KR20050027215A - 프로테아제 억제제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 및 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 시스테인 프로테아제 억제제에 관한 것이며, 본 발명의 시스테인 프로테아제 억제제는 골다공증 또는 악성 종양성 고칼슘 혈증 등의 예방·치료제 및 음식품 및 사료 등에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 및 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 시스테인 프로테아제 억제제에 관한 것이며, 골다공증 또는 악성 종양성 고칼슘 혈증 등의 예방·치료제 및 음식품 및 사료 등에 이용할 수 있는 시스테인 프로테아제 억제제에 관한 것이다.
활성 중심에 티올기를 갖는 단백질 분해효소는 시스테인 프로테아제(티올프로테아제)로 총칭되고 있다. 카텝신 L, 카텝신 B 및 카텝신 K는 칼슘 의존성 중성 프로테아제(CAMP), 파파인, 피신 및 프로멜라인 등과 함께 대표적인 시스테인 프로테아제의 하나이다. 그리고 이러한 시스테인 프로테아제에 대하여 억제작용을 갖는 물질은 시스테인 프로테아제가 관여한다고 하는 질환, 예를 들면 근이영양증, 근위축증, 심근경색, 뇌졸중, 알츠하이머병, 두부 외상시의 의식장애나 운동장애, 다발성 경화증, 말초 신경병증, 백내장, 염증, 알레르기, 전격성 간염, 골다공증, 고칼슘 혈증, 유방암, 전립선암 및 전립선 비대증 등의 치료약으로서, 또는 암의 증식억제, 전이 예방약, 혈소판의 응집 억제약 등으로서 기대된다. 또한, 최근에 이르러 가쓰누마 등의 연구에 의해서 카텝신 L 및 카텝신 B와 골다공증 내지 악성 종양성 고칼슘 혈증과의 관계가 해명되어, 이에 따라 특히 카텝신 L 억제제의 골다공증 치료제 내지 악성 종양성 고칼슘 혈증 치료제로서 의약에의 적용이 주목되고 있다[참조: 가쓰누마 노부히코 저, 「BI0 media」, 제7권, 제6호, 제73-77페이지, 1992년]. 골조직에서 골아세포(osteoblast)에 의한 골형성과 파골세포(osteoclast)에 의한 골흡수가 평생동안 이루어지고 있으며, 성장기에는 골형성이 골흡수를 상회함으로써 골중량이 증가하는 한편, 노년기에는 역으로 골흡수가 골형성을 상회하므로 골중량이 감소하여 골다공증이 발병하게 된다. 이러한 골다공증의 원인으로서는 여러 가지가 있지만, 특히 골붕괴(골흡수)를 주원인의 하나로서 들 수 있다. 이것을 다시 2개의 원인으로 분류하면 다음과 같이 된다. 즉, 하나는 칼슘의 흡수와 침착 부전에 기인하는 것이며, 보다 상세하게는 칼슘의 공급량, 전송, 흡수 및 침착이 관계하는 것이며, 비타민 D 유도체, 여성 호르몬(에스트로겐) 등이 관여하고 있다고 생각된다. 다른 하나는 골지지 조직인 콜라겐의 분해촉진을 내용으로 하는 것이며, 파골세포 내의 리소좀으로부터 분비되는 시스테인 프로테아제군, 이중에서도 특히 카텝신 L, 카텝신 B, 카텝신 K에 의한 골 콜라겐 분해가 주원인이다. 파골세포 내의 리소좀으로부터 분비된 이러한 카텝신 L 및 B는 골조직중의 콜라겐의 분해를 촉진하며, 이에 의해 오래된 뼈는 용해되어, 하이드록시프롤린과 함께 칼슘이 혈중으로 유리 방출하게 된다. 따라서, 카텝신 L, 카텝신 B 및 카텝신 K의 콜라겐 분해능을 억제함으로써 과잉의 골붕괴를 방지할 수 있으며, 나아가서는 골다공증을 치료할 수 있게 된다. 이러한 골다공증의 치료제로서는 에스트로겐, 단백질 동화 호르몬, 칼슘제, 비타민 D, 칼시토닌 또는 비스포스포네이트 등이 공지되어 있다. 또한 카텝신 L 억제, 카텝신 B 억제 또는 카텝신 K 억제의 소위 시스테인 프로테아제 억제를 작용 메카니즘으로 하는 골다공증 치료제에 대해서도 몇개의 시스테인 프로테아제 억제제를 이용한 골다공증 치료제의 개발이 진행되고 있지만[참조: 일본 공개특허공보 제(평)7-179496호, 국제공개특허공보 제2002-501502호], 새로운 골다공증 치료제의 개발이 요망되고 있다.
한편, 고칼슘 혈증은 혈청중의 칼슘 농도가 정상치 이상이 되는 대사이상이며, 종양 환자에 많이 나타난다. 이것을 방치한 경우, 환자의 수명은 10일 정도라고 한다. 원인의 대부분은 종양의 골전이이다. 종양이 뼈로 전이되면, 골파괴가 일어나며, 칼슘이 혈중으로 방출된다. 당해 칼슘은 신장에서 처리되지만, 골파괴의 속도가 신장의 처리능력을 상회할 때, 고칼슘 혈증이 발현된다. 치료방법으로서는 프로세미드(furosemide)를 병용하는 생리적 식염수의 수액을 사용함으로써 신장으로부터의 칼슘 배설을 촉진시키는 방법이나, 골다공증 치료약인 칼시토닌을 사용하는 방법 등이 공지되어 있다. 즉, 골흡수를 억제하도록 하는 골다공증 치료약은 악성 종양성 고칼슘 혈증의 치료제로서도 유효하다고 할 수 있다.
본 발명자 등에 의해 이러한 목적으로 사용할 수 있는 시스테인 프로테아제 억제제로서 이미 하기의 것이 개시되어 있다.
(1) 카텝신 L 특이적 억제 폴리펩티드[참조: 일본 공개특허공보 제(평)7-179496호]
(2) 티올프로테아제 억제제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)9-221425호]
(3) 발린 유도체 및 이의 용도[참조: 일본 공개특허공보 제2001-139534호]
(4) 티올프로테아제 억제제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)7-242600호]
(5) FA-70C1 물질[참조: 일본 공개특허공보 제2000-72797호]
(6) FA-70D 물질, 이의 제조법 및 이의 용도[참조: 국제공개 제97/31122호 팜플렛]
그러나, 추가로 항원성이 없는 안전한 소재로서 사용할 수 있는 시스테인 프로테아제 억제제의 개발이 요망되고 있었다.
한편, 지금까지 모유중에 프로테아제 억제물질이 존재하는 것이 공지되어 있다. 모유에 포함되는 프로테아제 억제물질로서 공지되어 있는 것으로서는 α1-안티키모트립신, α1-안티트립신을 들 수 있으며, 인터-α2-트립신 억제물질, α2-안티플라스민, α2-마크로글로블린, 안티트롬빈III, 안티류코프로테아제 등의 억제제 등도 모유에 미량 함유되어 있다[참조: 기요사와 이사오 저, 「모유의 영양학」, 가네하라출판, 제80-81페이지].
젖 중에 있어서, 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질에 관해서는 이미 하기의 것이 개시되어 있다.
(1) 소의 초유 유래의 당쇄를 갖는 분자량 약 57kDa의 신규 시스테인 프로테아제 억제제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)7-2896호]
(2) 소의 초유 유래의 분자량 16±2kDa 또는 13±2kDa의 신규 시스테인 프로테아제 억제제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)7-126294호]
(3) 사람 모유 유래의 분자량 16±2kDa 또는 13±2kDa의 신규 단백질 및 이의 제조방법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)10-80281호]
(4) 우유로부터 조제된 우유 유래 염기성 시스타틴 및/또는 우유 유래 염기성 시스타틴 분해물을 유효성분으로 하는 골흡수 억제제[참조: 일본 공개특허공보 제2000-281587호]
(5) 젖 염기성 단백질(MBP)중에 포함되는 시스타틴 C 및 시험관 내에서 당해 시스타틴 C에 의한 골흡수 억제효과[참조: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Japan, Vol.66, No.12, pp.2531-2536, 2002]
포유류 젖에 다량으로 함유되는 단백질로서 락토페린 및 β-카세인 등을 들 수 있다. 락토페린(lactoferrin: 하기 Lf라고 약칭하는 경우가 있다)은 주로 모유중에 포함되어 있는 약 분자량 80kDa의 철 결합성 당 단백질이고, 대장균, 칸디다균, 크로스트리듐균, 포도구균 등의 유해 미생물에 대하여 항균작용을 나타내는 것으로 공지되어 있다[참조: Jounal of Pediatrics, Vol.94, p.1, 1979; Journal of Dairy Science, Vol.67, p.60, 1984]. 또한, 다양한 작용을 갖는 젖 단백질로서, 질병의 치료제로 폭넓게 이용되고 있다. 락토페린은 젖 유래의 단백질이기 때문에 안전성이 높고, 장기 연용하는 것이 가능하며, 그 자체는 거의 무미 무취하며, 각종 식품·의약품·사료의 첨가물로서, 범용성이 높은 단백질이다.
