteine protease inhibitor of the present invention is produced by using casein, casein partial peptide, and / or casein hydrolyzate, and combining these with a known pharmaceutically acceptable pharmaceutical carrier. can do.
  • the dosage unit form of the preparation of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose of the treatment. Specifically, tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, syrups Preparations, suppositories, ointments, patches and the like.
  • additives such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, diluents, surfactants, and solvents for injections are commonly used as pharmaceutical carriers for ordinary pharmaceuticals. Can be used.
  • the amounts of casein, casein partial peptide, and / or casein hydrolyzate contained in the preparation of the present invention are not particularly limited, and may be appropriately selected, and for example, all are usually 0.005 to 8 in the preparation. It is good to be 0 mass%, preferably 0.05 to 60 mass%.
  • a disease associated with cysteine proteinase can be treated.
  • the patient may be a human or a mammal other than a human.
  • the administration method of the preparation of the present invention is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, the age and sex of the patient, other conditions, the degree of symptoms of the patient, and the like.
  • the dose of the active ingredient in the preparation of the present invention is appropriately selected depending on the usage, age and sex of the patient, degree of the disease, other conditions, and the like.
  • the amount of casein, a casein partial peptide, and / or casein hydrolyzate as an active ingredient is 0.1 to 120 mg / kg / day, preferably 10 to 50 mg / kg.
  • the dose should be within the range of / day, and it can be administered once or multiple times a day.
  • the cysteine protease inhibitors of the present invention include diseases involving cysteine protease, such as allergy, muscular dystrophy, muscular atrophy, myocardial infarction, stroke, Alzheimer's disease, multiple sclerosis, cataract, osteoporosis, and high malignant neoplastic calcium.
  • diseases involving cysteine protease such as allergy, muscular dystrophy, muscular atrophy, myocardial infarction, stroke, Alzheimer's disease, multiple sclerosis, cataract, osteoporosis, and high malignant neoplastic calcium.
  • diseases involving cysteine protease such as allergy, muscular dystrophy, muscular atrophy, myocardial infarction, stroke, Alzheimer's disease, multiple sclerosis, cataract, osteoporosis, and high malignant neoplastic calcium.
  • prostatic hyperplasia breast cancer, prostate cancer, periodontal disease, etc.
  • bacteria such as Staphylococcus aureus V8
  • viruses It is useful as a growth inhibitor
  • the cysteine protease inhibitory IJ of the present invention may be used alone, but it can also be used in combination with a known preventive or therapeutic agent for the above-mentioned disease or the above-mentioned bacterial-virus growth inhibitor. When used in combination, the effect of preventing or treating the above-mentioned disease or the effect of inhibiting the growth of bacteria and viruses can be enhanced.
  • the known prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases or the bacterial antiviral growth inhibitor to be used in combination may be contained as an active ingredient in the inhibitor of the present invention, or may be contained in the inhibitor of the present invention. Instead, they may be combined and commercialized as separate agents and combined at the time of use.
  • the food and drink composition of the present invention can be produced by adding casein, a casein partial peptide, and / or casein hydrolyzate to a raw material of a food or beverage, and can be taken orally. .
  • the raw materials those used in ordinary beverages and foods can be used.
  • the food and drink composition of the present invention can be prepared in the same manner as a normal food and drink composition except that a cysteine protease inhibitor is added.
  • Examples of the form of the food and drink composition include beverages such as soft drinks, carbonated drinks, nutritional drinks, fruit juice drinks, lactic acid bacteria drinks, etc.
  • Ice creams such as ice cream, sorbet and shaved ice
  • sweets such as candy, chewing gum, candy, gum, chocolate, tablets, snacks, biscuits, jellies, jams, creams and baked goods: processed milk, milk Beverages, fermented milk, dairy products such as flour; bread; enteral nutritional food, liquid food, milk for childcare, sports drinks, and other functional foods.
  • the amount of casein, casein partial peptide, and / or casein hydrolyzate to be added is appropriately determined depending on the form of the food and drink composition. It may be added so as to be 0.05 to 80% by mass, preferably 0.05 to 60% by mass.
  • the feed composition of the present invention can be produced by adding casein, a partial peptide of casein, and / or casein hydrolyzate to the feed, and can be used for general mammals, livestock, fish farming, and pets. Can be administered orally.
  • Examples of the form of the feed composition include pet food, livestock feed, fish feed, etc., along with cereals, cakes, bran, fish meal, bone meal, fats and oils, skim milk powder, whey, mineral feed, yeast, etc. They can be mixed to produce the feed composition of the present invention.
  • the amount of casein, casein partial peptide, and / or casein hydrolyzate to be added is appropriately determined depending on the form of the feed composition, but is usually 0.000 in normal feed. It may be added in an amount of 5 to 80% by mass, preferably 0.05 to 60% by mass.
  • the food or drink composition or feed composition of the present invention can be a food or drink composition or feed composition showing the efficacy for the prevention or treatment of the following diseases. That is, for the prevention or treatment of diseases involving cysteine protease, for example, osteoporosis, malignant neoplastic hypercalcemia, breast cancer, prostate cancer, periodontal disease, or bacterial / viral infection. Can be displayed.
  • diseases involving cysteine protease for example, osteoporosis, malignant neoplastic hypercalcemia, breast cancer, prostate cancer, periodontal disease, or bacterial / viral infection.
  • display means an act of informing a consumer of the above-mentioned effects, and for example, the above-mentioned effects are applied to a food or drink composition or a feed composition of the present invention, or to packaging, advertising, or the like of a product.
  • a partial heptapeptide or casein hydrolyzate used as an active ingredient of the cysteine protease inhibitor of the present invention will be described.
  • a peptide having the amino acid sequence of amino acids 133 to 151 was produced by the following method.
  • the peptide of the present invention was synthesized and produced using an automatic amino acid synthesizer (Applied Biosystems, Model 433A).
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • the peptide was purified from the crude peptide by high performance liquid chromatography (hereinafter abbreviated as HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the column used is a reversed-phase C 18-0
  • casein hydrolyzate (U.S.A., Amano Enzym, 1 12,00 OU / g) was added, and the mixture was hydrolyzed by holding at 50 ° C for 4 hours, followed by heat treatment at 90 ° C for 10 hours to deactivate the enzyme. By freeze-drying, about 100 g of casein hydrolyzate was obtained. The decomposition rate of the obtained casein hydrolyzate was 9.5%, and the number average molecular weight was 910 dalton.
  • the present inventor used a technique called "reverse zymography” as a method for detecting a protease inhibitor, and detected a protease inhibitor present on a gel of SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Inverse zymography is based on the reverse method of ordinary zymography, and the basic principle is as follows. That is, a sample containing a protease inhibitor is applied to an SDS polyacrylamide gel containing gelatin, and after electrophoresis, the gel is immersed in a protease solution to degrade proteins in the gel.
  • the portion where the inhibitor is present inhibits the activity of the protease, so that gelatin is prevented from being degraded by the protease, and this is stained with the staining solution, whereby the inhibitor can be identified.
  • Test method One method of inverse zymography in the present invention is as follows.
  • electrophoresis (hereinafter, SDS polyacrylamide gel electrophoresis was performed using 12.5% SDS polyacrylamide gel containing 0.1% gelatin) PAGE). After the electrophoresis, the gel was washed by immersing it in a 2.5% Triton X-100 solution for 45 minutes and then immersing it in distilled water for another 45 minutes three times to wash the gel. This gel was immersed in 100 ml of 0.025 M acetate buffer (pH 5.5) containing I mg papain (3 lunits / l), and incubated at 37 ° C for 10 hours to digest gelatin.
  • the gel is washed with distilled water, stained with a staining solution (0.025% Coomassie Prillant. Blue (CBB) R-250, 40% methanol, 7% acetic acid aqueous solution) for 1 'hour, and then decolorized solution (40% (Methanol, 10% acetic acid aqueous solution).
  • CBB Coomassie Prillant. Blue
  • FIG. Figure 1 shows the results of one pattern of inverse zymography.
  • lane 1 is a normal SDS-PAGE pattern of total protein in milk
  • lane 2 is a reverse zymography pattern of total protein in milk
  • lane 3 is gelatin on milk protein gel in milk.
  • Reverse zymography pattern without control (lane) lane
  • lane 6 is a pattern of reverse zymography of natural casein
  • lane 7 is a gel of natural casein without gelatin
  • Each pattern of inverse zymography (control) is shown.
  • the arrows in the figure indicate the migration positions of /?-Casein (molecular weight: 35 kDa) derived from natural Mesh 'by SDS-PAGE. Note that lanes 4 and 5 have no direct relationship with this test example.
  • Figure 2 shows the results of this test.
  • Figure 2 shows the results of determining the amino acid sequence of the 35 kDa staining band in milk.
  • the N-terminal amino acid sequence of the 35-kDa stained band was completely identical to that of p-5-casein. Therefore, from both the results of this test and the results of Test Example 1, it was clarified that calcium casein had cysteine protease inhibitory activity.
  • This test was performed to search for a region having cysteine protease inhibitory activity in the casein molecule.
  • the casein 250 / g was dissolved in 10 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.5) and digested with lysyl peptidase at 35 ° C for 16 hours.
  • the cysteine protease inhibitory activity was measured to determine whether the digestive casein-peptide mixture retained the cysteine protease inhibitory activity.
  • the method for measuring the inhibitory activity was as follows with reference to the method of Barrett et al. [Methods in Enzyraology, Vol. 80, pp. 535-561, 1981]. That is, dissolved in 0.1 M acetate buffer pH 5.5 Z-Phe-Arg-MCA (final concentration: 2 OmM: manufactured by Peptide Research Laboratories) was added as a substrate to the obtained casein peptide mixture solution, and cysteine protease (papain: manufactured by Sigma) was used in this test.
  • the fluorescence intensity of AMC released from the digested substrate (excitation wavelength: 37 nm, emission wavelength: 460 nm) were measured using a fluorescence spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • the amino acid sequence of the peptide sample having the activity was determined using a G1005A protein sequencing system manufactured by Hewlett-Packard Inc.
  • Figure 2 shows the results of this test.
  • the main peptide sample having inhibitory activity was identified by the amino acid sequence from Leu at residue 142 to residue His at residue 160 in the amino acid sequence of amino-casein in Fig. 2 (underlined part). :
  • the peptide having the above sequence is referred to as “case-peptide”.
  • test samples were tested in the same manner as in the method for measuring cysteine proteinase inhibitory activity described in Test Example 3. Was measured for its cysteine protease inhibitory activity.
  • Figure 3 shows the results of this test.
  • Figure 3 shows the cysteine protein against papain in casein, casein, and casein. It shows an inhibitory effect on ze.
