CN115537442A - 一种蛋黄磷酸肽及其高效富集制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋黄磷酸肽及其高效富集制备方法与应用，属于生物技术领域。以工业生产蛋黄卵磷脂废弃物脱脂蛋黄粉为原料，添加水和胰酶或碱性蛋白酶，酶解、灭酶后过滤取上清液，酶解上清液过10000Da超滤膜，取截留液，干燥后即得到蛋黄磷酸肽。进一步研究发现，本发明所制备的蛋黄磷酸肽磷元素含量较高，且具有较高的钙离子螯合能力和促进成骨细胞增殖活性。本发明对工业化生产蛋黄卵磷脂废弃物进行回收利用，制备出具有高生物活性的蛋黄磷酸肽，具有较高的社会和经济效益。此外，本发明具有制备工艺简单高效和反应条件温和的优点。

Description

一种蛋黄磷酸肽及其高效富集制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用畜禽及副产物生产功能性肽的制备方法，具体涉及一种蛋黄磷酸肽及其高效富集制备方法与应用。
背景技术
随着世界人口逐渐进入老龄化阶段，骨质疏松症的发病率逐年上升，其特点是骨矿物质密度低和骨组织微结构退化。据报道，全球约有2亿名患者正在接受治疗。目前，成骨细胞和骨基质再生药物(例如双磷酸盐、雌激素受体调节剂、钙剂和他汀类等)是治疗骨质疏松症的主要药物，但是长期服用此类药物会存在一些副作用，如眼部炎症、肾脏损伤和心脏病发作等。因此，开发具有较小副作用的新型治疗剂逐渐成为研究热点。
脱脂蛋黄粉是工业生产蛋黄卵磷脂的副产物。近年来，随着卵磷脂生产量的不断扩大，此副产物在工业生产中不断累积，并作为废弃物被大量丢弃，造成资源浪费和环境污染。诸多研究报道蛋黄蛋白质是一类优质蛋白质，氨基酸配比均衡，营养价值高。蛋黄蛋白中含有多种高度磷酸化的蛋白质，如卵黄高磷蛋白(Phosvitin，PV)是目前已知的蛋黄蛋白中磷酸化程度最高的一种蛋白质，相对分子量为35000Da，主要由216个氨基酸构成，其中含有124个丝氨酸，且80％的丝氨酸残基已发生磷酸化。已有多项研究表明，PV对于脂质过氧化损伤具有抑制作用，以及具有较好的乳化性、促进骨骼矿化、抗菌等生理活性功能，因此PV可以用作功能性食品的成分，以及在医疗保健方面可用于治疗心肌炎，冠心病等。
源自蛋的骨强化组合物公开了一种来自蛋黄蛋白的骨强化组合物，其特征是蛋黄蛋白水解物。这项研究首次发现蛋黄蛋白水解物有促进成骨细胞增殖及钙化的作用，同时也发现此产物可促进骨生长和骨代谢，但是此发明采用的原料是价格较为昂贵的新鲜蛋黄液或蛋黄粉，且并未将促骨骼生长的有效成分进行富集。逯振宇等人发明了一种牛骨胶原蛋白肽及制备方法和用途，该发明公开了一种牛骨胶原蛋白多肽的制备方法，此发明用胰蛋白酶和复配蛋白酶酶解牛骨粉得到牛骨肽，此牛骨胶原肽既可以提高骨密度，又可以增加骨骼韧性和弹性，是一种骨骼保护营养剂。张珍妮公开了一种供骨质疏松人群食用的含肽组合物及应用，此发明所述组合物是以牛骨低聚粉、葛根粉和酪蛋白磷酸肽等制备而成，所述组合物具有强筋健骨、促成骨细胞增殖的功效，改善骨质疏松的效果。在张恒发明的鳄鱼肽的提取方法中，其公开了一种从鳄鱼骨肉中运用生物酶解技术进行小分子活性肽的提取方法，此肽中含有大量活性钙和磷等，可用于治疗老年骨质疏松、促进儿童生长发育等特殊功效。上述活性肽均为天然活性物质，可促进成骨细胞生长，缓解骨质疏松和儿童发育不良等问题，同时可避免传统促骨生长药物对人体造成的副作用。然而，关于蛋黄磷酸肽如何从酶解产物中高效富集在发明或文献中鲜有提及，关于制备具有成骨活性蛋黄磷酸肽的发明和文献也未见报道。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足与繁冗，本发明的目的在于提供一种蛋黄磷酸肽及其高效富集制备方法与应用，具体为一种从蛋黄酶解产物中高效富集蛋黄磷酸肽的方法，获得蛋黄磷酸肽并将蛋黄磷酸肽应用于制备具有促进骨骼生长的功能食品和/或保健食品中，该方法的要点在于采用独特的酶解技术结合膜处理技术富集酶解产物中蛋黄磷酸肽，获得较高的磷酸根含量和较高促成骨细胞增殖活性的蛋黄磷酸肽。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种高效富集蛋黄磷酸肽的方法，包括如下步骤：