또, 질병의 치료제에 락토페린을 응용한 예로서는
(1) 항종양제[참조: 일본 특허공보 제(평)5-86932호]
(2) 항류머티스제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-186368호]
(3) IgA 생성 촉진제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)6-32743호]
(4) 변비를 개선하는 육아용 조제 분유[참조: 일본 공개특허공보 제(평)6-205640호]
(5) 혈관 신생병 치료제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)9-194388호]
(6) 경구 암 전이 억제제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)10-59864호]
(7) IgE 생성 억제제[참조: 일본 공개특허공보 제2001-158748호]
등이 개시되어 있다.
또한, Lf의 분해물의 효과에 관해서는
(8) 항균성 및 티로신아제 활성 억제(유럽 특허공보 제438750호)
(9) 세포에 대한 병원균 부착 방지[참조: 일본 공개특허공보 제(평)3-220130호)
(10)항 바이러스 작용[참조: 일본 공개특허공보 제(평)1-233226호)
등이 개시되어 있다.
또한, 철-락토페린을 유효성분으로 하는 골강화제가 골질환의 예방 및 치료에 효과적인 것이 개시되어 있다[참조: 일본 공개특허공보 제2000-281586호]. 이러한 기술은 철과 락토페린이 결합한 철-락토페린을 유효성분으로서 투여하여, 골기질인 콜라겐의 전구체인 프롤린 및 리신의 수산화에 관여하는 효소의 조효소인 철을 공급하여, 콜라겐 생성을 강화시킨다는 것이다.
상기한 바와 같이 지금까지 시스테인 프로테아제 억제물질이 밝혀지고 있으며, 동물세포, 혈액, 뇨 및 젖 중에 있어서도 몇개의 시스테인 프로테아제 억제물질이 밝혀지고 있다. 시스테인 프로테아제 억제물질 중에 단백질성인 것은 시스타틴으로 총칭되고 있다. 시스타틴 계열은 공통되는 활성부위를 갖는 것이 공지되어 있으며, 이의 서열이 밝혀지고 있다[참조: 하야이시 오사무 저, 「프로테아제와 이의 억제제」, 메디칼뷰(MEDICAL VIEW CO., LTD.)사, 제1판, 제1쇄, 제104 내지 115페이지, 1993년].
그러나, 락토페린 및 이의 부분 펩티드 및 트랜스페린이 시스테인 프로테아제 억제작용을 갖는 것은 공지되어 있지 않으며, 또한 락토페린 및 트랜스페린이 시스타틴 계열의 공통활성 부위서열과 상동성을 갖는 영역을 포함하는 것에 대해서도 공지되어 있지 않았다. 또한, 락토페린 및 이의 부분 펩티드 및 트랜스페린에 의한 시스테인 프로테아제 억제를 작용 메카니즘으로 하는 골질환의 예방·치료제에 대해서도 공지되어 있지 않았다.
발명의 개시
본 발명은 식품 소재로서 폭넓게 이용할 수 있으며, 골다공증 또는 악성 종양성 고칼슘 혈증 등의 예방·치료제 및 각종 음식품 및 사료 등에 이용할 수 있는, 범용성이 높은 시스테인 프로테아제 억제제를 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
본 발명자는 항원성이 없는 안전한 소재로서 이용할 수 있는 시스테인 프로테아제 억제물질을 예의 검색한 결과, 젖 유래의 단백질인 락토페린 및 락토페린 유래의 펩티드 단편 및 트랜스페린에 시스테인 프로테아제 억제 활성이 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 요지는 하기의 (1) 내지 (12)와 같다.
(1) 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 및 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 시스테인 프로테아제 억제제.
(2) 락토페린 및/또는 트랜스페린이 금속 포화형, 금속 부분 포화형 및 아포형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물인 상기 (1)에 기재된 시스테인 프로테아제 억제제.
(3) 락토페린 및/또는 락토페린의 부분 펩티드가 하기의 (a) 내지 (d)에 나타내는 단백질 또는 펩티드의 1종 또는 복수종의 혼합물인 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 시스테인 프로테아제 억제제:
(a) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드,
(b) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 역위를 포함하며, 또한 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드,
(c) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드,
(d) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 역위를 포함하여, 또한 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드.
(4) 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환의 예방·치료제인 상기 (1) 내지 (3)중의 어느 하나에 기재된 시스테인 프로테아제 억제제.
(5) 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환이 골다공증 또는 악성 종양성 고칼슘 혈증인 상기 (1) 내지 (4) 중의 어느 하나에 기재된 시스테인 프로테아제 억제제.
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중의 어느 하나에 기재된 시스테인 프로테아제 억제제를 첨가하여 이루어진 음식품 조성물 또는 사료 조성물.
(7) 상기 (1) 내지 (5) 중의 어느 하나에 기재된 시스테인 프로테아제 억제제를 환자에게 투여함을 특징으로 하는 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환의 치료방법.
(8) 시스테인 프로테아제 억제제의 제조를 위한 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 및 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물의 용도.
(9) 락토페린 및/또는 트랜스페린이 금속 포화형, 금속 부분 포화형 및 아포형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물인, 상기 (8)에 기재된 용도.
(10) 락토페린 및/또는 락토페린의 부분 펩티드가 하기의 (a) 내지 (d)에 기재된 단백질 또는 펩티드의 1종 또는 복수종의 혼합물인 상기 (8) 또는 (9)에 기재된 용도:
(a) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드,
(b) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 역위를 포함하며, 또한 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드,
(c) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드,
(d) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 역위를 포함하며, 또한 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드.
(11) 시스테인 프로테아제 억제제가 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환의 예방·치료제인 상기 (8) 내지 (10) 중의 어느 하나에 기재된 용도.
(12) 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환이 골다공증 또는 악성 종양성 고칼슘 혈증인 상기 (11)에 기재된 용도.
도 1은 우유 단백질의 역 자이모그래피에 의한 검출을 도시하는 도면(사진)이다.
도 2는 시스테인 프로테아제에 대한 사람 락토페린의 시스테인 프로테아제 억제효과를 도시하는 도면이다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 사람 락토페린의 부분 펩티드(사람 락토페린 펩티드 Y679-K695) 및 소 락토페린의 부분 펩티드(소 락토페린 펩티드 Y676-K692), 및 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 666 내지 682의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(사람 트랜스페린 펩티드 Y666-R682), 및 서열목록의 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 672 내지 688의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(소 트랜스페린 펩티드 Y672-R688)의 아미노산 서열을 도시하는 도면이다.
도 4는 시스테인 프로테아제에 대한 사람 락토페린 펩티드 Y679-K695의 시스테인 프로테아제 억제효과를 도시하는 도면이다.
도 5는 시스테인 프로테아제에 대한 트랜스페린의 시스테인 프로테아제 억제효과를 도시하는 도면이다.
다음에, 본 발명의 바람직한 실시 태양에 관해서 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명은 하기의 바람직한 실시 양태로 한정되지 않으며, 본 발명의 범위내에서 자유롭게 변경할 수 있는 것이다. 더욱이, 본 명세서에서 백분률은 특별히 단정하지 않는 한 질량에 의한 표시이다.
본 발명은 락토페린(예를 들면, Swiss-Prot Accession No.: P02788에 기재된 아미노산 서열을 갖는 사람·락토페린, Swiss-Prot Accession No.: P24627에 기재된 아미노산 서열을 갖는 소·락토페린, Swiss-Prot Accession No.: Q29477에 기재된 아미노산 서열을 갖는 염소·락토페린, Swiss-Prot Accession No.: O77811에 기재된 아미노산 서열을 갖는 말·락토페린), 락토페린의 부분 펩티드 및 트랜스페린(예를 들면, Swiss-Prot Accession No.: P02787에 기재된 아미노산 서열을 갖는 사람·트랜스페린, Swiss-Prot Accession No.: Q29443에 기재된 아미노산 서열을 갖는 소·트랜스페린, Swiss-Prot Accession No.: P27425에 기재된 아미노산 서열을 갖는 말·트랜스페린)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 시스테인 프로테아제 억제제에 관한 것이다.
