KR101170852B1

KR101170852B1 - 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제

Info

Publication number: KR101170852B1
Application number: KR1020067005999A
Authority: KR
Inventors: 요시카즈 모리타; 아츠시 세리자와; 히로아키 마츠야마; 무츠미 모토우리; 히로시 가와카미
Original assignee: 유키지루시 메그밀크 가부시키가이샤
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2012-08-02
Also published as: KR20060095997A; US20080206226A1; CA2539445A1; EP1669084A1; US20060286084A1; NZ584473A; EP1669084A4; WO2005030244A1; NZ545953A; AU2004275649A1

Abstract

일상의 식사 중에서 기호적으로 문제없고, 장기적?직접적으로 경구 섭취할 수 있으며, 또한 직접적으로 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제 작용을 뼈에 부여하며, 각종 골 질환의 예방 또는 개선 치료 효과를 기대할 수 있는 신규한 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제, 더 나아가서는 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제용 식음료, 의약 또는 사료를 제공한다. β₂마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 유효 성분으로 한다. 이들 물질은, 파골 세포에 의한 골 흡수를 현저히 억제하는 효과 및/또는 골아 세포의 증식이나 분화를 촉진함으로써, 골 형성을 촉진하는 효과가 있다.

Description

골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제{AGENT FOR PROMOTING OSTEOGENESIS AND/OR INHIBITING BONE RESORPTION}

본 발명은, β₂마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 유효 성분으로 하는 골 형성 촉진 및/또한 골 흡수 억제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 β₂마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 배합한 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제, 더 나아가서는 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제용 식음료, 의약 또는 사료에 관한 것이다.

최근, 고령자 인구의 증가에 따라, 골 다공증, 골절, 요통 등의 각종 골 질환이 증가하는 경향이 있다. 골 조직에서는, 끊임없이 골 형성과 골 흡수가 이루어지고, 젊을 때에는 골 형성과 골 흡수의 밸런스가 유지되지만, 나이가 듦에 따라 여러 가지의 원인으로 그 밸런스가 골 흡수 쪽으로 기운다(언커플링). 그리고, 이 상태가 장기간 계속되면 골 조직이 취약해져서, 골 다공증, 골절, 요통 등의 각종 골 질환을 발생시키게 된다. 이 언커플링을 방지할 수 있으면, 골 다공증, 골절, 요통 등의 각종 골 질환을 예방할 수 있을 것으로 생각된다.

종래부터, 언커플링을 방지하고, 각종 골 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, (1) 식이에 의한 칼슘 보급, (2) 가벼운 운동, (3) 일광욕, (4) 약품 치료 등이 행해지고 있다. 식이에 의한 칼슘 보급에는 탄산칼슘, 인산칼슘 등의 칼슘염이나 난각, 어골분 등의 천연 칼슘제가 사용되고 있다. 그러나, 이것들은 반드시 경구 섭취에 적합한 소재라고는 할 수 없다.

가벼운 운동은 조깅이나 산책 등이 좋다고 하지만, 몸이 약해져 있는 경우에는 가벼운 운동도 귀찮은 것인데, 하물며 누워지내는 노인으로서는 운동은 거의 불가능하다. 일광욕은 활성형 비타민 D3의 보급이라는 점에서는 좋다고 하지만, 이것만으로는 불충분하다. 약품 투여에는 1α-히드록시비타민 D3이나 칼시토닌 제제 등이 사용되고 있고, 골 다공증의 치료에는 유효하다는 것이 알려져 있다. 그러나, 이들 물질은 의약 그 자체이며, 식품 소재로서 사용 가능한 것은 아니다.

파골 세포는 조혈간 세포로부터 발생하여, 해면골 표면에 존재하며, 뼈를 용해하는 세포이다. 또한, 골아 세포는 골 조직 표면에 존재하여, 왕성하게 콜라겐 등의 골 기질 단백질을 합성하고 있는 골 형성에서 중심적인 역할을 하고 있는 세포이다. 이 골 기질 단백질에 인산칼슘, 히드록시아파타이트의 결정이 침작하여(석회화), 단단한 골 조직이 완성된다.

파골 세포가 골 기질을 용해하고(골 흡수), 그 후, 골아 세포가 골 기질을 합성함으로써(골 형성), 골의 형성이나 성장(모델링), 대사(리모델링)가 일어난다고 생각되고 있다.

본 발명자들은 식품 소재로서 사용 가능한 골 형성 촉진 작용이나 골 흡수 억제 작용을 갖는 물질을 얻기 위해, 유청 단백질 중에 존재하는 골 형성 촉진 인자 및 골 흡수 억제 인자를 계속 탐색하여 왔다. 그 결과, 역침투막이나 전기 투석 등의 처리에 의해, 유청 단백질의 수용성 분획으로부터 유청 유래의 염을 제거한 단백질 및 펩티드 혼합물에 골 강화 작용이 있는 것을 발견하였다(일본 특허 공개 평4-183371호 공보). 그리고, 이 단백질 및 펩티드 혼합물의 수용액을 에탄올 처리, 가열 처리, 가염 처리, 한외 여과막 처리하여 얻어지는 분획에 골아 세포 증식 촉진 작용 및 골 강화 작용이 있는 것을 발견하였다(예컨대, 일본 특허 공개 평5-176715호 공보 및 일본 특허 공개 평5-320066호 공보). 또한, 젖 중에 미량으로 밖에 존재하지 않는 염기성 단백질에 골아 세포 증식 촉진 작용, 골 강화 작용 및 골 흡수 억제 작용이 있는 것을 발견하였다(일본 특허 공개 평8-151331호 공보).

본 발명자들은 탐색을 더 진행시키고, 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제 작용을 갖는 활성 본체의 분리 정제를 시도하여 그 물질을 동정한 바, 기지 물질인 β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민 및 이들의 효소 분해물에 의해, 파골 세포에 의한 골 흡수가 현저히 억제되는 것을 발견하였다.

또한, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민 및 이들의 효소 분해물에 의해, 파골 세포에 의한 골 흡수가 현저히 억제되는 동시에, 골아 세포의 증식을 촉진함으로써 골 형성이 촉진되는 것을 발견하였다.

또한, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물에 의해, 골아 세포의 분화를 촉진함으로써 골 형성이 촉진되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성함에 이르렀다.