  • single-casein and single casein 1 0- 5 M concentration papain was completely inhibited in the, it was found that substantially inhibit the activity of papain in even 1 0- 4 M while also weakly slightly the shed one Kazin . Therefore, it was clarified that not only ⁇ -casein but also one casein and one strength casein had cysteine proteinase inhibitory activity.
  • cysteine protein of the test sample was obtained in the same manner as in the method for measuring cysteine proteinase inhibitory activity described in Test Example 3. —Ze inhibition activity was measured.
  • FIG. 4 shows the results of this test.
  • FIG. 4 shows the results of measurement of the inhibitory effect of bovine ⁇ ⁇ 1> zein on papain, cathepsin B, and forceepsin L.
  • ⁇ sheet -? Casein has been found to completely inhibit papain in 1 0- 5 M.
  • the ⁇ Shi also Katebushin B and Katebushin L -? Casein was found to substantially inhibit their protease activity at 1 CT 4 M. Therefore, it was revealed that peczytin zein inhibits the protease activity of papain, cathepsin B, and cathepsin L, and has a broad spectrum of cysteine protease inhibitory activity spectrum.
  • Human 5-casein purified according to a conventional method (for example, J. Daily Sci. J Vol. 53, No. 2, pp. 136-145, 1997 0, purified by the method described in), and the sequence listing synthesized in Example 1.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of human casein
  • a peptide having an amino acid sequence of amino acid numbers 133 to 151 in FIG. 5, underlined peptide of human casein: The peptide of this sequence is referred to as human ⁇ -casein peptide.
  • Each of the test samples was used as a test sample, and the cysteine protein of the test sample was tested in the same manner as in the method for measuring cysteine protease inhibitory activity described in Test Example 3. Ze inhibitory activity was measured.
  • the decomposition rates (%) of test sample 1, test sample 2 and test sample 3 were 8.2, 33.5 and 38.0, respectively.
  • the number average molecular weights (Dalton) of Test Sample 1, Test Sample 2 and Test Sample 3 were 1020, 250 and 210, respectively.
  • Z-Phe-Arg-MCA final concentration: 20 mM; manufactured by Peptide Laboratories
  • cysteine protease After adding and mixing a papain solution (final concentration 15 units / ml) and reacting at 37 ° C for 10 minutes, the fluorescence intensity of AMC released from the digested substrate (excitation wavelength: 370 nm, (Emission wavelength: 460 nm) was measured using a fluorescence spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • Table 1 shows the results of this test.
  • Table 1 shows the cysteine of each test sample. Shows protease inhibitory activity.
  • Test Sample 1 inhibited cysteine protease activity by papain by 39% at a concentration of 0.1 mg / ml and 61% at a concentration of 0.2 mg / ml.
  • Test sample 2 inhibited papain's cystine protease activity by 76% at a concentration of 0.2 mg / ml and 50% at a concentration of 0.05 mg / ml.
  • Test sample 3 inhibited papain's cysteine protease activity by 53% at a concentration of 0.2 mg / ml, and 44% at a concentration of 0.1 mg / ml and 37% at a concentration of 0.05 mg / ml did.
  • a tablet cysteine protease inhibitor having the following composition was produced by the following method.
  • Lactose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 600 g, corn starch (manufactured by Nisshin Flour Milling Co., Ltd.) 400 g, crystalline cellulose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 400 g and Shikacasein (manufactured by Sigma Corporation)
  • the mixture is sieved with a mesh sieve (manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.), placed in a 0.5 mm-thick polyethylene bag, mixed by inversion, and the powder is applied using a fully automatic capsule filling machine (manufactured by Cesere Pedini, press type).
  • Capsules (manufactured by Nippon Elanco Co., Ltd., No. 1 gelatin capsule, Op. Yellow No. 6 Body, empty weight: 75 mg) are filled with 275 mg of content, and 7,000 capsules containing 82 mg of percasein Obtained.
  • skim milk powder (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) is dissolved in 800 ml of hot water at 50 ° C, sugar (Nissin Sugar Co., Ltd.) 30 g, instant coffee powder (Nestlé Co., Ltd.) 14 g, caramel (Showa Kako Co., Ltd.) ) 2 g and 0.01 g of coffee flavor (manufactured by San-ei Chemical Co., Ltd.) are added and dissolved sequentially with stirring, cooled to 10 ° C, and — casein (manufactured by Sigma) lg was added to prepare a milk drink having a cysteine protease inhibitory effect containing about 0.1% of casein.
  • Enzyme degradation product of whey protein (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) 10.8 kg, dextrin (Showa Industry Co., Ltd.) 36 kg, and a small amount of water-soluble bimin and mineral dissolved in 200 kg of water, and aqueous phase in tank Prepared.
  • a cysteine protease inhibitor of the following composition is prepared / prepared by the following method.
  • Casein hydrolyzate produced in Production Example 2 40.0 (%) Lactose (Morinaga Dairy) 18.5 Corn starch (Nissin Flour Mills) 30.7 Magnesium stearate (Taihei Chemical Co., Ltd.) 1. 4 Calcium carboxymethylcellulose (manufactured by Gotoku Pharmaceutical Co., Ltd.) After drying for 3 hours, magnesium stearate was added to the obtained dried product, mixed, and tableted by a conventional method to obtain a tablet.
  • skim milk powder (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) is dissolved in 800 ml of hot water at 50 ° C, and sugar (Nissin Sugar Co., Ltd.) 30 g Instant coffee powder (Nestlé Co., Ltd.) 14 g, caramel (Showa Kako) 2 g) and 0.01 g of coffee flavor (manufactured by San-Ei Chemical Co., Ltd.) were sequentially added and dissolved while stirring, and the mixture was cooled to 10 ° C. 1 g of the hydrolyzate was added to prepare a milk beverage having a cysteine protease inhibitory effect containing about 0.1% of the hydrolyzate of cycasein.