본 발명에 사용하는 락토페린은 시판중인 락토페린이나, 포유동물(예를 들면, 사람, 소, 염소, 양, 말 등)의 초유, 이행유, 상유, 말기유 또는 이러한 젖의 처리물인 탈지유, 유장 등을 원료로 하여, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피 등의 통상적인 방법에 의해, 상기 원료로부터 분리하여 수득되는 락토페린을 사용할 수 있다. 이중에서도, 공업적 규모로 제조되고 있는 시판중인 락토페린[예를 들면, 모리나가뉴교(MORINAGA MILK INDUSTRY CO., LTD.)사 제조]을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 유전자 공학법에 의해 미생물, 동물세포 및 트랜스제닉 동물 등에서 생산한 락토페린을 사용할 수 있다.
본 발명의 시스테인 프로테아제 억제제의 효과에 있어서 락토페린중의 금속함유량은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명에서는 락토페린을 염산이나 시트르산 등에 의해 탈철한 아포형 락토페린; 당해 아포형 락토페린을, 철, 구리, 아연 및 망간 등의 금속으로 킬레이트시켜 수득되는 포화도 100% 상태의 금속 포화 락토페린; 및 100% 미만의 각종 포화도로 금속이 결합하고 있는 상태의 금속 부분 포화 락토페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 1종 또는 복수종의 혼합물을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용하는 락토페린의 부분 펩티드의 제조방법으로서는 상기 락토페린을 산 또는 프로테아제에 의해 공지된 방법으로 가수분해함으로써 제조하는 방법, 유전자 공학법을 사용하여 재조합 펩티드를 합성함으로써 제조하는 방법, 및 화학합성에 의해서 합성 펩티드를 제조하는 방법 등이 예시된다. 더욱이, 가수분해에 의해서 제조하는 방법을 사용한 경우, 본 발명의 락토페린의 부분 펩티드는 가수분해물중에 혼합물로서 포함된 형태로 사용해도 양호하며, 또한 통상적인 방법에 따라서 HPLC 등에 의해 정제한 형태로 사용해도 양호하다.
본 발명에 사용하는 락토페린 또는 락토페린의 부분 펩티드의 바람직한 형태로서는 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 사람 락토페린, 또는 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드를 예시할 수 있다. 또한, 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 소 락토페린, 또는 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드 등을 예시할 수 있다. 또, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 및 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 1 내지 19는 시그널 서열이다.
이러한 락토페린 또는 락토페린의 부분 펩티드는 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖기 때문에, 본 발명의 시스테인 프로테아제 억제제에 사용하는 것이 가능하다.
또한, 후술하는 바와 같이 완전한 길이의 락토페린이 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 점에서, 서열목록의 서열번호 1의 아미노산 번호 679 내지 695를 포함하며, N 말단측 또는 C 말단측 또는 이의 양쪽 서열을 연장시킨 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 서열목록의 서열번호 2의 아미노산 번호 676 내지 692를 포함하며, N 말단측 또는 C 말단측 또는 이의 양쪽 서열을 연장시킨 아미노산 서열을 갖는 펩티드도 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는다고 생각된다.
이러한 단백질 및 펩티드는, 예를 들면, 본 발명에 따라 이의 시스테인 프로테아제 억제 활성 영역이 밝혀졌기 때문에, 당해 영역을 포함하는 아미노산 서열에 기초하여 화학합성에 의해 수득할 수 있으며, 또한 유전자 재조합 기술 등에 의해 수득할 수 있다. 예를 들면, 당해 영역을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 기초로 적당한 프라이머를 제작하고, 당해 프라이머를 사용하여, 목적하는 염기서열을 포함하는 cDNA를 주형으로 하여 PCR 등에 의해서 염기서열을 증폭시키고, 수득된 염기서열을 적당한 발현계를 사용하여 발현시킴으로써 수득할 수 있다.
또한, 통상적으로 유전자에 있어서는 종, 족, 개체 등의 차이에 따라 1개 또는 복수개의 위치에서의 1개 또는 복수개의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위 등의 변이가 당연히 존재하며, 이러한 변이를 갖는 유전자가 암호화하는 단백질의 아미노산도 변이가 발생하는 경우가 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 락토페린 및 락토페린의 부분 펩티드에는 시스테인 프로테아제 억제 활성이 손상되지 않는 범위에 있어서, 이러한 변이를 포함하는 것도 함유된다.
여기서, 본 발명에 사용할 수 있는 락토페린 또는 락토페린의 부분 펩티드로서는 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드, 또는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하며 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드가 예시된다. 더욱이, 「1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위」로서 가능한 것은 적어도 상기 아미노산 번호의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드와 시스테인 프로테아제 사이의 입체적인 상호작용에 영향을 미치지 않으며 시스테인 프로테아제 억제 활성을 손상시키지 않는 범위에서 임의로 설정할 수 있는 것이다. 예를 들면, 복수개란, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 및 서열목록의 서열번호 2에 기재한 것 중, 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산에 있어서, 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조에서 위치나 종류에 따라서도 상이하지만, 예를 들면, 2 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 3개, 보다 바람직하게는 2개이다.
아미노산 서열에 있어서의 치환은 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 686 내지 690의 아미노산 및 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 683 내지 687의 아미노산에 있어서 아미노산의 종류를 변경하지 않는 범위에서의 치환이 바람직하다. 즉, 상기 서열에서 아미노산과 당해 아미노산을 치환하는 아미노산은 구조상의 분류에서 유사종류의 아미노산인 것이 바람직하다. 구체적으로는 상기 서열의 아미노산이 산성 아미노산 또는 산성 아미노산 아미드인 경우는 아스파라긴산, 글루탐산, 아스파라긴 또는 글루타민 중의 어느 하나와의 치환, 염기성 아미노산인 경우는 리신, 히스티딘 또는 아르기닌 중의 어느 하나와의 치환, 방향족 아미노산인 경우는 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판 중의 어느 하나와의 치환, 지방족 아미노산 또는 옥시아미노산인 경우는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린 또는 트레오닌중의 어느 하나와의 치환 및 상기 이외의 아미노산(시스테인, 메티오닌, 프롤린 등)의 경우는 시스테인 프로테아제 억제 활성을 손상시키지 않는 범위에서 임의로 치환하는 것이 바람직하다. 또한, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 이외의 범위의 아미노산 또는 서열목록의 서열번호 2에 기재한 것 중 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 이외의 범위의 아미노산에 있어서, 1개 또는 복수개의 치환·결실 등을 포함하는 것이라도 양호하다. 이 경우, 복수개란 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조에서 위치나 종류에 따라서도 상이하지만, 예를 들면, 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 바람직하게는 2 내지 3개이다.
또한, 본 발명에 사용할 수 있는 락토페린 또는 락토페린의 부분 펩티드로서는 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 혹은 펩티드 또는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 혹는 펩티드와 아미노산 서열에 있어서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지며 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드도 예시된다.
상기와 같은 락토페린 단백질 또는 락토페린의 부분 펩티드와 실질적으로 동일한 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열은, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해서 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하도록 염기서열을 변형함으로써 수득된다. 또한, 상기와 같은 변형된 염기서열은 종래부터 공지되어 있는 돌연변이 유발 기술에 의해서도 취득될 수 있다.
상기와 같은 변이를 갖는 염기서열을 적당한 세포로 발현시켜, 본 발명의 시험예 또는 실시예에 기재된 시스테인 프로테아제 억제 활성의 측정법에 의해 시스테인 프로테아제 억제 활성을 조사함으로써, 락토페린 단백질 또는 락토페린의 부분 펩티드와 실질적으로 동일한 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열이 수득된다.