β₂마이크로글로불린(β₂-Microglobulin)은 분자량 약 11.6 kDa의 단백질로서, 주요 조직 적합 복합체(MHC)의 구성 성분이다. 혈액을 비롯하여 전신 조직 중에 널리 분포되어 있는 것이 알려져 있고, 인간이나 소에서는 젖 중에도 존재하고 있는 것이 보고되어 있다. β₂ 마이크로글로불린의 뼈에 대한 작용에 관해서는, 골 대사 회전의 마커로서, 고회전형 골 다공증에는 혈중 β₂마이크로글로불린 농도가 높아진다는 보고가 되어 있다[문헌(J. M. Quesada 외 6 명, 「고년 여성의 고골 리모델링의 마커로서의 혈청 β₂마이크로글로불린」 Mechanism of Aging and Development, (미국), 1998년, 102호, p.293-298)]. 또한, 배양 골아 세포 MC3T3의 증식을 촉진하였기 때문에, β₂마이크로글로불린은 골 형성을 촉진한다는 보고가 있다[문헌(E. Balint 외 2 명, 「β₂마이크로글로불린이 유발하는 뼈로부터의 미네랄 용출에서의 인터류킨(6)의 역할」, Kideny International, (미국), 2000년, 57 호, p.1599-1607)]. 한편, 골 흡수 작용에 관해서는, β₂마이크로글로불린이 뼈로부터의 칼슘 용출을 촉진한다는 보고가 있다[문헌(J. Petersen 외 1 명, 「β₂마이크로글로불린의 골 흡수에서의 인비보 효과」, American Journal of Kideny Diseases, (미국), 1994년, 23호, p. 726-730)]. 그러나, 칼슘 용출을 촉진하는 작용과 골 흡수를 억제하는 작용과는 상이하며, 본 발명자들이 발견한 β₂마이크로글로불린이 골 흡수를 억제하는 작용에 관해서 기재한 문헌은 볼 수 없다.

히스톤(Histone)은 고등 동물의 세포핵 중에 존재하는 염기성 단백질이다. 고등 동물의 경우, 유전자 정보를 담당하는 DNA(디옥시리보헥산)는 직선 거리로 약 2 m 길이라고 하지만, 그 DNA를 세포핵 중에 효율적으로 수납하기 위해 필수적인 단백질이다. 즉, DNA는 히스톤에 감긴 상태로 기능적으로 접혀져 있다. 통상, H1, H2A, H2B, H3, H4의 5 분자 종으로 이루어지고, H2A, H2B, H3, H4 각 2 분자씩 계 8 분자로 하나의 집합체를 형성한다. 그 집합체에 DNA가 감기고, 크로마틴으로 불리는 단위를 형성한다. H1은 크로마틴끼리를 접착시키는 역할을 담당하고 있다. 이와 같이 히스톤과 DNA는 항상 세트이며, 중량비에서 거의 1:1의 비율로 핵 내에 존재하고 있다. 지금까지 DNA에 관해서는 핵산 및 그 구성 성분으로서 영양 효과에 관한 보고가 수많이 행해져, 핵산은 제6 필수 영양소가 아닐까라는 견해도 있다. 그러나, 이와 쌍을 이뤄 존재하는 히스톤에 관해서는 영양 효과를 보고한 예는 없다. 동물성 식품은 기본적으로 세포의 집합체이다. 따라서 식품을 섭취하는 이상, 히스톤은 동물의 종류에 관계없이 필연적으로 섭취하게 되는 단백질이다. 그러나, 인간의 경우, 백미나 밀가루, 설탕 등과 같이, 정제되어 세포핵을 함유하지 않는 식소재를 이용한 무세포 식품을 섭취하는 경우가 매우 많다. 히스톤의 골 흡수 억제 작용만을 기대하면, 세포의 덩어리인 간장이나 이리(milt) 등의 식소재를 식사에 많이 넣으면 좋지만, 미각적, 또한 식품 가공 상의 문제가 크고, 제약이 매우 크다.

보체(Complement component)는 혈청 안에 있고, 항원 항체 복합물과 반응하여 활성화되며, 복잡한 반응을 일으키면서 생리 활성을 발휘하는 효소 유사 물질이다. 현재, C1부터 C9까지의 아홉 개의 성분이 알려져 있다. Complement component 3은 C3에 상당하는 것으로, 보체 제3 성분이라고 불리우고, 보체 성분 중에서 가장 함유량이 많다. 그 구조는 분자량 10.5만의 α 쇄와 분자량 7.5만의 β 쇄가 2 지점의 S-S 결합으로 가교된 단백질이다. 이 분자량 18만의 C3은 C3 전환 효소에 의해, α쇄의 일부가 분해되어 생긴 분자량 9,000의 C3a와, 2 지점의 S-S 결합을 포함하는 나머지 분자량 17만의 C3b로 나뉜다. C3a는 비만 세포를 자극하여 히스타민 방출을 촉진하는 등, 염증 반응을 야기하는 대표적인 아나필라톡신의 하나로서 알려져 있다. C3b는 또한 C3 전환 효소에 의해 분해되고, 그 일부가 항원 항체 복합물과 공유 결합한다. 혈액 중의 대식세포 등의 식세포는 세포 표면에 C3b 수용체를 가지고 있기 때문에, 결과적으로 이 반응은 식세포에 의한 이물의 빈식(貧食)을 항진한다. 이와 같이 보체 제3 성분(C3)은 면역 반응에 깊이 관여하는 물질이다. 이 외에 보체 제3 성분을 유효 성분으로서 함유하는 배(embryo)?태아 및 이들의 조직 배양용 영양 인자 조성물이나 불임증 치료용 조성물이 공개되어 있다(일본 특허 공개 평10-033164호 공보). 보체 제3 성분은 자기 조직인 골 조직을 분해해 가는 기능을 갖는 파골 세포에 대해서는, 반대로 그 활성을 억제하는 역할을 하는 것이 본 발명에 의해 명백해졌다.

단구 주화성 단백질-1(Monocyte chemotactic protein-1 또는 Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)은 단구나 혈관 내피, 글리오마 세포주 등이 생산하는 단구 주화성 인자이다. RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)와 함께 대표적인 C-C 케모카인 패밀리의 하나로서, 분자량은 8,000 내지 18,000, 76 아미노산으로 이루어진다. 주로 단구에 주화성을 나타내고, 호중구나 림프구에는 작용하지 않는다.

리소자임(Lysozyme)은 세균 세포벽의 뮤코펩티드 등에 존재하는 N-아세틸 뮤라민산과 N-아세틸 글루코사민 사이의 β-1→4 결합을 가수 분해하는 효소로서, 동식물계에 널리 분포하고 있다. 기질 특이성이나 분자량으로부터 4개의 군으로 나뉜다.

리보뉴클레아제(Ribonuclease)는 핵산의 일종인 리보핵산(RNA)에 작용하여, 모노뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 효소의 총칭이다.

