CN1166688C - 一种从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

一种从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法，包括下列步骤：(1)采用一步磷酸钙亲和沉淀法将微量的乳铁传递蛋白选择性地从乳清液中预先沉淀分离，得含乳铁传递蛋白的沉淀粉；(2)沉淀粉用缓冲液或盐水抽提得含乳铁传递蛋白的抽提液；(3)抽提液用分子量截留值为5万道尔顿的超滤膜分离和浓缩，喷雾或冷冻干燥得含量为40-50%的乳铁传递蛋白粉产物；(4)浓缩液也可用阳离子交换柱作进一步纯化，再喷雾或冷冻干燥得含量为90-95%的乳铁传递蛋白粉产物。本发明方法具有低成本，低投资、管理容易，快速和完整的生产工艺，产品质量稳定等特点，是适用于大规模商业化生产高纯度乳铁传递蛋白的方法。

Description

一种从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法

技术领域

本发明涉及来自于动物的乳铁传递蛋白的获得方法，尤其是关于从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法。

背景技术

铁传递蛋白族(Transferrins)是一组具有类似结构和性质的糖蛋白质。其类似性包括所有的铁传递蛋白的高级结构都由单链多肽形成两个相似但不均一铁结合部位(一分子蛋白质结合两分子Fe³⁺)以及含有多聚糖(Glycan)以及它们分子量大约在76000-81000道尔顿的范围内。铁传递蛋白广泛地分布在脊椎动物的生理液体和细胞中，例如乳汁、唾液、胆汁、胰液、眼泪和血浆等。

血清铁传递蛋白(Serum Transferrin)、卵清铁传递蛋白(Ovatransferrin)和乳铁传递蛋白(Lactoferrin)是铁传递蛋白族的主要成员。铁传递蛋白最初被命名是因为其在铁代谢中的传递和储存功能。随着近二十年来对铁传递蛋白的广泛研究，已发现了该蛋白具有除了结合铁以外的多样化结合能力以及除了传递铁以外的多种生理或生物学功能。其中，人血清铁传递蛋白、人乳和牛乳传递蛋白的氨基酸顺序(一级结构)已确定。此外，乳铁传递蛋白的完整立体结构(高级结构)以及牛乳铁传递蛋白重要部份的立体结构也已确定。

众所周知，用母(人)乳喂养的婴儿更健康。化学综合分析表明母(人)乳中各种活性物质的含量非常高，其中，人乳中的铁传递蛋白质是牛乳中的15倍。但商业的食用铁传递蛋白制剂则只能来自牛乳。由于牛乳铁传递蛋白残留在奶酪或干酪生产后的乳清废液中，所以从乳清液中提取和纯化这种

有关乳铁传递蛋白的分离方法，常用的主要包含两大类方法：即膜分离和色层分离技术。膜分离技术是当今广受重视和采用的一项新技术。根据膜孔径大小，分离技术又可分为微过滤(Microfiltration，0.1-10μm)、超过滤(Ultrafiltration，5-400nm)、毫微过滤(Nanofiltration，1-5nm)和反渗透(Reverseosmosis，0.1-1nm)。在食品和生物工程领域中，超过滤主要用于不同分子量蛋白质之间和蛋白质与其他小分子之间的分离。乳铁传递蛋白的分子量已知为8万道尔顿，所以用分子量截留值为5-8万道尔顿的超滤膜[N.Kothe et al，US Patent 4,644,056，(1987)]，或截留值为1万和5万道尔顿的超滤膜两次分离[GH.Scott & DO Lucas，US Patent 4,834,974(1989)]可以将乳清液中的乳铁传递蛋白与其他低分子量蛋白质、乳糖和无机盐分开。然而，膜分离技术的选择性较低，所以用该方法只能得到低纯度的蛋白制剂。

