WO2005030244A1 - 骨形成促進及び／又は骨吸収抑制剤 - Google Patents

骨形成促進及び／又は骨吸収抑制剤 Download PDF

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WO2005030244A1
WO2005030244A1 PCT/JP2004/014761 JP2004014761W WO2005030244A1 WO 2005030244 A1 WO2005030244 A1 WO 2005030244A1 JP 2004014761 W JP2004014761 W JP 2004014761W WO 2005030244 A1 WO2005030244 A1 WO 2005030244A1
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bone resorption
component
bone
promoting
thrombin
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PCT/JP2004/014761
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Yoshikazu Morita
Atsushi Serizawa
Hiroaki Matsuyama
Mutsumi Motouri
Hiroshi Kawakami
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Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
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    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis

Definitions

  • the present invention relates to ( 2) microglobulin, histone, third component of capturer, monocyte chemoattractant protein 1, lysozyme, liponuclease, prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, capture
  • the present invention relates to a bone formation promoting and / or bone resorption inhibitor comprising as an active ingredient at least one of the fourth component of the body, ⁇ -defensin, and one or more of these enantiomers.
  • the present invention relates to the following: ( 2) microglobulin, histone, third component of tachibana, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, liponuclease, prothrombin, cytochrome P_450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, complement A bone formation promoting and / or bone resorption inhibitor containing a fourth component of the body, e-defensin, and any one or more of these enzymatic degradation products, and food and drink for promoting bone formation and inhibiting Z or bone resorption Products, medicines or feed.
  • methods for preventing uncoupling and preventing or treating various bone diseases include (1) dietary calcium supplementation, (2) light exercise, (3) sunbathing, and (4) drug treatment.
  • Calcium salts such as calcium carbonate and calcium phosphate, and natural calcium agents such as eggshell and fish bone meal are used for calcium supplementation by diet.
  • Light exercise is said to be good for jogging and walking, but if you are weak, light exercise is troublesome, and bedridden elderly people can hardly exercise.
  • sunbathing is good at capturing active vitamin D3, this alone is not sufficient.
  • 1 ⁇ -hydroxyvitamin D3 and calcitonin preparations are used, and it is known that they are effective for treating osteoporosis.
  • these substances are medicines themselves and cannot be used as food materials.
  • Osteoclasts are cells generated from hematopoietic stem cells and located on the surface of cancellous bone, and lyse bone. Osteoblasts are cells that are present on the surface of osteophytes and actively play a central role in bone formation, which is actively synthesizing bone matrix proteins such as collagen. Calcium phosphate and hydroxyapatite crystals deposit on this bone matrix protein (calcification), and hard bone tissue is formed.
  • osteoclasts dissolve bone matrix (bone resorption), and osteoblasts synthesize bone matrix (bone formation), bone formation, growth (modeling), and metabolism (remodeling) occur. It is considered.
  • the present inventors have continued to search for a bone formation promoting factor and a bone absorption suppressing factor present in whey protein in order to obtain a substance having a bone formation promoting action and a bone resorption suppressing action that can be used as a food material. Have been. As a result, it has been found that a protein and peptide mixture obtained by removing a whey-derived salt from a water-soluble fraction of whey protein by a treatment such as a reverse osmosis membrane or electrodialysis has a bone strengthening effect (Japanese Patent Laid-Open No. -183371).
  • the fraction obtained by treating the aqueous solution of the protein and peptide mixture with ethanol, heating, salting, and ultrafiltration membrane had an osteoblast proliferation promoting action and a bone strengthening action (for example, And JP-A-5-176715 and JP-A-5-320066).
  • a basic protein present only in a trace amount in milk has an osteoblast proliferation promoting action, a bone strengthening action and a bone resorption inhibiting action (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-151331).
  • the present inventors have further advanced the search attempts to separation and purification of the active body with bone formation promoting and inhibiting bone resorption, was identified the material is a known substance, beta 2 Miku B globulin, histones, capturing Third component of the body, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, We found that liponuclease, prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, and their enzymatic degradation products markedly inhibit bone resorption by osteoclasts.
  • prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, and their enzymatic degradation products significantly suppress bone resorption by osteoclasts and promote osteoblast proliferation. It was found that bone formation was promoted.
  • Microglobulin ( ⁇ 2-microglobulin) is a protein / protein having a molecular weight of about 11.6 kDa, and is a constituent component of the major thread and tissue compatible complex (MHC). It is known to be widely distributed in systemic tissues including blood, and in humans, it has been reported that it is also present in milk. 3) Regarding the effect of 2 microglobulin on bone, it has been reported that a high turnover type osteoporosis increases the blood 2 microglobulin concentration as a marker for bone metabolism (Jiy'em Qesada (JM).
  • JM Jiy'em Qesada
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • DNA that controls genetic information is said to have a length of about 2 m in linear distance, but it is an essential protein for efficiently storing the DNA in the cell nucleus. . That is, DNA is functionally folded around histones. Usually, it consists of five molecular species, Hl, H2A, H2B, H3, and H4, and each of two molecules of H2A, H2B, H3, and H4 forms one aggregate with eight molecules in total. DNA wraps around the aggregate to form a unit called chromatin. HI is responsible for bonding chromatin to each other. Thus, histone and DNA are always a set, and are present in the nucleus at a ratio of about 1: 1 by weight.
  • nucleic acid may be the sixth essential nutrient.
  • Nucleic acid may be the sixth essential nutrient.
  • histone is a protein that is inevitably consumed regardless of the type of animal.
  • a cell-free diet that uses purified, cell nucleus-free food ingredients such as white rice, wheat flour, and sugar! 3 ⁇ 4 is very often consumed. If only the effect of histones on inhibiting bone resorption is to be expected, it is advisable to incorporate a large amount of food ingredients such as liver and milt, which are cell clumps, into the diet. large.
  • a complement component is an enzyme-like substance that is present in serum, is activated by reacting with an antigen-antibody complex, and exerts a physiological activity while causing a complex reaction.
  • C1 force, and C9 are known.
  • Complement component 3 fi C3, which is called the third component of complement, and has a high content among all trapping components. Its structure is a glycoprotein in which an ⁇ -chain with a molecular weight of 150,000 and a / 3 chain with a molecular weight of 750,000 are cross-linked by two SS bonds.
  • the C3 with a molecular weight of 180,000 can be converted into C3a with a molecular weight of 9,000 formed by partial decomposition of the ⁇ chain by C3 convertase and C3b with a molecular weight of 170,000 containing two SS bonds.
  • C3a is known as one of the representative anaphylatoxins that induces an inflammatory response, such as stimulating mast cells to promote histamine release.
  • C3b is further degraded by C3 convertase, and a part of it is covalently bound to the antigen-antibody complex.
  • Phagocytic cells such as macrophages in blood have C3b receptor on the cell surface. As a result, this reaction enhances the phagocytosis of foreign substances by phagocytes.
  • the third component (C3) is a substance that is deeply involved in the immune response.
  • embryos and fetuses and a nutritional factor composition for tissue culture and a composition for treating infertility thereof, which contain the third component as an active ingredient have been disclosed (JP-A-10-033164). It has been clarified by the present invention that the third component of complement complements osteoclasts, which have the function of degrading bone tissue, which is a self-organization, on the contrary.
  • Monocyte chemoattractant protein-1 (Monocyte chemotactic protein-1 or Monocyte chemoattractant protein-1 or MCP-1) is a monocyte, vascular endothelium, or a cell line produced by a glioma cell line, etc. It is a chemotactic factor.
  • TES regulated on activation, normal T cell expressed and secreted
  • it is one of the representative C-C chemokine families and has a molecular weight of 8,000 to 18,000, 76 amino acids. It is mainly chemotactic for monocytes and has no effect on neutrophils / lymphocytes.
  • Lysozyme is an enzyme that hydrolyzes the j3-l ⁇ 4 bond between N-acetyl muramic acid and N-acetyl darcosamine, which is present in mucopeptides of bacterial cell walls, etc., and is widely distributed in the animal and plant kingdoms. I have. They are divided into four groups according to their substrate specificity and molecular weight.
  • Ribonuclease is a general term for enzymes that act on ribonucleic acid (RNA), a type of nucleic acid, to produce mononucleotides or oligonucleotides.
  • Prothrombin is a protein with a molecular weight of about 7.2 kDa and is also called blood coagulation ⁇ factor. It is one of the vitamin K-dependent blood coagulation factors, and is accelerated to thrombin by factor X in the presence of vitamin K. The resulting thrombin breaks down fibrinogen into fibrin and the blood is coagulated by the cross-linking of fibrin.
  • Prothrombin is known to be widely distributed in systemic tissues, including blood, and has been reported to be present in milk in humans. Thrombin is obtained by digesting prothrombin with an enzyme such as factor X as described above.
  • Cytochrome P-450 is a collective term for a group of protoheme proteins that bind to carbon monoxide in a reduced form and exhibit a Soret absorption band near 450 nm. Functionally, it synthesizes various steroid hormones, bile acids, and prostanoids, oxidizes fatty acids, activates vitamins!), Countless foreign drugs and environmental pollutants taken into the body. It is involved in the acid-riding detoxification reaction.
  • Plasminogen is a precursor of plasmin and is present in animal plasma.
  • the plasminogen activator cleaves the Arg-Val bond in the molecule to form active plasmin. It is a single-chain glycoprotein with a molecular weight of about 91,000, and the N-terminal peptide is cleaved by a protease such as plasmin to produce a molecular weight of about 91,000.
  • Plasmin is obtained by decomposing plasminogen with an enzyme such as plasminogen activator.
  • Transferrin is a protein with a molecular weight of about 75,000 that binds to transport iron in the blood, and is also called iron-binding globulin. Immature erythrocytes have a receptor for iron bound to transferrin, and serum iron must be bound to transferrin in order to be used for hemoglobin synthesis. As for transferrin, it is disclosed that a membrane-bound transferrin-like protein promotes the formation of chondrocytes, but it promotes the formation of chondrocytes, and its mechanism is completely different from that of bone formation. And the republished patent W001 / 013951).
  • Complement component C4 is an enzyme-like substance that is present in serum, is activated by reacting with the antigen-antibody complex, and exerts a physiological activity while causing a complex reaction.
  • the fourth component of complement itself has no specificity for the antigen, but is activated by the antigen-antibody complex to enhance phagocytosis and destroy cells and bacteria to which the specific antibody is bound.
  • the fourth component of the capturer is a protein with a molecular weight of 210 kDa consisting of three types of polypeptide chains, ie, a heavy chain, three chains, and a ⁇ chain. It was not known that the fourth component of complement promotes osteoblastic differentiation.
  • Defensin is known as a strong basic antimicrobial peptide having three S—S bonds in the molecule. It has 4 to 10 arginine residues and 6 cysteine residues. It is a basic protein consisting of 34 amino acids. Due to differences in the location of cysteine residues, they can be broadly classified into ⁇ -type and i3 type. Gram-positive bacteria and It has not only antibacterial activity against gram-negative bacteria but also anti-bacterial virus. 3 Defensins are expressed in respiratory epithelial cells and mucosal epithelial cells, and six types are known in humans.
  • Defensins are known to be widely involved in host defense, including antibacterial effects, cytotoxic effects on normal cells and cancer cells, histamine release from mast cells, and monocyte chemotaxis.