본 발명에 있어서는 트랜스페린 또는 트랜스페린의 부분 펩티드를 사용할 수 있다. 본 발명에 사용하는 트랜스페린은 일반적으로 시판되고 있는 트랜스페린이나 포유동물(예를 들면, 사람, 소, 염소, 양, 말 등)의 젖 또는 혈액 등을 원료로 하며, 예를 들면 칼럼 크로마토그래피법 등에 의해 분리하여 수득되는 트랜스페린을 사용할 수 있다. 더욱이, 유전자 공학법에 의해, 미생물, 동물세포, 트랜스제닉 동물 등에서 생산된 트랜스페린을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 시스테인 프로테아제 억제제의 효과에 있어서, 트랜스페린중의 금속 함유량은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명에서는 트랜스페린을 염산이나 시트르산 등에 의해 탈철한 아포형 트랜스페린; 당해 아포형 트랜스페린을 철, 구리, 아연, 망간 등의 금속으로 킬레이트시켜 수득되는 포화도 100% 상태의 금속 포화 트랜스페린; 및 100% 미만의 각종 포화도에서 금속이 결합하고 있는 상태의 금속 부분 포화 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 1종 또는 복수종의 혼합물을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서는 트랜스페린의 부분 펩티드도 사용할 수 있다. 상기 락토페린의 시스테인 프로테아제 억제 활성 영역으로 추정되는 아미노산 서열(서열번호 1의 아미노산 번호 679 내지 695 및 서열번호 2의 아미노산 번호 676 내지 692)와, 트랜스페린의 아미노산 서열을 비교한 결과, 서열번호 3에 나타나는 사람 트랜스페린의 아미노산 서열중 아미노산 번호 666 내지 682의 영역(사람 트랜스페린 펩티드 Y666-R682) 및 서열번호 4에 나타나는 소 트랜스페린의 아미노산 서열중 아미노산 번호 672 내지 688의 영역(소 트랜스페린 펩티드 Y672-R688)에, 락토페린의 시스테인 프로테아제 억제 활성 영역과 높은 상동성이 확인되었다(도 3 참조). 이러한 점과, 후기 실시예에 나타내는 바와 같이 트랜스페린에 시스테인 프로테아제 억제 활성이 확인된 점으로부터, 상기 각각의 영역을 포함하는 사람 트랜스페린 및 소 트랜스페린의 부분 펩티드도 마찬가지로 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 것이 강하게 시사된다.
본 발명에 사용하는 트랜스페린의 부분 펩티드의 제조방법으로서는 상기트랜스페린을 산 또는 프로테아제에 의해 공지된 방법으로 가수분해함으로써 제조하는 방법, 유전자 공학법을 사용하여 재조합 펩티드를 합성함으로써 제조하는 방법 및 화학합성에 의해 합성 펩티드를 제조하는 방법 등이 예시된다. 더욱이, 가수분해에 의해 제조하는 방법을 사용한 경우, 본 발명의 트랜스페린의 부분 펩티드는 가수분해물중에 혼합물로서 포함된 형태로 사용해도 양호하며, 또한 통상적인 방법에 따라서 HPLC 등에 의해 정제한 형태로 사용해도 양호하다.
본 발명에 사용하는 트랜스페린 또는 트랜스페린의 부분 펩티드의 바람직한 형태로서는 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 사람 트랜스페린, 또는 사람 트랜스페린의 아미노산 서열인 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 666 내지 682의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드를 들 수 있다. 또한, 서열목록의 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 소 트랜스페린 또는 소 트랜스페린의 아미노산 서열인 서열목록의 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 672 내지 688의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드 등을 예시할 수 있다. 또, 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열 및 서열목록의 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 1 내지 19의 아미노산 서열은 시그널 서열이다.
서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 666 내지 682의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 및 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 672 내지 688의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드는, 본 발명에 의해서 밝혀진 시스테인 프로테아제 억제 활성 영역인 사람 락토페린의 아미노산 서열인 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열 및 소 락토페린의 아미노산 서열인 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열과의 상동성으로부터 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 것으로 생각된다. 또한, 완전한 길이의 트랜스페린이 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 점에서, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 666 내지 682의 아미노산 서열을 포함하며 N 말단측 또는 C 말단측 또는 이의 양쪽 서열을 연장시킨 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 및 서열목록의 서열번호 4의 아미노산 번호 672 내지 688을 포함하며 N 말단측 또는 C 말단측 또는 이의 양쪽 서열을 연장시킨 아미노산 서열을 갖는 펩티드도 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 것으로 생각된다.
이러한 단백질 및 펩티드는, 예를 들면, 본 발명에 의해 이의 시스테인 프로테아제 억제 활성 영역으로 추정되는 영역이 밝혀졌기 때문에, 당해 영역을 포함하는 아미노산 서열에 기초하여 화학합성에 의해 수득할 수 있으며, 또한 유전자 재조합 기술 등에 의해 수득할 수 있다. 예를 들면, 당해 영역을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 기초로 적당한 프라이머를 제작하고, 당해 프라이머를 사용하여, 목적하는 염기서열을 포함하는 cDNA를 주형으로 하여 PCR 등에 의해서 염기서열을 증폭시켜, 수득된 염기서열을 적당한 발현계를 사용하여 발현시킴으로써 수득할 수 있다.
또한, 통상적인 유전자에 있어서는 종, 속, 개체 등의 차이에 따라, 1개 또는 복수개의 위치에서의 1개 또는 복수개의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위 등의 변이가 당연히 존재하며, 이러한 변이를 갖는 유전자가 암호화하는 단백질의 아미노산에 있어서도 변이가 발생하는 경우가 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 트랜스페린 및 트랜스페린의 부분 펩티드에는 시스테인 프로테아제 억제 활성이 손상되지 않는 범위에 있어 이러한 변이를 포함하는 것도 함유된다.
여기서, 본 발명에 사용할 수 있는 트랜스페린 또는 트랜스페린의 부분 펩티드로서는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 666 내지 682의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 672 내지 688의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하며 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드가 예시된다. 더욱이, 「1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위」로서 가능한 것은 적어도 상기 아미노산 번호의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드와 시스테인 프로테아제 사이의 입체적인 상호작용에 영향을 미치지 않으며 시스테인 프로테아제 억제 활성을 손상시키지 않는 범위에서 임의로 설정할 수 있는 것이다. 예를 들면, 복수개란, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 666 내지 682의 아미노산, 및 서열목록의 서열번호 4에 기재한 것 중 아미노산 번호 672 내지 688의 아미노산에 있어서, 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조에서 위치나 종류에 따라서도 상이하지만, 예를 들면, 2 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 3개, 보다 바람직하게는 2개이다.
아미노산 서열에 있어서 치환은 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 673 내지 677의 아미노산, 및 서열목록의 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 679 내지 683의 아미노산에 있어서는 아미노산의 종류를 변경하지 않는 범위에서의 치환이 바람직하다. 즉, 상기 서열에서 아미노산과 당해 아미노산을 치환하는 아미노산은 구조상의 분류에서 유사종류의 아미노산인 것이 바람직하다. 구체적으로는 상기 서열의 아미노산이 산성 아미노산 또는 산성 아미노산 아미드인 경우는 아스파라긴산, 글루탐산, 아스파라긴 또는 글루타민 중의 어느 하나와의 치환, 염기성 아미노산인 경우는 리신, 히스티딘, 또는 아르기닌 중의 어느 하나와의 치환, 방향족 아미노산인 경우는 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판 중의 어느 하나와의 치환, 지방족 아미노산 또는 옥시아미노산인 경우는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린 또는 트레오닌중의 어느 하나와의 치환, 및 상기 이외의 아미노산(시스테인, 메티오닌, 프롤린 등)의 경우는 시스테인 프로테아제 억제 활성을 손상시키지 않는 범위에서 임의로 치환하는 것이 바람직하다. 또한, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 666 내지 682의 아미노산 이외의 범위의 아미노산, 및 서열목록의 서열번호 4에 기재한 것 중, 아미노산 번호 672 내지 688의 아미노산 이외의 범위의 아미노산에 있어서, 1개 또는 복수개의 치환·결실 등을 포함하는 것이라도 양호하다. 이 경우, 복수개란 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조에서 위치나 종류에 따라서도 상이하지만, 예를 들면, 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 바람직하게는 2 내지 3개이다.
또한, 본 발명에 사용할 수 있는 트랜스페린 또는 트랜스페린의 부분 펩티드로서는 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 666 내지 682의 아미노산 서열을 갖는 단백질 혹은 펩티드, 또는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 672 내지 688의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드와, 아미노산 서열에 있어서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지며 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드도 예시된다.