如要制备高纯度的乳铁传递蛋白，就需使用色层分离。现阶段，可以有效地分离乳铁传递蛋白的色层分离技术是阳离子交换层析。由于乳铁传递蛋白的等电点为pH8.0左右，所以当把环境pH调到低于等电点时，蛋白质带正电而能吸附到阳离子交换剂上。阳离子交换剂的活性基团大多使用弱酸型，即羧甲基(-OCH₂COO-)；也可使用强酸型活性基团像磺丙基(-CH₂CH₂CH₂SO₃-)，但羧甲基的分离效果更佳。离子交换剂的母体可以是交联葡聚糖凝胶或纤维素。用羧甲基交联葡聚糖凝胶树酯从牛奶乳清液中提取乳铁传递蛋白的得率为86％，分离的蛋白质纯度为95％。根据已发表的文献，可用于分离乳铁传递蛋白的层析分离技术包括：铜螯合层析、凝胶层析、磷酸纤维素树酯[Yoshida，S.and Xiuyun，Y.(1991)J.Dairy Sci.74，1439-1444；Dionysius，DA.et al，(1991)Aust.J.Dairy Technol.46，72-76；Shimazaki，K.andYoshimoto，Y.(1988)Japanese J.Dairy Food Sci.37，105；Al-Mashikhi，S.A.，etal.(1988)J.Dairy Sci.71，1747；Al-Mashikhi，S.A.and Nakai，S.(1987)J.DairySci.70，2486；Foley，AA.and Bates，GW.(1987)Anal.Biochem.162，296-300；Chen，JP and Wang，CH(1991)J.Food Sci.50，701-13.]。蛋白质的技术也成为研究的焦点。

近十几年来，世界各地的实验室对乳铁传递蛋白的功能，特别是生物功能进行了广泛的研究。使人感到迷惑不解的是该蛋白的生物学功能是如此之多样化。许多新的功能正不断地发现。表1归纳和罗列了那些该蛋白已被引例的生物学功能[徐跃(2000)，生物工程进展，20卷，6期，34-42页]。

     表1乳铁传递蛋白的生物学功能

(1)广泛的结合能力	(a)结合金属离子
			(b)与其它蛋白质结合
	(c)与细胞结合
			(d)与DNA结合
(2)抗微生物和病毒的活性
		(3)抗氧化性
(4)乳铁传递蛋白与炎症和免疫反应的关系
		(5)抗癌细胞活性
(6)抑制胆固醇的积累
		(7)基因转录活化剂
(8)细胞生长因子

基于乳铁传递蛋白的生理和生物学功能，它的应用范围列于表2中。乳铁传递蛋白在保健品或功能食品范围内的应用前景非常光明。目前，乳铁传递蛋白主要用于婴儿食品，其次的使用范围将会是滋补品，化妆品(特别是防晒和处理青春痘)和饲料添加剂(例如，用于防猪腹泄)。

                  表2乳铁传递蛋白预期的应用范围

功能	婴儿食品配方	健康食品	医药/临床	兽医/饲料	美容
						铁载体	适用	适用	适用	适用
抗炎症			适用	适用	适用
						保护肠菌群	适用	适用		适用
抗细菌/防腐			适用	适用	适用
						助细胞生长剂	适用	适用	适用	适用
防自由基产生			适用		适用

然而，由于乳铁传递蛋白在乳清中的含量很低(大约100-200毫克/升)，奶酪工厂日产乳清的量极大，一天数千吨属中等规模。所以用色层分离技术直接处理如此大的液量成本很高。此外，乳清是制造乳清浓缩蛋白和乳糖的原料，当乳清经过色层分离柱处理后，将不可避免地影响这些产品的生产。

因此，一种低成本、低投资，快速和完整的生产工艺，用于大规模商业化生产高纯度乳铁传递蛋白的方法，是市场生产中期待已久待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法，该方法是使用一步磷酸钙亲和沉淀法将微量的乳铁传递蛋白选择性地从乳清液中预先沉淀分离。沉淀物用缓冲液或生理盐水进行抽提。抽提液或用分子量截留值为5万道尔顿的超滤膜分离和浓缩后喷雾或冷冻干燥，可以制备乳铁传递蛋白含量为40-50％的制剂，或将超滤浓缩液上离子交换柱进一步分离和纯化，然后喷雾或冷冻干燥可以制备乳铁传递蛋白含量达90-95％的制剂。

本发明从乳清液中分离乳铁传递蛋白的工艺流程参见图1。

本发明从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法，包括下列步骤：

1、采用一步磷酸钙亲和沉淀法将乳铁传递蛋白从乳清液中预先沉淀下来，沉淀物用离心机、板框压滤机、真空过滤机或其它过滤机械分离。即在1升乳清液中加入1-80毫摩尔氧化钙和1-10毫摩尔磷酸钠，用NaOH将pH调节至6.0-7.5，搅拌，过滤得含乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀泥，经喷雾或低温真空干燥或冷冻干燥得沉淀粉，低温-10℃储存备用。乳铁传递蛋白从乳清液转移至沉淀中的转移率可达70-75％；