  • An oil phase was prepared by mixing and dissolving 2 kg, 0.2 kg of fatty acid monoglyceride (manufactured by Kao Corporation), and a small amount of fat-soluble vitamin.
  • the oil phase was added to the water phase in the tank, mixed with stirring, heated to 70 ° C, and homogenized with a homogenizer at a pressure of 14.7 MPa. Then, after sterilizing at 90 ° C for 10 minutes, the mixture was concentrated and spray-dried to prepare about 59 kg of an intermediate product powder.
  • the present invention relates to a cysteine protease inhibitor comprising casein, a partial peptide of casein, and / or casein hydrolyzate as an active ingredient. It is as follows.

Abstract

　本発明は、乳由来のタンパク質であるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼインの加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能である。

Description

明細 システィンプロテアーゼ阻害剤 技術分野
本発明は、 カゼイン、 カゼインの部分ペプチド、 またはカゼイン加水分解物を 有効成分として含有するシスティンプロテア一ゼ阻害剤に関するものであり、骨 粗鬆症、 悪性腫瘍性高カルシウム血症、 乳癌、 前立腺癌、 歯周病、 又は細菌 - ゥ ィルス感染症等の予防 ·治療剤、 並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能 なシスティンプロテアーゼ阻害剤である。 背景技術
活性中心にチオール基を有する蛋白分解酵素はシスティンプロテアーゼ（チォ
—ルプロテア一ゼ） と総称されている。 カテブシン L、 カテブシン B、 力テプシ ン Kは、 カルシウム依存性中性プロテア一ゼ ( C AM P )ヽ パパイン、 フイシン、 ブロメライン等とともに代表的なシスティンプロテアーゼの一つである。そして これらシスティンプロテア一ゼに対して阻害作用を有する物質は、 システィンプ 口テアーゼが関与するとされる疾患、 例えば筋ジストロフィー、 筋萎縮症、 心筋 梗塞、 脳卒中、 アルツハイマー病、 頭部外傷時の意識障害や運動障害、 多発性硬 化症、 末梢神経のニューロパシー、 白内障、 炎症、 アレルギー、 劇症肝炎、 骨粗 鬆症、 高カルシウム血症、 乳癌、 前立腺癌、 前立腺肥大症等の治療薬として、 あ るいは癌の増殖抑制、 転移予防薬、 血小板の凝集阻害薬等として期待される。 ま た、 近年に至り、 勝沼等の研究によってカテブシン L、 カテブシン Bと骨粗鬆症 乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症との関係が解明され、 それによつて、 とりわけ カテブシン L阻害剤の骨粗鬆症治療剤乃至悪性腫瘍性高カルシゥム血症治療剤 としての医薬への適用が注目されつつある （勝沼信彦著、 「： B I O raediaj, 第 7 卷、 第 6号、 第 7 3〜 7 7ページ、 1 9 9 2年）。 骨組織においては、 骨芽細胞 (osteoblast) による骨形成と、 破骨細胞 （osteoclast) による骨吸収が生涯を 通じて行われており、成長期には骨形成が骨吸収を上回ることにより骨重量が増 加し、 一方老年期には逆に骨吸収が骨形成を上回るために骨重量が減少し、 骨粗 鬆症の発症となる。 これら骨粗鬆症の原因としては様々なものがあるが、 特に骨 崩壊 （骨吸収） を主原因の一つとして挙げることができる。 これを更に 2つの原 因に分けると次のようになる。 即ち、 一つはカルシウムの吸収と沈着不全に起因 するものであり、 更に詳しくはカルシウムの供給量、 転送、 吸収、 及び沈着が関 係するものであり、 ビタミン D誘導体、 女性ホルモン （エストロゲン） 等が関与 していると考えられる。 いま一つは、 骨支持組織であるコラーゲンの分解促進を 内容とするものであり、破骨細胞内リソゾームから分泌されるシスティンプロテ ァーゼ群、 中でも特にカテブシン L、 カテブシン B、 カテブシン Kによる骨コラ ーゲン分解が主たる原因である。破骨細胞内のリソゾームから分泌されたこれら カテブシン L及び Bは骨組織中のコラーゲンの分解を促進し、 それによつて古い 骨は溶解され、 ヒドロキシプロリンとともにカルシウムが血中に遊離放出させら れる。 従って、 カテブシン L、 カテブシン B及びカテブシン Kのコラーゲン分解 能を阻害することによって過剰な骨崩壊を防止することが可能であり、 ひいては 骨粗鬆症の治療が可能となる。これら骨粗鬆症の治療剤としては、エストロゲン、 夕ンパク同化ホルモン、 カルシウム剤、 ビタミン D、 カルシトニン、 あるいはビ スホスホネート等が知られている。 またカテブシン L阻害、 カテブシン B阻害、 又はカテブシン K阻害のいわゆるシスティンプロテア一ゼ阻害を作用機序とす る骨粗鬆症治療剤についてもいくつかのシスティンプロテア一ゼ阻害剤をもち いた骨粗鬆症治療剤の開発が進められている （特開平 7— 1 7 9 4 9 6号公報、 特表 2 0 0 2— 5 0 1 5 0 2号公報） が、 さらなる骨粗鬆症治療剤の開発が望ま れている。
一方、 高カルシウム血症は、 血清中のカルシウム濃度が正常値以上となる代謝 異常であり、 腫瘍患者に多く見受けられる。 これを放置した場合、 患者の寿命は 1 0日程度であると言われている。原因の多くは腫瘍の骨転移である。腫瘍が骨 に転移すると、 骨破壊が起こり、 カルシウムが血中に放出される。 このカルシゥ ムは腎臓で処理されるが、 骨破壊のスピ一ドが腎臓の処理能力を上回つたとき、 高カルシウム血症の発現となる。 治療方法としては、 フロセミ ドを併用した生理 的食塩水の輸液を用いることにより腎臓からのカルシウム排泄を促進する方法 や、骨粗鬆症治療薬であるカルシトニンを使用する方法等が知られている。即ち、 骨吸収を抑制するような骨粗鬆症治療薬は悪性腫瘍性高カルシウム血症の治療 剤としても有効であるといえる。
本発明者らにより、 このような目的に使用し得るシスティンプロテアーゼ阻害 剤としてすでに以下のものが開示されている。
(1) カテブシン L特異的阻害ポリペプチド （特開平 7— 179496号公報）
(2) チオールプロテアーゼ阻害剤 （特開平 9— 221425号公報）
(3) パリン誘導体およびその用途 （特開 2001 - 139534号公報）
(4) チオールプロテアーゼ阻害剤 （特開平 7— 242600号公報）
(5) FA- 70C1物質 （特開 2000- 72797号公報）
(6) FA- 70D物質、 その製造法及びその用途（国際公開第 97/31122号パ ンフレット）
しかしながら、 食品素材として利用の点から、 より汎用性の高いシスティンプ 口テアーゼ阻害剤の開発が望まれていた。
他方、 これまでに、 母乳中にプロテア一ゼ阻害物質が存在することが知られて いる。 母乳に含まれるプロテアーゼ阻害物質として知られているものとしては、 ひ1一アンチキモトリブシン、 ひ 1—アンチトリプシンが挙げられ、 ィン夕一 α2 —トリプシン阻害物質、 ひ 2—アンチプラスミン、 ひ 2—マクログロブリン、 アン チトロンビン III、 アンチロイコプロテアーゼなどの阻害剤等も母乳に微量含ま れている （清澤功著、 「母乳の栄養学」、 金原出版、 第 80〜81ページ）。
乳中において、 システィンプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質について は、 すでに以下のものが開示されている。
( 1 )牛初乳由来の糖鎖を有する分子量約 57 kDaの新規システィンプロテア一 ゼインヒビ夕一 （特開平 7— 2896号公報）
( 2 ) 牛初乳由来の分子量 16 ± 2 kDa又は 13 ± 2 kDaの新規システィンプ 口テアーゼインヒビ夕一 （特開平 7—126294号公報）
( 3 ) 人乳由来の分子量 16 ± 2 kDa又は 13 ± 2 kDaの新規夕ンパク質およ びその製造方法 （特開平 10— 80281号公報）
( 4 )牛乳から調製された牛乳由来塩基性シス夕チン及び/又は牛乳由来塩基性 シス夕チン分解物を有効成分とする骨吸収阻害剤（特開 2000-281587 号公報）
(5) 乳塩基性蛋白質 （MBP) 中に含まれるシス夕チン C；、 及びインビトロに おける該シス夕チン Cによる骨吸収阻害効果 （バイオサイエンス 'バイオテクノ ロシ一 ' アン ド ' ノ ィ オケミ ス ト リ一 L Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry], 日本、 第 66卷、 第 12号、 2002年、 ρ· 2531 - 25 3 6 )
ほ乳類乳に多量に含有されるタンパク質として、ラクトフヱリン及び/?一カゼ インなどが挙げられる。カゼインは、 ひ s—カゼイン、 ーカゼイン及び 一力 ゼインに分類され、 人乳中のカゼインは、 5—カゼインがほとんどであり、 ひ s —カゼインは存在しないか、 又は痕跡程度認められるのみであるが、 牛乳中の力 ゼインは、 cc s—カゼイン、 ?一カゼインをほぼ等量含む。 カゼインは栄養成分 としての働きの他に、最近ではそのタンパク質の一次構造に潜在的に含まれる力 ルシゥム吸収促進作用やマクロファージ貪食活性化作用を有する生理活性ぺプ チド等が発見され、 注目を集めている。 また、 カゼインは高い栄養価とともに、 乳製品の原材料として、 あるいは、 チーズ、 ヨーグルト、 スキムミルク等の様々 な食品に含まれ、 我々の食生活に寄与している。
カゼインを利用した発明としては、本出願人により、すでに 一カゼイン又は /c—カゼインの加水分解物を有効成分とする動脈硬化防止剤（特開平 8— 8 1 3 8 8号公報） が開示されている。
また、ヒト乳から分離した /?—カゼィン若しくはその組換え形態又はそのいず れかの水解物は、 ィンフルェンザ菌のヒト細胞への付着の阻害 （特表平 1 0— 5 0 0 1 0 1号公報)、 及び哺乳動物細胞の R Sウィルス (Respiratory Syncytial Virus) 感染阻害 （特表平 1 0— 5 0 0 1 0 0号公報） が開示されている。
更に、 ーカゼイン加水分解物のアンジォテンシン変換酵素阻害活性 （特開平 6 - 1 2 8 2 8 7号公報及び特開平 6— 2 7 7 0 9 0号公報）が開示されている c しかしながら、 カゼィン及びその部分ぺプチドがシスティンプロテアーゼ阻害 作用を有することは知られていない。 発明の開示
本発明は、 食品素材として幅広く利用することが可能であり、 骨粗鬆症、 悪性 腫瘍性高カルシウム血症、 乳癌、 前立腺癌、 歯周病、 又は細菌 ·ウィルス感染症 等の予防 ·治療剤、 並びに各種飲食品及び飼料等に利用することが可能な、 汎用 性の高いシスティンプロテアーゼ阻害剤を提供することを目的としている。
本発明者は、 抗原性のない、 安全な素材として利用する事が可能なシスティン プロテア一ゼ阻害物質を鋭意探索した結果、乳由来のタンパク質であるカゼィン、 カゼィンの部分ぺプチド、及びカゼィンの加水分解物にシスティンプロテアーゼ 阻害活性を有することを見出し、 本発明を完成するに至った。
本発明の要旨は以下の （ 1) 〜 （24) のとおりである。
(1) カゼィン又はその部分べプチドを有効成分として含有するシスティ ンプロテア一ゼ阻害剤。
(2) カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はゥシ由来である （1) の システィンプロテアーゼ阻害剤。
(3) 以下の （A) 又は （B) に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有 効成分として含有するシスティンプロテア一ゼ阻害剤。
(A)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 133〜 15 1のアミノ酸配列を有するぺプチド。
