CN101948896B - 多功能乳酪蛋白活性肽的集成制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多功能乳酪蛋白活性肽的集成制备方法。本发明以乳酪蛋白为原料，采用蛋白酶进行水解，采用4～6kDa超滤膜将各种活性肽从反应体系中分离出来；再采用1～2kDa超滤膜进行分级；根据磷酸肽主要带负电荷，而抑菌肽带较多正电荷，采用离子交换层析进行分离可同时获得抑菌肽、磷酸肽和降压肽，采用喷雾干燥或冷冻干燥获得各种活性肽产品。最后采用液质联用对磷酸肽、抑菌肽和降压肽进行序列鉴定。本发明最大限度地开发利用乳酪蛋白水解产物，解决当前仅制备单一种类活性肽造成资源浪费、活性肽生产成本高的现有工艺问题。
Description
技术领域
本发明涉及多种活性肽的集成制备方法，特别是一种多功能乳酪蛋白活性肽的集成制备方法，具体是基于多肽的构效关系和释放规律，组合采用酶膜耦合反应器和层析分离，集成制备抑菌肽、磷酸肽和降压肽等多种乳酪蛋白活性肽的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
生物活性多肽与人类健康息息相关，是生命体的基石和新药研发的源泉，它所具有的高活性与多样性是其他诸多物质无法比拟的。因此，生物活性多肽制备方法的开发是医药和食品生物技术的研究热点，其中蛋白质酶解法制备食源性多肽因安全、廉价、简便是最为重要的制备手段。
乳酪蛋白的酶法深加工开发是乳品科学、保健食品、生理医学与生命科学的研究热点，这是因为乳酪蛋白不仅含有人体全部必需氨基酸，而且还是制备近十类百余种活性多肽的有效肽源，功能涵盖免疫调节、自由基清除、矿物质载体、抗癌、抑菌、溶栓、降压等(InternationalDairy Journal，2005，15：1-15)。许多学者已从乳酪蛋白的水解液中分离制备了酪蛋白磷酸肽、抗菌肽、降压肽、糖巨肽等活性肽，但所设计的活性多肽酶解制备技术大多只制备单一类活性多肽，未能充分利用原料，使多肽产品生产成本增高。
为了最大限度地开拓乳酪蛋白酶解产物的总体价值，需尽可能多地从产物中分离制备多种活性肽，而各类酪源活性肽具有不同的结构特点，为它们的相互分离和多产品联产提供了可能。其中，磷酸肽(CPPs)富含磷酸丝氨酸，多为阴离子肽，与钙、铁和锌等元素的结合能力强，被誉为“矿物质载体”；抑菌肽是生物体抵御外来病原体入侵，并具有抑菌作用的一类生物分子，其中线性螺旋阳离子肽分布最广、最受关注，其肽链呈线性，含20～46个氨基酸残基，绝大部分为阳离子型(Annual Review of Microbiology，1995，49：277-304)；降压肽是一类对血压调节十分有效的物质，可用于治疗心梗、中风等心血管疾病，所含氨基酸残基个数一般少于12个(International Dairy Journal，2006，16：1277-1293.)。本发明基于活性肽的构效关系和释放规律，组建酶膜反应器和层析分离，连续酶解、同时制备磷酸肽(携钙)、抑菌肽(抑菌)和降压肽(降压)，可实现酪源活性肽的整体开发利用。
据统计，高血压正在影响着全国1/10以上人口的身体健康，是引起心梗、中风、心衰等心血管疾病的重要危险因素；大量调查资料表明：长期形成的膳食结构使40％的中国人口存在缺钙问题，平均摄入量仅为RDA(每日饮食建议量)的50％，尤以儿童和老年人更为突出；传统的抑菌制剂易引起病菌、病毒的耐药性，且对生物体毒副作用较大，而本发明集成制备的三种乳酪源活性多肽具有降压、携钙、抑菌等多种重要而独特的生理功效，且食用安全性极高，可作为功能性保健品食用，具有广阔的市场前景和极高的经济价值，且有利于全民健康水平的提高和生活质量的改善，具有明显的社会效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种多功能乳酪蛋白活性肽的集成制备方法。