프로트롬빈(Prothrombin)은 분자량 약 7.2 kDa의 단백질로서, 혈액 응고 II 인자라고도 불리운다. 비타민 K 의존성 혈액 응고 인자의 하나이며, 비타민 K의 존재 하에서 제X 인자에 의해 트롬빈으로 분해된다. 생성된 트롬빈은 피브리노젠을 피브린으로 분해하고, 피브린이 가교함으로써 혈액이 응고한다. 프로트롬빈은 혈액을 비롯하여, 전신 조직 중에 널리 분포하고 있는 것이 알려지고 있고, 인간이나 소에서는 젖 중에도 존재하고 있는 것이 보고되어 있다.

트롬빈(Thombin)은 전술한 바와 같이 프로트롬빈을 제X 인자 등의 효소로 분해한 것이다.

시토크롬 P-450(Cytochrome P-450)은 환원형으로 일산화탄소를 결합하여 450 nm 부근에 소렛(Soret) 흡수대를 나타내는 일군의 프로토헴 단백질의 총칭이다. 기능적으로는, 각종 스테로이드 호르몬, 담즙산, 프로스타노이드의 합성?분해 반응, 지방산의 ω 산화, 비타민 D의 활성화 반응, 무수한 외래 약물이나 체내에 받아들인 환경 오염 물질 등의 산화적 해독 반응에 관여하고 있다.

플라스미노겐(Plasminogen)은 플라스민의 전구체로서, 동물 혈장 중에 존재하고, 플라스미노겐 활성체에 의해 분자 내의 Arg-Val 결합이 절단되어 활성인 플라스민이 된다. 분자량 약 91,000의 단쇄의 당 단백질이며, 플라스민 등의 프로테아제에 의해 N 말단측의 펩티드가 절단되어 분자량 약 82,000의 변형 플라스미노겐이 된다.

플라스민(Plasmin)은 이와 같이 플라스미노겐을 플라스미노겐 활성체 등의 효소로 분해한 것이다.

트랜스페린(Transferrin)은 혈중의 수송 철과 결합하는 분자량 약 75,000의 단백질로서, 철 결합성 글로불린이라고도 불리운다. 미숙 적혈구는 트랜스페린과 결합한 철에 대한 수용체를 가지고 있으며, 혈청 철이 헤모글로빈의 합성에 이용되기 위해서는 트랜스페린과 결합해야 한다. 트랜스페린에 관해서는 막 결합형 트랜스페린 유사 단백질이 연골 세포의 형성을 촉진하는 것으로 개시되어 있지만, 연골 세포의 형성 촉진이며, 골 형성 촉진과는 메카니즘은 전혀 다르다(일본 특허 공개 2002-20311호 공보 및 재공표 특허 W001/013951호 공보).

보체 제4 성분(Complement component C4)은 혈청 중에 있고, 항원 항체 복합물과 반응하여 활성화되며, 복잡한 반응을 일으키면서 생리 활성을 발휘하는 효소 유사 물질이다. 보체 제4 성분 자체로서는 항원에 대한 특이성은 갖지 않지만, 항원 항체 복합물에 의해 활성화되고, 빈식 작용의 항진을 일으키거나, 특이 항체에 결합한 세포나 세균을 파괴하거나 한다. 보체 제4 성분은 α쇄, β쇄, γ쇄라는 3 종류의 폴리펩티드쇄로 이루어지는 분자량 210 kDa의 단백질이다. 보체 제4 성분이 골아 세포의 분화를 촉진하는 것에 관해서는 알려져 있지 않았다.

디펜신(Defensin)은 분자 내에 3개의 S-S 결합을 갖는 강한 염기성의 항균 펩티드로서 알려져 있고, 아르기닌 잔기가 4 내지 10개, 시스테인 잔기가 6개 있는 29 내지 34개의 아미노산으로 이루어지는 염기성 단백질이다. 시스테인 잔기의 존재 위치의 차이로부터, 크게 α형과 β형으로 나뉜다. 그램 양성 세균 및 그램 음성 세균에 대한 항균 활성뿐만 아니라, 곰팡이나 바이러스에 대하여도 항균 활성을 보유한다. β 디펜신은 호흡기계 상피 세포나 점막 상피 세포에서 발현하고 있고, 인간에 있어서는 6개의 유형이 알려져 있다. 디펜신에는 항균 작용 외에, 정상 세포나 암 세포에 대한 세포 상해 작용, 비만 세포로부터의 히스타민 방출 작용, 단구 주화 작용 등 널리 생체 방어에 관계하고 있는 것이 알려져 있다. 효모와 유산균의 특정한 배양액 여액을 투여하여 디펜신 등을 분비시키는 것으로 이루어지는 레트로 바이러스 감염증 치료약(일본 특허 공개 2004-115497호 공보)이나, 피부에 서의 디펜신의 발현을 자극하는 쑥 뿌리로 이루어지는 화장용 조성물 등이 공개되어 있지만(일본 특허 공개 2004-067660호 공보), 골아 세포의 분화를 촉진하는 것에 관해서는 알려져 있지 않았다.

이들 골 형성 촉진 작용 및 골 흡수 억제 작용을 갖는 물질 중, β₂ 마이크로글로불린에 관해서는 상기한 바와 같이, 뼈로부터의 칼슘 용출을 촉진하는 등의 보고가 있다. 그러나, 이것도 상기한 바와 같이, 칼슘 용출을 촉진하는 작용과 골 흡수를 억제하는 작용과는 상이하며, 본 발명자들이 발견한 β₂마이크로글로불린이 골 흡수를 억제하는 작용에 관해서 기재한 문헌은 보이지 않는다. β₂ 마이크로글로불린 이외의 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 어느 하나에 관해서도 골 형성 촉진이나 골 흡수를 억제하는 작용에 관해서 기재한 문헌은 보이지 않는다.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명은, 골 다공증, 골절, 요통 등의 각종 골 질환의 성질상, 일상의 식사 중에서 기호적으로도 문제없고, 장기적?직접적으로 경구 섭취할 수 있으며, 또한 직접적으로 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제 작용을 뼈에 부여하여, 골 다공증, 골절, 요통 등의 각종 골 질환의 예방 또는 개선 치료 효과를 기대할 수 있는 신규한 골 형성 촉진제 및 골 흡수 억제제, 더 나아가서는 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 식음료, 의약 또는 사료의 제공을 과제로 한다.

발명을 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 이들 문제점을 감안하여, 널리 식품 소재에 함유되어 있는 골 강화 작용을 나타내는 물질에 관해서 예의, 탐색을 진행하여, 골 형성 촉진 작용 및 골 흡수 억제 작용을 갖는 단백질에 관해서, 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제 작용을 갖는 성분의 분리 정제를 시도하여 그 물질을 동정한 바, 기지 물질인 β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민 및 이들의 효소 분해물이 파골 세포에 의한 골 흡수를 현저히 억제하는 것, 또한 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민 및 이들의 효소 분해물이, 파골 세포에 의한 골 흡수를 현저히 억제하는 동시에 골아 세포의 증식을 촉진함으로써 골 형성을 촉진하는 것, 또한 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물이 골아 세포의 분화를 촉진함으로써 골 형성을 촉진하는 것을 발견하였다.