( B )配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 133〜 15 1のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含み、 且つシスティンプロテア一ゼ 阻害活性を有するペプチド。
(4) 以下の （C) 又は （D) に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有 効成分として含むシスティンプロテアーゼ阻害剤。
( C )配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち、 少なくともァミノ酸番 号 142〜160のアミノ酸配列を有するペプチド。
(D)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、 少なぐともアミノ酸番 号 142〜160のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含み、 且つシスティンプロテアーゼ 阻害活性を有するペプチド。
( 5 ) カゼィンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることがで き、 かつ、 システィンプロテア一ゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物を有効 成分として含有するシスティンプロテア一ゼ阻害剤。
( 6 ) 前記加水分解酵素が、 動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択 される 1種又は複数種である （5) のシスティンプロテアーゼ阻害剤。
( 7 ) 前記カゼィン加水分解物の分解率が 6〜 45 %である（ 5 )又は（ 6 ) のシスティンプロテアーゼ阻害剤。
( 8 ) 前記カゼィン加水分解物の数平均分子量が 200〜 5000ダルト ンである （5) 〜 （7) のいずれかのシスティンプロテアーゼ阻害剤。 (9) カゼイン加水分解物を全量に対して 0.005質量％以上含有する、 (5) 〜 （8) のいずれかのシスティンプロテア一ゼ阻害剤。
(10) システィンプロテア一ゼが関与する疾患の予防 ·治療剤である（1) 〜 （9) のいずれかのシスティンプロテアーゼ阻害剤。
(1 1) システィンプロテアーゼが関与する疾患が、 骨粗鬆症、 悪性腫瘍 性高カルシウム血症、 乳癌、 前立腺癌、 歯周病、 又は細菌 ·ウィルス感染症等で ある （10) のシスティンプロテアーゼ阻害剤。
(12) (1) 〜 （1 1) のいずれかのシスティンプロテア一ゼ阻害剤を 添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
(13) (1) 〜 （1 1) のいずれかのシスティンプロテア一ゼ阻害剤を 患者に投与することを特徴とする、 システィンプロテアーゼが関与する疾患の治 療方法。
(14) カゼイン又はその部分ペプチドの、 システィンプロテアーゼ阻害 剤の製造のための使用。
(15) カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はゥシ由来である、 （1 4) の使用。
(16) 以下の（A)又は（B)に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、 システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。
(A)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 133〜 151のアミノ酸配列を有するぺプチド。
( B )配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 133〜 51のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含み、 且つシスティンプロテア一ゼ 阻害活性を有するペプチド。
(17) 以下の（C)又は（D)に示すカゼィン又はその部分ペプチドの、 システィンプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
( C )配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち、 少なくともァミノ酸番 号 142〜160のアミノ酸配列を有するペプチド。
( D )配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 142〜160のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含み、 且つシスティンプロテア一ゼ 阻害活性を有するペプチド。
(18) カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることが でき、 かつ、 システィンプロテア一ゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物の、 システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。
(19) 前記加水分解酵素が、 動物又は微生物由来の加水分解酵素から選 択される 1種又は複数種である （18) の使用。
(20) 前記カゼイン加水分解物の分解率が 6〜45%である （ 18) 又 は （19) の使用。
(21) 前記カゼィン加水分解物の数平均分子量が 200〜 5000ダル トンである （18) 〜 （20) のいずれかの使用。
(22) カゼィン加水分解物をシスティンプロテア一ゼ阻害剤の全量に対 して 0. 005質量％以上含有させることを特徴とする、 （ 18) 〜 （21) の いずれかの使用。
(23) システィンプロテアーゼ阻害剤が、 システィンプロテア一ゼが関 与する疾患の予防 '治療剤である、 （14) 〜 （22) のいずれかの使用。
(24) システィンプロテアーゼが関与する疾患が、 骨粗鬆症、 悪性腫瘍 性高カルシウム血症、 乳癌、 前立腺癌、 歯周病、 又は細菌 ·ウィルス感染症等で ある （23) の使用。 図面の簡単な説明
図 1は、 ゥシ乳タンパク質の逆ザィモグラフィ一の検出を示す図 （写真） であ る。
図 2は、 ゥシ カゼィン及びゥシ ?一力ゼィンぺプチドのアミノ酸配列を示 す図である。
図 3は、 パパインに対するカゼィン類のシスティンプロテア一ゼ阻害効果を示 す図である。
図 4は、 ?一カゼインのシスティンプロテア一ゼ阻害活性スぺクトルを示す図 である。
図 5は、 ヒト ?—カゼイン及びヒト ?—カゼインペプチドのアミノ酸配列を示 す図である。 発明を実施するための最良の形態
次に、 本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。 ただし、 本発明は 以下の好ましい実施態様に限定されず、 本発明の範囲内で自由に変更することが できるものである。 尚、 本明細書において百分率は特に断りのない限り質量によ る表示である。
本発明は、 カゼイン、 カゼインの部分ペプチド、 またはカゼイン加水分解物を 有効成分として含有するシスティンプロテアーゼ阻害剤に関する。本発明に用い られるカゼインとしては、 市販の各種カゼイン、 若しくはヒト、 ゥシ、 ゥマ、 ヒ ッジ、 ャギ等の乳等から常法 （例えば、 等電点沈殿法） により単離したもの、 又 は遺伝子組換え技術等によって生産されたものであってよい。 カゼインは、 ひ一 カゼイン、 ?一カゼイン、 及び 一カゼインに分類されるが、 本発明にはいずれ のカゼインも用いることができ、好ましくは/?—カゼィン又は 一カゼィンを用 いることができる。その中でも特にヒト由来の ?—カゼイン（例えば、 Swiss-Prot Accession No.： P05814に記載のァミノ酸配列を有するヒト ?—カゼィン）、 及 びゥシ由来の/?—カゼィン （例えば、 Swiss-Prot Accession No.： P02666に記載 のアミノ酸配列を有するゥシ ?—カゼイン） が好ましい。 具体的には、 ヒトの/? 一力ゼィンのアミノ酸配列を配列番号 1、 ゥシの^—カゼィンのアミノ酸配列を 配列番号 2に示す。
本発明に用いられるカゼインの部分ペプチドとしては、 例えば、 前記カゼイン を酸又はプロテアーゼにより公知の方法で加水分解し、生成した部分ぺプチドを 精製することにより得ることができる。 一例としては、 カゼィンを 1 0 O mMの トリス塩酸緩衝液 （ p H 8 . 5 ) 中でリシルェンドぺプチダーゼにより 3 5 で 3時間以上消化し、生成した部分べプチドを高速ク口マトグラフ法等により精製 することにより製造することができる。
本発明において使用することができるカゼィン又はカゼィンの部分ぺプチド の好ましい形態としては、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するヒト ?一力 ゼイン、 又は配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するペプチドを例示することができる。 また、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するウシ^—カゼィン、又は配列番号 2に 記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸 配列を有するペプチドも例示することができる。 なお、 配列表の配列番号 1に記 載のアミノ酸配列、 及び配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、 アミ ノ酸番号 1〜 1 5はシグナル配列である。
これらのカゼィン又はカゼィンの部分ぺプチドはシスティンプロテアーゼ阻 害活性を有するため、本発明のシスティンプロテアーゼ阻害剤に用いることがで きる。 また、 完全長のカゼインがシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有すること から、 配列表の配列番号 1のァミノ酸番号 1 3 3〜 1 5 1を含み、 N末端側もし くは C末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチド、 及び、 配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0を含み、 N末端側もし くは C末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するぺプチド も、 システィンプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。
これらのペプチドは、 例えば、 本発明によりシスティンプロテアーゼ阻害活性 領域が明らかになつたので、該領域を含むアミノ酸配列に基づいて化学合成によ つて得ることもでき、また遺伝子組換え技術等により得ることもできる。例えば、 該領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列をもとに適当なプライマ一を 作製し、該プライマ一を用いて目的の塩基配列を含む c D N Aを铸型として P C R等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現 させることにより得ることができる。
また、 通常遺伝子においては、 種、 属、 個体等の違いによって、 1又は複数個 の位置での 1又は複数個の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位等の変異が 存在し、 このような変異を有する遺伝子がコ一ドするタンパク質のアミノ酸にお いても変異が生じることがあるので、本発明に用いることができるカゼィン及び カゼィン部分べプチドにおいても、 システィンプロテアーゼ阻害活性が損なわれ ない範囲でこのような変異を含むことが可能である。本発明に用いることができ るカゼィン又はカゼィンの部分べプチドとしては、配列表の配列番号 1に記載の アミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 3 3〜1 5 1のアミノ酸配列を 有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又 は逆位を含み、 且つシスティンプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド、 並びに 配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち、 少なくともァミノ酸番号 1 4 2〜1 6 0のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の 置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含み、 且つシスティンプロテアーゼ阻害活 性を有するペプチドが例示される。 ここで、 複数とは、 配列表の配列番号 1に記 載のアミノ酸配列のうち、 アミノ酸番号 1 3 3〜1 5 1のアミノ酸、 及び、 配列 表の配列番号 2に記載のうち、 アミノ酸番号 1 4 2〜1 6 0のアミノ酸において、 ァミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、 例えば、 2から 5個、 好ましくは、 2から 3個である。