步骤1：将脱脂蛋黄粉粉碎并与水混合，加入水的质量为脱脂蛋黄粉质量的5-15倍，充分混匀，得到混合溶液；
步骤2：将步骤1中混合溶液的pH调节为7-12，加入脱脂蛋黄粉质量0.1％-2％的胰酶或碱性蛋白酶，在37-65℃水浴摇床中水解1-24h；
步骤3：将步骤2中水解完成后的水解液升温灭酶，离心去除沉淀，得到上清液；
步骤4：将上清液过超滤膜，取截留液，浓缩，喷雾干燥，得到蛋黄磷酸肽。
进一步地，步骤1所述脱脂蛋黄粉来源于鸡蛋、鸭蛋中任意一种。
进一步地，步骤2中，所述胰酶为中国南宁东恒华道胰酶，所述碱性蛋白酶为日本天野AY50C碱性蛋白酶。
进一步地，步骤2中，所述混合溶液的pH调节为8-10。
进一步地，步骤2中，在37-65℃水浴摇床中水解3-24h。
进一步地，步骤3所述灭酶的条件为：75-100℃加热5-30min。
进一步地，步骤3所述灭酶的条件为：75-90℃加热5-25min。
进一步地，步骤3所述离心的条件为：1000-10000g离心5-30min。
进一步地，步骤3所述离心的条件为：5000-10000g离心10-15min。
进一步地，步骤4所述过超滤膜为过截留分子量10000Da的超滤膜。
进一步地，步骤4所述浓缩为浓缩至固形物的质量百分含量为5％-45％。
进一步地，步骤4所述浓缩为浓缩至固形物的质量百分含量为10％-45％。
进一步地，步骤4所述蛋黄磷酸肽为促成骨细胞增殖的蛋黄磷酸肽，在凝胶电泳和凝胶渗透色谱法分子量分析中，分子量大部分为小于3000Da，且其含有较高的磷含量(>10mg/g)。
本发明还提供所述蛋黄磷酸肽的应用。
进一步地，所述蛋黄磷酸肽在制备具有促进骨骼生长的功能食品和/或保健食品中的应用。
进一步地，所述具有促进骨骼生长的功能食品和/或保健食品包括所述蛋黄磷酸肽和可接受的辅料。
进一步地，所述可接受的辅料为淀粉、硬脂酸镁、甜菊糖、山梨醇中的一种以上。
本发明的蛋黄磷酸肽是使用安全的天然物质，可以作为日常生活中可摄取的骨强化原材料，在饮食或医药中广泛使用。
本发明提供含有蛋黄磷酸肽的膳食补充剂，具体地，所述蛋黄磷酸肽的膳食补充剂量为2.0～10mg/kg·d。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用10000Da超滤膜对脱脂蛋黄粉酶解产物进行截留，发现截留液(蛋黄磷酸肽)中磷离子含量显著高于酶解产物和酶解产物透过液，且蛋黄磷酸肽的钙离子螯合能力和促成骨细胞增殖活性均高于酶解产物和透过液。这表明超滤膜可以截留具有更高促成骨细胞增殖活性的蛋黄磷酸肽。
(2)传统理论认为小分子化合物会通过10000Da超滤膜，在透过液中富集。本发明采用10000Da超滤膜对脱脂蛋黄粉酶解产物进行截留，发现截留液中(蛋黄磷酸肽)分子量大部分均小于3000Da。这表明超滤膜可以截留分子量低于3000Da的蛋黄磷酸肽。
(3)本发明工艺操作简单高效、生产成本低、没有任何污染，所得蛋黄磷酸肽相较于脱脂蛋黄粉酶解产物和脱脂蛋黄粉酶解产物透过液具有更高的钙离子螯合率和更好的促成骨细胞增殖活性。
(4)本发明对工业化生产蛋黄卵磷脂废弃物进行回收利用，制备出具有高生物活性的蛋黄磷酸肽，具有较高的社会和经济效益。此外，本发明具有制备工艺简单高效和反应条件温和的优点。
附图说明
图1为本发明公开的蛋黄磷酸肽制备流程图。
图2为个已知分子量标准品的高效液相色谱图。
图3为实施案例1中酶解产物及各超滤截留组分的高效液相色谱图。
图4为本发明实施案例1中蛋黄磷酸肽的促成骨细胞增殖效果图。
具体实施方式
本发明公开了一种蛋黄磷酸肽及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
脱脂蛋黄粉酶解液水解度和蛋白回收率的测定：蛋白质水解度是指酶解上清液氨氮总含量与酶解体系总氮含量的比值。蛋白回收率是指酶解上清液中总氮含量与酶解体系总氮含量的比值。