그리고, 이들 물질을 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제로서 이용할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 유효 성분으로 하는 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 β₂마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 배합한 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제용 식음료, 의약 또는 사료에 관한 것이다.

발명의 효과

본 발명의 β₂마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 유효 성분으로 하는 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제는, 이것을 경구 투여함으로써, 골 다공증 등의 각종 골 질환의 예방이나 개선에 유용하다. 또한, 이들 유효 성분을 식음료, 의약, 사료 등에 배합하면, 골 형성을 촉진하거나, 또는 골 흡수를 억제하여 골 다공증 등의 각종 골 질환을 예방하고 개선하는 효과를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은, β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 배합함으로써, 파골 세포에 의한 골 흡수가 억제되는 골 흡수 억제제이다.

또한, 본 발명은 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 배합함으로써, 파골 세포에 의한 골 흡수가 현저히 억제되는 동시에, 골아 세포의 증식이 촉진되는 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제제이다.

또한, 본 발명은 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 배합함으로써, 골아 세포의 분화가 촉진되는 골 형성 촉진제이다.

β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물에 발견된 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제 작용을 이용함으로써, 골 대사를 골 형성 우위의 밸런스로 기울어지게 하는 것을 기대할 수 있다. 따라서, 본 발명은 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제 작용을 갖는 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제, 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제용 식음료, 의약 또는 사료를 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제의 유효 성분으로서 사용하는 β₂마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분 및 β 디펜신은 모두 소, 물소, 인간, 돼지, 양, 염소, 말 등의 젖 중에도 미량으로 존재하고 있고, 젖으로부터 분리 추출이 가능하다. 젖 성분으로서는 생유, 탈지유, 또는 유장으로부터 분리한 단백질 분획, 또는 생유로부터 분리한 젖 중의 세포 분획을 이용할 수 있다. β₂ 마이크로글로불린, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분 및 β 디펜신은 건강한 가축의 혈액으로부터 조제할 수도 있다. 히스톤을 추출하는 소재로서는 젖 성분 외에, 곡물 배아, 이리 등을 이용할 수 있다. 곡물 배아는 밀 배아, 쌀 배아 등을 이용할 수 있다. 이리는 연어, 송어, 대구, 청어, 오징어, 가리비 등의 어개류로부터 채취된 것을 이용하면 좋고, 특히 연어, 송어, 대구 등의 어획량이 많은 어류의 이리를 이용하는 것이, 자원의 효율적인 이용 면에서 바람직하다고 할 수 있다.

β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신은 모두 시판되고 있고, 이 시판품을 이용하는 것도 가능하다. 또한, 유전자 공학적으로 제작한 재조합을 이용하여도 좋다.

또한, β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신을, 트립신, 판크레아틴, 키모트립신, 펩신, 파파인, 칼리크레인, 카텝신, 서모라이신, V8 프로테아제 등의 단백질 분해 효소에 의해 분해한 것을 이용하여도 좋다. 예컨대, 프로트롬빈 분해물은 상기한 프로트롬빈을 단백질 분해 효소로 한정 분해한 펩티드 혼합물이다. 프로트롬빈을 팩터 X 등의 효소로 분해한 트롬빈을 이용하여도 좋다. 또한, 플라스미노겐을 플라스미노겐 활성체 등의 효소로 분해한 플라스민을 이용하여도 좋다. 트롬빈, 플라스민도 프로트롬빈, 플라스미노겐과 마찬가지로 시판되고 있고, 이 시판의 것을 이용할 수도 있다.

젖으로부터의 조제에 관해서는, 예컨대 신선한 우유를 이온 교환 수지에 접촉시켜 β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신을 포함하는 분획을 흡착시키고, 염화나트륨의 농도를 서서히 높여 용출한 후, 겔 여과 크로마토그래피에 의해 각각 얻을 수 있다.

혈액으로부터의 조제에 관해서는, 시트르산 혈장을 시트르산 바륨과 반응시키고, 불용성 바륨에 흡착된 β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신의 침전을 각각 회수한다. 또한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 순도를 높일 수 있다.

본 발명의 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제는, β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을 유효 성분으로 한다. 또한, 이 β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물 중 1종 이상을, 우유, 유음료, 커피 음료, 쥬스, 젤리, 비스킷, 빵, 국수, 소시지 등의 식음료에 배합하여도 좋고, 정제나 분말 등의 의약으로서도 좋다. 또한, 염화칼슘, 탄산칼슘, 젖산칼슘, 난각, 우유 유래의 칼슘 등의 흡수성이 양호한 칼슘제를 병용하여, 골 대사를 골 형성 우위의 밸런스로 기울어지게 함으로써, 골 강화 작용을 한층 더 높일 수도 있다.

본 발명의 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제의 투여량은 유효 성분, 연령, 치료 효과 및 병상 등에 의해 다르지만, 성인의 경우, 1일당 1 ng 내지 1 g을 수회에 걸쳐 경구 섭취하면 좋다. 이와 같이, 본 발명의 골 형성 촉진 및/또는 골 흡수 억제제를 섭취함으로써, 골 다공증 등의 각종 골 질환을 예방할 수 있다. 또한, β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분, β 디펜신은 원래 혈장이나 젖 유래의 성분이며, 래트에서의 급성 독성은 확인되지 않았다. 또한, 이들의 유효 성분을 사료에 함유시켜, 가축이나 집에서 기르는 새 등의 골 형성을 촉진시키거나, 골 흡수를 억제시킬 수도 있다.

다음에, 실시예 및 시험예를 나타내어 본 발명을 상세히 설명하지만, 이들은 단순히 본 발명의 실시 형태를 예시할 뿐이며, 본 발명은 이들에 의해 전혀 한정되지 않는다.

[시험예 1]

(골 흡수 억제 작용)

β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈 및 플라스민에 대해서 골 흡수 억제 작용을 조사하였다. 시험에 제공한 각 유효 성분은 모두 시판의 것을 이용하였다. 시험에 제공한 각 유효 성분의 유래 및 각 유효 성분의 최종 농도는 표 1에 기재한 바와 같다.