상기와 같은 트랜스페린 단백질 또는 트랜스페린의 부분 펩티드와 실질적으로 동일한 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열은, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해서, 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하도록 염기서열을 변형함으로써 수득된다. 또한, 상기와 같은 변형된 염기서열은 종래부터 공지되어 있는 돌연변이 유발 기술에 의해서도 취득될 수 있다.
상기와 같은 변이를 갖는 염기서열을 적당한 세포에서 발현시키고, 본 발명의 시험예 또는 실시예에 기재된 시스테인 프로테아제 억제 활성의 측정법에 의해 시스테인 프로테아제 억제 활성을 조사함으로써, 트랜스페린 단백질 또는 트랜스페린의 부분 펩티드와 실질적으로 동일한 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열이 수득된다.
본 발명의 시스테인 프로테아제 억제제에 있어서는 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 또는 트랜스페린 혹은 트랜스페린의 부분 펩티드를 각각 단독으로 사용하는 것도, 복수종을 병용하여 사용하는 것도 가능하다. 또한, 락토페린의 부분 펩티드는 1종을 단독으로 사용하는 것도, 복수종을 혼합하여 사용하는 것도 가능하다. 또한, 트랜스페린의 부분 펩티드는 1종을 단독으로 사용하는 것도 복수종을 혼합하여 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 사용할 수 있는 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 또는 트랜스페린은 카텝신 B, L, S 및 파파인 등의 시스테인 프로테아제에 대하여 억제 활성을 갖는다. 시스테인 프로테아제 억제 활성은 Barrett 등의 방법에 따라서 측정할 수 있다. 본 발명의 시험예 또는 실시예에 있어서, 당해 측정방법에 관해서 상세하게 기재한다.
본 발명의 시스테인 프로테아제 억제제는 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 또는 트랜스페린을 사용하며, 이들의 1개 또는 복수개종을 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 조합함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 제제의 투여단위 형태는 특별히 한정되지 않으며, 치료목적에 따라서 적절하게 선택할 수 있으며, 구체적으로는 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제, 시럽제, 좌제, 주사제, 연고제, 첩부제, 점안제 및 점비제 등을 예시할 수 있다. 제제화에 있어서는 약제학적 담체로서 통상적인 약제에 범용되는 부형제, 결합제, 붕괴제, 윤활제, 안정제, 향미제, 희석제, 계면활성제, 주사제용 용제 등의 첨가제를 사용할 수 있다.
본 발명의 제제중에 포함되는 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 또는 트랜스페린의 양은 특별히 한정되지 않으며 적절하게 선택하면 양호하지만, 예를 들면, 어느것이나 통상적인 제제중에 0.005 내지 60질량%, 바람직하게는 0.05 내지 50질량%로 하는 것이 양호하다.
본 발명의 시스테인 프로테아제 억제제를 경구적 또는 비경구적으로 환자에게 투여함으로써 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환을 치료할 수 있다. 여기서, 환자란 사람이라도 양호하지만, 사람 이외의 포유동물이라도 양호하다.
본 발명의 제제의 투여방법은 특별히 한정되지 않으며, 각종 제제형태, 환자의 연령, 성별, 기타 조건, 환자의 증상의 정도 등에 따라서 결정된다. 본 발명의 제제의 유효성분의 투여량은 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 기타 조건 등에 따라 적절하게 선택된다. 통상적으로 유효성분으로서의 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 또는 트랜스페린의 양은 0.1 내지 1200mg/kg/일, 바람직하게는 10 내지 500mg/kg/일의 범위가 되는 양을 기준으로 하는 것이 양호하며, 1일 1회 또는 복수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 시스테인 프로테아제 억제제는 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환, 예를 들면, 알레르기, 근이영양증, 근위축증, 심근경색, 뇌졸중, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 백내장, 골다공증, 악성 종양성 고칼슘 혈증, 전립선 비대증, 유방암, 전립선암, 치주병 등의 예방·치료제, 또는 암 세포의 증식이나 전이의 억제제, 또는 세균[스타필로코쿠스·아우레우스(Staphylococcus aureus) V8 등]이나 바이러스[폴리오 바이러스(polio virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus), 코로나 바이러스(corona virus), AIDS 바이러스 등)의 증식 억제제로서 유용하다. 본 발명의 시스테인 프로테아제 억제제는 단독으로 사용해도 양호하지만, 공지된 상기 질환의 예방·치료제, 또는 상기 세균·바이러스 증식 억제제와 병용하여 사용할 수 있다. 병용함으로써 상기 질환의 예방·치료효과 또는 상기 세균·바이러스 증식 억제효과를 높일 수 있다. 병용하는 공지된 상기 질환의 예방·치료제 또는 상기 세균·바이러스 증식 억제제는 본 발명의 억제제중에 유효성분으로서 함유시켜도 양호하며, 본 발명의 억제제 중에는 함유시키지 않고 별개의 약제로서 조합하여 상품화하여 사용시에 조합해도 양호하다.
본 발명의 음식품 조성물은 식품 또는 음료의 원료에 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 또는 트랜스페린을 첨가하여 제조할 수 있으며, 경구적으로 섭취하는 것이 가능하다. 상기 원료는 통상적인 음료나 식품에 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 음식품 조성물은 시스테인 프로테아제 억제제를 첨가하는 점 이외는 통상적인 음식품 조성물과 동일하게 하여 제조할 수 있다. 음식품 조성물의 형태로서는 청량음료, 탄산음료, 영양음료, 과즙음료, 유산균 음료 등의 음료(이러한 음료의 농축원액 및 조정용 분말을 포함한다); 아이스크림, 샤베트, 빙수 등의 빙과; 엿, 츄잉 껌, 캔디, 껌, 쵸콜렛, 정과, 스낵과자, 비스켓, 젤리, 잼, 크림, 구운 과자 등의 과자류: 가공유, 유음료, 발효유, 버터 등의 유제품; 빵; 경장 영양식, 유동식, 육아용 밀크, 스포츠 음료; 기타 기능성 식품 등이 예시된다.
본 발명의 음식품 조성물에 있어서 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 또는 트랜스페린을 첨가하는 양은 음식품 조성물의 형태에 따라 적절하게 설정되지만, 통상적인 식품 또는 음료중 0.005 내지 60질량%, 바람직하게는 0.05 내지 50질량%가 되도록 첨가하면 양호하다.
본 발명의 사료 조성물은 사료에 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 또는 트랜스페린을 첨가하여 제조할 수 있으며, 일반적인 포유동물이나 가축류, 양어류 및 애완 동물에게 경구적으로 투여하는 것이 가능하다. 사료 조성물의 형태로서는 애완 동물 사료, 가축사료 및 양어사료 등이 예시되며, 곡류, 박(粕)류, 겨류, 어분, 골분, 유지류, 탈지 분유, 유장, 광물질 사료 및 효모류 등과 함께 혼합하여 본 발명의 사료 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물에 있어서 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 또는 트랜스페린을 첨가하는 양은 사료 조성물의 형태에 따라 적절하게 설정되지만, 통상적인 사료중 0.005 내지 60질량%, 바람직하게는 0.05 내지 50질량%가 되도록 첨가하면 양호하다.
더욱이, 본 발명의 음식품 조성물 또는 사료 조성물은 하기에 나타나는 질환의 예방용 또는 치료용으로서의 효능을 표시한 음식품 조성물 또는 사료 조성물로 할 수 있다. 즉 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환, 예를 들면, 골다공증 또는 악성 종양성 고칼슘 혈증의 예방용 또는 치료용인 것을 표시할 수 있다.
여기에, 「표시」란, 상기 효능을 수요자가 인식하게 하는 행위를 의미하며, 예를 들면, 본 발명의 음식품 조성물 또는 사료 조성물의 상품 또는 상품의 포장·광고 등에 상기 효능을 부착하는 행위, 부착한 것을 양도, 인도, 전시 등을 하는 행위 등이 있지만, 특히 특정 보건용 식품〔건강증진법 시행규칙(평성 15년 4월 30일, 일본국 후생 노동성령 제86호)의 제12조 제1항 제5호 참조〕으로서 표시하는 양태가 바람직하다.
다음에 시험예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다.
[시험예 1]
본 시험은 젖 중의 시스테인 프로테아제 억제물질을 검출하기 위해 실시하였다.