本发明是根据各种活性肽不同的结构特点，首先大多数活性肽的分子量小于6kDa，故采用4～6kDa超滤膜将各种活性肽从反应体系中分离出来；再根据磷酸肽与抑菌肽的分子量较大，而降压肽的分子量较小，采用用1～2kDa超滤膜进行分级；根据磷酸肽主要带负电荷，而抑菌肽带较多正电荷，因此采用离子交换层析进行分离。基于该工艺，可同时获得抑菌肽、磷酸肽和降压肽，从而最大限度地开发利用乳酪蛋白水解产物，解决当前仅制备单一种类活性肽造成资源浪费、活性肽生产成本高的现有工艺问题。
本发明提供的多功能乳酪蛋白活性肽的集成制备方法为：以乳酪蛋白为原料，采用蛋白酶进行水解，反应至一定的水解程度后，采用4～6kDa超滤膜从反应体系中分离出各种产物多肽，再将该产物用1～2kDa的超滤膜进行分级，其中截留液进入离子交换柱，分离获得磷酸肽(阴离子肽)和抑菌肽(阳离子肽)；渗透液进入离子交换柱或凝胶排阻层析柱，分离获得不同降压效果的降压肽。采用喷雾干燥或冷冻干燥获得各种活性肽产品。最后采用液质联用对磷酸肽、抑菌肽和降压肽进行序列鉴定。
本发明提供的多功能乳酪蛋白活性肽的集成制备方法包括的步骤：
1)乳酪蛋白的溶解：将乳酪蛋白溶解在pH为7.0-9.0的碱性溶液(NaOH)中，配制成10-30g/L的蛋白溶液，滴加碱或者酸调节到指定pH值。
2)酶解：将蛋白溶液置于持续搅拌且恒温30-50℃的酶膜或间歇生物反应器中，按照酶与底物的质量比为1∶(10-1000)加入蛋白水解酶，开始反应并计时。在水解的过程中通过滴加碱或酸维持反应体系的pH值，并计算水解度。
3)一级膜分离：将步骤2)获得的酶解液置于4～6kDa膜分离装置中，通过膜过滤截留分子量较大的底物和蛋白酶，得到低于4～6kDa分子量的水解产物。
4)二级膜分离：将步骤3)获得的低于4～6kDa分子量的水解产物置于1～2kDa膜分离装置中进行过滤，分别得到分子量较大的截留液和分子量较小(低于1～2kDa)的渗透液。
5)离子交换层析制备磷酸肽和抑菌肽：将步骤4)获得的截留液(分子量大于1～2kDa)在离子交换层析系统中上样，采用不同离子强度的流动相进行梯度洗脱，收集各个洗脱时间的组分。洗脱条件：流动相A为10mM柠檬酸缓冲液，pH 3.0；流动相B为10mM柠檬酸缓冲液，1mol/LNaCl，pH 3.0；梯度条件为100％A(0～2.5CV)，100％A～45％A(2.5～12.5CV)，100％B(12.5～16CV)，CV为柱体积；上样流速为2mL/min；洗脱流速为10mL/min。
其中，当使用阳离子交换层析时，不保留或弱保留的组分(洗脱体积小于3.5倍柱体积)为阴离子肽，其主要成分为磷酸肽；较强保留的组分(洗脱体积大于3.5倍柱体积)为阳离子肽，其主要成分为抑菌肽。而当使用阴离子交换层析时，不保留或弱保留的组分(洗脱体积小于3.5倍柱体积)为阳离子肽，其主要成分为抑菌肽；较强保留的组分(洗脱时间体积大于3.5倍柱体积)为阴离子肽，其主要成分为磷酸肽。
6)层析分离制备降压肽：将步骤4)获得的渗透液(分子量低于1～2kDa)在离子交换层析或凝胶排阻层析中上样，收集各个洗脱时间的组分。洗脱条件：流动相为超纯水；流速为4mL/min，检测波长为215nm。
7)干燥：将步骤5)和6)获得的不同层析组分进行收集，将其喷雾干燥或冷冻干燥，获得相应的活性多肽产品。
8)磷酸肽、抑菌肽和降压肽的序列鉴定：将步骤5)-7)获得的样品溶于0.1％三氟乙酸溶液中，采用液质联用技术和Sequest数据库检索对活性肽的序列进行鉴定。