생후 10 내지 20 일령의 ICR계 마우스의 장관골을 적출하고, 연조직을 제거한 후, 5% 우태아 혈청을 함유하는 α-MEM(Flow Laboratories사제) 용액 중에서 뼈를 기계적으로 세단(細斷)하여, 파골 세포를 함유하는 모든 골수 세포를 얻었다. 이 파골 세포를 함유하는 모든 골수 세포를 약 2×10⁶세포가 되도록 상아편 위에 분산시키고, 5% 우태아 혈청을 함유하는 α-MEM 용액으로 스포팅하였다. 2 시간 후, β2 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈 및 플라스민을, 표 1에 기재한 각각의 최종 농도가 되도록 5% 우태아 혈청을 함유하는 α-MEM 용액을 첨가하고, 37℃에서 5 일간 배양하여, 기존의 파골 세포의 골 흡수 억제 활성을 조사하였다.

골 흡수 억제 작용의 평가는 배양 후, 상아편 위의 세포를 박리하여 헤마톡실린 염색하고, PIASLA-555에 의해 화상 분석하여 골 흡수 피트(pit)의 수를 측정하였다[문헌(세노 타케시 등, 연구 테마별 동물 배양 세포 메뉴얼, pp. 199-200, 1993)]. 즉, 피트 수가 적다는 것은 파골 세포의 활성이 저하되어 골 흡수가 억제된 것을 의미하고 있다. 또한, 피트 분석에서 골 흡수 억제 효과가 나타난 물질은 동물 실험에서도 골 흡수의 억제 효과가 나타나고 있어[문헌(Toba 등, Bone, vol.27, p. 403-408, 2000)], 일반적으로 피트 분석은 골 흡수 억제 효과를 조사하는 데 있어서 적합한 실험계이다. 대조로서, 유효 성분 무첨가인 것을 이용하여, 유효 성분 무첨가인 것의 골 흡수 활성을 100%로 하였을 때의 각각의 골 흡수 활성(%)으로 나타내었다.

그 결과를 표 1에 나타낸다.

본 발명의 유효 성분인 β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 플라스민 및 트롬빈을 첨가한 것은 모두, 유효 성분 무첨가인 것에 비해 골 흡수 활성이 억제되어 있어, 현저한 골 흡수 억제 작용을 갖는 것을 알 수 있었다.

[시험예 2]

(골아 세포 증식 작용)

프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈 및 플라스민에 대해서 골아 세포 증식 작용을 조사하였다. 시험에 제공한 각 유효 성분은 모두 시판의 것을 이용하였다. 시험에 제공한 각 유효 성분의 유래 및 각 유효 성분의 최종 농도는 표 2 기재한 바와 같다.

마우스 골아 세포 MC3T3-E1 세포를 10% 우태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배지(Flow Laboratories사제)에서, 2×10⁴/㎖의 세포수로 96 웰 플레이트에 파종하고, 5% CO₂존재 하에 37℃에서 24 시간 배양하여, 시험용 배양 세포로 하였다. 그리고, 배지를 우태아 혈청을 함유하지 않는 α-MEM 배지로 교환하고, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 플라스민 및 트롬빈을 표 2에 기재한 각각의 최종 농도가 되도록 배지에 첨가하여, 37℃에서 18 시간 배양하였다. 여기에 브로모디옥시우리딘(BrdU)을 이용한 세포 증식 분석 키트(Amersham Biosciences사제)로 세포 증식 활성을 조사하였다. 대조로서, 유효 성분 무첨가인 것을 이용하여, 유효 성분 무첨가인 것의 세포 증식 활성을 100%로 하였을 때의 각각의 세포 증식 활성(%)으로 나타내었다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 플라스민 및 트롬빈을 첨가한 것은 모두 유효 성분 무첨가인 것에 비해 마우스 골아 세포 MC3T3-E1 증식 활성이 농도 의존적으로 현저히 증가하고 있어, 골아 세포 증식 작용을 갖는 것을 알 수 있었다.

[시험예 3]

(골아 세포 분화 촉진 작용)

보체 제4 성분 및 β 디펜신의 골아 세포 분화 촉진 작용을 조사하였다. 즉, 인간 유래 전(前) 골아 세포 MG63 세포를, 10% 우태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지(Flow Laboratories사제)를 이용하여 2×10⁴/㎖의 세포수로 96 웰 플레이트에 파종하고, 5% C0₂존재 하에 37℃에서 4 일간 배양하여, 시험용 배양 세포로 하였다. 그리고, 배지를 1% 우태아 혈청을 함유하는 배지로 교환하고, 보체 제4 성분(Complement component C4, C8195, 시그마사제)을 최종 농도 0.1, 1, 및 10 ㎍/㎖가 되도록, 또한 β 디펜신(β 디펜신 1 및 2, 가부시키가이샤펩티드겐큐죠제]을 최종 농도 0.1, 1 및 10 ㎍/㎖가 되도록 배지에 첨가하여, 37℃에서 5 일간 배양하였다. 배양 상청을 회수하고, Procollagen Type I C-peptide EIA Kit(Takara MK101, 다카라슈조사제)로 배양 상청 중의 I형 콜라겐량을 측정함으로써, 골아 세포 분화 촉진 활성을 조사하였다. 대조로서 보체 제4 성분 및 β 디펜신이 무첨가인 것을 이용하였다. 콜라겐 생산량은 대조의 I형 콜라겐 측정량에 대한 각각의 샘플의 I형 콜라겐 측정량의 비율(%)로 나타내었다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

보체 제4 성분 및 β 디펜신을 첨가한 군은 모두 대조(보체 제4 성분 및 β 디펜신 무첨가) 군에 비해 I형 콜라겐량이 증가되어 있어, 골아 세포 분화 촉진 작용을 갖는 것을 알 수 있었다.

이상에 나타낸 바와 같이, [시험예 1]의 시험 결과로부터 β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민 및 이들의 효소 분해물은 파골 세포에 의한 골 흡수를 현저히 억제하는 것, 또한 [시험예 2]의 시험 결과로부터 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민 및 이들의 효소 분해물은 파골 세포에 의한 골 흡수를 억제하는 동시에, 골아 세포의 증식을 촉진함으로써 골 형성을 촉진하는 것, 또한 [시험예 3]의 시험 결과로부터 보체 제4 성분, β 디펜신 및 이들의 효소 분해물은 골아 세포의 분화를 촉진함으로써 골 형성을 촉진하는 것을 알 수 있다.

[실시예 1]

(β₂ 마이크로글로불린 함유 골 흡수 억제제)

기지의 방법(Hoshi F., D. Nagai, S. Higuchi, T. Noso, A. Takahashi, S. Kawanlura, Veterinary Immunology and Immunopathology, 53, 29-38, 1996. Purification of bovine beta2-microglobulin from colostrums and its complete amino acid sequence)에 따라, 소의 초유(初乳)로부터 β₂ 마이크로글로불린을 조제하였다.