2、将沉淀粉或含乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀泥用缓冲液或盐水抽提，得含乳铁传递蛋白的抽提液，抽提率可达85-96％，缓冲液浓度0.1-1摩尔/升，盐水浓度0.5-5重量％，缓冲液或盐水的pH值为6-8，沉淀物与所述浓度的缓冲液或盐水用量的重量比为1∶5-10，抽提时间20-60分钟，缓冲液可选自磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐缓冲液或它们的任意二种的混合物。

3、含乳铁传递蛋白的抽提液用分子量截留值为5万道尔顿的超滤膜分离，浓缩得浓缩液，浓缩液可直接喷雾或冷冻干燥，制得含量为40-50％的乳铁传递蛋白粉产物。总产率为60-72％。

4、浓缩液也可用阳离子交换柱进一步纯化，采用常用的羧甲基阳离子交换柱或交联葡聚糖凝胶树脂的离子交换柱。又因乳铁传递蛋白是碱性蛋白，在pH3.7时带较强的正电荷，需用离子强度较高的洗脱液洗脱。纯化后再喷雾或冷冻干燥，即制得含量为90-95％的乳铁传递蛋白粉产物。总产率为57-65％。

有关钙与乳铁传递蛋白结合的研究已有文献报道(Y.Xu(2000)Lactoferrin：Structure，Function and Applications，(edited by Shimazaki，KI et a1.)，p.47-52，Elsevier，Amsterdam，New York)。钙与乳铁传递蛋白结合显然是磷酸钙与乳铁传递蛋白共沉淀的基础，本发明方法中乳铁传递蛋白在pH调至6.0-7.5的情况下结合钙，然而钙与磷酸根形成磷酸钙，最终形成乳铁传递蛋白与磷酸钙的共沉淀。(见图2)。

将本发明磷酸钙沉淀物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(见图3)，图3显示磷酸钙沉淀物含有一条与标准乳铁传递蛋白分子量相等的蛋白质谱带，通过对沉淀物的鉴定证实了沉淀物中是含有乳铁传递蛋白的。又将磷酸钙沉淀物电泳进行品红试剂的染色(见图4)，表明这条谱带是糖蛋白。对标准牛血清蛋白和标准乳过氧化酶的鉴定进一步排除了是其他蛋白质的可能性。

对该蛋白质谱带的氨基酸序列分析标明从氨基末端起的10个氨基酸残基是Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr，它们与文献上(参见Pierce，A.等，Eur.J.Biochem，196，177-184，1991)报道的乳铁传递蛋白相吻合。

又另外用标准乳铁传递蛋白的溶液进行磷酸钙共沉淀反应后，得到的标准乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀物与沉淀物分离后的上清液进行电泳分析(见图5)，表明蛋白质谱带从溶液中已转移至沉淀物中。以上这些实验清楚地证明磷酸钙可以有效地将乳铁传递蛋白沉淀下来。

乳铁传递蛋白的含量可以用凝胶电泳加扫描进行定量。首先制备1毫克/毫升的标准纯乳铁传递蛋白溶液，将3微升的标准纯乳铁传递蛋白溶液和8微升的本发明的样品上凝胶电泳分离，然后凝胶上染色的标准和样品的乳铁传递蛋白质谱带用光密度计(使用600nm波长，岛津双波长TCL扫描仪CS910)扫描得到吸收峰面积，因标准的乳铁传递蛋白浓度是1毫克/毫升，计算机根据吸收峰面积可自动计算出样品中乳铁传递蛋白质的含量。

本发明优点：由于乳铁传递蛋白在乳清中的含量极低，而乳清的处理量极大且易腐，本发明使用的一步磷酸钙亲和沉淀法可以将微量的乳铁传递蛋白有选择地和快速地从乳清中预先沉淀下来，这样工厂中分离和提纯的操作量瞬间减少150-200倍，也就是说使得为乳铁传递蛋白后加工所需的超滤膜和离子交换设备的投资可大大减少。