9)活性肽的功能测定：磷酸肽主要测定其氮磷比；抑菌肽主要测定其抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的能力；降压肽主要测定其抑制血管紧张素转换酶ACE活性的能力。
所述的蛋白主要是指乳酪蛋白，也可以是含磷酸化基团的食源性蛋白。
所述的蛋白水解酶包括胰酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶或风味蛋白酶等。
所述的步骤3)，一级膜分离可以是与酶解同时进行，即步骤2)采用酶膜反应器；也可以是在酶解后进行，即步骤2)采用间歇反应器。
所述的超滤膜包括中空纤维膜、平板膜、卷式膜等。
所述的离子交换层析方法包括阳离子交换层析、阴离子交换层析等。
本发明提供的磷酸肽、抑菌肽和降压肽集成制备方法，可充分利用食源性蛋白水解液中的活性成分，从而降低了活性肽的生产成本，在食品生物技术领域中具有良好的应用前景。
附图说明
图1磷酸肽、抑菌肽和降压肽集成制备的工艺流程图。
图2离子交换层析分离制备磷酸肽和抑菌肽的色谱图。
图3凝胶排阻层析分离制备降压肽的色谱图。
具体实施方式
实施例1
配制2L 20g/L的牛乳酪蛋白(Sigma公司)溶液，加0.1M的NaOH溶液调节pH值为8.0，将其置于持续搅拌且恒温37℃的自制酶膜反应器，其中平板膜的截留分子量为5kDa。按照酶与底物质量比为1∶100加入0.4g胰酶(Sigma公司)，并开始计时，同时滴加0.1M的NaOH维持体系pH值为8.0。预反应20min后，调节过膜压力，并开启补料泵，维持反应体积为2L，调节膜前后的压力，保持渗透通量为4L/h。将渗透液置于另外一套低分子量膜过滤装置，平板膜截留分子量为1kDa，调节过膜压力为0.2MPa，获得分子量为1k-5kDa的截留液和小于1kDa的渗透液。
取1kDa膜分离后分子量为1k-5kDa的多肽溶液(上述截留液)100mL，上样到强阳离子交换层析柱SP650M(TOSOH公司)，进行梯度洗脱，洗脱条件：流动相A为10mM柠檬酸缓冲液，pH 3.0；流动相B为10mM柠檬酸缓冲液，1mol/L NaCl，pH 3.0；梯度条件为100％A(0～2.5CV)，100％A～45％A(2.5～12.5CV)，100％B(12.5～16CV)，CV为柱体积；上样流速为2mL/min；洗脱流速为10mL/min。经过洗脱，获得10个组分(图2)。
再对所获得的10个组分进行序列鉴定，采用液质联用和Sequest数据库检索相结合的方法，液质联用操作条件：LCQ Advantage MAX电喷雾离子阱质谱；214TP54反相色谱柱；进样体积为10μL；流速为1.0mL/min；检测时间为60min；检测方式为正离子检测。多肽的鉴定和搜索是由Bioworks V3.1(Thermo Finnigan公司)中的TurboSequest软件完成的。结果表明：先洗脱的组分1和组分2以磷酸肽为主(共检出24个多肽，其中含21个磷酸肽，具体氨基酸序列见表1)，占87.5％；后洗脱的组分4-6在1.0mg/mL时对金黄色葡萄球菌的抑菌活性分别为100％、92.27％和78.42％。
取1kDa膜分离后分子量小于1kDa的多肽溶液(渗透液)100mL，上样到Sephadex G-15凝胶排阻层析柱中进行洗脱，洗脱条件：流动相为超纯水；流速为4mL/min，检测波长为215nm。经洗脱，得到5个组分，其中组分1-2在1.0mg/mL时具有ACE抑制活性，分别达到82％和75.3％。
表1酶膜反应器洗脱组分1和2的磷酸肽组成与氨基酸序列
实施例2
配制10L20g/L的牛乳酪蛋白(Sigma公司)溶液，加0.1M的NaOH溶液调节pH值为8.0，将其置于持续搅拌且恒温37℃的间歇反应器中，按照酶与底物质量比为1∶400加入0.5g胰酶(Sigma公司)，并开始计时，同时滴加NaOH维持体系pH值为8.0。反应30min后，加酸灭酶。利用5kDa的卷式膜对酶解液进行过滤，获得滤出液(产物)，再利用1kDa的卷式膜进行过滤，分别获得分子量为1k-5kDa的截留液和小于1kDa的渗透液。