즉, 10 ℓ의 소의 초유로부터 원심 분리법에 의해 탈지유를 얻고, 1 N 염산으로 pH를 4로 조정하고, 응집된 카제인을 원심 분리로 침전시켰다. 20 g의 카제인을 5 mM 인산나트륨 완충액(PBS: pH 8.3) 1 ℓ로 용해하고, 같은 완충액으로 평형화한 디에틸아미노에틸(DEAE) 셀룰로오스(DE-52: Whatman사제) 칼럼에 흡착시켰다. 평형화 완충액으로 세정하고, 얻어진 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석하고, 12 kDa의 단백질을 함유하는 분획을 한외 여과에 의해 농축하고, 5 mMPBS(pH 8.3)에 대하여 4℃에서 밤새 투석하였다. 농축액을 5 mM PBS(pH 8.3)로 평형화한 세파덱스 G-75 칼럼으로 이루어지는 겔 여과 크로마토그래피에 통과시켰다. 12 kDa의 단백질을 함유하는 분획을 한외 여과로 농축하고, 10 mM 아세트산암모늄 용액에 대하여 투석하였다. 이를 동결 건조하여 본 발명의 유효 성분인 β₂ 마이크로글로불린 12 mg을 얻었다. 이 β₂ 마이크로글로불린 12 mg을 젖당 120 mg과 혼합하고, 과립상으로 성형하여 본 발명의 골 흡수 억제제를 얻었다.

또한, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임 및 리보뉴클레아제, 프로트롬빈, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분 및 β 디펜신에 대해서도 상기 β₂ 마이크로글로불린과 같은 방법에 의해 소의 초유로부터 제조하는 것이 가능하다.

[실시예 2]

(히스톤 함유 골 흡수 억제제)

외피를 제거한 연어의 이리(핵산 6% 함유) 1 kg을 물로 세정한 후, 탈수하고, 또한 물 3 ℓ를 첨가하여 균질기화로 등질액을 조제하였다. 이 등질액에 0.05 N 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 6으로 조정하고, 파파인 20 g을 첨가하여 35℃에서 2 시간 교반하면서 단백질을 분해한 후, 80℃에서 30 분간 유지하여 효소를 실활시켜 분해를 종료하였다. 분해 종료 후, 원심 분리에 의해 침전을 제거하고, 얻어진 상청에 대하여 2.5 배량의 95% 에탄올을 첨가하여 DNA을 침전시켰다. 그리고, 함수 에탄올을 여과하여 제거한 후, 동결 건조하여 DNA 분말로 이루어지는 본 발명의 골 흡수 억제제 65 g을 얻었다. 또한, 이 골 흡수 억제제 1 g 중에는 히스톤 425 mg이 함유되어 있었다.

[실시예 3]

(프로트롬빈 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제제)

기지의 방법(Hashimoto, N., T. Morita, and S. Iwanaga, J. Biochem.(Tokyo), vol.97, p.1347-1355, 1985)에 준하여, 소의 혈장 프로트롬빈을 조제하였다. 즉, 0.01 M이 되도록 시트르산나트륨을 첨가하고, 원심 분리에 의해 소 혈장을 얻었다. 10 ℓ의 소 혈장에 0.1 M이 되도록 시트르산 바륨을 천천히 첨가하고, 약하게 1 시간 교반한 후, 4,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하였다. 얻어진 침전을 0.01 M 염화바륨, 1 mM 벤자미딘 염산, 0.02% 아지드화 소듐을 함유하는 0.1 M 염화나트륨 용액으로 세정하고, 원심 분리하였다. 이 세정 조작을 2회 반복하였다. 바륨 침전을 40% 포화 황산나트륨 1 ℓ로 현탁하고, 1 mM이 되도록 디이소프롤일 포스포로플루오리데이트(DFP)를 첨가하여 밤새 교반하였다. 5,000 rpm에서 30 분간, 원심 분리를 행하여, 상청을 얻었다. 이 상청에 67% 포화도가 되도록 포화 황산나트륨을 첨가하고, 5,000 rpm, 30 분간의 원심 분리에 의해 침전을 회수하였다. 이 침전을 0.2 M 염화나트륨, 1 mM DFP, 1 mM 벤자민 염산을 함유하는 0.05 M 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 100 내지 150 ㎖로 용해하고, 동일한 완충액 20 ℓ에 대하여 밤새 투석을 행하였다. 불용 성분을 원심 분리로 제거한 후, DEAE-세파덱스 A-50 크로마토그래피에 제공하였다. 0.2 M의 염화나트륨, 1 mM 벤자미딘 염산을 함유하는 0.05 M 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 DEAE-세파덱스 A-50 칼럼(200×100 mm)에 제공하여, 염화나트륨 농도를 600 mM까지 점차 높여, 흡착된 단백질을 용출하였다. 프로트롬빈은 염화나트륨 농도가 약 300 mM가 되었을 때 용출하였다. 이것을 투석에 의해 탈염하고, 이어서 0.1 M의 염화나트륨, 1 mM 벤자미딘 염산을 함유하는 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 6.3)으로 평형화 블루 세파로오스 CL-6B 칼럼(80×200mm)에 제공하여, 평형화 완충액으로 세정한 후, 염화나트륨 농도를 4 M로 한 완충액으로 흡착된 단백질을 용출하였다. 이것을 투석에 의해 탈염하고, 동결 건조하여 본 발명의 유효 성분인 프로트롬빈 1.0 g을 얻었다. 이 프로트롬빈 1.0 g을 젖당 9.0 g과 혼합하고, 과립상으로 성형하여 본 발명의 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제제를 얻었다.

또한, β₂ 마이크로글로불린, 히스톤, 보체 제3 성분, 단구 주화성 단백질 1, 리소자임, 및 리보뉴클레아제, 시토크롬 P-450, 플라스미노겐, 트랜스페린, 트롬빈, 플라스민, 보체 제4 성분 및 β 디펜신에 대해서도 상기 프로트롬빈과 같은 방법에 의해 소 혈장으로부터 조제하는 것이 가능하다.

[실시예 4]

(프로트롬빈 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제제)

우유로부터 프로트롬빈을 함유하는 분획을 조제하였다. 양이온 교환 수지의 SP 세파로오스 HP(Amersham Biosciences사제) 400 g을 충전한 칼럼(직경 5 cm×높이 30 cm)을 탈이온수로 충분히 세정한 후, 이 칼럼에 미살균 탈지유 40 ℓ(pH 6.7)를 유속 25 ㎖/min으로 통액하였다. 통액 후, 이 칼럼을 탈이온수로 충분히 세정하고, 1.5 M 염화나트륨을 함유하는 0.02 M 탄산 완충액(pH 7.0)으로 수지에 흡착된 단백질 분획을 용출하였다. 그리고, 이 용출액을 역침투(RO)막에 의해 탈염하여 농축한 후, 동결 건조하여 단백질 분획 분말 21 g을 얻어 본 발명의 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제제로 하였다. 또한, 이 단백질 분획 분말에는 프로트롬빈이 0.01 중량% 함유되어 있었다.