(1) 검출법
본 발명자는 프로테아제 억제물질의 검출법으로서「역 자이모그래피」라는 수법을 사용하여, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 겔 위에 존재하는 프로테아제 억제물질을 검출하였다. 역 자이모그래피란 통상적인 자이모그래피의 반대 수법에 의한 것이고, 기본적 원리는 다음과 같다. 즉, 젤라틴을 포함하는 SDS 폴리아크릴아미드 겔에 프로테아제 억제물질을 포함하는 샘플을 적용하여, 전기영동을 실시한 후에 겔을 프로테아제 용액에 침지하여 겔 중의 단백질을 분해한다. 이러한 조작에 의해 억제물질이 존재하는 부분은 프로테아제의 활성을 억제하는 점에서 젤라틴은 프로테아제에 의한 분해를 피하며, 이것이 염색액에 의해 염색됨으로써, 억제물질을 식별하는 것이 가능해진다.
(2) 시험방법
본 발명에 있어서 역 자이모그래피의 방법은 하기와 같다.
우유중의 전체 단백질 및 소 락토페린[참조: 모리나가뉴교사 제조]을 샘플로 하고, 0.1% 젤라틴을 포함하는 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여, 전기영동(하기, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 SDS-PAGE로 약칭하는 경우가 있다.)을 실시하였다. 영동후, 겔을 2.5% Triton X-100 용액에 45분동안 침지하여 세정한 후, 추가로 45분동안 증류수에 침지하는 조작을 3회 반복하여 겔을 세정하였다. 이러한 겔을 1mg 파파인(31units/ml)을 포함하는 0.025M 아세트산 완충액(pH 5.5) 100ml에 침지하여, 37℃에서 10시간동안 보온하여 젤라틴을 소화하였다. 겔을 증류수로 세정한 후, 염색액(0.025% 쿠마시·브릴리언트·블루(CBB) R-250, 40% 메탄올, 7% 아세트산 수용액)으로 1시간동안 염색한 다음, 탈색액(40% 메탄올, 10% 아세트산 수용액)으로 탈색하였다.
이와는 별도로, 대조시험으로서 젤라틴을 포함하지 않는 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 상기와 동일하게 역 자이모그래피를 실시하였다. 추가로, 통상적인 12.5% SDS-PAGE(CBB 염색)을 실시하였다.
(3) 시험결과
본 시험의 결과는 도 1에 도시하는 바와 같다. 도 1은 역 자이모그래피의 패턴을 나타내는 결과이다. 도 1의 1레인은 우유중의 전체 단백질의 통상적인 SDS-PAGE의 패턴, 2레인은 우유중의 전체 단백질의 역 자이모그래피의 패턴, 3레인은 우유중의 전체 단백질의 겔에 젤라틴을 포함하지 않는 역 자이모그래피(대조)의 패턴, 4레인은 소 락토페린의 역 자이모그래피의 패턴, 5레인은 소 락토페린의 겔에 젤라틴을 포함하지 않는 역 자이모그래피(대조)의 패턴을 각각 도시하고 있다. 더욱이, 도면중의 화살 표시는 소 유래 락토페린(분자량 78kDa)의 SDS-PAGE에 의한 영동위치를 나타내고 있다. 또한, 6레인 및 7레인은 본 시험예와는 직접 관계가 없다.
도 1로부터 밝혀지는 바와 같이 2레인에 있어서 소 락토페린의 영동위치(78kDa)와 거의 동일 위치에 역 자이모그래피의 포지티브한 밴드가 확인되었다. 이로부터 우유중에 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 물질의 존재가 확인되었다. 또한, 4레인에 있어서 소 락토페린을 영동한 파파인을 사용한 역 자이모그래피에 있어서 포지티브한 밴드가 확인되었다.
이상의 결과로부터, 소 유래의 락토페린에 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 것이 시사되었다.
[시험예 2]
본 시험은 시험예 1에 있어서 시스테인 프로테아제 억제 활성이 시사된 78kDa의 밴드에 관해서 N 말단 아미노산 서열을 결정하기 위해 실시하였다.
(1) 시험방법
시험예 1에서 사용한 우유중의 전체 단백질 샘플을 동일하게 사용하여 SDS-PAGE를 실시한 후, 폴리비닐이덴 디플루오라이드(PVDF)막에 전사하여, PVDF막을 CBB로 염색한 후, 78kDa 부근에 영동된 염색밴드를 절단 인출하였다. 이러한 밴드에 관해서, 휴렛 패커드(Hewlett-packard Development Company)사 제조 G1005A 프로테인 시퀀싱 시스템을 사용하여 N 말단 아미노산 서열을 결정하였다.
(2) 시험결과
우유중의 78kDa 염색밴드의 아미노산 서열을 결정한 결과, 78kDa 염색밴드의 N 말단 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 2에 기재된 소 락토페린의 것과 완전하게 일치하였다. 따라서, 본 시험의 결과와 시험예 1의 결과로부터, 소 락토페린은 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 것이 명백해졌다.
[시험예 3]
본 시험은 소 락토페린의 시스테인 프로테아제에 대한 억제효과를 측정하기 위해서 실시하였다.
(1) 시험방법
시험시료로서 시판중인 소 락토페린[참조: 모리나가뉴교사 제조]를 사용하여 시스테인 프로테아제로서 파파인, 카텝신 B, 카텝신 L 및 카텝신 S[이상 모두 시판품: 와코쥰야쿠고교(Wako Pure Chemical Industries. Ltd.)사 제조]에 대하여 시스테인 프로테아제 억제 활성을 측정하였다. 억제 활성의 측정방법은 Barrett 등의 방법[참조: Methods in Enzymology, Vol.80, pp.535-561, 1981]을 참고로 하여, 다음과 같이 실시하였다. 즉, 0.1M 아세트산 완충액 pH 5.5에 여러 가지 농도로 용해된 샘플에, 기질로서 Z-Phe-Arg-MCA[벤질옥시카보닐-L-페닐알라닌-L-아르기닌 4-메틸-쿠마릴-7-아미드, 최종 농도 20mM: 펩티드켄큐쇼(PEPTIDE INSTITUTE, INC.) 제조]를 첨가하고 시스테인 프로테아제(본 시험에서는 각 샘플에 관하여, 파파인, 카텝신 B, 카텝신 L 및 카텝신 S로부터 선택되는 1종: 와코쥰야쿠고교사 제조)용액(최종농도: 15units/ml)을 첨가하여 혼합하고, 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 소화된 기질로부터 유리된 AMC(7-아미노-4-메틸-쿠마린)의 형광 강도(여기파장: 370nm, 발광파장: 460nm)을 형광분광도계 [참조: 히타치세사쿠쇼(Hitachi, Ltd.)사 제조]를 사용하여 측정하였다.
(2) 시험결과
본 시험의 결과는 표 1에 나타내는 바와 같다. 표 1은 파파인, 카텝신 B, 카텝신 L 및 카텝신 S에 대한 소 락토페린의 시스테인 프로테아제 억제효과를 나타낸다. 그 결과, 파파인 및 카텝신 L의 시스테인 프로테아제 활성은 소 락토페린의 농도가 10-6M에 도달했을 때에 완전하게 억제되었다. 또한, 카텝신 B 및 카텝신 S의 시스테인 프로테아제 활성은 소 락토페린의 농도가 10-5M에 도달했을 때에 70% 이상 억제되며, 10-4M의 농도에서 완전하게 억제되었다. 따라서, 소 락토페린은 파파인, 카텝신 B, 카텝신 L 및 카텝신 S에 대하여 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 것이 판명되었다.
억제제 | 시스테인 프로테아제 | 각 농도에 있어서의 억제율 (%) | ||||
10-6M | 10-7M | 10-6M | 10-5M | 10-4M | ||
소 락토페린 | 파파인 | 0 | 40 | 100 | 100 | 100 |
카텝신 L | 0 | 20 | 100 | 100 | 100 | |
카텝신 B | 0 | 0 | 10 | 70 | 100 | |
카텝신 S | 0 | 0 | 15 | 80 | 100 |
[시험예 4]
본 시험은 사람 락토페린의 시스테인 프로테아제에 대한 억제효과를 측정하기 위해서 실시하였다.
(1) 시험방법
시험시료로서 시판중인 사람 락토페린[참조: 시그마(SIGMA CORP.)사 제조]을 사용하고 시스테인 프로테아제로서 파파인, 카텝신 B, 카텝신 L 및 카텝신 S(이상 모두 시판품: 와코쥰야쿠고교사 제조)에 대하여 시험예 3에 기재된 시스테인 프로테아제 억제 활성 측정방법과 동일한 방법에 의해 시스테인 프로테아제 억제 활성을 측정하였다.