また、 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、 ァミノ酸番号 1 3 3 〜1 5 1のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸、 又は、 配列表の配列番号 2に記載の うち、 アミノ酸番号 1 4 2〜1 6 0のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸において 1 又は複数個の置換 ·欠失等を含むものであってもよい。 この場合の複数個とは、 ァミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、 例えば、 2から 1 0個、 好ましくは、 2から 5個である。
さらに、本発明に用いることができるカゼィン又はカゼィンの部分べプチドと しては、 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸 番号 1 3 3〜1 5 1のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチド、又は、 配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち、少なくともァミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはべプチドと、 アミノ酸配列におい て 8 0 %以上、 好ましくは 9 0 %以上、 より好ましくは 9 5 %以上の相同性を有 し、 システィンプロテア一ゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドも例示さ れ "3
前記のようなカゼィンタンパク質又はべプチドと実質的に同一のタンパク質 又はペプチドをコードする塩基配列は、 例えば部位特異的変異法によって、 特定 の部位のアミノ酸残基が置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むように塩基配 列を改変することによって得られる。 また、 改変された塩基配列は従来知られて いる変異処理によっても取得されうる。変異を有する塩基配列は適当な細胞で発 現させ、本発明の実施例に記載のシスティンプロテアーゼ阻害活性の測定法によ つてシスティンプロテア一ゼ阻害活性を調べることにより、 カゼィン又はべプチ ドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列が得られる。 本発明においては、 カゼインの加水分解物を用いることもできる。加水分解に 用いるカゼインは、 前述したようなものを挙げることができる。 これらのカゼィ ンを、 以下のように加水分解酵素で加水分解することによって、 カゼイン加水分 解物を得ることができる。
すなわち、 まず前記のような原料カゼインを水又は温湯に分散し、 溶解する。 該溶解液の濃度は格別の制限はないが、 通常、 蛋白質換算で 5〜15%前後の濃 度範囲にするのが効率性及び操作性の点から望ましい。得られた前記カゼィンを 含有する溶液を 70〜90°Cで 10分間〜 15秒間程度加熱殺菌することが、雑 菌汚染による変敗防止の点から望ましい。 次いで、 前記カゼインを含有する溶液 にアル力リ剤又は酸剤を添加し、 pHを使用する加水分解酵素の至適 pH又はそ の付近に調整することが好ましい。本発明の方法に使用するアルカリ剤又は酸剤 は、食品又は医薬品に許容されるものであれば如何なるアル力リ剤又は酸剤であ つてもよい。 具体的には、 アルカリ剤としては、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリ ゥム、 炭酸カリウム等を、 酸剤としては、 塩酸、 クェン酸、 リン酸、 酢酸等を例 示することができる。
次いで、 前記カゼイン溶液に加水分解酵素溶液を添加する。 加水分解酵素は蛋 白質を加水分解する酵素であれば特に制限されず、 動物由来、 又は微生物由来の 酵素であることが好ましい。 また、 酵素はエンドぺプチダ一ゼであることが好ま しい。 エンドべプチダ一ゼとしては、 パンクレアチン、 ペプシン、 トリプシン、 エラス夕ーゼ等、 種々の酵素を使用することができる。 尚、 「由来」 とは、 元来 上記の生物が保持していることを意味し、 採取原を意味するものではない。例え ば、 バチルス ·ズプチリスが産生するプロテア一ゼをコードする遺伝子をェシェ リヒア ·コリに導入し、 同遺伝子を発現させることにより製造したプロテア一ゼ は、 バチルス■ズブチリス 「由来」 である。
加水分解酵素はカゼイン 1 g当たり 20〜200活性単位（この単位について は後記する） の割合で添加することが好ましい。 ここで、 活性単位は、 例えば、 次の方法により測定することができる。 すなわち、 プロテア一ゼを含有する粉末 を 0. 2g/100mlの割合で 0. 1モルのリン酸緩衝液 （ p H 7. 0 ) に分 散又は溶解して酵素溶液を調製する。 一方、 ロイシルパラニトロァニリ ド （国産 化学社製。 以後 Leu— pNAと記載する） を 0. 1モルのリン酸緩衝液 （pH 7. 0)に溶解して 2 mMの基質溶液を調製する。 酵素溶液 lmlに基質溶液 1 mlを添加し、 37 °Cで 5分間反応させ、 その後 30%の酢酸溶液 2 mlを添加 して反応を停止させる。反応液をメンブランフィルターで濾過し、 波長 41 On mで濾液の吸光度を測定する。 プロテア一ゼの活性単位は、 1分間に l /mol の L e u _ p N Aを分解するのに必要な酵素量を 1活性単位と定義し、次式によ り求めることができる。 活性単位 （粉末 1 g当たり） = 2 O x (A/B )
ただし、 前記の式において A及び Bは、 それぞれ波長 4 1 O n mにおける試料の 吸光度及び 0 . 2 5 mMパラ二トロア二リンの吸光度を示す。
本発明において用いる加水分解酵素は 1種でもよく、 2種以上用いてもよい。 2種以上の酵素を用いる場合は、 それぞれの酵素反応は同時に行ってもよく、 別々に行ってもよい。
酵素を添加した溶液を、酵素の種類に応じて適当な温度、例えば 3 0〜6 0 °C、 望ましくは 4 5〜 5 5 °Cに保持してカゼィンの加水分解を開始する。加水分解反 応時間は、 酵素反応の分解率をモニターしながら、 好ましい分解率に達するまで 反応を続ける。尚、本発明において、カゼィン加水分解物の分解率は、 6〜4 5 % が特に好適である。 ここで、 カゼイン加水分解物の分解率が 6 %以上であると、 より分解が進んでいると考えられる。 すなわち、 分解率が 6 %未満であると、 酵 素反応を受けない未分解のカゼィンが残存している可能性が考えられることか ら、 分解率は 6 %以上が好ましい。
尚、 蛋白質の分解率の算出方法は、 例えば、 ケルダール法 （日本食品工業学会 編、 「食品分析法」、 第 1 0 2頁、 株式会社光琳、 昭和 5 9年） により試料の全窒 素量を測定し、 ホルモール滴定法 （満田他編、 「食品工学実験書」、 上巻、 第 5 4 7ページ、 養賢堂、 1 9 7 0年） により試料のホルモール態窒素量を測定し、 こ れらの測定値から分解率を次式により算出することができる。
分解率 （％) = (ホルモール態窒素量/全窒素量） X 1 0 0
加水分解反応の停止は、 加水分解液中の酵素の失活により行われ、 常法による 加熱失活処理により実施することができる。加熱失活処理の加熱温度と保持時間 は、 使用した酵素の熱安定性を考慮し、 十分に失活できる条件を適宜設定するこ とができるが、 例えば、 8 0〜1 3 0 °Cの温度範囲で 3 0分間〜 2秒間の保持時 間で行うことができる。 尚、 得られた反応液は必要に応じてクェン酸等の酸によ り p Hを 5 . 5〜7の範囲に調整しても良い。
本明細書において、 数平均分子量とは、 数平均分子量に関する文献（社団法人 高分子学会編、 「高分子科学の基礎」、 第 1 1 6乃至 1 1 9頁、 株式会社東京化学 同人、 1 9 7 8年） に記載されるとおり、 高分子化合物の分子量の平均値を次の とおり異なる指標に基づき示すものである。 即ち、 蛋白質加水分解物等の高分子 化合物は不均一な物質であり、 かつ分子量に分布があるため、 蛋白質加水分解物 の分子量は、 物理化学的に取り扱うためには、 平均分子量で示す必要があり、 数 平均分子量 （以下、 Mnと略記することがある。） は、 分子の個数についての平 均であり、 ペプチド鎖 iの分子量が Miであり、 その分子数を N iとすると、 次 の一般式 Iにより定義される。
[一般式 I ] oo CO
Mn ΣΜ Ν /ΣΝ
ί=1 尚、 本発明において数平均分子量を測定する場合は、 高速液体クロマトグラフ ィ一により分子量分布を測定し、検量線から GP C分析システムによりデータ解 析することにより、 数平均分子量を算出することができる。高速液体クロマトグ ラフィ一の具体的条件としては、 カラムとして、 ポリハイ ドロキシェチル ·ァス ノ、リレアミ ド ·カラム [P o 1 y Hydroxye thyl Aspart am i d e Co lumn ： ポリ 'エル ·シ一 （P o 1 y 〇） 社製。 4. 6 mmx 400mm] を使用し、 20mM塩化ナトリウム、 50mMギ酸により、 溶出速度 0. 5ml/分で溶出する条件を挙げることができる。検出は UV検出 器 （島津製作所。 215nm) を使用して分子量分布を測定し、 分子量が既知の サンプルにより検量線を作成し、 GPC分析システム （波長 215nm :島津製 作所社製） によりデータ解析し、 数平均分子量を求めることができる。
尚、 本発明において、 カゼィン加水分解物の数平均分子量は、 200〜500 0ダルトンが特に好適である。 ここで、 カゼイン加水分解物の数平均分子量が 5 000ダルトン以下である場合は、加水分解反応を受けない未分解のカゼィンは 含まれず、 本願発明の有効成分であるカゼィン加水分解物をより確実に得ること ができると考えられることから、数平均分子量は 5000ダルトン以下が好まし い。
得られたカゼィン加水分解物を含有する溶液は、 そのまま使用することも可能 であり、 また、 必要に応じて、 この溶液を公知の方法により濃縮した濃縮液、 更 に、この濃縮液を公知の方法により乾燥した粉末、として使用することもできる。 上記のようにして得られるカゼィン加水分解物は、 システィンプロテアーゼ阻 害作用を有する。 したがって、 システィンプロテアーゼ阻害作用を指標として、 カゼィン加水分解物を製造する際の条件は、 適宜設定することができる。
本発明のプロテアーゼ阻害剤においては、カゼィン、カゼィンの部分べプチド、 または加水分解物を単独で使用することも、 これらのうちの 2種以上を併用して 使用することも可能である。さらに、カゼィンの部分ぺプチド及び加水分解物は、 1種を単独で使用することも、 複数種を混合して用いることも可能である。 本発明に用いることができるカゼイン、 カゼインの部分ペプチド、 またはカゼ イン加水分解物は、 カテブシン B、 L及びパパイン等のシスティンプロテア一ゼ に対して阻害活性を有する。 システィンプロテアーゼ阻害活性は、 Barrett等の 方法 [メソヅド .イン ·ェンザィモロジ一 （Methods in Enzymology), 第 8 0卷、 第 5 3 5〜5 6 1ページ、 1 9 8 1年]に従って測定することができる。例えば、 0 . 1 酢酸緩衝液 11 5 . 5に溶解したカゼイン、 カゼインの部分ペプチド、 及び/または加水分解物を含む溶液に、基質として Z— P h e— A r g— M C A ( Benzyloxycarbonyl- L-Phenylalanyl- L-Arginine 4-Methyl- Coumaryl- 7 - Amide：最終濃度 2 O mM：ペプチド研究所社製） を添加し、 システィンプロ テアーゼ （本試験ではパパイン：シグマ社製） 溶液 （最終濃度： 1 5 u n i t s /m l ) を添加して混合し、 3 7 °Cで 1 0分間反応させた後、 消化を受けた基質 から遊離した AM C (7- Amino- 4-Methyl- Coumarin)の蛍光強度 （励起波長： 3 7 0 nm、 発光波長： 4 6 0 n m) を蛍光分光度計 （日立製作所社製） を用いて測 定することができる。 .