  • Therapeutic agent for retroviral infectious diseases comprising secretion of defuncin and the like by administering a specific culture solution filtrate of yeast and basidiomycete (JP-A-2004-115497), and stimulating the expression of defensin in the skin
  • JP-A-2004-115497 JP-A-2004-115497
  • beta 2 micro glow purine other histone capturing material the third component, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, V Po nuclease, prothrombin, cytochrome [rho-450, plus Minogen, transferrin, thrombin, plasmin, complement fourth component,
  • monocyte chemotactic protein 1 lysozyme
  • V Po nuclease prothrombin
  • cytochrome [rho-450, plus Minogen transferrin
  • thrombin plasmin
  • complement fourth component There is no literature describing ⁇ -defensin or any of its enzymatic degradation products in terms of promoting bone formation and inhibiting bone resorption.
  • An object of the present invention is to provide a food and drink, a medicine or a feed for promoting bone formation and suppressing bone resorption.
  • Liponuclease, prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, and their enzymatic degradation products significantly inhibit bone resorption by osteoclasts.
  • Cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, and these enzymes The degradation products significantly inhibit bone resorption by osteoclasts and promote osteoblast proliferation, thereby promoting bone formation.
  • Fourth complement component, j3 defensin, and their enzymatic degradation Were found to promote bone formation by promoting osteoblast differentiation.
  • the present invention relates to 2 microglobulin, histone, third component of complement, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, liponuclease, prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, complement
  • the present invention relates to a bone formation promoting and / or bone resorption inhibitor comprising as an active ingredient at least one of a body fourth component, ⁇ -defensin, and an enzymatic degradation product thereof.
  • the present invention relates to 2 microglobulin, histone, third component of complement, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, liponuclease, prothrombin, cytochrome ⁇ -450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin,
  • the present invention relates to a food, beverage, medicine or feed for promoting bone formation and / or inhibiting bone resorption, which comprises at least one of the fourth component of complement, ⁇ -defensin, and an enzymatically decomposed product thereof.
  • a bone formation promoting and / or bone resorption inhibitor containing ⁇ -defensin and / or one or more of these enzyme degradation products as an active ingredient can be administered orally to produce various bone diseases such as osteoporosis. It is useful for prevention and improvement.
  • these active ingredients when these active ingredients are incorporated in foods and drinks, medicines, feeds, and the like, they have the effect of promoting bone formation or suppressing bone resorption to prevent and improve various bone diseases such as osteoporosis.
  • the present invention i3 2 microglobulin, histone, complement third component, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, lipoic nuclease, prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, ⁇ A bone resorption inhibitor that suppresses bone resorption by osteoclasts by combining one or more of these enzymatic degradation products.
  • the present invention provides remarkable bone resorption by osteoclasts by mixing prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, and any one or more of these enzyme degradation products. It is a bone formation promoting and bone resorption inhibitor that promotes the growth of osteoblasts while being suppressed by osteoblasts. Furthermore, the present invention is a bone formation promoting agent that promotes osteoblast differentiation by blending at least one of the fourth component of complement, defuncin, and an enzymatic degradation product thereof.
  • the present invention can provide an agent for promoting bone formation and ⁇ or bone resorption having an action of promoting bone formation and inhibiting bone resorption, a food or beverage, a medicament or a feed for promoting bone formation and suppressing bone resorption. .
  • Microglobulin, histone, third component of the catcher, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, liponuclease, prothrombin, cytochrome ⁇ -450, plasmino Gen-gen, transferrin, thrombin, plasmin, the fourth component of the catcher, and defensin are all present in trace amounts in milk of horses, buffaloes, humans, pigs, higgins, goats, and horses.
  • the milk can be separated and extracted.
  • As the milk component a protein fraction separated from raw milk, skim milk, or whey, or a cell fraction in milk separated from raw milk can be used.
  • Microglobulin, third component of capture, monocyte chemotactic protein 1, prothrombin, cytochrome ⁇ -450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, fourth component of capture, and i3 defensin It can also be prepared from the blood of healthy livestock.
  • cereal germ, milt, etc. can be used as a material for extracting histones.
  • Wheat germ, rice germ, etc. can be used as grain germ.
  • the milt may be selected from fish and shellfish such as salmon, trout, cod, nisin, squid, scallop, etc. It is preferable from the viewpoint of effective use of resources.
  • Beta-defensins are all commercially available, and these commercially available products can also be used.
  • a recombinant product prepared by genetic engineering may be used.
  • micro Gros purine, histones, capturing material the third component, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, ribonuclease, pro-thrombin, cytochrome P- 450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, complement the It is also possible to use four components, ⁇ -defensin, which have been degraded with proteolytic enzymes such as trypsin, pancreatin, chymotrypsin, pepsin, papain, kallikrein, cathepsin, thermolysin, and V8 protease.
  • proteolytic enzymes such as trypsin, pancreatin, chymotrypsin, pepsin, papain, kallikrein, cathepsin, thermolysin, and V8 protease.
  • the prothrombin hydrolyzate is a peptide mixture obtained by subjecting the above-mentioned protobin to limited degradation with a protease.
  • Thrombin obtained by degrading prothrombin with an enzyme such as factor X may be used.
  • plasmin obtained by decomposing plasminogen with an enzyme such as plasminogen activator may be used.
  • Thrombin and plasmin are also commercially available, as are prothrombin and plasminogen. Use these commercially available products. You can also
  • ion-exchange resin For preparation from milk, for example, fresh cows are brought into contact with an ion-exchange resin, and 2 microglobulins, histones, third component of the catcher, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, ribonuclease, prothrombin, cytochrome ⁇ - Absorb fractions containing 450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, the fourth component of the catcher, and ⁇ -defensin, elute with gradually increasing the concentration of sodium chloride, and then perform genole filtration chromatography. Obtainable.
  • the bone formation-promoting and / or bone resorption inhibitor of the present invention includes 2 microglobulin, histone, the third component of a capturer, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, ribonuclease, prothrombin, cytochrome ⁇ -450, and plasminol. Gen, transferrin, thrombin, plasmin, the fourth component of complement, ⁇ -defensin, and at least one of these enzyme digests are used as active ingredients.
  • the / 3 2 micro Gros purine, histone, complement third component, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, Riponukurea over Ze, pro-thrombin, cytochrome [rho - 450, plasminogen, trans: E phosphate, thrombin, Plasmin, fourth component of complement, ⁇ -defensin, and at least one of these enzymatic degradation products in milk, beverages, coffee drinks, juices, jellies, biscuits, breads, ⁇ , sausages, etc. Or a medicine such as a tablet or powder.
  • calcium agents with good absorbability such as calcium chloride, calcium carbonate, calcium lactate, eggshell, and milk-derived calcium, is used to enhance bone strengthening by shifting bone metabolism to a balance that favors bone formation. You can also.
  • the dosage of the osteogenesis-promoting and / or bone resorption inhibitor of the present invention varies depending on the active ingredient, age, therapeutic effect, disease state, and the like.In the case of an adult, lng to lg is divided into several times per day. You can take it orally. Thus, various bone diseases such as osteoporosis can be prevented by taking the bone formation promoting and / or bone resorption inhibitor of the present invention.
  • various bone diseases such as osteoporosis can be prevented by taking the bone formation promoting and / or bone resorption inhibitor of the present invention.
  • plasminogen plasminogen
  • transferrin thrombin
  • plasmin complement fourth
  • the component, i3 defensin was originally derived from plasma and milk, and no acute toxicity was observed in rats.
  • these active ingredients can be contained in feeds to promote bone formation in livestock and poultry, and to suppress bone resorption.
  • the bones were mechanically minced in a-MEM (Flow Laboratories) solution containing 5% fetal calf serum. Then, whole bone marrow cells including osteoclasts were obtained. The whole bone marrow cells including the osteoclasts were seeded on ivory pieces so as to be about 2 ⁇ 10 6 cells, and spotted with an ⁇ -MEM solution containing 5% fetal calf serum.
  • a-MEM Flow Laboratories
  • 100 26.3 workers 15.1 is an active ingredient iS 2 microglobulin of the present invention, the histone, complement third component, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, lipoic nuclease, prothrombin, Tito chrome P- 450, plasminogen, Toransufu Bone resorption in which perlin, plasmin and thrombin were added had a suppressed bone resorption activity as compared with those in which the active ingredient was not added, indicating that it had a remarkable inhibitory effect on bone resorption.
  • Osteoblast proliferation was examined for prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin and plasmin.
  • Each subject to the test Commercially available active ingredients were used. The origin of each active ingredient used in the test and the final concentration of each active ingredient are as shown in Table 2.
  • Mouse osteoblast MC3T3- E1 cells a containing 10% fetal calf serum - in MEM medium (Flow Laboratories Co.) were seeded in 96 well plates at a cell number of 2 X 10 4 / ml, 5 % C0 2 present
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours to obtain cultured cells for testing.
  • replace the medium with ⁇ -MEM medium without fetal bovine serum, and adjust the medium so that prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, plasmin, and thrombin have the final concentrations shown in Table 2.
  • Prothrombin 10 176 Sat 20 Prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, plasmin, and thrombin have higher levels of MC3T3-E1 proliferative activity in mouse osteoblasts than those without the active ingredient. It was significantly increased in a concentration-dependent manner, and was found to have an osteoblast proliferation effect.
  • the culture supernatant was recovered, and the osteoblast differentiation promoting activity was examined by measuring the amount of type I collagen in the culture supernatant using a Procollagen Type I C-peptide EIA Kit (Takara MK101, manufactured by Takara Shuzo).
  • a Procollagen Type I C-peptide EIA Kit Takara MK101, manufactured by Takara Shuzo.
  • the amount of collagen production was expressed as the ratio (%) of the measured amount of type I collagen of each sample to the measured amount of type I collagen of the control.
  • Table 3 Final concentration (/ ⁇ 1) Collagen production (%) Control (no addition) 100 ⁇ 6 4th trap component 0.1 138 ⁇ 7
  • Cytochrome ⁇ -450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin and their degradation products promote bone formation by inhibiting bone resorption by osteoclasts and promoting osteoblast proliferation
  • the fourth component of the capturer, ⁇ -defensin, and these enzyme degradation products It can be seen that promote bone formation by promoting the differentiation of myoblasts.
  • casein 20 g was dissolved in 5 mM sodium phosphate buffer (PBS: pH 8.3) 11 and dimethylaminoethyl (DEAE) cellulose equilibrated with the same buffer (DE-52: Whatmann ring) Adsorbed to the column. After washing with equilibration buffer, the obtained fraction was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the fraction containing the 12 kDa protein was concentrated by ultrafiltration to obtain 5 mM It was dialyzed against PBS (pH 8.3) at 4 ° C.
  • PBS sodium phosphate buffer
  • DME dimethylaminoethyl
  • the concentrate was passed through a Genole filtration chromatograph consisting of a Sephadex G-75 column equilibrated with 5 mM PBS (pH 8.3).
  • the fraction containing the 12 kDa protein was concentrated by ultrafiltration and dialyzed against lOmM ammonium hydroxide solution. This was lyophilized to give the active ingredient der Ru j3 2-microglobulin 12 mg of the present invention.
  • the j3 2-microglobulin 12 mg was mixed with ChichiMamoru 120 mg, to obtain a bone resorption inhibiting agent molded to the present invention into granules.
  • histone, third component of captor, monocyte chemotactic protein 1, lysozyme, and ribonuclease, prothrombin, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, fourth component of captor, and i3 defensin for also possible to prepare than ⁇ shea HatsuMakoto L in the same manner as described above i3 2 micro Gros purine.