(2) 시험결과
본 시험의 결과는 도 2에 도시하는 바와 같다. 도 2는 파파인, 카텝신 B, 카텝신 L 및 카텝신 S에 대하여 사람 락토페린의 시스테인 프로테아제 억제효과를 도시한다. 그 결과, 파파인 및 카텝신 L의 시스테인 프로테아제 활성은 사람 락토페린의 농도가 10-6M에 도달했을 때에 거의 완전하게 억제되었다. 또한, 카텝신 B 및 카텝신 S의 시스테인 프로테아제 활성은 사람 락토페린의 농도가 10-5M에 도달했을 때에 80% 이상 억제되며, 10-4M의 농도에서 거의 완전하게 억제되었다. 따라서, 사람 락토페린은 파파인, 카텝신 B, 카텝신 L 및 카텝신 S에 대하여 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 것이 판명되었다.
[시험예 5]
본 시험은 락토페린의 부분 펩티드의 시스테인 프로테아제에 대한 억제효과를 측정하기 위해 실시하였다.
(1) 시험방법
시험시료로서 후술하는 실시예 1에서 제조된 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 펩티드[하기, 사람 락토페린 펩티드 Y679-K695(도 3을 참조)라고 기재한다.]를 사용하고 시스테인 프로테아제로서 파파인, 카텝신 B 및 카텝신 L(이상 모두 시판품: 와코쥰야쿠고교사 제조)에 대하여, 시험예 3에 기재된 시스테인 프로테아제 억제 활성 측정방법과 동일한 방법에 의해 시스테인 프로테아제 억제 활성을 측정하였다.
(2) 시험결과
본 시험의 결과는 도 4에 도시하는 바와 같다. 도 4는 파파인, 카텝신 B 및 카텝신 L에 대한 사람 락토페린 펩티드 Y679-K695의 시스테인 프로테아제 억제효과를 도시한다. 그 결과, 파파인 및 카텝신 L의 시스테인 프로테아제 활성은 상기 펩티드의 농도가 10-4M에 도달했을 때에 50% 이상 억제되며, 10-3M의 농도에서 거의 완전하게 억제되었다. 또한, 카텝신 B의 시스테인 프로테아제 활성은 상기 펩티드의 농도가 10-3M에 도달했을 때에 60% 억제되었다. 따라서, 사람 락토페린 펩티드 Y679-K695는 파파인, 카텝신 B 및 카텝신 L에 대하여 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 것이 판명되었다. 또한, 후기하는 실시예 1에서 제조된 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 펩티드[하기, 소 락토페린 펩티드 Y676-K692(도 3을 참조)라고 기재한다.]에 관해서 동일한 시스테인-프로테아제 억제 활성 측정시험을 실시한 결과, 사람 락토페린 펩티드 Y679-K695와 거의 동등한 활성을 나타내는 것이 명백해졌다.
[시험예 6]
본 시험은 트랜스페린의 시스테인 프로테아제에 대한 억제효과를 측정하기 위해서 실시하였다.
(1) 시험방법
시험시료로서 시판중인 소 트랜스페린[참조: 니혼세야쿠사 제조]를 사용하여 시스테인 프로테아제로서 파파인, 카텝신 B 및 카텝신 L(이상 모두 시판품: 와코쥰야쿠고교사 제조)에 대하여, 시험예 3에 기재된 시스테인 프로테아제 억제 활성측정방법과 동일한 방법에 의해 시스테인 프로테아제 억제 활성을 측정하였다.
(2) 시험결과
본 시험의 결과는 도 5에 도시하는 바와 같다. 도 5는 파파인, 카텝신 B 및 카텝신 L에 대한 트랜스페린의 시스테인 프로테아제 억제효과를 도시한다. 그 결과, 파파인의 시스테인 프로테아제 활성은 트랜스페린의 농도가 10-4M에 도달했을 때에 40% 억제되며, 10-3M의 농도에서 완전하게 억제되었다. 또한, 카텝신 B 및 카텝신 L의 시스테인 프로테아제 활성은 트랜스페린의 농도가 10-4M에 도달했을 때에 30% 이상 억제되었다. 따라서, 소 트랜스페린은 파파인, 카텝신 B 및 카텝신 L에 대하여 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 것이 판명되었다.
다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 더욱이, 본 발명은 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(도 3을 참조: 사람 락토페린 펩티드 Y679-K695)를 하기의 방법에 의해 제조하였다.
더욱이, 상기 본 발명의 펩티드는 자동 아미노산 합성장치[참조: 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems.)사 제조, Model 433A]를 사용하여 합성하여 제조하였다.
20% 피페리딘 함유 N-메틸피롤리돈(어플라이드·바이오시스템즈사 제조, 하기, N-메틸피롤리돈을 NMP라고 약칭한다)에 의해, 펩티드 합성용 고상 수지인 HMP 수지[참조: 어플라이드·바이오시스템즈사 제조]의 아미노 보호기인 Fmoc기를 절단 제거하여, NMP로 세정한 후, Fmoc-트레오닌[구체적으로는 합성하는 펩티드의 C 말단 아미노산에 상당하는 Fmoc-아미노산[참조: 어플라이드·바이오시스템즈사 제조]를 FastMoc(등록상표) 시약 키트[참조: 어플라이드·바이오시스템즈사 제조]를 사용하여 축합시켜, NMP로 세정하였다. 이어서, 상기 Fmoc기를 절단하고, 계속해서 C 말단에서 2번째의 아미노산에 상당하는 Fmoc-알라닌을 축합 및 세정을 실시한 다음, Fmoc-아미노산의 축합 및 세정을 반복하여, 보호 펩티드 수지를 제조하고, 수지로부터 조악한 펩티드를 회수하였다.
상기 조악한 펩티드로부터 고속 액체 크로마토그래피(하기, HPLC라고 약칭한다.)에 의해 펩티드의 정제를 실시하였다. 칼럼은 역상계의 C18-ODS[머크(Merco& CO., INC.)사 제조, Lichrospher100]를 사용하였다. 수득된 정제 펩티드는 HPLC 분석을 실시하여, 정제물이 단일한 것을 추가로 확인하였다. 또한, 정제 펩티드의 아미노산 서열을 기상식 자동 아미노산 시퀀서(어플라이드·바이오시스템즈사 제조, Model 473A)를 사용하여 결정한 결과, 서열번호 1의 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖고 있었다.
또한, 동일한 방법에 의해 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(도 3을 참조: 소 락토페린 펩티드 Y676-K692)도 제조하였다.
[실시예 2]
(락토페린을 배합한 정제의 제조)
다음 조성으로 이루어지는 정제의 시스테인 프로테아제 억제제를 하기의 방법에 의해 제조하였다.
소 락토페린[참조: 모리나가뉴교사 제조] 40.0(%)
유당[참조: 모리나가뉴교사 제조] 18.5
옥수수 전분[참조: 닛신세이훈(Nisshin Seifun Group Inc.)사 제조] 30.7
스테아르산 마그네슘[참조: 타이헤이카가쿠산교(TAIHEI CHEMICAL INDUSTRIAL CO., LTD.)사 제조] 1.4
카복시메틸 셀룰로즈 칼슘[참조: 고토쿠야쿠힌(GOTOKU CHEMICAL COMPANY LTD.)사 제조] 9.4
소 락토페린, 유당, 옥수수 전분 및 카복시메틸 셀룰로즈 칼슘의 혼합물에 멸균 정제수를 적절하게 첨가하면서 균일하게 혼련하여, 50℃에서 3시간동안 건조시키고, 수득된 건조물에 스테아르산 마그네슘을 첨가하여 혼합하며, 통상적인 방법에 의해 압축하여, 정제를 수득하였다.