酶解上清液氨氮总含量的测定采用甲醛滴定法：准确称取5g脱脂蛋黄粉酶解上清液液体，加入75g超纯水至溶液体系总质量为80g，混合均匀，随后缓慢滴入0.1MNaOH水溶液至体系pH为8.2，加入10mL甲醛，继续滴入0.1MNaOH水溶液至体系pH为9.2，记录溶液体系从8.2至9.2消耗的氢氧化钠体积V，同时，以80g超纯水代替5g酶解上清液液体和75g超纯水作为空白对照，空白对照体系pH从8.2滴定至9.2消耗的氢氧化钠体积记为V0。此外需称量酶解体系中脱脂蛋黄粉酶解上清液总质量m上清液(单位g)，脱脂蛋黄粉酶解上清液氨氮总含量计算公式如下：
Figure BDA0003870060010000041
酶解体系总氮含量的测定采用凯氏订氮法：酶解体系中总氮的含量即为加入脱脂蛋黄粉中的总氮质量。准确称取0.2g脱脂蛋黄粉至消化管中，再加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL浓硫酸于消化炉中进行消化，当消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却于自动凯氏定氮仪上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录消耗盐酸的体积V，同时，设置空白组(仅不加脱脂蛋黄粉，其它步骤同上)，记录消耗盐酸的体积V0。此外，需记录酶解体系中加入脱脂蛋黄粉的总质量m脱脂蛋黄粉(单位g)，酶解体系总氮含量计算公式如下：
Figure BDA0003870060010000042
公式(2)中C盐酸代表盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)。
酶解上清液总氮含量的测定采用凯氏订氮法：准确称取2g脱脂蛋黄粉酶解上清液至消化管中，再加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL浓硫酸于消化炉中进行消化，当消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却于自动凯氏定氮仪上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录消耗盐酸的体积V，同时，以2g超纯水代替2g脱脂蛋黄粉酶解上清液作为对照，记录消耗盐酸的体积V0。此外，需称量酶解体系中脱脂蛋黄粉酶解上清液总质量m上清液(单位g)，上清液总氮含量计算公式如下：
Figure BDA0003870060010000051
公式(3)中C盐酸代表盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)。
水解度和蛋白回收率根据以下公式(4)和(5)进行计算：
Figure BDA0003870060010000052
Figure BDA0003870060010000053
蛋黄磷酸肽钙离子螯合工艺及钙离子螯合率的测定：准确称取5mL酶解上清液，1MNaOH调节pH至7.0，加入0.5mL CaCl2水溶液(30mg/mL)，放入60℃空气摇床中充分反应40min，待反应结束后，按酶解上清液与无水乙醇比例为1:8(v/v)加入40mL无水乙醇，静置1h，离心10min(9000转/min)，取上清液。参考GB 5009.92-2016测定上清液中钙离子含量，钙离子螯合率根据公式(6)进行计算：
Figure BDA0003870060010000054
其中，公式(6)中钙离子总添加量的单位为mg；上清液中钙离子总量的单位为mg。
蛋黄磷酸肽分子量的测定：采用HPLC法测定蛋黄磷酸肽分子量分布情况。配制5mg/mL的蛋黄磷酸肽，0.22μm针式滤头过膜。选择色谱柱TSKgel2000SWXL(7.8×300mm，250mm)，检测波长220nm，柱温30℃。流动相为乙腈：水：三氟乙酸＝25：75：0.01(V/V/V)，以0.8mL/min等度洗脱。以牛血清蛋白(Mw 68000)、细胞色素C(Mw 12384)、抑酞酶(Mw6511.53)、杆菌肽(Mw 1422.69)和谷胱甘肽(Mw 189)为标准品，以标准分子量对数与洗脱时间做回归方程，计算各蛋黄磷酸肽的分子量分布。