本発明のシスティンプロテア一ゼ阻害剤は、 カゼイン、 カゼインの部分べプチ ド、 及び/またはカゼイン加水分解物を使用し、 これらを公知の製剤学的に許容 される製剤担体と組合わせることにより製造することができる。本発明の製剤の 投与単位形態は特に限定されず、 治療目的に応じて適宜選択でき、 具体的には、 錠剤、 丸剤、 散剤、 液剤、 懸濁剤、 乳剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 シロップ剤、 坐 剤、 軟膏剤、 貼付剤等を例示できる。 製剤化にあたっては製剤担体として通常の 薬剤に汎用される賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 安定剤、 矯味矯臭剤、 希釈 剤、 界面活性剤、 注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
本発明の製剤中に含まれるカゼイン、 カゼインの部分ペプチド、 及び/または カゼィン加水分解物の量は特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれ も通常製剤中に 0 . 0 0 5〜8 0質量％、 好ましくは 0 . 0 5〜6 0質量％とす るのがよい。 本発明のシスティンプロテアーゼ阻害剤を経口的、又は非経口的に患者に投与 することにより、 システィンプロテァーゼが関与する疾患を治療することができ る。 ここで、 患者とは、 ヒトであってもよいし、 ヒト以外の哺乳動物であっても よい。 本発明の製剤の投与方法は特に限定されず、 各種製剤形態、 患者の年齢、 性別、 その他の条件、 患者の症状の程度等に応じて決定される。 本発明の製剤の 有効成分の投与量は、 用法、 患者の年齢、 性別、 疾患の程度、 その他の条件等に より適宜選択される。通常有効成分としてのカゼィン、カゼィンの部分ペプチド、 及び/またはカゼイン加水分解物の量は、 0 . 1〜 1 2 0 O m g/k g/日、 好 ましくは 1 0〜 5 0 O m g/k g/日の範囲となる量を目安とするのが良く、 1 日 1回又は複数回に分けて投与することができる。
本発明のシスティンプロテアーゼ阻害剤は、 システィンプロテア一ゼが関与す る疾患、 例えばアレルギー、 筋ジストロフィー、 筋萎縮症、 心筋梗塞、 脳卒中、 アルツハイマー病、 多発性硬化症、 白内障、 骨粗鬆症、 悪性腫瘍性高カルシウム 血症、 前立腺肥大症、 乳癌、 前立腺癌、 歯周病等の予防 ·治療剤、 若しくは癌細 胞の増殖や転移の抑制剤、 又は細菌 (スタフイロコヅカス 'ァゥレウス V 8等) やウィルス （ポリオウイルス、 ヘルぺスウィルス、 コロナウィルス、 エイズウイ ルス等） の増殖抑制剤として有用である。 本発明のシスティンプロテアーゼ阻害 斉 IJは、単独で使用しても良いが、公知の前記疾患の予防'治療剤、又は前記細菌 - ゥィルス増殖抑制剤と併用して使用することも可能である。併用することによつ て、 前記疾患の予防 ·治療効果、 又は前記細菌 ·ウィルス増殖抑制効果を高める ことができる。併用する公知の前記疾患の予防 ·治療剤、 又は前記細菌 ' ウィル ス増殖抑制剤は、 本発明の阻害剤中に有効成分として含有させても良いし、 本発 明の阻害剤中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて商品化して使用時 に組み合わせても良い。
本発明の飲食品組成物は、 食品又は飲料の原料にカゼイン、 カゼインの部分ぺ プチド、 及び/またはカゼイン加水分解物を添加して製造することができ、 経口 的に摂取することが可能である。 前記原料は、 通常の飲料や食品に用いられてい るものを使用することができる。 本発明の飲食品組成物は、 システィンプロテア —ゼ阻害剤を添加する以外は、 通常の飲食品組成物と同様にして調製することが できる。 飲食品組成物の形態としては、 清涼飲料、 炭酸飲料、 栄養飲料、 果汁飲 料、 乳酸菌飲料等の飲料 （これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；ァ イスクリーム、 シヤーべヅ ト、 かき氷等の氷菓；飴、 チューインガム、 キャンデ ィ一、 ガム、 チョコレート、錠菓、 スナック菓子、 ビスケヅ ト、 ゼリー、 ジャム、 クリーム、 焼き菓子等の菓子類：加工乳、 乳飲料、 発酵乳、 バタ一等の乳製品； パン；経腸栄養食、 流動食、 育児用ミルク、 スポーツ飲料；その他機能性食品等 が例示される。
本発明の飲食品組成物において、 カゼイン、 カゼインの部分ペプチド、 及び/ またはカゼィン加水分解物を添加する量は、飲食品組成物の形態によって適宜設 定されるが、 通常の食品又は飲料中 0 . 0 0 5〜8 0質量％、 好ましくは 0 . 0 5〜6 0質量％となるように添加すればよい。
本発明の飼料組成物は、 飼料にカゼイン、 カゼインの部分ペプチド、 及び/ま たはカゼィン加水分解物を添加して製造することができ、一般的な哺乳動物や家 畜類、 養魚類、 愛玩動物に経口的に投与することが可能である。 飼料組成物の形 態としては、 ぺットフード、 家畜飼料、 養魚飼料等が例示され、 穀類、 粕類、 糠 類、 魚粉、 骨粉、 油脂類、 脱脂粉乳、 ホエー、 鉱物質飼料、 酵母類等とともに混 合して本発明の飼料組成物を製造することができる。
本発明の飼料組成物において、 カゼイン、 カゼインの部分ペプチド、 及び/ま たはカゼィン加水分解物を添加する量は、飼料組成物の形態によって適宜設定さ れるが、通常の飼料中 0 . 0 0 5〜8 0質量％、好ましくは 0 . 0 5〜6 0質量％ となるように添加すればよい。
尚、 本発明の飲食品組成物又は飼料組成物は、 以下に示す疾患の予防用又は治 療用としての効能を表示した飲食品組成物又は飼料組成物とすることができる。 すなわち、 システィンプロテア一ゼが関与する疾患、 例えば、 骨粗鬆症、 悪性腫 瘍性高カルシウム血症、 乳癌、 前立腺癌、 歯周病、 又は細菌 ·ウィルス感染症の 予防用又は治療用であること、 を表示することができる。
ここに、 「表示」 とは、 前記効能を需要者に対して知らしめる行為を意味し、 例えば、 本発明の飲食品組成物又は飼料組成物の商品若しくは商品の包装 ·広告 等に前記効能を付する行為、 付したものを譲渡、 引き渡し、 展示等をする行為等 があるが、 特に特定保健用食品 〔健康増進法施行規則 （平成 1 5年 4月 3 0日、 日本国厚生労働省令第 8 6号） の第 1 2条第 1項第 5号参照〕 として表示する態 様が好ましい。 以下に、本発明のシスティンプロテア一ゼ阻害剤の有効成分として使用した力 ゼィンの部分べプチドまたはカゼィン加水分解物の製造例を示す。
[製造例 1 ]
配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、 アミノ酸番号 133〜15 1のアミノ酸配列を有するペプチドを、 以下の方法により製造した。
尚、 前記本発明のペプチドは、 自動アミノ酸合成装置 （アプライ ド 'バイオシ ステムズ社製。 Model 433A) を用いて合成を行い製造を行った。
20%ピぺリジン含有 N—メチルピロリ ドン （アプライ ド ·バイオシステムズ 社製。 以下、 N—メチルピロリ ドンを NMPと略記する） により、 ペプチド合成 用固相樹脂である HMP樹脂 （アプライ ド 'バイオシステムズ社製） のァミノ保 護基である Fmo c基を切断除去し、 NMPで洗浄した後、 Fmoc—スレオ ニン [具体的には、 合成するペプチドの C末端アミノ酸に相当する Fmoc—ァ ミノ酸 （アプライ ド ·バイオシステムズ社製）] を FastMoc (登録商標） リージェントキット（アプライ ド 'バイオシステムズ社製）を使用して縮合させ、 NMPで洗浄した。 次に、 前記 Fmoc基の切断、 続いて、 C末端から 2番目の アミノ酸に相当する Fmo c—ァラニンの縮合、 及び洗浄を行い、 さらに Fmo c—アミノ酸の縮合及び洗浄を繰り返し、 保護ペプチド樹脂を作製し、 樹脂より 粗製ペプチドを回収した。
前記粗製ペプチドから、 高速液体クロマトグラフィー （以下、 HPLCと略記 する。） によりペプチドの精製を行った。 使用するカラムは逆相系の C 18-0
D S (メルク社製。 LichrospherlOO) を例示することができる。 得られた精製ぺ プチドは HP LC分析を行い、 精製物が単一であることを更に確認した。 また、 精製ペプチドのアミノ酸配列を、 気相式自動アミノ酸シーケンサ— （アプライ ド 'バイオシステムズ社製。 Model 473A) を用いて決定した結果、 配列番号 1の アミノ酸番号 133〜151のアミノ酸配列を有していた。
尚、 同様の方法により配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、 アミノ酸番号 142〜160のアミノ酸配列を有するペプチドも製造した。
[製造例 2 ]
市販牛乳カゼイン 「ァラシッド」 （蛋白質含量 90%、 ニュージーランドミル クプロダクツ製） 100 gを 60°Cに加熱した精製水に 10%濃度に懸濁し、 2. 5 gの水酸化ナトリゥムを加えて完全に溶解した。 その後、 85°Cで 10分間の 殺菌を行い、 溶解液を 50°Cに調整した後、 加水分解酵素として、
ン （天野ェンザィム社製、 1 12, 00 OU/g) を 2500U添加し、 50°C で 4時閬保持することによって加水分解し、 90°Cで 10加熱処理して酵素を失 活した後、 凍結乾燥することによりカゼイン加水分解物約 100 gを得た。 得ら れたカゼィン加水分解物の分解率は 9. 5%、 数平均分子量は 910ダルトンで あった。
[製造例 3 ]
市販カゼインナトリウム 「ァラネート」 （蛋白質含量 90%、 ニュージ一ラン ドミルクプロダクツ製） 100 gを 50°Cに加熱した精製水に 12%濃度に溶解 した。 その後、 85°Cで 10分間の殺菌を行い、 溶解液を 40°Cに調整した後、 加水分解酵素として、 ブタトリブシン （PTN6. O S ;ノボザィム社製、 1, 250 U/g) を 250U添加し、 40°Cで 6時間保持することによって加水分 解し、 90°Cで 10分間加熱処理して酵素を失活した後、 凍結乾燥することによ りカゼィン加水分解物約 100 gを得た。得られたカゼィン加水分解物の分解率 は 10. 8 %、 数平均分子量は 750ダルトンであった。 次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
[試験例 1 ]
本試験は、 乳中のシスティンプロテア一ゼ阻害物質を検出するために行った。 ( 1 ) 検出法
本発明者はプロテア一ゼ阻害物質の検出法として 「逆ザィモグラフィー」 とい う手法を用い、 SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動のゲル上に存在するプロ テア一ゼ阻害物質の検出を行った。逆ザィモグラフィ一とは通常のザィモグラフ ィ一の逆の手法によるものであり、 基本的原理は次のとおりである。 即ち、 ゼラ チンを含む SDSポリアクリルアミ ドゲルにプロテア一ゼ阻害物質を含むサン プルをアプライし、電気泳動を行った後にゲルをプロテアーゼ溶液に浸漬してゲ ル中のタンパク質を分解する。 この操作により阻害物質が存在する部分はプロテ ァーゼの活性を阻害することから、 ゼラチンはプロテア一ゼによる分解を免れ、 これが染色液によって染色されることにより、 阻害物質を識別することが可能と なる。
( 2 ) 試験方法 本発明における逆ザィモグラフィ一の方法は以下のとおりである。
牛乳中の全タンパク質及び天然のゥシ カゼインをサンプルとし、 0. 1% ゼラチンを含む 12. 5%SDSポリアクリルアミドゲルを用いて、電気泳動（以 下、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を SD S— PAGEと略記すること がある。） を行った。 泳動後、 ゲルを 2. 5%Triton X- 100溶液に 45分間浸漬 して洗浄した後、更に 45分間蒸留水に浸漬する操作を 3回繰り返してゲルを洗 浄した。 このゲルを、 I mgパパイン （3 lunits/ l) を含む 0. 025M酢酸 緩衝液 （pH 5. 5) 1 00mlに浸潰し、 37 °Cで 10時間保温してゼラチン を消化した。 ゲルを蒸留水で洗浄後、 染色液 （ 0. 025 %クマシ一■プリリァ ント .ブルー （CBB) R— 250、 40%メタノール、 7%酢酸水溶液） で 1' 時間染色し、 その後脱色液 （40%メタノール、 10%酢酸水溶液） で脱色を行 つた。
これとは別に、 対照試験としてゼラチンを含まない 12. 5%SDSポリアク リルアミ ドゲルを用いて前記と同様に逆ザィモグラフィーを行った。 さらに、 通 常の 12. 5%SD S-P AGE (CBB染色） を行った。
( 3 ) 試験結果
本試験の結果は図 1に示すとおりである。図 1は逆ザィモグラフィ一のパター ンを示す結果である。図 1の 1レーンは牛乳中の全タンパク質の通常の SD S— PAGEのパターン、 2レーンは牛乳中の全タンパク質の逆ザィモグラフィ一の パターン、 3レーンは牛乳中の全夕ンパク質のゲルにゼラチンを含まない逆ザィ モグラフィー （対照） のパターン、 6レーンは天然のゥシ 一カゼインの逆ザィ モグラフィ一のパターン、 7レーンは天然のゥシ ?一力ゼィンのゲルにゼラチン を含まない逆ザィモグラフィ一 （対照） のパターンを各々示している。 尚、 図中 矢印は天然めゥシ'由来/?—カゼイン （分子量 35kDa) の SDS— PAGEに よる泳動位置を示している。 尚、 4レーン及び 5レーンは、 本試験例とは直接関 係がない。