[실시예 3]
(캡슐 주입 락토페린의 제조)
유당[참조: 와코쥰야쿠고교사 제조] 600g, 옥수수 전분[참조: 닛신세이훈사 제조] 400g, 결정 셀룰로즈[참조: 와코쥰야쿠고교사 제조] 400g 및 소 락토페린[참조: 모리나가뉴교사 제조] 600g을 50메쉬 체[참조: 야마토카가쿠(Yamato Scientific Co., Ltd.)사 제조]에 의해 체 분리하고, 두께 0.5mm의 폴리에틸렌제의 자루에 넣고 전도 혼합하여, 전자동 캡슐 충전기(Cesere Pedini사 제조. 프레스식)를 사용하여, 상기 분말을 캡슐(니혼에란코사 제조. 1호 젤라틴 캡슐, Op. Yellow No.6 Body, 공중량은 75mg)에 내용량 275mg으로 충전하여, 소 락토페린 82mg이 주입된 캡슐제 7,000개를 수득하였다.
[실시예 4]
(소 락토페린을 첨가한 음료의 제조)
탈지분유[참조: 모리나가뉴교사 제조] 90g을 50℃의 온탕 800ml에 용해하고, 설탕[참조: 닛신세이토(Nisshin Sugar Manufacturing Co., Ltd.)사 제조] 30g, 인스턴트 커피분말[참조: 네슬레사 제조] 14g, 카라멜[참조: 쇼와카코(SHOWA KAKO CO., LTD.)사 제조] 2g, 및 커피 플레이버[참조: 산에이카가쿠사 제조] 0.01g을 교반하면서 순차적으로 첨가하여 용해시키고, 10℃로 냉각시켜, 소 락토페린[참조: 모리나가뉴교사 제조] 1g를 첨가하고, 소 락토페린 약 0.1%을 포함하는 시스테인 프로테아제 억제효과를 갖는 유음료를 제조하였다.
[실시예 5]
(소 락토페린을 첨가한 경장 영양식 분말의 제조)
유장 단백질 효소 분해물[참조: 모리나가뉴교사 제조] 10.8kg, 덱스트린[참조: 쇼와산교(Showa Sangyo Co., Ltd,)사 제조] 36kg, 및 소량의 수용성 비타민과 미네랄을 물 200kg에 용해시키고, 수상(水相)을 탱크내에 조제하였다. 이것과 별도로, 대두 샐러드유[참조: 다이요유시(TAIYO YUSHI K.K.)사 제조] 3kg, 팜유[참조: 다이요유시사 제조] 8.5kg, 홍화유[참조: 다이요유시사 제조] 2.5kg, 레시틴[참조: 아지노모토(AJINOMOTO CO., INC.)사 제조] 0.2kg, 지방산 모노글리세리드[참조: 카오(KAO CORP.)사 제조] 0.2kg 및 소량의 지용성 비타민을 혼합 용해하여, 오일상을 제조하였다. 탱크 내의 수상에 오일상을 첨가하고, 교반하여 혼합한 후, 70℃로 가온하고, 추가로 균질기에 의해 14.7MPa의 압력으로 균질화하였다. 이어서, 90℃에서 10분동안 살균한 후에, 농축시키고 분무 건조하여, 중간산물 분말 약 59kg을 조제하였다. 이러한 중간산물 분말 50kg에 자당[참조: 호크렌사 제조] 6.8kg, 아미노산 혼합분말[참조: 아지노모토사 제조] 167g 및 소 락토페린[참조: 모리나가뉴교사 제조] 60g을 첨가하고 균일하게 혼합하여, 소 락토페린을 함유하는 시스테인 프로테아제 억제효과를 갖는 경장 영양식 분말 약 57kg을 제조하였다.
이상 상기한 바와 같이 본 발명은 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 및 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 시스테인 프로테아제 억제제에 관한 것이며, 본 발명에 따라 나타나는 효과는 다음과 같다.
(1) 식품소재로서 이용할 수 있는 단백질 또는 이의 부분 펩티드이므로, 안전성이 우수하고, 일상적으로 장기간 투여 또는 섭취가 가능하다.
(2) 폭넓은 시스테인 프로테아제에 대하여 억제 활성 스펙트럼을 갖는다.
(3) 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환의 예방·치료제로서 사용하는 것이 가능하다.
(4) 특정 보건용 식품, 영양 보조식품을 포함하는 기능성 식품 등의 제조 등의 용도에 이용하는 것이 가능하다.
(5) 식품 가공분야에서 식품의 물성 조절제로서 이용하는 것이 가능하다.
<110> Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
<120> Protease Inhibitor
<130> FP147OP1610
<150>JP 2002/347802
<151> 2002-11-29
<160> 4
<170> KopatentIn Ver. 1.71
<210> 1
<211> 711
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)...(19)
<223> Lactoferrin
<400> 1
Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu
1 5 10 15
Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser
20 25 30
Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys
35 40 45
Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln
50 55 60
Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp
65 70 75 80
Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro
85 90 95
Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr
100 105 110
Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu
115 120 125
Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly
130 135 140
Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly
145 150 155 160
Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser
165 170 175
Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu
180 185 190
Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro
195 200 205
Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly
210 215 220
Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp
225 230 235 240
Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg
245 250 255
Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser
260 265 270
His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp
275 280 285
Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro
290 295 300
Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe
305 310 315 320
Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser
325 330 335
Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg
340 345 350
Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys
355 360 365
Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu
370 375 380
Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys
385 390 395 400
Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly
405 410 415
Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala
420 425 430
Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val
435 440 445
Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser
450 455 460
Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His
465 470 475 480
Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu
485 490 495
Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser
500 505 510
Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile
515 520 525
Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg
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Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly
545 550 555 560
Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly
565 570 575
Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala
580 585 590
Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser
595 600 605
Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp
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Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe
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Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser
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Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg
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Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val
675 680 685
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<212> PRT
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<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)...(19)
<223> Lactoferrin
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Cys Leu Ala Ala Pro Arg Lys Asn Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Gln
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Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu
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Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Ala Leu Glu Cys
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Ile Arg Ala Ile Ala Glu Lys Lys Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly
65 70 75 80
Gly Met Val Phe Glu Ala Gly Arg Asp Pro Tyr Lys Leu Arg Pro Val
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Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Gln Leu
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Ile Ile Pro Met Gly Ile Leu Arg Pro Tyr Leu Ser Trp Thr Glu Ser
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Leu Glu Pro Leu Gln Gly Ala Val Ala Lys Phe Phe Ser Ala Ser Cys
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Val Pro Cys Ile Asp Arg Gln Ala Tyr Pro Asn Leu Cys Gln Leu Cys
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Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Gln Asp Gly Ala Gly Asp
210 215 220
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Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asn Asn Ser Arg Ala
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Pro Val Asp Ala Phe Lys Glu Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His
260 265 270
Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Lys
275 280 285
Leu Leu Ser Lys Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asn Lys Ser Arg Ser
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<220>
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Claims (12)
- 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 및 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 시스테인 프로테아제 억제제.
- 제1항에 있어서, 락토페린 및/또는 트랜스페린이 금속 포화형, 금속 부분 포화형 및 아포형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물인 시스테인 프로테아제 억제제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 락토페린 및/또는 락토페린의 부분 펩티드가 하기의 (a) 내지 (d)에 나타내는 단백질 또는 펩티드의 1종 또는 복수종의 혼합물인 시스테인 프로테아제 억제제:(a) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드,(b) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 역위를 포함하며, 또한 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드,(c) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드,(d) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 역위를 포함하며, 또한 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환의 예방·치료제인 시스테인 프로테아제 억제제.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환이 골다공증 또는 악성 종양성 고칼슘 혈증인 시스테인 프로테아제 억제제.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 시스테인 프로테아제 억제제를 첨가하여 이루어진 음식품 조성물 또는 사료 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 시스테인 프로테아제 억제제를 환자에게 투여함을 특징으로 하는 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환의 치료방법.
- 시스테인 프로테아제 억제제의 제조를 위한 락토페린, 락토페린의 부분 펩티드 및 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물의 용도.
- 제8항에 있어서, 락토페린 및/또는 트랜스페린이 금속 포화형, 금속 부분 포화형 및 아포형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물인 용도.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 락토페린 및/또는 락토페린의 부분 펩티드가 하기의 (a) 내지 (d)에 나타내는 단백질 또는 펩티드의 1종 또는 복수종의 혼합물인 용도:(a) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드,(b) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 679 내지 695의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 역위를 포함하며, 또한 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드,(c) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드,(d) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 적어도 아미노산 번호 676 내지 692의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드로서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 역위를 포함하며, 또한 시스테인 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드.
- 제8항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 시스테인 프로테아제 억제제가 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환의 예방·치료제인 용도.
- 제11항에 있어서, 시스테인 프로테아제가 관여하는 질환이 골다공증 또는 악성 종양성 고칼슘 혈증인 용도.
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