磷离子含量的测定：采用国标GB 5009.87-2016第三法电感耦合等离子体发射光谱法。
蛋黄磷酸肽促成骨细胞增殖活性的测定：取处在对数生长期的MC3T3-E1细胞，血球计数板进行计数后，将细胞悬液稀释至1.5×105cells/mL，接种于96孔板内，每孔100μL。在37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养，细胞紧贴瓶壁时，弃去培养基。实验分为空白调零组，对照组和实验组：空白调零组为只添加培养液的实验组，对照组为含细胞不加蛋黄磷酸肽的实验组，实验组为加入200μL不同浓度(0.5mg/mL和1mg/mL)的蛋黄磷酸肽。培养板于培养箱中培养24h后，弃去旧培养基(原培养基中的肽样品要去除干净，避免对MTT的影响)，每孔加入200μLMTT(0.5mg/mL)，继续培养4h后，弃去MTT溶液，加入150μL DMSO。室温下在摇床上避光震荡5min，充分混匀后，在全波长酶标仪上选择570nm波长，测定各孔吸光度值A570。实验重复6次，取平均值。按以下公式计算：
Figure BDA0003870060010000061
下面举出实施例来详细说明本发明，但并不限制本发明只能应用该实施例。
图1为本发明公开的蛋黄磷酸肽制备流程图。
实施例1
(1)将100g脱脂蛋黄粉粉碎过60目筛与900g饮用水混合，1M NaOH水溶液调节pH为9.0，加入1g的AY50C碱性蛋白酶(日本天野Amano酶制剂公司)，在60℃水浴摇床中震荡酶解6h，80℃灭酶处理10min，8000g离心12min，取上清液，即为脱脂蛋黄粉酶解产物；
(2)将上述步骤(1)得到的酶解产物过截留分子量10000Da和3000Da的超滤膜，将步骤(1)得到的酶解产物、10000Da截留组分、3000Da-10000 Da以及过3000Da膜滤液分别命名为AY1、AY2、AY3和AY4。将上述4个组分浓缩至固形物质量百分含量为25％，喷雾干燥，即得到4种不同的蛋黄磷酸肽组分。
图3为实施案例1中脱脂蛋黄粉原酶解物(步骤(1)得到的蛋黄蛋白酶解产物)AY1(图3中的A)及超滤后各组分AY2(图3中的B)、AY3(图3中的C)和AY4(图3中的D)的高效液相色谱图。从图3中可以看出原始酶解AY1物及超滤后的各组分其出峰时间均在18min后，对比图2中标准品液相色谱图各分子量出峰时间可得，其分子量均为小于3000Da的小分子物质。
通过本发明具体实施方式中的技术方案来测定4种不同蛋黄磷酸肽组分的蛋白质含量、磷含量、钙离子螯合能力、分子量分布和ζ-电位，结果如表1所示。
采用凝胶渗透色谱法测定10000Da超滤膜截留组分蛋黄磷酸肽的分子量分布，发现此组分分子量分布几乎均为小于3000Da，表明此组分存在大量磷酸基团或负电荷等特征导致此组分被截留。
经测定，从表1中可以看出，AY2组分的钙离子螯合能力最高，其次依次是AY1、AY3和AY4。此结果表明，经过10000Da超滤膜得到的截留液组分有效的将高钙离子螯合活性的物质富集。具体地，AY2的蛋白质含量为72.34％，钙离子螯合能力为63.13mg/g。
经过金属离子和ζ-电位测定，AY2中磷元素的含量为12.5mg/g，大于10.0mg/g，电位为-14.25mV，该组分的磷含量及ζ-电位均高于骤(1)得到的酶解产物AY1及剩余组分AY3和AY4。肽链中的每个磷酸基团带4个负电荷，因此上述结果表明AY2组分实现了对含磷酸基团肽段的富集。
表1
Figure BDA0003870060010000071
配制不同梯度浓度AY1、AY2、AY3和AY4蛋黄磷酸肽的细胞培养基，测定不同组分的促MC3T3-E1成骨细胞增殖活性。以对照组细胞增殖率为100％时的相对值来表示，所述蛋黄磷酸肽的促成骨细胞增殖活性如表2所示。从表2中可以看出，在不同样品浓度梯度下，AY2组分的促MC3T3-E1成骨细胞增殖活性均高于其他组分，其最高促成骨细胞增殖率可达190％。此结果说明，本发明将蛋黄蛋白酶解液中的具有高促成骨细胞增殖活性的蛋黄磷酸肽成功富集。