  • Plasma prothrombin was prepared according to a known method (Hashimoto, N., T. Morita, and S. Iwanaga, J. Biochem. (Tokyo), vol. 97, p. 1347-1355, 1985). That is, sodium citrate was added to 0.01 M, and centrifugation was performed to obtain plasma. The citrate was slowly added to 0.1 ⁇ l of the plasma to 0.1 M, stirred gently for 1 hour, and then centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes. The resulting precipitate was washed with a 0.1 M sodium chloride solution containing 0.01 M barium chloride, ImM benzamidine hydrochloride, and 0.02% sodium azide, and centrifuged. This washing operation was repeated twice.
  • the barium precipitate was suspended in 40% saturated ammonium sulfate 11, and diisoprolylphosphorofluoridate (DFP) was added to 1 mM, followed by stirring for 1 hour. Centrifugation was performed at 5,000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant. Saturated ammonium sulfate was added to the supernatant to a 67% saturation, and the precipitate was collected by centrifugation at 5,000 rpm for 30 minutes. This precipitate was dissolved in 100-150 ml of 0.05 M sodium phosphate buffer (H6.0) containing 0.2 M sodium chloride, 1 niM DFP, and 1 mM benzamidine hydrochloride, and the same buffer was used in 201.
  • DFP diisoprolylphosphorofluoridate
  • Dialysis was performed. After removing insoluble components by centrifugation, the mixture was subjected to DEAE-Sephadex A50 chromatography. The sample was applied to a DEAE-Sephadex A-50 column (200 x 100 mm) equilibrated with 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.2 M sodium chloride and I mM benzamidine hydrochloride. The sodium chloride concentration was gradually increased to 600 mM, and the adsorbed protein was eluted. Prothrombin eluted when the sodium chloride concentration reached about 300 mM. This was desalted by dialysis, then, 0.
  • Microglobulin, histone, third component of complement, monocyte chemoattractant protein 1, lysozyme, and ribonuclease, cytochrome P-450, plasminogen, transferrin, thrombin, plasmin, fourth component of complement and deferment Insulin can also be prepared from blood plasma by the same method as for prothrombin.
  • a fraction containing prothrombin was prepared from milk. After sufficiently washing a column (diameter 5 cm x height 30 cm) packed with 400 g of cation exchange resin SP Sepharose HP (manufactured by Amersham Bioscience) with deionized water, the column is filled with unsterilized skim milk 40 1 (pH 6.7) at a flow rate of 25 ml / min. After the passage, the column was sufficiently washed with deionized water, and the protein fraction adsorbed on the resin was eluted with a 0.02 M carbonate buffer (pH 7.0) containing 1.5 M sodium chloride.
  • the eluate was desalted with a reverse osmosis (R0) membrane, concentrated, and lyophilized to obtain 21 g of a protein fraction powder, which was used as the bone formation promoting and bone resorption inhibitor of the present invention.
  • the protein fraction powder had a prothrombin weight of 0.01 / 0 . Was included.
  • liponuclease manufactured by Sigma
  • 93.5 g of hydrous dextrose 5 g of calcium carbonate, 1 g of sugar ester, and 0.5 g of perfume.
  • the mixture is tabletted into tablets and the ribonuclease of the present invention is added.
  • An osteogenesis promoter containing was produced.
  • cytochrome P-450 containing bone formation promoting and bone resorption inhibitor A cytochrome P-450 containing bone formation promoting and bone resorption inhibitor.
  • cytochrome p-450 manufactured by Sigma
  • 93.5 g of hydrous dextrose, 5 g of calcium carbonate, sugar ester lg, and 0.5 g of fragrance were added, mixed, and tabletted into a tablet.
  • An agent for promoting bone formation and inhibiting bone resorption containing cytochrome P-450 of the present invention was produced.
  • the thus-obtained fourth component and / 3 defensin can be directly used as the bone formation promoter of the present invention.
  • the osteogenesis promoter containing the fourth component of complement of the present invention was produced.
  • Complement component C4, C8195 (Sigma) 1 mg, ⁇ -defensin (-Defensin- 2 , 4338-s, Peptide Research Institute Co., Ltd.) lmg, hydrous crystalline glucose 93.4 g, After adding 5 g of calcium carbonate, sugar ester lg, and 0.5 g of perfume, mixing and tableting, tablet-shaped ointment containing 4th component of complement and defensin of the present invention was produced.
  • the raw materials were mixed in the composition shown in Table 10 to produce a dog breeding feed (dog food) for suppressing histone-containing bone resorption of the present invention.
  • Table 10 Women, _ hundred 5Z ⁇ ffi mouth
  • Raw materials were mixed using commercially available plasminogen in the composition shown in Table 12, and a dough was formed and molded, and then roasted to produce a biscuit for promoting bone formation and inhibiting bone resorption of the present invention. .
  • Table 12
  • the raw materials were mixed using commercially available plasmin in the composition shown in Table 13 to produce a biscuit for promoting bone formation and inhibiting bone resorption of the present invention.
  • Table 13
  • the raw materials were mixed using commercially available thrombin in the composition shown in Table 16 to produce a processed cheese for thrombin-containing osteogenesis promotion and bone resorption suppression of the present invention.
  • Table 16 The raw materials were mixed using commercially available thrombin in the composition shown in Table 16 to produce a processed cheese for thrombin-containing osteogenesis promotion and bone resorption suppression of the present invention.
  • the raw materials were mixed with commercially available thrombin in the composition shown in Table 19 to produce an infant formula for promoting bone formation and inhibiting bone resorption according to the present invention.
  • Table 19 Nonfat dry milk 75.85 (% by weight)
  • Raw L was homogenized at a homogeneous pressure of 120 kg m 2 , and then heat-sterilized at 75 ° C for 15 seconds.