取1kDa膜分离后分子量为1k-5kDa的多肽溶液100mL，上样到强阳离子交换层析柱，通过梯度洗脱(洗脱条件同实施例1)获得6个组分，根据液质联用和Sequest数据库检索的结果可见：先洗脱的组分1以磷酸肽为主(共检出多肽17个，含15个磷酸肽，具体氨基酸序列见表2)，占88.2％；后洗脱的组分3-5在1.0mg/mL时对金黄色葡萄球菌的抑菌活性分别为90.98％、97.49％和71.30％。
取1kDa膜分离后分子量小于1kDa的多肽溶液100mL，上样到Sephadex G-15凝胶排阻层析柱中进行洗脱(洗脱条件同实施例1)。经洗脱，得到5个组分，其中组分1-2在1.0mg/mL时具有ACE抑制活性，分别达到71％和73.5％。
表2间歇反应器洗脱组分1的磷酸肽组成与氨基酸序列
Claims (4)
1.一种乳酪蛋白活性肽的集成制备方法，其特征在于它包括的步骤：
1)乳酪蛋白的溶解：将乳酪蛋白溶解在pH为8.0的碱性溶液中，配制成10-30g/L的蛋白溶液；
2)酶解：将蛋白溶液置于持续搅拌且恒温30-50℃的酶膜或间歇生物反应器中，按照酶与底物的质量比为1∶10-1000加入蛋白水解酶，开始反应并计时，在水解的过程中通过滴加碱或酸维持反应体系的pH为8.0，并计算水解度；所述的蛋白水解酶为胰酶；
3)一级膜分离：将步骤2)获得的酶解液置于5kDa膜分离装置中，通过超滤膜过滤截留分子量较大的底物和蛋白酶，得到低于5kDa分子量的水解产物；
4)二级膜分离：将步骤3)获得的低于5kDa分子量的水解产物置于1kDa膜分离装置中进行过滤，分别得到分子量较大的截留液和分子量低于1kDa的渗透液；
5)离子交换层析制备磷酸肽和抑菌肽：将步骤4)获得的截留液，分子量大于1kDa，在阳离子交换层析柱SP650M系统中上样，采用不同离子强度的流动相进行梯度洗脱，收集各个洗脱时间的组分；洗脱条件：流动相A为10mM柠檬酸缓冲液，pH 3.0；流动相B为10mM柠檬酸缓冲液，1mol/L NaCl，pH 3.0；梯度条件为0～2.5CV的100％A，2.5～12.5CV的100％A～45％A，12.5～16CV的100％B，CV为柱体积；上样流速为2mL/min；洗脱流速为10mL/min；
6)层析分离制备降压肽：将步骤4)获得的分子量低于1kDa的渗透液在阳离子交换层析柱SP650M或Sephadex G-15凝胶排阻层析柱中上样，收集各个洗脱时间的组分；洗脱条件：流动相为超纯水；流速为4mL/min，检测波长为215nm；
7)干燥：将步骤5)和6)获得的不同层析组分进行收集，将其喷雾干燥或冷冻干燥，获得相应的活性多肽产品；
8)磷酸肽、抑菌肽和降压肽的序列鉴定：将步骤5)-7)获得的样品溶于0.1％三氟乙酸溶液中，采用液质联用技术和Sequest数据库检索对活性肽的序列进行鉴定；
9)活性肽的功能测定：磷酸肽主要测定其氮磷比；抑菌肽主要测定其抑制金黄色葡萄球菌的能力；降压肽主要测定其抑制血管紧张素转换酶ACE活性的能力。
2.根据权利要求1所述的集成制备方法，其特征在于所述的乳酪蛋白是含磷酸化基团的食源性蛋白。
3.根据权利要求1所述的集成制备方法，其特征在于步骤3)所述的一级膜分离是与酶解同时进行，即步骤2)采用酶膜反应器；或是在酶解后进行，即步骤2)采用间歇反应器。
4.根据权利要求1所述的集成制备方法，其特征在于所述的超滤膜包括中空纤维膜、平板膜、卷式膜。
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