図 1から明らかなとおり、 2レーンにおいてゥシ ?—カゼインの泳動位置 （3 5kDa) とほぼ同位置に逆ザィモグラフィ一のポジティブなバンドが確認され た。 このことより、 牛乳中にシスティンプロテアーゼ阻害活性を有する物質の存 在が確認された。 また、 6レーンにおいて天然のゥシ ?一カゼインを泳動したパ パインを用いた逆ザィモグラフィ一において、 ポジティブなバンドが確認された 以上の結果から、 ゥシ由来の^—カゼィンにシスティンプロテア一ゼ阻害活性 を有することが示唆された。
[試験例 2 ]
本試験は、試験例 1においてシスティンプロテアーゼ阻害活性が示唆された 3 5 kD aのバンドについて N末端アミノ酸配列を決定するために行った。
( 1 ) 試験方法
試験例 1で使用した牛乳中の全夕ンパク質サンプルを同様に使用して S D S — PAGEを行った後、ポリビニリデンジフルオラィ ド（PVDF)膜に転写し、 P V D F膜を C B Bで染色後、 35 k D a付近に泳動された染色バンドを切り出 した。 このバンドについて、 ヒューレットパッカード社製 G 1005 Aプロティ ンシーケンシングシステムを用いて N末端アミノ酸配列を決定した。
( 2 ) 試験結果
本試験の結果は図 2に示すとおりである。図 2は牛乳中の 35 k D a染色バン ドのアミノ酸配列を決定した結果である。 その結果、 35 kD a染色バンドの N 末端アミノ酸配列はゥシ 5—カゼインのそれと完全に一致した。従って、 本試験 の結果と試験例 1の結果の両者から、 ゥシ ?一カゼインはシスティンプロテア一 ゼ阻害活性を有することが明らかとなった。
[試験例 3]
本試験は、 カゼィン分子中におけるシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有する 領域を検索するために行った。
( 1 ) 試験方法
ゥシ ?—カゼイン 250 /gを、 10 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH8. 5) に溶解し、 リシルェンドぺプチダ一ゼにより 35°Cで 16時間消化した。 消化後 のゥシ ?—カゼインペプチド混合物にシスティンプロテア一ゼ阻害活性が保持 されているかどうかを確認するために、 システィンブロア一ゼ阻害活性を測定し た。
阻害活性の測定方法は Barrett等の方法 [メソッド 'イン 'ェンザィモロジ一 (Methods in Enzyraology), 第 80巻、 第 535〜 561ページ、 1981年] を参考にして、 次のとおり行った。 即ち、 0. 1M酢酸緩衝液 pH5. 5に溶解 したゥシ ?一カゼインペプチド混合物溶液に、 基質として Z- Phe- Arg- MCA (最終 濃度 2 O mM：ペプチド研究所社製） を添加し、 システィンプロテアーゼ （本試 験ではパパイン：シグマ社製） 溶液 （最終濃度： 1 5 units/il) を添加して混合 し、 3 7 °〇で 1 0分間反応させた後、 消化を受けた基質から遊離した AMCの蛍光 強度 （励起波長： 3 7 0 nm、 発光波長： 4 6 0 n m) を蛍光分光度計 （日立社 製） を用いて測定した。
測定の結果、 ゥシ ?一力ゼィンぺプチド混合物に阻害活性が保持されているこ とが確認されたので、 引き続きペプチド混合物について、 TSK Gel DDS- 80Tsカラ ム （東ソ一社製） を用いた逆相 H P L Cによるァセトニトリル直線濃度勾配溶出 法によって、主要なピークを分離した。次に、分離したピークのサンプル（以下、 ペプチドサンプルと記載する。） の各々について、 前記と同様の方法でシスティ ンプロテアーゼ阻害活性を測定した。
ぺプチドサンプルの阻害活性測定の結果、活性を有するぺプチドサンプルにつ いて、 ヒュ一レヅ トパヅカード社製 G 1 0 0 5 Aプロティンシーケンシングシス テムを用いてそのアミノ酸配列を決定した。
( 2 ) 試験結果
本試験の結果は図 2に示すとおりである。 その結果、 阻害活性を有する主要な ぺプチドサンプルは、 図 2中のゥシ ?—カゼィンのアミソ酸配列における 1 4 2 残基目 Leuから 1 6 0残基目 Hisまでのアミノ酸配列 （下線部：以下、 該配列の ペプチドをゥシ ?—カゼィンぺプチドと記載する。） を有することが判明した。
[試験例 4 ]
本試験は、 カゼィン類のシスティンプロテアーゼに対する阻害効果を測定する ために行った。 '
( 1 ) 試験方法
試験試料として、 ゥシ ?一カゼイン、 ゥシひ一カゼイン、 及びゥシ 一力ゼィ ンを各々用いて、 試験例 3に記載のシスティンプロテア一ゼ阻害活性測定方法と 同様の方法により前記試験試料のシスティンプロテアーゼ阻害活性を測定した。 ( 2 ) 試験結果
本試験の結果は、 図 3に示すとおりである。 図 3は、 ゥシ 一カゼイン、 ゥシ ひ一カゼィン、及びゥシ Λ:—カゼィンのパパインに対するシスティンプロテア一 ゼ阻害効果を示す。 その結果、 一カゼイン及び 一カゼインは 1 0—5Mの濃度 でパパインを完全に阻害し、 ひ一カゼィンについても若干弱いながらも 1 0— 4M でパパインの活性をほぼ阻害することが判明した。従って、 ^—カゼインだけで なく、 一カゼィンやひ一力ゼィンについてシスティンプロテァーゼ阻害活性を 有することが明らかとなった。
[試験例 5 ]
本試験は、 ゥシ ?一カゼインのシスティンプロテアーゼ阻害活性スぺクトルを 測定するために行った。
( 1 ) 試験方法
試験試料としてゥシ カゼイン、 システィンプロテア一ゼとしてパパイン、 カテブシン B、 及び力テプシン Lを使用して、 試験例 3に記載のシスティンプロ テアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により、試験試料のシスティンプロテア —ゼ阻害活性スベクトルを測定した。
( 2 ) 試験結果
本試験の結果は図 4に示すとおりである。 図 4は、 パパイン、 カテブシン B、 及び力テプシン Lに対するウシ^一力ゼィンの阻害効果を測定した結果である。 その結果、 ゥシ ?—カゼインが 1 0—5Mでパパインを完全に阻害することが判明 した。 またカテブシン B及びカテブシン Lについてもゥシ ?—カゼインが 1 CT4 Mでそれらのプロテアーゼ活性をほぼ阻害することが判明した。 従って、 ゥシ ? 一力ゼィンはパパイン、 カテブシン B、 及びカテプシン Lのプロテア一ゼ活性を 阻害し、 幅広いシスティンプロテア一ゼ阻害活性スぺクトルを有することが明ら かとなつた。
[試験例 6 ]
本試験は、 ヒト ? _カゼインのシスティンプロテア一ゼに対する阻害効果を測 定するために行った。
( 1 ) 試験方法
常法に従って精製したヒト 5—カゼイン （例えば、 ジャーナル ·ォブ 'ディリ 一 -サイエンス [J. Daily Sci. j 第 5 3卷、 第 2号、 第 1 3 6〜1 4 5ページ、 1 9 7 0年、 に記載の方法によって精製)、 及び実施例 1で合成した配列表の配 列番号 1に記載のアミノ酸配列 （ヒト ?—カゼインのアミノ酸配列） のうち、 ァ ミノ酸番号 133〜151のアミノ酸配列を有するペプチド （図 5中、 ヒト ?一 カゼィンの下線部べプチド：以下、 該配列のぺプチドをヒト^—カゼィンぺプチ ドと記載する。） を各々試験試料として、 試験例 3に記載のシスティンプロテア ーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により、試験試料のシスティンプロテア一ゼ 阻害活性を測定した。
( 2 ) 試験結果
本試験の結果、 ヒト ?—カゼィンは 10— 5Mでパパインのプロテア一ゼ活性を ほぼ完全に阻害することが判明した。 また、 ヒト ?一カゼインペプチドは、 10 —5Mでパパインのプロテア一ゼ活性を 65%阻害し、 10— 4Mでパパインのプロテ ァ一ゼ活性を完全に阻害することが判明した。
[試験例 7]
本試験は、 カゼィン加水分解物のシスティンプロテアーゼに対する阻害効果を 測定するために行った。
( 1 ) 試料の調製
加水分解物としてパンクレアチンをそれそれ 2000、 8000、 及び 900 0ユニット （units) 添加して製造したこと以外は、 製造例 2と同一の方法によ り製造したカゼィン加水分解物を試験試料 1、試験試料 2及び試験試料 3とした c 尚、試験試料 1、試験試料 2及び試験試料 3の分解率（％)は、 それぞれ 8. 2、 33. 5及び 38. 0であった。 また、 試験試料 1、 試験試料 2及び試験試料 3 の数平均分子量（ダルトン）は、それぞれ 1020、 250及び 210であった。
( 2 ) 試験方法
0. 1M酢酸緩衝液 pH5. 5に溶解した試験試料溶液に、 基質として Z— P he-Ar g-MCA (最終濃度 20 mM：ペプチド研究所社製） を添加し、 シ スティンプロテア一ゼであるパパイン溶液 （最終濃度 15uni t s/ml) を 添加して混合し、 37°Cで 10分間反応させた後、 消化を受けた基質から遊離し た AM Cの蛍光強度 （励起波長： 370 nm、 発光波長： 460 nm) を蛍光分 光度計 （日立製作所社製） を用いて測定した。
( 3 ) 試験結果
本試験の結果は、 表 1に示すとおりである。 表 1は、 各試験試料のシスティン プロテア一ゼ阻害活性を示す。 その結果、 試験試料 1は、 0. lmg/mlの濃 度でパパインによるシスティンプロテア一ゼ活性を 39%阻害し、 0. 2mg/ mlの濃度では 61%阻害した。 試験試料 2は、 0. 2mg/mlの濃度でパパ インによるシスティンプロテア一ゼ活性を 76%阻害し、 0. 05mg/mlの 濃度においても 50%阻害した。 試験試料 3は、 0. 2mgノ mlの濃度でパパ インによるシスティンプロテア一ゼ活性を 53%阻害し、 0. lmg/mlの濃 度で 44% 0. 05mg/mlの濃度においても 37%阻害した。
【表 1】
-a7- Sに一おける阻害率 （％) δ¾料 分解率（％) 数平均分子量 0.2 0.1 0.05
(ダルトン） (mg/il) (mg/ml) (mg/ml) Si験試料 1 8.2 1020 61 39 8
§式験 §i料 2 33.5 250 76 64 50 試験 a ^料 3 38.0 210 53 44 37 実施例
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。 尚、 本発明は以下の実施 例に限定されるものではない。
[実施例 1 ]
(ゥシ ?一カゼインを配合した錠剤の調製）
次の組成からなる錠剤のシスティンプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製 造した。
ゥシ 一カゼイン （シグマ社製） 40. 0 (%) 乳糖 （森永乳業社製） 18. 5 トウモロコシ澱粉 （日清製粉社製） 30. 7 ステアリン酸マグネシウム （太平化学産業社製） 1. 4 カルボキシメチルセルロースカルシウム （五徳薬品社製） 9. 4 ゥシ カゼイン、 乳糖、 トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロース カルシウムの混合物に、 滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、 50°Cで 3時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシゥムを添加して混合し、 常法により打錠し、 旋剤を得た。 [実施例 2 ]
(カプセル入りゥシ ?—カゼインの調製）
乳糖 （和光純薬工業社製） 600 g、 トウモロコシデンプン （日清製粉社製） 400 g、 結晶セルロース （和光純薬工業社製） 400 g及びゥシ ーカゼィン (シグマ社製） 600 gを、 50メッシュ篩（ャマト科学社製）により篩分けし、 厚さ 0. 5 mmのポリエチレン製の袋にとり、 転倒混合し、 全自動カプセル充填 機 （Cesere Pedini社製。 プレス式） を用い、 前記粉末をカプセル （日本エラン コ社製。 1号ゼラチンカプセル、 Op.Yellow No.6 Body、 空重量は 75mg) に 内容量 275 mgで充填し、 ゥシ 一カゼイン 82mg入りのカプセル剤 7, 0 00個を得た。
[実施例 3]
(ゥシ ?—カゼインを添加した飲料の調製）
脱脂粉乳（森永乳業社製） 90 gを 50 °Cの温湯 800mlに溶解し、砂糖（日 新製糖社製） 30 g、 インスタントコーヒー粉末 （ネスレ社製） 14 g、 カラメ ル（昭和化工社製） 2 g、及びコ一ヒ一フレーバー（三栄化学社製） 0. 01 g、 を攪拌しながら順次添加して溶解し、 10°Cに冷却し、 ゥシ ?—カゼイン （シグ マ社製） l gを添加し、 ゥシ ?一カゼイン約 0. 1%を含むシスティンプロテア ーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