  • ⁇ -defensin (-Defensin- 1,4337-s, manufactured by Peptide Laboratories, Inc.) was added to the raw milk. Add aseptically to lOmg per 1 bottle, 100 ml glass bottle To prepare a milk beverage for promoting osteogenesis containing defensin of the present invention.
  • Fructose 20.0 (% by weight), granulated sugar 15.0 (wt%), starch syrup 5.0 (wt% :), agar 1.0 (wt%), perfume 0.11 (wt%), calcium 0.1 (wt%), water 58.39 (wt 0 / After mixing the ingredients in a ratio of 0 ) and sterilizing by heating, aseptically add complement component 4 (Complement component C4, C8195, manufactured by Sigma) at 10 mg per 11 and fill the container. Then, a gel for promoting osteogenesis containing the fourth component of complement of the present invention was produced.
  • complement component 4 Complement component C4, C8195, manufactured by Sigma
  • a complement fourth component Complement component C4, C8195, manufactured by Sigma

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Abstract

日常の食事の中で、嗜好的にも問題なく、長期的・直接的に経口摂取することができ、また、直接的に骨形成促進及び骨吸収抑制作用を骨に付与し、各種骨疾患の予防又は改善治療効果が期待できるような、新規な骨形成促進及び／又は骨吸収抑制剤、さらには骨形成促進及び／又は骨吸収抑制用飲食品、医薬又は飼料を提供する。　β２ミクログロブリン、ヒストン、補体第３成分、単球走化性タンパク質１、リゾチーム、リボヌクレアーゼ、プロトロンビン、チトクロームP-450、プラスミノーゲン、トランスフェリン、トロンビン、プラスミン、補体第４成分、βデフェンシン、及びこれらの酵素分解物のいずれか１種以上を有効成分とする。これらの物質は、破骨細胞による骨吸収を顕著に抑制する効果及び／又は骨芽細胞の増殖や分化を促進することにより骨形成を促進する効果がある。

Description

明 細書 骨形成促進及び Z又は骨吸収抑制剤
[技術分野]
本発明は、 2ミクログロブリン、 ヒストン、 捕体第 3成分、 単球走化性タン パク質 1、リゾチー 、リポヌクレアーゼ、プロ トロンビン、チトクローム P- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、プラスミン、捕体第 4成分、 βデフェンシン及ぴこれらの酵素分角物のいずれか 1種以上を有効成分とする骨 形成促進及び/又 ίま骨吸収抑制剤に関する。 また、 本発明は、 2ミクログロブ リン、 ヒストン、 橘体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌ クレアーゼ、 プロ 卜ロンビン、 チトクローム P_450、 プラスミノーゲン、 トラン スフエリン、 トロンビン、 プラスミン、 補体第 4成分、 eデフェンシン、 及ぴこ れらの酵素分解物のいずれか 1種以上を配合した骨形成促進及び/又は骨吸収抑 制剤、 さらには骨形成促進及び Z又は骨吸収抑制用飲食品、 医薬又は飼料に関す る。
[背景技術]
近年、 高齢者人口の増加に伴い、 骨粗鬆症、 骨折、 腰痛等の各種骨疾患が増加 する傾向にある。 骨組織においては、 絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、 若 い時には骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、 加齢に伴レ、種々の原因で そのバランスが骨吸収に傾く (アンカツプリング)。 そして、 この状態が長期間続 くと骨組織が脆くなり、 骨粗鬆症、 骨折、 腰痛等の各種骨疾患を生じることにな る。 このアンカップリングを防止することができれば、 骨粗鬆症、 骨折、 腰痛等 の各種骨疾患を予防することができると考えられている。
従来より、 アンカップリングを防止し、 各種骨疾患を予防あるいは治療する方 法として、 （1 )食餌によるカルシウム補給、 （2 ) 軽い運動、 ( 3 ) 日光浴、 （4 ) 薬物治療等が行われている。 食餌によるカルシウム捕給には、 炭酸カルシウム、 リン酸カルシウム等のカルシウム塩や卵殻、 魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用 されている。 しかし、 これらは必ずしも経口摂取に適している素材であるとはい えない。 軽い運動はジョギングや散歩等が良いとされるが、 体が弱っている場合は軽い 運動も厄介なものであり、 まして寝たきりの老人では殆ど運動できない。 日光浴 は活性型ビタミン D3 の捕給という点では良いとされているが、 これだけでは不 充分である。 薬物投与には、 1 α—ヒドロキシビタミン D3やカルシトニン製剤 等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効であるということが知られている。 し力 し、 これらの物質は医薬そのものであり、 食品素材としても使用可能なもの ではない。
破骨細胞は造血幹細胞から発生して海綿骨表面に存在し、 骨を溶解する細胞で ある。 また、 骨芽細胞は骨糸且織表面に存在し、 盛んにコラーゲンなどの骨基質タ ンパク質を合成している骨形成で中心的な役割を果たしている細胞である。 この 骨基質タンパク質にリン酸カルシウム、ヒドロキシァパタイトの結晶が沈着し (石 灰化)、 硬い骨組織ができあがる。
破骨細胞が骨基質を溶解し（骨吸収)、その後、骨芽細胞が骨基質を合成する（骨 形成） ことによって、骨の形成や成長 (モデリング)、代謝 (リモデリング) が起 こると考えられている。
本発明者らは、 食品素材として使用可能な骨形成促進作用や骨吸収抑制作用を 有する物質を得るために、 乳清タンパク質中に存在する骨形成促進因子及び骨吸 収抑制因子を探索し続けてきた。その結果、逆浸透膜や電気透析等の処理により、 乳清タンパク質の水溶性画分から乳清由来の塩を除去したタンパク質及ぴぺプチ ド混合物に骨強化作用があることを見出した （特開平 4-183371号公報)。そして、 このタンパク質及ぴぺプチド混合物の水溶液をェタノール処理、 加熱処理、加塩 処理、 限外濾過膜処理して得られる画分に骨芽細胞増殖促進作用及び骨強化作用 があることを見出した (例えば、特開平 5 - 176715号公報及び特開平 5-320066号公 報)。また、乳中に微量にしか存在しない塩基性タンパク質に骨芽細胞増殖促進作 用、 骨強化作用及び骨吸収抑制作用があることを見出した (特開平 8-151331号公 報)。
本発明者らは、 更に探索を進め、 骨形成促進及び骨吸収抑制作用を有する活性 本体の分離精製を試み、 その物質を同定したところ、 既知物質である、 β 2ミク ログロブリン、 ヒストン、捕体第 3成分、単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌクレアーゼ、 プロトロンビン、 チトクローム P- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、プラスミン、及ぴこれらの酵素分解物によって、 破骨細胞による骨吸収が顕著に抑制されることを見出した。
また、 プロトロンビン、 チトクローム P - 450、 プラスミノーゲン、 トランスフ エリン、 トロンビン、 プラスミン、及びこれらの酵素分解物によって、 破骨細胞 による骨吸収が顕著に抑制されるとともに骨芽細胞の増殖を促進することに り 骨形成が促進されることを見出した。
さらに、 補体第 4成分、 βデフェンシン、及びこれらの酵素分解物によって、 骨芽細胞の分化を促進することにより骨形成が促進されることを見出し、 本努明 を完成するに至った。
2ミクログロブリン ( β 2 - Microglobulin)は、分子量約 11. 6kDaのタン/くク 質であり、 主要糸且織適合複合体 （MHC)の構成成分である。 血液を始め、 全身組織 中に広く分布していることが知られており、 ヒトゃゥシでは乳中にも存在してい ることが報告されている。 ）3 2ミクログロブリンの骨への作用については、 骨代 謝回転のマーカーとして、 高回転型骨粗鬆症では血中 2ミクログロプリン濃度 が高くなるとの報告がされている（ジヱイ 'ェム ·クエサダ （J. M. Quesada) 6 名， 「高年女性の高骨リモデリングのマーカーとしての血清 2ミクログロブリ ン」、メカニズムス 'ォブ'エージング'アンド'ディべロプメント、 （米国） 1998 年、 102号、 p. 293-298)。また、培養骨芽細胞 MC3T3の増殖を促進したことから、 2ミクログロプリンは骨形成を促進するとの報告がある（ィー ·バリント
(E. Balint)外 2名、 「 2ミクログロプリンが誘発する骨からのミネラル溶 に おけるインターロイキン 6の役割」、キドニ^ fンターナショナル、（米国）、 2O00 年、 57号、 p. 1599-1607)。 一方、 骨吸収作用に関しては、 j3 2ミクログロブリン が骨からのカルシウム溶出を促進するとの報告がある （ジエイ ·ピーターセン
(J. Petersen)外 1名、「 2ミクログロブリンの骨吸収におけるィンビボ効果」、 ァメリカン ·ジャーナル ·ォプ .キドニ一 ·ディズィーズ、 (米国)、 1994年、 23 号、 p. 726 - 730)。 しかし、 カルシウム溶出を促進する作用と骨吸収を抑制する作 用とは異なっており、 本発明者らが見出したような 2ミクログロプリンが骨吸 収を抑制する作用について記載した文献は見られない。 ヒストン（Histone) は、高等動物の細胞核中に存在する塩基性タンパク質であ る。 高等動物の場合、 遺伝子情報をつかさどる DNA (デォキシリボ核酸） は直線 距離で約 2mの長さがあると言われているが、 その DNAを細胞核中に効率よく收 納するために必須なタンパク質である。 すなわち、 DNAはヒストンに卷き付いた 状態で機能的に折り畳まれている。 通常、 Hl、 H2A、 H2B、 H3、 H4の 5分子種から なり、 H2A、 H2B、 H3、 H4各 2分子ずつ計 8分子で一つの集合体を形成する。 その 集合体に DNAが卷き付き、 クロマチンと呼ばれる単位を形成する。 HIはクロマチ ン同士を接着させる働きを担っている。 このようにヒストンと DNAは常にセット であり、重量比でほぼ 1： 1の割合で核内に存在している。 これまで DNAについて は、 核酸及びその構成成分として栄養効果に関する報告が数多く行われ、 核酸は 第 6の必須栄養素ではないかとの考え方もある。 し力 し、 それと対をなして存¾£ するヒストンについては、 栄養効果を報告した例はない。 動物性の食物は基本的 に細胞の集合体である。 よって食物を摂る以上、 ヒストンは動物の種類に関係な く必然的に摂取することになるタンパク質である。 しかしヒ トの場合、 白米や/卜 麦粉、 砂糖等のように、 精製され、 細胞核を含まない食素材を用いた無細胞食！ ¾ を摂取する場合が極めて多い。ヒストンの骨吸収抑制作用だけを期待するならば、 細胞の塊である肝臓や白子等の食素材を多く食事に取り入れればよいが、味覚的、 また食品加工上の問題が大きく、 制約が極めて大きい。
捕体 （Complement component) は、 血清中にあり、 抗原抗体複合物と反応して 活性化され、 複雑な反応を起こしながら生理活性を発揮する酵素様物質である。 現在、 C1力、ら C9までの九つの成分が知られている。 Complement component 3 fi: C3にあたるもので補体第 3成分と呼ばれ、捕体成分の中でもつとも含有量が多い。 その構造は分子量 10. 5万の α鎖と分子量 7. 5万の /3鎖が 2箇所の S- S結合で架橋 された糖たんぱく質である。 この分子量 18万の C3は、 C3転換酵素によって、 α 鎖の一部が分解されてできた分子量 9, 000の C3aと、 2箇所の S- S結合を含む凑 りの分子量 17万の C3bに分かれる。 C3aは肥満細胞を刺激してヒスタミン放出 促進する等、 炎症反応を惹起する代表的なァナフイラトキシンの一つとして知ら れている。 C3bはさらに C3転換酵素により分解され、その一部が抗原抗体複合物 と共有結合する。 血液中のマクロファージ等の食細胞は細胞表面に C3bレセプダ 一を有しているため、 結果的にこの反応は食細胞による異物の貪食を亢進する。 このように捕体第 3成分 （C3) は免疫反応に深く関与する物質である。 この他に 捕体第 3成分を有効成分として含有する胚 ·胎児及びそれらの組織培養用栄養因 子組成物や不妊症治療用組成物が公開されている（特開平 10-033164号公報)。補 体第 3成分は自己組織である骨組織を分解していく機能を有する破骨細胞に対し ては、 逆にその活性を抑制する役割を果たすことが本発明によって明らかとなつ た。
単球走ィ匕'性タンノヽク質一 1 (Monocyte chemotactic protein-1或レヽは Monocyte chemoattractant protein- 1、 MCP- 1)は単球や血管内皮、 グリオ一マ細胞株等が産 生する単球走化性因子である。 画 TES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)とともに代表的な C- Cケモカインファミリ一の一つで、 分子量は 8， 000〜18， 000、 76アミノ酸からなる。 主として単球に走化性を示し、 好中球ゃリンパ球には作用しない。