本发明将易腐败的乳清液体转化成易储藏的沉淀干粉。用这种含乳铁传递蛋白的沉淀干粉作为原料生产蛋白制剂使工厂更易管理。也解决了尤其在夏天由于乳清易腐败而引起的乳铁传递蛋白制剂的得率和质量容易波动的问题。按需要，可生产含量为40-50％或高含量达90-95％的乳铁传递蛋白产物。同时本发明方法也不影响乳清中的其他蛋白质和乳糖及它们的生产工艺。因此本发明方法与目前已有的从乳清中分离获得乳铁传递蛋白的方法来比较，本法具有低成本、低投资，管理容易，快速和完整的生产工艺，产品质量稳定等特点，是适用于大规模商业化生产高纯度乳铁传递蛋白的方法。

附图说明

图1是本发明从乳清液中分离乳铁传递蛋白的工艺流程图

图2是磷酸钙与乳铁传递蛋白共沉淀的机理示意图，

图中：

(A)乳铁传递蛋白+钙离子+磷酸根，pH6.0以下；

(B)pH调至6.0-7.5，钙离子首先通过结合使乳铁传递蛋白形成四联体，然后磷酸根与钙键合；

(c)乳铁传递蛋白-钙离子-磷酸根键合形成复合物，最终沉淀。

图3是本发明采用磷酸钙亲和沉淀法分离得的磷酸钙沉淀物的电泳分析，

图中：

1：本发明从乳清液中分离得到的磷酸钙沉淀物；2：标准乳铁传递蛋白；3：标准牛血清蛋白；4：乳清上清液；5：标准乳过氧化酶。

MW：分子量，Da：道尔顿单位。

图4是本发明采用磷酸钙亲和沉淀法分离得的磷酸钙沉淀物电泳的品红染色，图中：

1：标准乳过氧化酶；2：本发明从乳清液中分离得到的磷酸钙沉淀物；3：标准乳铁传递蛋白。

图5是标准乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀物的电泳分析，

图中：

1：标准乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀物；2：沉淀物分离后的上清液。

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1  从乳清液中分离制备乳铁传递蛋白

来自奶酪工厂的切达干酪乳清液先用离心分离机脱脂。脱脂切达干酪乳清液中乳铁传递蛋白含量为93毫克/升。在420升脱脂切达干酪乳清液中加入食用级的CaCl₂ 3.4公斤和NaH₂PO₄·2H₂O 0.62公斤，然后边搅拌边用6当量的氢氧化钠将pH值调至7.5。搅拌5分钟后，静置10分钟。悬浮液用液固离心机(或板框压滤机，或转鼓式真空过滤机或其他过滤机械)分离得到38.2公斤磷酸钙沉淀泥。澄清液送入乳清蛋白和乳糖生产车间。沉淀泥用冷冻干燥(或低温真空干燥，或加80公斤水后喷雾干燥)，得8.4公斤磷酸钙沉淀粉(其电泳分析等鉴定见图3和图4)，低温(-10℃)储藏备用。每公斤沉淀粉含乳铁传递蛋白3348毫克，乳清液中72％的乳铁传递蛋白转移至磷酸钙沉淀中。8.4公斤磷酸钙沉淀粉用84公斤pH6.0，0.5摩尔/升磷酸钠缓冲液搅拌抽提20分钟后过滤。每公斤抽提液含乳铁传递蛋白319.7毫克，抽提得率95.5％。84公斤抽提液用分子量截留值为5万道尔顿的超滤膜分离和浓缩10倍，然后在浓缩液中加80公斤水，第二次超滤和浓缩10倍。二次超滤可去除大量分子量低于5万道尔顿杂蛋白和其他杂质。8.4升浓缩液冷冻干燥后得63.94克乳铁传递蛋白制剂，纯度42％，总产率为68.8％。