[실시예 5]

(리보뉴클레아제 함유 골 흡수 억제제)

리보뉴클레아제(시그마사제) 50 mg에 함수 결정 포도당 93.5 g, 탄산칼슘 5 g, 슈가 에스테르 1 g, 향료 0.5g을 첨가하고 혼화한 후, 타블릿형으로 타정하여 본 발명의 리보뉴클레아제 함유 골 형성 촉진제를 제조하였다.

[실시예 6]

(시토크롬 P-450 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제제)

시토크롬 P-450(시그마사제) 10 mg에 함수 결정 포도당 93.5 g, 탄산칼슘 5 g, 슈가 에스테르 1 g, 향료 0.5g을 첨가하고 혼화한 후, 타블릿형으로 타정하여 본 발명의 시토크롬 P-450 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제제를 제조하였다.

[실시예 7]

(보체 제4 성분 및 β 디펜신 함유 골 형성 촉진제)

S-세파로오스 칼럼(Pharmacia사제)에 탈지한 우유 10 ℓ를 통액한 후, 20 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 충분히 세정하였다. 1.5 M 식염을 함유하는 인산 완충액(pH 8.5)의 비율을 1 시간에 100%까지 상승시키면서 흡착되어 있는 단백질을 구배 용출하고, 용출 시간 15 분의 위치에서 보체 제4 성분 0.5 mg을, 20 분의 위치에서 β 디펜신 0.3 mg을 회수하였다.

이와 같이 하여 얻어진 보체 제4 성분 및 β 디펜신은 그대로 본 발명의 골 형성 촉진제로서 사용 가능하다.

[실시예 8]

(보체 제4 성분 함유 골 형성 촉진제)

보체 제4 성분(Complement component C4, C8195, 시그마사제) 1 mg에 함수 결정 포도당 93.4 g, 탄산칼슘 5 g, 슈가 에스테르 1 g, 향료 0.5g을 첨가하고 혼화한 후, 타블릿형으로 타정하여 본 발명의 보체 제4 성분 함유 골 형성 촉진제를 제조하였다.

[실시예 9]

(β 디펜신 함유 골 형성 촉진제)

β 디펜신(β-Defensin-1, 4337-s, 가부시키가이샤펩티드겐큐죠제) 1 mg에 함수 결정 포도당 93.4 g, 탄산칼슘 5 g, 슈가 에스테르 1 g, 향료 0.5g을 첨가하고 혼화한 후, 타블릿형으로 타정하여 본 발명의 β 디펜신 함유 골 형성 촉진제를 제조하였다.

[실시예 10]

(보체 제4 성분 및 β 디펜신 함유 골 형성 촉진제)

보체 제4 성분(Complement component C4, C8195, 시그마사제) 1 mg, β 디펜신(β-Defensin-2, 4338-s, 가부시키가이샤펩티드겐큐죠제) 1 mg에 함수 결정 포도당 93.4 g, 탄산칼슘 5 g, 슈가 에스테르 1 g, 향료 0.5 g을 첨가하고 혼화한 후, 타블릿형으로 타정하여 본 발명의 보체 제4 성분 및 β 디펜신 함유 골 형성 촉진제를 제조하였다.

[실시예 11]

(β₂ 마이크로글로불린 함유 골 흡수 억제용 음료)

표 4에 나타낸 배합으로 원료를 혼합한 후, 용기에 충전하고, 가열 살균하여 본 발명의 β₂ 마이크로글로불린 함유 골 흡수 억제용 음료를 제조하였다.

[실시예 12]

(리소자임 함유 골 흡수 억제용 비스킷)

표 5에 나타낸 배합으로 원료를 혼합하고, 반죽을 작성하여 성형한 후, 구워서 본 발명의 리소자임 함유 골 흡수 억제용 비스킷을 제조하였다.

[실시예 13]

(보체 제3 성분 함유 골 흡수 억제용 젤리)

표 6에 나타낸 배합으로 원료를 혼합한 후, 용기에 충전하고, 가열 살균하여 본 발명의 보체 제3 성분 함유 골 흡수 억제용 젤리를 제조하였다.

[실시예 14]

(히스톤 함유 골 흡수 억제용 가공 치즈)

표 7에 나타낸 배합으로 원료를 혼합한 후, 85℃에서 유화하여 본 발명의 히스톤 함유 골 흡수 억제용 가공 치즈를 제조하였다.

[실시예 15]

(단구 주화성 단백질 1 함유 골 흡수 억제용 요구르트)

12 중량% 환원 탈지유를 90℃에서 20 분간 가열 살균한 후, 호산성 락트산간균(Lactobacillus acidophilus) 및 스트렙토코쿠스 서모필루스(Streptococcus thermophilus)를 각각 접종하고, 2 종류의 스타터 컬쳐(starter culture)을 얻어 양자를 등량 혼합하였다. 그리고, 표 8에 나타낸 배합으로 원료를 혼합한 후, 발효시켜 본 발명의 단구 주화성 단백질 1 함유 골 흡수 억제용 요구르트를 제조하였다.

[실시예 16]

(β₂ 마이크로글로불린 및 보체 제3 성분 함유 골 흡수 억제용 유아용 조제 분유)

표 9에 나타낸 배합으로 원료를 혼합하고, β₂ 마이크로글로불린 및 보체 제3 성분 함유 골 흡수 억제용 유아용 조제 분유를 제조하였다.

[실시예 17]

(히스톤 함유 골 흡수 억제용 개 사육용 사료)

표 10에 나타낸 배합으로 원료를 혼합하여 본 발명의 히스톤 함유 골 흡수 억제용 개 사육용 사료(도그 푸드)를 제조하였다.

[실시예 18]

(트랜스페린 및 시토크롬 P-450 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 과즙 음료)

표 11에 나타낸 배합으로 원료를 혼합한 후, 용기에 충전하고, 가열 살균하여 본 발명의 트랜스페린 및 시토크롬 P-450 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 과즙 음료를 제조하였다.

[실시예 19]

(플라스미노겐 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 비스킷)

표 12에 나타낸 배합으로 시판의 플라스미노겐을 이용하여 원료를 혼합하고, 반죽을 작성하여 성형한 후, 구워서 본 발명의 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 비스킷을 제조하였다.

[실시예 20]

(플라스민 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 비스킷)

표 13에 나타낸 배합으로 시판의 플라스민을 이용하여 원료를 혼합하여, 본 발명의 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 비스킷을 제조하였다.