リゾチーム（Lysozyme)は細菌細胞壁のムコペプチド等に存在する N-ァセチル ムラミン酸と N-ァセチルダルコサミンの間の j3 - l→4結合を加水分解する酵素 であり、 動植物界に広く分布している。 基質特異性や分子量から 4つのグループ に分けられる。
リボヌクレアーゼ（Ribonuclease)は核酸の一種であるリボ核酸 (RNA)に作用し て、 モノヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドを生じる酵素の総称である。 プロトロンビン (Prothrombin)は、 分子量約 7. 2kDaのタンパク質であり、 血液 凝固 Π因子とも呼ばれる。 ビタミン K依存性血液凝固因子の 1つであり、 ビタミ ン K存在下で第 X因子により トロンビンに分角早される。 生じたトロンビンはフィ プリノーゲンをフイブリンへと分解し、 フイブリンが架橋することによつて血液 が凝固する。 プロトロンビンは、 血液を始め、 全身組織中に広く分布しているこ とが知られており、ヒトゃゥシでは乳中にも存在していることが報告されている。 トロンビン (Thrombin)は前述のようにプロトロンビンを第 X因子等の酵素で分 解したものである。
チトクローム P- 450 (Cytochrome P-450)は、 還元型で一酸化炭素を結合して 450nm付近にソーレー吸収帯を示す一群のプロトヘムタンパク質の総称である。 機能的には、 各種のステロイドホルモン、 胆汁酸、 プロスタノィドの合成'分角军 反応、 脂肪酸の 酸化、 ビタミン!）の活性化反応、 無数の外来薬物や体内に取り 込まれた環境汚染物質等の酸ィ匕的解毒反応に関与している。
プラスミノーゲン (Plasminogen)は、プラスミンの前駆体であり、動物血漿中【こ 存在し、 プラスミノーゲンァクチべ一ターによって分子内の Arg-Val結合が切断 されて活性なプラスミンとなる。分子量約 91, 000の一本鎖の糖タンパク質であり、 プラスミン等のプロテアーゼによって N末端側のペプチドが切断されて分子量約
82, 000の修飾プラスミノ一ゲンとなる。
プラスミン (Plasmin)は、このようにプラスミノーゲンをプラスミノーゲンァク チベータ一等の酵素で分解したものである。
トランスフェリン (Transferrin)は、 血中の輸送鉄と結合する分子量約 75， 0O0 のタンパク質で、 鉄結合性グロブリンとも呼ばれる。 幼若赤血球はトランスフエ リンと結合した鉄に対する受容体を有しており、 血清鉄がへモグロビンの合成【こ 利用されるためにはトランスフェリンと結合していなければならない。 トランス フェリンについては膜結合型トランスフェリン様蛋白質が軟骨細胞の形成を促進 すると開示されているが、 軟骨細胞の形成促進であり、 骨形成促進とはメカニズ ムは全く異なっている （特開 2002-20311号公報及ぴ再公表特許 W001/013951号公 報)。
補体第 4成分 （Complement component C4) は血清中にあり、 抗原抗体複合物と 反応して活性化され、 複雑な反応を起こしながら生理活性を発揮する酵素様物質 である。 補体第 4成分自体では抗原に対する特異性は持たないが、 抗原抗体複合 物により活性化され、 貧食作用の亢進を起こしたり、 特異抗体の結合した細胞や 細菌を破壊したりする。 捕体第 4成分は、 ひ鎖、 3鎖、 γ鎖という 3種類のポリ ぺプチド鎖からなる分子量 210 k Daのタンパク質である。 補体第 4成分が骨芽条田 胞の分化を促進することに関しては知られていなかった。
デフェンシン（Defensin)は、 分子内に 3つの S— S結合をもつ強い塩基性の抗 菌ペプチドとして知られており、 アルギニン残基が 4〜： 10個、 システィン残基力 S 6個ある 29〜34個のアミノ酸からなる塩基性のタンパク質である。システィン残 基の存在位置の違いから、 大きく α型と i3型に分けられる。 グラム陽性細菌およ びグラム陰性細菌に対する抗菌活性だけではなく、 力ビゃウィルスに対しても抗 菌活性を保有する。 3デフェンシンは、 呼吸器系上皮細胞や粘膜上皮細胞で発現 しており、 ヒ トにおいては 6つのタイプが知られている。 デフェンシンには、 抗 菌作用のほか、 正常細胞や癌細胞に対する細胞傷害作用、 肥満細胞からのヒスタ ミン放出作用、 単球走化作用など広く生体防御に関係していることが知られてい る。 酵母と乱酸菌の特定の培養液濾液を投与してデフヱンシン等を分泌させるこ とからなるレトロウイルス感染症治療薬 （特開 2004-115497号公報） や、 皮膚に おけるデフエンシンの発現を刺激するョモギの根からなる化粧用組成物などが公 開されている （特開 2004-067660号公報） 力 骨芽細胞の分ィ匕を促進することに 関しては知られていなかった。
これらの骨形成促進作用及び骨吸収抑制作用を有する物質のうち、 3 2ミクロ グロブリンについては前記したように、 骨からのカルシウム溶出を促進するなど の報告がある。 し力 し、 これも前記したように、 カルシウム溶出を促進する作用 と骨吸収を抑制する作用とは異なっており、 本発明者らが見出したような 2ミ クログロプリンが骨吸収を抑制する作用について記載した文献は見られない。 β 2ミクログロプリン以外のヒストン、 捕体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 Vポヌクレアーゼ、 プロトロンビン、 チトクローム Ρ-450、 プラス ミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 補体第 4成分、 βデ フヱンシン、 及びこれらの酵素分解物のいずれについても骨形成促進や骨吸収を 抑制する働きについて記載した文献は見られない。
[発明の開示]
[発明が解決しようとする課題]
本発明は、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患の性質上、 日常の食事の中で、 嗜好的にも問題なく、 長期的'直接的に経口摂取することができ、 また、 直接的 に骨形成促進及び骨吸収抑制作用を骨に付与し、 骨粗鬆症、 骨折、 腰痛等の各種 骨疾患の予防又は改善治療効果が期待できるような、 新規な骨形成促進及び骨吸 収抑制剤、 さらには骨形成促進及び骨吸収抑制用飲食品、 医薬又は飼料を提供す ることを課題とする。
[課題を解決するための手段] 本発明者らは、 これらの問題点を鑑み、 広く食品素材に含まれている骨強化作 用を示す物質について、 鋭意、 探索を進め、 骨形成促進作用及び骨吸収抑制作用 を有するタンパク質について、 骨形成促進及び骨吸収抑制作用を有する成分の分 離精製を試み、 その物質を同定したところ、 既知物質である 2ミクログロプリ ン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌク レアーゼ、 プロトロンビン、 チトクローム P- 450、 プラスミノーゲン、 トランス フェリン、 トロンビン、 プラスミン、及ぴこれらの酵素分解物が、 破骨細胞によ る骨吸収を顕著に抑制すること、 また、 プロトロンビン、 チトクローム P - 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 及ぴこれらの 酵素分解物が、 破骨細胞による骨吸収を顕著に抑制するとともに骨芽細胞の増殖 を促進することにより骨形成を促進すること、 さらに、 補体第 4成分、 j3デフエ ンシン、及びこれらの酵素分解物が、 骨芽細胞の分化を促進することにより骨形 成を促進することを見出した。
そして、 これらの物質を骨形成促進及び Z又は骨吸収抑制剤として利用するこ とができることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球 走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌクレアーゼ、 プロトロンビン、 チトク ローム P- 450、プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、プラスミン、 補体第 4成分、 βデフェンシン、 及びこれらの酵素分解物のいずれか 1種以上を 有効成分とする骨形成促進及び Ζ又は骨吸収抑制剤に関する。
また、 本発明は、 2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走ィ匕 性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌクレアーゼ、 プロトロンビン、 チトクロー ム Ρ-450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 補 体第 4成分、 βデフェンシン、 及びこれらの酵素分解物のいずれか 1種以上を配 合した骨形成促進及び/又は骨吸収抑制用飲食品、 医薬又は飼料に関する。
[発明の効果]
本発明の i3 2ミクログロプリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンノ ク質 1、 リゾチーム、 リポヌクレアーゼ、 プロトロンビン、チトクローム P- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、プラスミン、補体第 4成分、 βデフェンシン、 及ぴこれらの酵素分解物のいずれか 1種以上を有効成分とする 骨形成促進及び Ζ又は骨吸収抑制剤は、 これを経口投与することにより、 骨粗鬆 症等の各種骨疾患の予防や改善に有用である。また、これらの有効成分を飲食品、 医薬、 飼料等に配合すると、 骨形成を促進し、 あるいは骨吸収を抑制して骨粗鬆 症等の各種骨疾患を予防し、 改善する効果を奏する。
[発明を実施するための最良の形態]
本発明は、 i3 2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タン パク質 1、リゾチーム、リポヌクレアーゼ、プロトロンビン、チトクローム P-450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 及ぴこれらの 酵素分解物のいずれか 1種以上を配合することによって、 破骨細胞による骨吸収 が抑制される骨吸収抑制剤である。
また、 本発明は、 プロトロンビン、 チトクローム P- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 及ぴこれらの酵素分解物のいずれ か 1種以上を配合することによって、 破骨細胞による骨吸収が顕著に抑制される とともに骨芽細胞の増殖が促進される骨形成促進及び骨吸収抑制剤である。 さらに、 本発明は、 補体第 4成分、 デフヱンシン、及びこれらの酵素分解物 のいずれか 1種以上を配合することによって、 骨芽細胞の分化が促進される骨形 成促進剤である。
2ミクログロブリン、 ヒストン、 捕体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リボヌクレアーゼ、 プロトロンビン、 チトクローム Ρ - 450、 プラス ミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 補体第 4成分、 βデ フェンシン、 及びこれらの酵素分解物に見出された骨形成促進及び/又は骨吸収 抑制作用を用いることによって、 骨代謝を骨形成優位のバランスへ傾けることが 期待できる。 よって本発明は、 骨形成促進及び骨吸収抑制作用を有する骨形成促 進及び Ζ又は骨吸収抑制剤、 骨形成促進及び Ζ又は骨吸収抑制用飲食品、 医薬又 は飼料を提供することができる。
本発明において骨形成促進及び/又は骨吸収抑制の有効成分として使用する β
2ミクログロプリン、 ヒストン、 捕体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾ チーム、 リポヌクレアーゼ、 プロトロンビン、 チトクローム Ρ - 450、 プラスミノ 一ゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 捕体第 4成分及ぴ デフ ェンシンはいずれもゥシ、 水牛、 ヒ ト、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥマ等の乳中にも 微量に存在しており、 乳から分離抽出が可能である。 乳成分としては、 生乳、 脱 脂乳、 又はホエーから分離したタンパク質画分、 あるいは生乳から分離した乳中 の細胞画分が利用できる。 2ミクログロブリン、 捕体第 3成分、 単球走化性タ ンノ ク質 1、 プロ トロンビン、 チトクローム Ρ - 450、 プラスミノーゲン、 トラン スフエリン、 トロンビン、 プラスミン、 捕体第 4成分、 及び i3デフェンシンは健 康な家畜の血液から調製することもできる。 ヒストンを抽出する素材としては、 乳成分のほかに、 穀物胚芽、 白子等を利用することができる。 穀物胚芽は小麦胚 芽、 米胚芽等が利用できる。 白子はサケ、 マス、 タラ、 二シン、 イカ、 ホタテ貝 等の魚介類から採取されたものを用いれば良いが、 特に、 サケ、 マス、 タラ等の 漁獲量の多い魚類の白子を用いることが、 資源の有効利用の面から好ましいとい える。
2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾ'チーム、 リポヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム p-450、 プラス ミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 補体第 4成分、 βデ フェンシンはいずれも市販されており、 この市販品を用いることも可能である。 また、 遺伝子工学的に作製したリコンビナント品を用いても良い。