[実施例 4]
(ゥシ ?—カゼインを添加した経腸栄養食粉末の調製）
ホエー蛋白酵素分解物 （森永乳業社製） 10. 8kg、 デキストリン （昭和産 業社製） 36 k g、 及び少量の水溶性ビ夕ミンとミネラルを水 200 k gに溶解 し、 水相をタンク内に調製した。 これとは別に、 大豆サラダ油 （太陽油脂社製） 3kg, パーム油 （太陽油脂社製） 8. 5kg, サフラワー油 （太陽油脂社製） 2. 5kg, レシチン （味の素社製） 0. 2kg、 脂肪酸モノグリセリ ド （花王 社製） 0. 2kg、 及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、 油相を調製した。 タンク内の水相に油相を添加し、 攪拌して混合した後、 70°Cにカロ温し、 更にホ モゲナイザーにより 14. 7 MP aの圧力で均質化した。 次いで、 90°Cで 10 分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約 59 k gを調製した。 この中間製品粉末 5 Okgに、 蔗糖 (ホクレン社製) 6. 8k , アミノ酸混合 粉末 （味の素社製） 167 g、 及びゥシ 5—カゼィン （シグマ社製） 60 gを添 加し、 均一に混合して、 ゥシ ?一カゼインを含有するシスティンプロテア一ゼ阻 害効果を有する経腸栄養食粉末約 57 kgを製造した。
[実施例 5]
(ゥシカゼィン加水分解物を配合した錠剤の調製）
次の組成からなる錠剤のシスティンプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製 し/し
製造例 2で製造したカゼイン加水分解物 40. 0 (%) 乳糖 （森永乳業社製） 18. 5 トウモロコシ澱粉 （日清製粉社製） 30. 7 ステアリン酸マグネシウム （太平化学産業社製） 1. 4 カルボキシメチルセルロースカルシウム （五徳薬品社製） 9. 4 ゥシカゼイン加水分解物、 乳糖、 トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセル ロースカルシウムの混合物に、 滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、 5 0 °Cで 3時間乾燥させ、 得られた乾燥物にステアリン酸マグネシゥムを添加して 混合し、 常法により打錠し、 錠剤を得た。
[実施例 6 ]
(ゥシカゼィン加水分解物を添加した飲料の調製）
脱脂粉乳（森永乳業社製） 90 gを 50 °Cの温湯 800mlに溶解し、砂糖（日 新製糖社製） 3 0 g インスタントコ一ヒー粉末 （ネスレ社製） 14 g、 カラメ ル（昭和化工社製） 2 g、及びコーヒーフレーバー（三栄化学社製） 0. 0 1 g、 を攪抻しながら順次添加して溶解し、 10°Cに冷却し、 製造例 2で製造したゥシ カゼイン加水分解物 1 gを添加し、 ゥシカゼイン加水分解物約 0. 1%を含むシ スティンプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
[実施例 7 ] (ゥシカゼィン加水分解物を添加した経腸栄養食粉末の調製）
ホエー蛋白酵素分解物 (森永乳業社製) 10. 8kg、 デキストリン （昭和産 業社製） 36kg、 及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水 20 Okgに溶解 し、 水相をタンク内に調製した。 これとは別に、 大豆サラダ油 （太陽油脂社製） 3k s パ一ム油 （太陽油脂社製） 8. 5kg、 サフラワー油 （太陽油脂社製） 2. 5kg、 レシチン （味の素社製） 0. 2kg、 脂肪酸モノグリセリ ド （花王 社製） 0. 2kg、 及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、 油相を調製した。 タンク内の水相に油相を添加し、 攪拌して混合した後、 70°Cにカロ温し、 更にホ モゲナイザ一により 14. 7 MP aの圧力で均質化した。 次いで、 90°Cで 10 分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約 59 k gを調製した。 この中間製品粉末 5 Okgに、 蔗糖 （ホクレン社製） 6. 8kg, アミノ酸混合 粉末 （味の素社製） 167 g、 及び製造例 2で製造したゥシカゼイン加水分解物 60gを添加し、 均一に混合して、 ゥシカゼイン加水分解物を含有するシスティ ンプロテアーゼ阻害効果を有する経腸栄養食粉末約 57kgを製造した。 産業上の利用の可能性
以上詳記したとおり、 本発明はカゼイン、 カゼインの部分ペプチド、 及び/又 はカゼィン加水分解物を有効成分とするシスティンプロテアーゼ阻害剤に関す るものであり、 本発明により奏される効果は次のとおりである。
(1)食品素材として利用することができるタンパク質、 その部分ペプチド及び /又はその加水分解物であるので、 安全性に優れ、 日常的に長期間投与又は摂取 が可能である。
(2) 幅広いシスティンプロテアーゼに対して阻害活性スぺクトルを有する。
(3)システィンプロテア一ゼが関与する疾患の予防'治療剤として使用するこ とが可能である。
(4)特定保健用食品、 栄養補助食品を含む機能性食品等の製造等の用途に利用 することが可能である。
( 5 )食品加工分野における食品の物性調節剤として利用することが可能である c

Claims

請求の範囲
1 . カゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシスティン プロテアーゼ阻害剤。
2 . カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はゥシ由来である請求項 1に 記載のシスティンプロテア一ゼ阻害剤。
3 . 以下の （A) 又は （B ) に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効 成分として含有するシスティンプロテア一ゼ阻害剤。
( A) 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するぺプチド。
( B ) 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列のうち、 少なくともァミノ酸番 号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミ ノ酸の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含み、 且つシスティンプロテアーゼ 阻害活性を有するペプチド。
4 . 以下の （C ) 又は （D ) に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効 成分として含むシスティンプロテアーゼ阻害剤。
( C )配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するぺプチド。
( D ) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するぺプチドであって、 1又は複数のアミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含み、 且つシスティンプロテアーゼ 阻害活性を有するペプチド。
5 . カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、 かつ、 システィンプロテアーゼ阻害作用を有するカゼィン加水分解物を有効成分 として含有するシスティンプロテアーゼ阻害剤。
6 . 前記加水分解酵素が、 動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択さ れる 1種又は複数種である請求項 5に記載のシス インプロテアーゼ阻害剤。
7 . 前記カゼィン加水分解物の分解率が 6 ~ 4 5 %である請求項 5又は 6 に記載のシスティンプロテアーゼ阻害剤。
8 . 前記カゼィン加水分解物の数平均分子量が 2 0 0〜 5 0 0 0ダルトン である請求項 5〜請求項 7のいずれか一項に記載のシスティンプロテアーゼ阻 害剤。
9 . カゼイン加水分解物を全量に対して 0 . 0 0 5質量％以上含有する、 請求項 5〜請求項 8のいずれか一項に記載のシスティンプロテア一ゼ阻害剤。
1 0 . システィンプロテアーゼが関与する疾患の予防 ·治療剤である請求 項 1〜請求項 9のいずれか一項に記載のシスティンプロテア一ゼ阻害剤。
1 1 . システィンプロテア一ゼが関与する疾患が、 骨粗鬆症、 悪性腫瘍性 高カルシウム血症、 乳癌、 前立腺癌、 歯周病、 又は細菌 ·ウィルス感染症である 請求項 1 0に記載のシスティンプロテアーゼ阻害剤。
1 2 . 請求項 1〜請求項 1 1のいずれか一項に記載のシスティンプロテア ーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
1 3 .請求項 1〜 1 1のいずれか一項に記載のシスティンプロテア一ゼ阻害 剤を患者に投与することを特徴とする、 システィンプロテアーゼが関与する疾患 の治療方法。 .
1 4 . カゼィン又はその部分ぺプチドの、 システィンプロテア一ゼ阻害剤 の製造のための使用。
1 5 . カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はゥシ由来である、 請求項 1 4に記載の使用。
1 6 . 以下の （A) 又は （B ) に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、 システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。
(A) 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するペプチド。
( B )配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するぺプチドであって、 1又は複数のアミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含み、 且つシスティンプロテア一ゼ 阻害活性を有するペプチド。
1 7 . 以下の （C ) 又は （D ) に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、 システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。
( C ) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するペプチド。
(D ) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、 少なくともアミノ酸番 号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含み、 且つシスティンプロテア一ゼ 阻害活性を有するペプチド。
1 8 . カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることがで き、 かつ、 システィンプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物の、 シ スティンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。
1 9 . 前記加水分解酵素が、 動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択 される 1種又は複数種である請求項 1 8に記載の使用。
2 0 . 前記カゼイン加水分解物の分解率が 6〜4 5 %である請求項 1 8又 は 1 9に記載の使用。
2 1 . 前記カゼィン加水分解物の数平均分子量が 2 0 0〜 5 0 0 0ダルト ンである請求項 1 8〜請求項 2 0のいずれか一項に記載の使用。
2 2 . カゼィン加水分解物をシスティンプロテアーゼ阻害剤の全量に対し て 0 . 0 0 5質量％以上含有させることを特徴とする、 請求項 1 8〜請求項 2 1 のいずれか一項に記載の使用。
2 3 . システィンプロテア一ゼ阻害剤が、 システィンプロテア一ゼが関与 する疾患の予防.治療剤である、 請求項 1 4〜請求項 2 2のいずれか一項に記載 の使用。
2 4 . システィンプロテアーゼが関与する疾患が、 骨粗鬆症、 悪性腫瘍性 高カルシウム血症、 乳癌、 前立腺癌、 歯周病、 又は細菌 · ウィルス感染症である 請求項 2 3に記載の使用。
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