[실시예 21]

(트랜스페린 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 젤리)

표 14에 나타낸 배합으로 원료를 혼합한 후, 용기에 충전하고, 가열 살균하여 본 발명의 트랜스페린 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 젤리를 제조하였다.

[실시예 22]

(프로트롬빈 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 가공 치즈)

표 15에 나타낸 배합으로 시판의 프로트롬빈을 이용하여 원료를 혼합한 후, 85℃에서 유화하여 본 발명의 프로트롬빈 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 가공 치즈를 제조하였다.

[실시예 23]

(트롬빈 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 가공 치즈)

표 16에 나타낸 배합으로 시판의 트롬빈을 이용하여 원료를 혼합하여, 본 발명의 트롬빈 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 가공 치즈를 제조하였다.

[실시예 24]

(트랜스페린 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 요구르트)

12 중량% 환원 탈지유를 90℃에서 20 분간 가열 살균한 후, 호산성 락트산간균 및 스트렙토코쿠스 서모필루스를 각각 접종하고, 2 종류의 스타터 컬쳐를 얻어 양자를 등량 혼합하였다. 그리고, 표 17에 나타낸 배합으로 원료를 혼합한 후, 발효시켜 본 발명의 트랜스페린 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 요구르트를 제조하였다.

[실시예 25]

(프로트롬빈 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 조제 분유)

표 18에 나타낸 배합으로, 실시예 3에서 얻어진 프로트롬빈을 이용하여 원료를 혼합하여, 본 발명의 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 유아용 조제 분유를 제조하였다.

[실시예 26]

(트롬빈 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 유아용 조제 분유)

표 19에 나타낸 배합으로, 시판의 트롬빈을 이용하여 원료를 혼합하여, 본 발명의 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 유아용 조제 분유를 제조하였다.

[실시예 27]

(플라스미노겐 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 개 사육용 사료)

표 20에 나타낸 배합으로 시판의 플라스미노겐을 이용하여 원료를 혼합하여, 본 발명의 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 개 사육용 사료(도그 푸드)를 제조하였다.

[실시예 28]

(플라스민 함유 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 개 사육용 사료)

표 21에 나타낸 배합으로 시판의 플라스민을 이용하여 원료를 혼합하여 본 발명의 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 개 사육용 사료(도그 푸드)를 제조하였다.

[실시예 29]

(보체 제4 성분 및 β 디펜신 함유 골 형성 촉진용 유음료)

생유를 균질 압력 120 kg/cm²로 균질화한 후, 75℃에서 15 초간 가열 살균한 생유에, 보체 제4 성분(Complement component C4, C8195, 시그마사제) 및 β 디펜신(β-defensin-1, 4337-s, 가부시키가이샤펩티드겐큐죠제)을 각각 1 ℓ당 10 mg이 되도록 무균 하에서 첨가하고, 100 ㎖ 용량의 유리병에 충전하여 본 발명의 보체 제4 성분 및 β 디펜신 함유 골 형성 촉진용 유산균 음료를 제조하였다.

[실시예 30]

(β 디펜신 함유 골 형성 촉진용 유음료)

생유를 균질 압력 120 kg/cm²로 균질화한 후, 75℃에서 15 초간 가열 살균한 생유에, β 디펜신(β-Defensin-1, 4337-s, 가부시키가이샤펩티드겐큐죠제)을 1 ℓ당 10 mg이 되도록 무균 하에서 첨가하고, 100 ㎖ 용량의 유리병에 충전하여 본 발명의 β 디펜신 함유 골 형성 촉진용 유산균 음료를 제조하였다.

[실시예 31]

(보체 제4 성분 함유 골 형성 촉진용 젤리)

과당 20.0(중량%), 그래뉴당 15.0(중량%), 물엿 5.0(중량%), 한천 1.0(중량%), 향료 0.11(중량%), 칼슘 0.1(중량%), 물 58.39(중량%)의 비율로 원료를 혼합하여 가열 멸균한 후, 보체 제4 성분(Complement component C4, C8195, 시그마사제)을 1 ℓ당 10 mg이 되도록 무균 하에서 첨가하고, 용기에 충전하여 본 발명의 보체 제4 성분 함유 골 형성 촉진용 젤리를 제조하였다.

[실시예 32]

(β 디펜신 함유 골 형성 촉진용 유아용 조제 분유)

탈지유 75.61(중량%), 유청 단백질 농축물 2.36(중량%), 젖당 13.86(중량%), 미네랄 혼합물 0.32(중량%), 수용성 비타민 혼합물 0.32(중량%), 지용성 비타민을 함유하는 지방 7.53(중량%)의 비율로 원료를 혼합하여 살균한 후, 농축하고, 분무 건조하여 조제 분유 원료분을 제조하였다. 이것에 β 디펜신(β-Defensin-2, 4338-s, 가부시키가이샤펩티드겐큐죠 제조)을 1 kg 당 10 mg가 되도록 무균 하에서 첨가, 혼합하여 본 발명의 β 디펜신 함유 골 형성 촉진용 유아용 조제 분유를 제조하였다.

[실시예 33]

(보체 제4 성분 함유 골 형성 촉진용 도그 푸드)

대두박 12.0(중량%), 탈지 분유 14.0(중량%), 대두유 4.0(중량%), 옥수수유 2.0(중량%), 팜유 28.0(중량%), 옥수수 전분 15.0(중량%), 밀가루 9.0(중량%), 왕겨 2.0(중량%), 비타민 혼합물 9.0(중량%), 미네랄 혼합물 2.0(중량%), 셀룰로오스 3.0(중량%)의 비율로 원료를 혼합하여 살균하고 냉각 후, 보체 제4 성분(Complement component C4, C8195, 시그마사제)을 1 ℓ당 10 mg이 되도록 무균 하에서 첨가하여 성형하여 본 발명의 보체 제4 성분 함유 골 형성 촉진용 개 사육용 사료(도그 푸드)를 제조하였다.

Claims

트롬빈을 유효 성분으로 하는 골 형성 촉진제, 골 흡수 억제제, 또는 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제제.
트롬빈을 배합한 골 흡수 억제제.
트롬빈을 배합한 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제제.
삭제
트롬빈을 배합한 골 흡수 억제용 식음료.
트롬빈을 배합한 골 형성 촉진용 식음료, 골 흡수 억제용 식음료, 또는 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 식음료.
삭제
트롬빈을 배합한 골다공증, 골절 또는 요통의 예방 또는 치료용 의약.
트롬빈을 배합한 골 흡수 억제용 사료.
삭제
트롬빈을 배합한 골 형성 촉진용 사료, 골 흡수 억제용 사료, 또는 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제용 사료.