さらに、 i3 2ミクログロプリン、 ヒストン、 捕体第 3成分、 単球走化性タンパ ク質 1、 リゾチーム、 リボヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、チトクローム P- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、プラスミン、補体第 4成分、 βデフヱンシンを、 トリプシン、 パンクレアチン、 キモトリプシン、 ペプシン、 パパイン、 カリクレイン、 カテブシン、 サーモライシン、 V 8プロテアーゼ等の タンパク質分解酵素により分解したものを用いても良レ、。 例えば、 プロトロンビ ン分解物は、 上記のプロト口ンビンをタンパク質分解酵素で限定分解したぺプチ ド混合物である。 プロトロンビンをファクター X等の酵素で分解したトロンビン を用いても良い。 また、 プラスミノーゲンをプラスミノーゲンァクチベータ一等 の酵素で分解したプラスミンを用いても良い。 トロンビン、 プラスミンもプロト ロンビン、 プラスミノーゲンと同様に市販されており、 この市販のものを用いる こともできる。
乳からの調製については、 例えば、 新鮮な牛轧をイオン交換樹脂に接触させて 2ミクログロブリン、 ヒストン、 捕体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リ ゾチーム、 リボヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム Ρ— 450、 プラスミ ノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 捕体第 4成分、 βデフ ェンシンを含む画分を吸着させ、 塩化ナトリウムの濃度を徐々に高めて溶出しこ 後、 ゲノレ濾過クロマトグラフィーによりそれぞれ得ることができる。
血液からの調製については、 クェン酸血漿をクェン酸バリウムと反応させ、 不 溶性バリウムに吸着した j3 2ミクログロプリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単求 走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リボヌクレアーゼ、 プロトロンビン、 チトク ローム P - 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 ト口ンビン、 プラスミン、 捕体第 4成分、 デフェンシンの沈殿をそれぞれ回収する。 さらにイオン交換ク 口マトグラフィ一により純度を高めることができる。
本発明の骨形成促進及び Ζ又は骨吸収抑制剤は、 2ミクログロブリン、 ヒス トン、捕体第 3成分、単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リボヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム Ρ- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 補体第 4成分、 βデフェンシン、 及びこれらの酵素分 解物のいずれか 1種以上を有効成分とする。 また、 この /3 2ミクログロプリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌクレア ーゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム Ρ - 450、 プラスミノーゲン、 トランス: ェ リン、 トロンビン、 プラスミン、 補体第 4成分、 βデフェンシン、 及びこれらの 酵素分解物のいずれか 1種以上を、 牛乳、 飲料、 コーヒー飲料、 ジュース、 ゼ リー、 ビスケット、 パン、 麵、 ソーセージ等の飲食品に配合しても良いし、 錠剤 や粉末等の医薬としても良い。 さらに、 塩化カルシウム、 炭酸カルシウム、 乳酸 カルシウム、 卵殻、 牛乳由来のカルシウム等の吸収性が良好なカルシウム剤を件 用し、 骨代謝を骨形成優位のバランスへ傾けることにより、 骨強化作用を一層高 めることもできる。
本発明の骨形成促進及ぴ Ζ又は骨吸収抑制剤の投与量は、 有効成分、 年齢、 洽 療効果及び病態等により異なるが、成人の場合、 1日当たり lng〜lgを数回に分 けて経口的に摂取すれば良い。 このように、 本発明の骨形成促進及び/又は骨吸 収抑制剤を摂取することにより、 骨粗鬆症等の各種骨疾患を予防することができ る。 なお、 β 2ミクログロブリン、 ヒストン、 捕体第 3成分、 単球走化性タンパ ク質 1、 リゾチーム、 リボヌクレアーゼ、プロトロンビン、チトクローム Ρ- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、プラスミン、補体第 4成分、 i3デフヱンシンは、 元来、 血漿や乳由来の成分であり、 ラットにおける急性毒性 は認められなかった。 また、 これらの有効成分を飼料に含有させて、 家畜や家禽 等の骨形成を促進させたり、 骨吸収を抑制させることもできる。
次に、 実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、 これらは単に本 発明の実施態様を例示するのみであり、 本発明はこれらによって何ら限定される ものではない。
[試験例 1 ]
(骨吸収抑制作用）
j3 2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム P- 450、 プラス ミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン及ぴプラスミンについて骨吸収抑制 作用を調べた。 試験に供した各有効成分はいずれも市販の物を用いた。 試験に供 した各有効成分の由来及び各有効成分の最終濃度は表 1記載の通りである。
生後 10〜20日齢の ICR系マウスの長管骨を摘出し、軟組織を除去した後、 5 % 牛胎児血清を含む a -MEM (Flow Laboratories社製)溶液中で骨を機械的に細切し、 破骨細胞を含む全骨髄細胞を得た。この破骨細胞を含む全骨髄細胞を約 2 X 106細 胞になるように象牙片の上に撒き込み、 5 %牛胎児血清を含む α - MEM溶液でスポ ットした。 2時間後、 2ミクログロブリン、 ヒストン、 捕体第 3成分、 単球走化 性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、 チトクロー ム P - 450、プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン及びプラスミンを、 表 1記載のそれぞれの最終濃度となるように、 5 %牛胎児血清を含む α -MEM溶液 を加え、 37°Cで 5日間培養し、 既存の破骨細胞の骨吸収抑制活性を調べた。
骨吸収抑制作用の評価は、 培養後、 象牙片上の細胞を剥がしてへマトキシリン 染色し、 PIASLA - 555 により画像解析して骨吸収窩（ピット） の数を測定した （瀬 野悍二ら，研究テーマ別動物培養細胞マニュアル， pp. 199-200, 1993)。すなわち、 ピット数が少なレ、ということは、 破骨細胞の活性が低下して骨吸収が抑制された ことを意味している。また、ピットァッセィで骨吸収抑制効果が示された物質は、 動物実験でも骨吸収の抑制効果が示されており （Toba ら、 Bone, vol. 27, p. 403-408, 2000)、 一般的にピットアツセィは骨吸収抑制効果を調べる上で適し た実験系である。 対照として、 有効成分無添加のものを用い、 有効成分無添加の ものの骨吸収活性を 100%としたときのそれぞれの骨吸収活性 (%) で表した。 その結果を表 1に示す。
Figure imgf000014_0001
プラスミノーゲン 1 z g/ml) 44.1 士 37.9
(シグマ社製） 10 13.8 土 19.9
100 2.0 土 2.8 トランスフェリン 1 /z g/ml) 70.7 土 36.6
(フナコシ 10 51.9 士 19.4 チトクローム p- 450 1 94.7 土 10.2
(ゥサギ） 10 83.0 士 27.6
(シグマ社製） 100 75.3 士 16.3 プロトロンビン 0.1 g/ml) 62.0 士 19.7
(シグマ社製） 1 o b 35.1 士 16.0
10 25.1 土 20.1 プラスミン 1 (μ g/ml) 54.1 土 27.1
(シグマ社製） 10 23.3 士 19.1
100 5.0 士 2.5 トロンビン 1 (μ g/ml) 55.0 土 16.5
(シグマ社製） 10 39.1 士 13.0
100 26.3 士 15.1 本発明の有効成分である iS2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単 球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌクレアーゼ、 プロトロンビン、 チト クローム P- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフヱリン、 プラスミン及ぴトロン ビンを添加したものはレ、ずれも、 有効成分無添加のものに比べ骨吸収活性が抑制 されており、 顕著な骨吸収抑制作用を有することが判った。
[試験例 2]
(骨芽細胞增殖作用）
プロ トロンビン、チトクローム P - 450、プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン及びプラスミンについて骨芽細胞増殖作用を調べた。 試験に供した各 有効成分は ヽずれも市販のものを用いた。 試験に供した各有効成分の由来及び各 有効成分の最終濃度は表 2記載の通りである。
マウス骨芽細胞 MC3T3- E1 細胞を 10%牛胎児血清を含む a - MEM培地（Flow Laboratories社製） で、 2 X 104/mlの細胞数で 96穴プレートに播種し、 5% C02 存在下、 37°Cで 24時間培養し、試験用培養細胞とした。 そして、培地を牛胎児血 清を含まない α— MEM培地に交換し、プロトロンビン、チトクローム P- 450、プラ スミノーゲン、 トランスフェリン、 プラスミン及ぴトロンビンを表 2記載のそれ ぞれの最終濃度となるよう培地に添加して、 37°Cで 18時間培養した。これにプロ
。
モデォキシゥリジン (BrdU)を用いたセルプロロフィレーションアツセィキット
(アマシャムバイオサイエンス社製） で細胞増殖活十生を調べた。 対照として、 有 効成分無添加のものを用い、 有効成分無添加のも曰のの細胞増殖活性を 100%とし たときのそれぞれの細胞増殖活性 (%) で表した。 その結果を表 2に示す。 表 2
有効成分 濃度 相対活性 (％) プラスミノーゲン 0. 5 g/ml) 163 土 21
(シグマ社製） 5 235 土 27 卜ランスフェリン 0. 5 g/ml) 146 士 17
(フナコシ社製） 5 235 土 17 チトクローム P- 450 (ゥサギ） 0. 5 ( t g/ml) 172 士 15
(シグマ社製） 5 199 士 22
50 220 土 27 プロトロンビン 201 士 11
(シグマ社製） 353 土 2
379 土 3
プラスミン 0. 5 ( ^ g/ml) 141 土 10 (シグマ社製） 5 206 土 23 トロンビン 0. 1 ( μ g/ml) 134 土 9 (シグマ社製） 1 165 士 11
10 176 土 20 プロ トロンビン、チトクローム P - 450、プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 プラスミン及ぴトロンビンを添加したものはレヽずれも有効成分無添加のものに比 ベ、マウス骨芽細胞 MC3T3- E1増殖活性が濃度依存的に顕著に增加しており、骨芽 細胞増殖作用を有することが判つた。
[試験例 3 ]
(骨芽細胞分化促進作用）
補体第 4成分及び βデフェンシンの骨芽細胞分化促進作用を調べた。すなわち、 ヒト由来前骨芽細胞 MG63細胞を、 10%牛胎児血清を含む DMEM培地 (Flow
Laboratories社製） を用いて、 2 X 104/mlの細胞数で 96穴プレートに播種し、 5% C02存在下、 37°Cで 4日間培養し、試験用培養細胞とした。 そして、培地に 1%牛 胎児血清を含む培地に交換し、補体第 4成分（Complement component C4, C8195、 シグマ社製） を最終濃度 0. 1、 1、 及ぴ 10 μ g/mlとなるように、 また、 βデフェ ンシン （ デフエンシン 1及ぴ 2、 株式会社べプチド研究所製） を最終濃度 0. 1、 1、 及び 10 μ g/mlとなるように培地に添加して、 37°Cで 5日間培養した。 培養上 清を回収し、 Procollagen Type I C- peptide EIA Kit (Takara MK101、 宝酒造社 製)にて培養上清中の I型コラーゲン量を測定することにより骨芽細胞分化促進 活性を調べた。 コントロールとして、 補体第 4成分及び デフヱンシンが無添カロ のものを用いた。 コラーゲン産生量は、 コントロールの I型コラーゲン測定量に 対するそれぞれのサンプルの I型コラーゲン測定量の割合 （％) で表した。 その 結果を表 3に示す。 表 3 最終濃度 （ /πι1) コラーゲン産生量 （％) コントロール （無添加） 100 ±6 捕体第 4成分 0. 1 138±7
1 169± 15
10 161土 9
j3デフェンシン 1 0. 1 127± 11
183±9
10 197土 18
i3デフェンシン 2 0. 1 134±9
1 147 ±5