实施例2  从乳清液中分离制备乳铁传递蛋白

生干酪乳清液中乳铁传递蛋白含量为124.9毫克/升。在540升生干酪乳清液中加入CaCl₂ 4.5公斤和NaH₂PO₄·2H₂O 0.8公斤，然后边搅拌边用6当量的氢氧化钠将pH值调至6.5。搅拌5分钟后，静置10分钟。悬浮液用液固离心机(或板框压滤机，或转鼓式真空过滤机或其他过滤机械)分离得到15公斤磷酸钙沉淀泥。澄清液送入乳清蛋白和乳糖生产车间。沉淀泥用冷冻干燥(或低温真空干燥，或加40公斤水后喷雾干燥)，得3.4公斤磷酸钙沉淀粉，低温(-10℃)储藏备用。每公斤沉淀粉含乳铁传递蛋白14.5克，乳清液中73％的乳铁传递蛋白转移至磷酸钙沉淀中。3.4公斤磷酸钙沉淀粉用34公斤pH8.0，1％盐水搅拌抽提20分钟后过滤。每公斤抽提液含乳铁传递蛋白1236.9毫克，抽提得率85.3％。34公斤抽提液用分子量截留值为5万道尔顿的超滤膜二次超滤并浓缩10倍，3.4升浓缩液冷冻干燥后得91.42克乳铁传递蛋白制剂，纯度46％，总产率62.2％。

实施例3  高纯度乳铁传递蛋白的制备

用0.05摩尔/升浓度，pH3.7的醋酸缓冲液平衡羧甲基交联葡聚糖凝胶树脂阳离子交换柱(或一种商业化的羧甲基阳离子交换柱，Carboxymethyl-Productive^TM)。将30毫升浓缩液(由实施例1制得)从柱顶部泵入，而后用0.7摩尔/升的氯化钠醋酸缓冲液(pH3.8)梯度洗脱，洗脱液的流速为2毫升/分钟。收集从120至170毫升的液体，总共50毫升，乳铁传递蛋白柱分离得率在90％以上。将收集的液体用渗析膜去离子，然后冷冻干燥。该产品的乳铁传递蛋白纯度为95％，总产率为61.9％。

实施例4  本发明磷酸钙沉淀物的电泳分析实验

取实施例3制得的磷酸钙沉淀物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，使用商业化标准电泳仪，凝胶板，缓冲液(Gradipore产品和操作程序)。固定溶液含乙醇50％，醋酸10％和水40％。染色水溶液含考马斯蓝0.5％和酰胺染料10B 0.5％。3％的醋酸溶液用于脱色。凝胶上染色的蛋白质谱带可用光密度计(岛津双波长TCL扫描仪CS910)扫描进行定量分析。

实施例5本发明方法获得的乳铁传递蛋白的氨基酸序列分析

将实施例3制得的乳铁传递蛋白样品用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳制成乳铁传递蛋白的单一谱带，然后用蛋白质印迹法(Bio-Rad的仪器和标准操作程序)将乳铁传递蛋白的单一谱带转移至聚二氟乙烯膜上。取下膜上的乳铁蛋白谱带后放入Applied-Biosystems-470A型全自动蛋白质序列分析仪测定该蛋白质从氨基末端起的10个氨基酸残基，它们是Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr，与文献报道相同。

Claims (4)

1、一种从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)采用一步磷酸钙亲和沉淀法将乳铁传递蛋白从乳清液中预先沉淀分离，即在1升乳清液中加入1-80毫摩尔氯化钙和1-10毫摩尔磷酸钠，调节pH为6.0-7.5，搅拌，过滤得含乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀泥，经喷雾或低温真空干燥或冷冻干燥得沉淀粉；

(2)将沉淀粉用缓冲液或盐水抽提，得含乳铁传递蛋白的抽提液，缓冲液浓度为0.1-1摩尔/升，盐水浓度为0.5-5重量％，缓冲液或盐水的pH值为6-8，沉淀物与所述浓度的缓冲液或盐水用量的重量比为1∶5-10，抽提时间为20-60分钟；

(3)含乳铁传递蛋白的抽提液用分子量截留值为5万道尔顿的超滤膜分离，浓缩得浓缩液；

(4)浓缩液用阳离子交换柱进一步纯化，再喷雾或冷冻干燥，制得含量为90-95％的乳铁传递蛋白粉。

2、按权利要求1所述的方法，其特征在于所述缓冲液是选自磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐缓冲液或它们的任意二种的混合物。

3、按权利要求1所述的方法，其特征在于所述采用磷酸钙亲和沉淀法所得的含乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀泥也可直接用缓冲液或盐水抽提。

4、按权利要求1所述的方法，其特征在于所述含乳铁传递蛋白的抽提液经超滤膜分离，浓缩得的浓缩液，也可直接通过喷雾或冷冻干燥，制得含量为40-50％的乳铁传递蛋白粉。

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