10 177± 14
捕体第 4成分及び βデフエンシンを添加した群はいずれもコントロール （補体 第 4成分及び デフヱンシン無添加） 群に比べ、 I型コラーゲン量が増加してお り、 骨芽細胞分化促進作用を有することが判つた。 以上に示したように、 [試験例 1 ]の試験結果から、 /3 2ミクログロブリン、 ヒ ストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リポヌクレアー ゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム Ρ - 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリ ン、 トロンビン、 プラスミン、及びこれらの酵素分解物は、 破骨細胞による骨吸 収を顕著に抑制すること、 また、 [試験例 2 ]の試験結果から、 プロトロンビン、 チトクローム Ρ - 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラ スミン、及ぴこれらの酵素分解物は、 破骨細胞による骨吸収を抑制するとともに 骨芽細胞の增殖を促進することにより骨形成を促進すること、さらに、 [試験例 3 ] の試験結果から、 捕体第 4成分、 βデフェンシン、 及びこれらの酵素分解物は、 骨芽細胞の分化を促進することにより骨形成を促進することが判る。
[実施例 1 ]
( 2ミクログロプリン含有骨吸収抑制剤） 既知の方法（Hoshi F.， D. Nagai, S. Higuchi, T. Noso, A. Takahashi, S. awamura, Veterinary Immunology and Iramunopathology, 53， 29—38， 199b. Purification of bovine beta2— microglobulin from colostrums and its complete amino acid sequence)に従い、 ゥシ初孚しょり j3 2ミクログロプリンを調製した。 すなわち、 10 1のゥシ初乳より遠心分離法により脱脂乳を得、 1 N塩酸で pH を 4に調整し、凝集したカゼィンを遠心分離で沈殿させた。 20 gのカゼィンを 5 mM リン酸ナトリゥム緩衝液 (PBS ： pH 8. 3) 1 1に溶解し、 同緩衝液で平衡化したジ ェチルアミノエチル (DEAE)セルロース （DE- 52:ワットマンネ環） カラムに吸着さ せた。 平衡化緩衝液で洗浄し、 得られた画分を SDS—ポリアクリルアミドゲノレ電 気泳動 (SDS-PAGE)で分析し、 12 kDaのタンパク質を含む画分を、 限外濾過により 濃縮し、 5 mM PBS (pH 8. 3) に対して 4°Cでー晚透析した。 濃縮液を 5 mM PBS (pH 8. 3)で平衡化したセフアデックス G— 75カラムからなるゲノレ濾過クロマトグラフ ィ一に通した。 12 kDaのタンパク質を含む画分を限外濾過で濃縮し、 lO mM酉乍酸 ァンモニゥム溶液に対して透析した。 これを凍結乾燥して本発明の有効成分であ る j3 2ミクログロブリン 12 mgを得た。この j3 2ミクログロブリン 12 mgを乳衛 120 mgと混合し、 顆粒状に成型して本発明の骨吸収抑制剤を得た。
なお、 ヒストン、 捕体第 3成分、 単球走化製タンパク質 1、 リゾチーム、 及ぴ リボヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム P- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 捕体第 4成分及び i3デフェンシン についても、 上記 i3 2ミクログロプリンと同様の方法によりゥシ初孚 Lより調製す ることが可能である。
[実施例 2 ]
(ヒストン含有骨吸収抑制剤）
外皮を除去したサケの白子 （核酸 6%含有） 1 kgを水で洗浄した後、 脱水し、 さらに水 3 1を加えてホモゲナイザーでホモジネートを調製した。 このホモジネ ートに 0. 05 N水酸化ナトリゥム溶液を加えて pHを 6に調整し、 パパイン 20 g を加えて 35°Cで 2時間撹拌しながらタンパク質を分解した後、 80°Cで 30分間保 持して酵素を失活させて分解を終了した。 分解終了後、 遠心分離により沈殿を除 去し、得られた上清に対し 2. 5倍量の 95%ェタノールを加えて DNAを沈殿させた。 そして、 含水エタノールを濾過して除去した後、 凍結乾燥して、 DNA粉末からな る本発明の骨吸収抑制剤 65 gを得た。 なお、 この骨吸収抑制剤 1 g中にはヒスト ン 425 mgが含まれていた。
[実施例 3 ]
(プロトロンビン含有骨形成促進及び骨吸収抑制剤）
既知の方法 (Hashimoto, N. , T. Morita, and S. Iwanaga, J. Biochem. (Tokyo) , vol. 97, p. 1347-1355, 1985)に準じ、 ゥシ血漿プロトロンビンを調製した。 すな わち、 0. 01 Mになるようにクェン酸ナトリウムを加え、 遠心分離によりゥシ血漿 を得た。 10 1のゥシ血漿に 0. 1 Mになるようにクェン酸バリゥムをゆつくりと加 え、 緩やかに 1時間撹拌した後、 4，000rpmで 10分間遠心分離した。 得られた沈 殿を 0. 01 M塩化バリウム、 ImMベンザミジン塩酸、 0. 02%アジ化ナトリウムを含 む、 0. 1 M塩化ナトリゥム溶液で洗浄し、 遠心分離した。 この洗浄操作を 2回繰 り返した。 バリウム沈殿を 40%飽和硫安 1 1で懸濁し、 1 mMになるようにジィソ プロリルフォスフオロフルオリデート （DFP)を加えて、 1 晚撹拌した。 5, 000rpm で 30分間、 遠心分離を行ない、 上清を得た。 この上清に 67%飽和度になるよう に飽和硫安を加え、 5, 000rpm、 30分間の遠心分離により、 沈殿を回収した。 この 沈殿を 0. 2 M塩化ナトリゥム、 1 niM DFP、 1 mMベンザミジン塩酸を含む 0. 05 M リン酸ナトリゥム緩衝液 ( H 6. 0) 100〜 150mlで溶解し、 同じ緩衝液 20 1に対し て 1 晚透析を行なった。 不溶成分を遠心分離で除いた後、 DEAE-セフアデックス A50クロマトグラフィーに供した。 0. 2 Mの塩化ナトリウム、 I mMベンザミジン 塩酸を含む 0. 05 Mリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH 6. 0)で平衡化した DEAE—セファ デックス A- 50カラム（200 X 100 mm)に供し、 塩化ナトリウム濃度を 600 mMまで 次第に高め、 吸着したタンパク質を溶出した。 プロトロンビンは塩化ナトリウム 濃度が約 300 mMとなったところで溶出した。これを透析により脱塩し、次いで、 0. 1 Mの塩化ナトリウム、 1 mMベンザミジン塩酸を含む 50mMトリス一塩酸緩衝液 (pH 6. 3)で平衡化したブルーセファロース CL- 6Bカラム （80 X 200mm)に供し、 平 衡化緩衝液で洗浄した後、 塩化ナトリゥム濃度を 4 Mとした緩衝液で吸着したタ ンパク質を溶出した。 これを透析により脱塩し、 凍結乾燥して本発明の有効成分 であるプロトロンビン 1. 0 gを得た。 このプロトロンビン l. Ogを乳糖 9. 0 gと混 合し、 顆粒状に成型して本発明の骨形成促進及び骨吸収抑制剤を得た。
なお、 2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンパク 質 1、 リゾチーム、 及びリボヌクレアーゼ、 チトクローム P- 450、 プラスミノー ゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 補体第 4成分及び デフェ ンシンについても上記プロトロンビンと同様の方法によりゥシ血漿より調製する ことが可能である。
[実施例 4 ]
(プロトロンビン含有骨形成促進及び骨吸収抑制剤）
牛乳からプロトロンビンを含む画分を調製した。 陽イオン交換樹脂の SP セフ ァロース HP (アマシャムバイオサイエンス社製） 400 gを充填したカラム （直径 5 cmX高さ 30 cm) を脱イオン水で十分洗浄した後、 このカラムに未殺菌脱脂乳 40 1 (pH 6. 7)を流速 25 ml/minで通液した。 通液後、 このカラムを脱ィオン水で 十分洗浄し、 1. 5M塩化ナトリウムを含む 0. 02M炭酸緩衝液 (pH 7. 0)で樹脂に吸着 したタンパク質画分を溶出した。 そして、 この溶出液を逆浸透 (R0)膜により脱塩 して、 濃縮した後、 凍結乾燥してタンパク質画分粉末 21 g を得、 本発明の骨形 成促進及び骨吸収抑制剤とした。 なお、 このタンパク質画分粉末には、 プロトロ ンビンが 0. 01重量0/。含まれていた。
[実施例 5 ]
(リボヌクレアーゼ含有骨吸収抑制剤）
リポヌクレアーゼ （シグマ社製） 50mgに、含水結晶ぶどう糖 93. 5g、 炭酸カル シゥム 5g、 シュガーエステル lg、 香料 0. 5gを加え、 混和した後、 タブレット状 に打錠して、 本発明のリボヌクレアーゼ含有骨形成促進剤を製造した。
[実施例 6 ]
(チトクローム P- 450含有骨形成促進及ぴ骨吸収抑制剤） チトクローム p - 450 (シグマ社製） 10mgに、 含水結晶ぶどう糖 93. 5g、 炭酸カル シゥム 5g、 シュガーエステル lg、 香料 0. 5gを加え、 混和した後、 タブレグ ト状 に打錠して、 本発明のチトクローム P- 450含有骨形成促進及び骨吸収抑制剤を製 造した。
[実施例 7 ]
(補体第 4成分及び βデフェンシン含有骨形成促進剤）
S-Sepharose カラム （フアルマシア社製） に脱脂した牛乳 10 1を通液した後、 20mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)で十分洗浄した。 1. 5M食塩を含むリン酸緩衝液 (pH8. 5) の比率を、 1時間で 100%まで上昇させながら吸着しているタンパク質をグラジェ ント溶出し、 溶出時間 15分の位置で捕体第 4成分 0. 5mgを、 20分の位置で βデ フェンシン 0. 3mgを回収した。
このようにして得られた捕体第 4成分及ぴ /3デフェンシンは、 そのまま本発明 の骨形成促進剤として使用可能である。
[実施例 8 ]
(補体第 4成分含有骨形成促進剤）
捕体第 4成分 (Complement component C4, C8195、 シグマ社製） lmg に、 含水結 晶ぶどう糖 93. 4g、炭酸カルシウム 5g、シュガーエステル lg、香料 0. 5gをカロえ、 混和した後、 タブレツト状に打錠して、 本発明の補体第 4成分含有骨形成促進剤 を製造した。
[実施例 9 ]
( βデフエンシン含有骨形成促進剤）
βデフヱンシン ( β -Defensin-1, 4337- s、 株式会社ぺプチド研究所製） lmg に、 含水結晶ぶどう糖 93. 4g、 炭酸カルシウム 5g、 シュガーエステル lg、 香料 0. 5gを加え、 混和した後、 タブレット状に打錠して、本発明の デフヱンシン含 有骨形成促進剤を製造した。 [実施例 1 o ]
(補体第 4成分及び βデフエンシン含有骨形成促進剤）
補体第 4成分 （Complement component C4, C8195、 シグマ社製） 1 mg、 βデ フェンシン （ - Defensin- 2， 4338-s, 株式会社ペプチド研究所製） lmgに、 含 水結晶ぶどう糖 93. 4g、 炭酸カルシウム 5g、 シュガーエステル lg、 香料 0. 5g を加え、 混和した後、 タブレット状に打錠して、 本発明の補体第 4成分及ぴ デフエンシン含有骨形成促進剤を製造した。
[実施例 1 1 ]
( 2ミクログロプリン含有骨吸収抑制用飲料）
表 4に示した配合で原料を混合した後、 容器に充填し、 加熱殺菌して、 本発明 の j3。ミクログロプリン含有骨吸収抑制用飲料を製造した。 表 4 混合異性化糖 15. 0 (重量。 /0)
果汁 10. 0
クェン酸 0. 5
/3 2ミクログロプリン
(実施例 1 ) 0. 05
香料 0. 1
カノレシゥム 0. 5
水 73. 85
[実施例 1 2 ]
(リゾチーム含有骨吸収抑制用ビスケット）
表 5に示した配合で原料を混合し、 ドウを作成して成型した後、 焙焼して、 本 発明のリゾチーム含有骨吸収抑制用ビスケットを製造した。 表 5 小麦粉 50.35 (重量％)
砂糖 20.0
金； fe& 0.5
マーガリン 12.5
卵 12.1
水 3.7
炭酸水素ナトリウム 0.1
重炭酸アンモニゥム 0.2
炭酸カルシウム 0.5
リゾチーム （シグマ社製） 0.05
[実施例 13]
(補体第 3成分含有骨吸収抑制用ゼリ一）
表 6に示した配合で原料を混合した後、 容器に充填し、 加熱殺菌して、 本発明 の補体第 3成分含有骨吸収抑制用ゼリ一を製造した。 表 6
20.0 (重量％)
グラニュー糖 15.0
水あめ 5.0
1.0
補体第 3成分 （シグマ社製) 0.05
香料 0.11
カノレシゥム 0.1 水 58. 74
[実施例 1 4 ]
(ヒストン含有骨吸収抑制用プロセスチーズ）
表 7に示した配合で原料を混合した錄、 85°Cで轧化して、 本発明のヒストン含 有骨吸収抑制用プロセスチーズを製造した。 表 7 ゴーダチーズ 43. 0 (重量％)
チェダーチーズ 43. 5
クェン酸ナトリウム 2. 0
ヒストン H1/2A (シグマ社製) 0. 05
乳由来カルシウム 1. 0
水 10. 45
[実施例 1 5 ]
(単球走ィヒ性タンパク質 1含有骨吸収抑制用ョーダルト）
12重量％還元脱脂乳を 90°Cで 20分間加熱殺菌した後、 ラクトバチルス ·ァシ ドフィルス（Lactobacillus acidophilus)及ぴストレップトコッカス ·サーモフ イノレス（Streptococcus thermophilus) をそれぞれ接種し、 2種類のスターター カルチャーを得て両者を等量混合した。 そして、 表 8に示した配合で原料を混合 した後、 発酵させて、 本発明の単球走化性タンパク質 1含有骨吸収 制用ョーグ ルトを製造した。 表 8 ョーグノレトミックス 96. 95 (重量％)
スターター力ノレチヤ一 3. 0
単球走化性タンパク質:
(バイオテック社） 0. 05
[実施例 1 6 ]
( i3 2ミクログロプリン及ぴ捕体第 3成分含有骨吸収抑制用等し児用調製粉乳） 表 9に示した配合で原料を混合し、 3 2ミクログロプリン及び補体第 3成分含 有骨吸収抑制用乳児用調製粉轧を製造した。 表 9 脱脂粉乳 75. 85 (重量％)
乳清タンパク質濃縮物 2. 36
乳糖 13. 86
ミネラル混合物 0. 32
脂溶性ビタミンを含む脂肪 7. 53
2ミクログロブリン (シグマ社製) 0. 03
補体第 3成分 （シグマ社製） 0. 05
[実施例 1 7 ]
(ヒス トン含有骨吸収抑制用ィヌ飼育用飼料）
表 1 0に示した配合で原料を混合して、 本発明のヒストン含有骨吸収抑制用ィ ヌ飼育用飼料 （ドッグフード） を製造した。 表 1 0 女ノ、 _百5Z^ ffi口
脱 H旨粉？L 13.95
大百油 4.0
Πーン油 2.0
パーム油 28.0
トウ ロコシでんぷん 15.0
J、 "ノ J q 0
ふすま 2. o0
ビタミン混合物 9.0
ミネラル混合物 2.0
セルロース 3.0
ヒストン H1/2A (シグマ社製） 0.05
[実施例 18]
(トランスフェリン及びチトクローム P-450含有骨形成促進及ぴ骨吸収抑制用果 汁飲料）
表 11に示した配合で原料を混合した後、 容器に充填し、 加熱殺菌して、 本発 明のトランスフェリン及びチトクローム P- 450含有骨开成促進及ぴ骨吸収抑制用 果汁飲料を製造した。 表 1
混合異性化糖 15.0(重量％)
果汁 10.0
クェン酸 0.5
トランスフェリン (フナコシ社製) 0.02
チトクローム P- 450 (シグマ社製） 0.03
香料 0.1
カルシウム 0.5 水 73.85
[実施例 19]
(プラスミノーゲン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用ビスケット）
表 12に示した配合で市販のプラスミノーゲンを用いて原料を混合し、 ドウを 作成して成型した後、 焙焼して、 本発明の骨形成促進及び骨吸収抑制用ビスケッ トを製造した。 表 12
小麦粉 50.0(重量％)
砂糖 20.0
食塩 0.5
マーガリン 12.5
卵 12.1
水 4.05
炭酸水素ナトリウム 0.1
重炭酸アンモニゥム 0.2
炭酸カルシウム 0.5
プラスミノーゲン （シグマ社製） 0.05
[実施例 20]
(プラスミン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用ビスケット）
表 13に示した配合で市販のプラスミンを用いて原料を混合し、 本発明の骨形 成促進及び骨吸収抑制用ビスケットを製造した。 表 13
小麦粉 50.0(重量％)
砂糖 20.0 食塩 0. 5
マーガリン 12. 5
卵 12. 1
水 4. 05
炭酸水素ナトリウム 0. 1
重炭酸アンモニゥム 0. 2
炭酸カルシウム 0. 5
プラスミン （シグマ社製） 0. 05
[実施例 2 1 ]
(トランスフェリン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用ゼリ一)
表 1 4に示した配合で原料を混合した後、 容器に充填し、 加熱殺菌して、 本発 明のトランスフェリン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用ゼリーを製造した。 表 1 4
果糖 20. 0 (重量0 /0)
グラニュー糖 15. 0
水あめ 5. 0
1. 0
トランスフェリン (フナコシ社製) 0. 05
香料 0. 11
炭酸カルシウム 0. 45
水 58. 39
[実施例 2 2 ]
(プロトロンビン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用プロセスチーズ）
表 1 5に示した配合で市販のプロ トロンビンを用いて原料を混合した後、 85°C で乳化して、 本発明のプロトロンビン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用プロセス チーズを製造した。 表 15
ゴーダチーズ · 43.0(重量％)
チヱダーチーズ 43.5
クェン酸ナトリウム 2.0
プロトロンビン （シグマ社製） 0.05
乳由来カルシウム 1.0
水 10.45
[実施例 23]
(トロンビン含有骨形成促進及ぴ骨吸収抑制用プロセスチーズ）
表 16に示した配合で市販のトロンビンを用いて原料を混合し、 本発明のトロ ンビン含有骨形成促進及び骨吸 抑制用プロセスチーズを製造した。 表 16
ゴーダチーズ 43.0(重量％)
チェダーチーズ 43.5
クェン酸ナトリウム 2.0
トロンビン （シグマ社製） 0.05
乳由来カルシウム 1.0
水 10.45
[実施例 24]
(トランスフェリン含有骨形成低進及ぴ骨吸収抑制用ョ一ダルト）
12重量％還元脱脂乳を 90°Cで 20分間加熱殺菌した後、 ラクトバチルス ·ァシ ドフイノレス（Lactobacillus acidophilus)及ぴストレプトコッカス .サーモフィノレ ス（Streptococcus thermophilus) をそれぞれ接種し、 2種類のスターターカルチ ヤーを得て両者を等量混合した。 そして、 表 1 7に示した配合で原料を混合した 後、 発酵させて、 本発明のトランスフェリン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用ョ —ダルトを製造した。 表 1 7
ョーグノレトミックス 97. 0 (重量0 /0)
スターター力ノレチヤ一 2. 95
トランスフェリン (ブナコシ社製） 0. 05
[実施例 2 5 ]
(プロ ト口ンビン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用調製粉乳) '
表 1 8に示した配合で、 実施例 3で得られたプロトロンビンを用いて原料を混 合し、 本発明の骨形成促進及び骨吸収抑制用乳児用調製粉乳を製造した。 表 1 8
脱脂粉乳 75. 85 (重量％)
乳清タンパク質濃縮物 2. 36
乳糖 13. 86
ミネラル混合物 0. 32
脂溶性ビタミンを含む脂肪 7. 53
プロトロンビン （実施例 3 ) 0. 08
[実施例 2 6 ]
(トロンビン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用乳児用調製粉乳）
表 1 9に示した配合で、 市販のトロンビンを用いて原料を混合し、 本発明の骨 形成促進及び骨吸収抑制用乳児用調製粉乳を製造した。 表 1 9 脱脂粉乳 75.85(重量％)
乳清タンパク質濃縮物 2.36
乳糖 13.86
ミネラル混合物 0.32
脂溶性ビタミンを含む脂肪 7.53
トロンビン （シグマネ： t^) 0.08
[実譲 27]
(ブラスミノーゲン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用ィヌ飼育用飼料） 表 2 0に示した配合で市販のプラスミノーゲンを用いて原料を混合して、 本発 明の骨形成促進及び骨吸収抑制用ィヌ飼育用飼料 （ドッグフード） を製造した。 表 20
大豆粕 12.0(重量％)
脱脂粉乳 14.5
大豆油 4.0
コーン油 2.0
ノーム油 28.0
トウモ口コシでんぷん 14.45
小麦粉 9.0
ふすま 2.0
ビタミ ン混合物 9.0
ミネラル混合物 2.0
セル π—ス 3.0
プラスミノーゲン (シグマ社製) 0.05
[実施例 28]
(ブラスミン含有骨形成促進及び骨吸収抑制用ィヌ飼育用飼料） 表 21に示した配合で市販のプラスミンを用いて原料を混合して、 本発明の骨 形成促進及ぴ骨吸収抑制用ィヌ飼育用飼料 （ドッグフード） を製造した。 表 2 1
大豆粕 12.0 (重量％)
脱脂粉乳 14.5
大豆油 4.0
コーン油 2.0
パーム油 28.0
トクモロコシでんぷん 14.45
小麦粉 9.0
ふすま 2.0
ビダミン混合物 9.0
ミネラル混合物 2.0
セノレロース 3.0
プヲスミン （シグマ社製） 0.05
[案施例 29]
(裙体第 4成分及ぴ βデフエンシン含有骨形成促進用乳飲料）
： 季しを、 均質圧力 120kgん m2でホモゲナイズした後、 75°Cで 15秒間加熱殺菌 しこ生乳に、 捕体第 4成分 (Complement component C4, C8195、 シグマ社製） を、 11 たり lOmgとなるように無菌下で添加し、 100 ml容量のガラス瓶に充填して 本 明の補体第 4成分及び βデフェンシン含有骨形成促進用乳飲料を製造した。
[案施例 30]
(βデフェンシン含有骨形成促進用乳飲料）
生 Lを、 均質圧力 120kgん m2でホモゲナイズした後、 75°Cで 15秒間加熱殺菌 しこ生乳に、 βデフェンシン ( - Defensin- 1,4337- s、 株式会社ペプチド研究所 製） を、 1 1当たり lOmgとなるように無菌下で添加し、 100 ml容量のガラス瓶 に充填して本発明の デフェンシン含有骨形成促進用乳飲料を製造した。
[実施例 31]
(補体第 4成分含有骨形成促進用ゼリ一）
果糖 20.0 (重量％)、 グラニュー糖 15.0(重量％)、 水飴 5.0(重量％：)、 寒天 1.0 (重量％)、香料 0.11 (重量％)、カルシウム 0.1 (重量％)、水 58.39 (重量0 /0) の割合で原料を混合して、加熱滅菌した後、補体第 4成分（Complement component C4, C8195、 シグマ社製） を、 11当たり 10mgとなるように無菌下で添加して容器に 充填し、 本発明の補体第 4成分含有骨形成促進用ゼリ一を製造した。
[実施例 32]
( βデフヱンシン含有骨形成促進用乳児用調製粉乳）
脱脂乳 75.61 (重量％)、乳清タンパク質濃縮物 2.36 (重量％)、乳糖 13.86 (重 量％)、ミネラル混合物 0.32 (重量％)、水溶性ビタミン混合物 0.32 (重量％)、 脂溶性ビタミンを含む脂肪 7.53 (重量％)の割合で原料を混合して殺菌した後、 濃縮し、噴霧乾燥して調製粉乳原料粉を製造した。これに、 ）3デフェンシン (β -Defensin-2, 4338- s、 株式会社ペプチド研究所製） を、 1 kg当たり 10mgとな るように無菌下で添加、 混合し、 本発明の 3デフヱンシン含有骨形成促進用乳 児用調製粉乳を製造した。
[実施例 33]
(補体第 4成分含有骨形成促進用ドッグフード）
大豆粕 12.0 (重量％)、脱脂粉乳 14.0(重量％)、 大豆油 4.0(重量％)、 コーン 油 2.0(重量％)、 パーム油 28.0(重量％)、 トウモロコシ澱粉 15.0(重量％)、 小 麦粉 9.0 (重量％)、 ふすま 2.0 (重量0 /0)、 ビタミン混合物 9.0 (重量0 /0)、 ミネラ ル混合物 2.0(重量％)、 セルロース 3.0(重量％)、 の割合で原料を混合して殺菌 し冷却後、 補体第 4成分 （Complement component C4， C8195、 シグマ社製） を、 1 1当たり lOmgとなるように無菌下で添加して成型し、本発明の捕体第 4成分含有 骨形成促進用ィヌ飼育用飼料 （ドッグフード） を製造した。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンパク質
1 . リゾチーム、 リポヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム P- 450、 プ ラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 補体第 4成分、 βデフェンシン、 及ぴこれらの酵素分解物のいずれか 1種以上を有効成分とする 骨形成促進及ぴ Ζ又は骨吸収抑制剤。
2 . i3 2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リボヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム P - 450、 プ ラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 及びこれらの酵 素分解物のいずれか 1種以上を配合した骨吸収抑制剤。
3 . プロ トロンビン、 チトクローム P- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフェリ ン、 トロンビン、 プラスミン、及びこれらの酵素分解物のいずれか 1種以上を配 合した骨形成促進及び骨吸収抑制剤。
4 . 補体第 4成分、 βデフェンシン、 及ぴこれらの酵素分解物のいずれか 1種 以上を配合した骨形成促進剤。
5 . 2ミクログロブリン、 ヒストン、 補体第 3成分、 単球走化性タンパク質 1、 リゾチーム、 リボヌクレアーゼ、 プロ トロンビン、 チトクローム Ρ- 450、 プ ラスミノーゲン、 トランスフェリン、 トロンビン、 プラスミン、 及ぴこれらの酵 素分解物のいずれか 1種以上を配合した骨吸収抑制用飲食品、 医薬又は飼料。
6 . プロ トロンビン、 チトクローム Ρ- 450、 プラスミノーゲン、 トランスフヱ リン、 トロンビン、 プラスミン、 及ぴこれらの酵素分解物のいずれか 1種以上を 配合した骨形成促進及び/又は骨吸収抑制用飲食品、 医薬又は飼料。
7 . 捕体第 4成分、 Ρデフェンシン、 及びこれらの酵素分解物のいずれか 1種 以上を配合した骨形成促進用飲食品、 医薬又は飼料。
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