表2
Figure BDA0003870060010000072
图4为本发明实施案例1中蛋黄磷酸肽的促成骨细胞增殖效果图。由图4可知，在成骨细胞培养基中加入AY2组分蛋黄磷酸肽后，成骨细胞数量显著增多，表明该AY2组分蛋黄磷酸肽具有促成骨细胞增殖活性。
实施例2
(1)将100g脱脂蛋黄粉粉碎过60目筛与500g饮用水混合，1M NaOH水溶液调节pH为7.0，加入0.1g的胰酶(南宁东恒华道生物科技有限公司)，在37℃水浴摇床中震荡酶解1h，75℃灭酶处理5min，5000g离心5min，取上清液，即为脱脂蛋黄粉酶解产物；
(2)将上述步骤(1)得到的酶解产物过截留分子量10000Da和3000Da的超滤膜，将骤(1)得到的酶解产物、10000Da截留组分、3000Da-10000 Da以及过3000Da膜滤液分别命名为Y1、Y2、Y3和Y4。将4个组分浓缩至固形物质量百分含量为5％，喷雾干燥，得4种不同的蛋黄磷酸肽组分。
通过本发明具体实施例2中的技术方案来测定4种不同蛋黄磷酸肽组分的蛋白质含量、钙离子螯合能力和分子量分布，结果如表3所示。AY2的蛋白质含量为68.92％，钙离子螯合能力为60.29mg/g。采用凝胶渗透色谱法测定10000Da超滤膜截留组分蛋黄磷酸肽的分子量分布，发现此组分分子量分布中有86.13％均为小于3000Da。综上所述，Y2组分含有最少的蛋白含量，却具有最高的钙离子螯合率，表明钙离子螯合有效成分被富集。
表3
Figure BDA0003870060010000081
配制两个较适浓度(0.5mg/mL和1mg/mL)AY1、AY2、AY3和AY4蛋黄磷酸肽的细胞培养基，测定不同组分蛋黄磷酸肽的促MC3T3-E1成骨细胞增殖活性。以对照组细胞增殖率为100％时的相对值来表示，所述蛋黄磷酸肽的促成骨细胞增殖活性如表4所示。从表4中可以看出，在不同样品浓度下，AY2组分的促MC3T3-E1成骨细胞增殖活性均高于其他组分，其最高促成骨细胞增殖率可达138％。
表4
Figure BDA0003870060010000091
实施例3
(1)将100g脱脂蛋黄粉粉碎粉碎过60目筛并与1500g饮用水充分混匀，采用1MNaOH水溶液将上述混合液的pH调节为12，加入2gAY50C碱性蛋白酶，在65℃水浴摇床中震荡酶解24h。酶解完成后的酶解液升温至100℃灭酶30min，10000g离心30min去除沉淀，得到上清液，即为脱脂蛋黄粉酶解产物。
(2)将骤(1)得到的酶解产物过截留分子量10000Da的超滤膜，取截留液，浓缩至固形物质量百分含量为45％，喷雾干燥，得蛋黄磷酸肽。
经测定，实施例3制备得到的蛋黄磷酸肽的蛋白质含量为70.02％，钙离子螯合能力为62.10mg/g，磷元素的含量为13.10mg/g，大于10.0mg/g，电位为-16.21mV，其分子量小于3000Da的组分占据98.8％。配制两个较适浓度(0.5mg/mL和1mg/mL)实施例3制备的蛋黄磷酸肽的细胞培养基，在实施例3制备的蛋黄磷酸肽浓度分别为0.5mg/mL和1mg/mL的细胞培养基条件下，以对照组细胞增殖率为100％，实施例3制备的蛋黄磷酸肽的促成骨细胞增殖活性分别可达到128％和145％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种蛋黄磷酸肽的高效富集制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将脱脂蛋黄粉粉碎并与水混合，加入水的质量为脱脂蛋黄粉质量的5-15倍，充分混匀，得到混合溶液；
步骤2：将步骤1中混合溶液的pH调节为7-12，加入脱脂蛋黄粉质量0.1％-2％的胰酶或碱性蛋白酶，在37-65℃水浴摇床中水解1-24h；
步骤3：将步骤2中水解完成后的水解液升温灭酶，离心去除沉淀，得到上清液；
步骤4：将步骤3中上清液过超滤膜，取截留液，浓缩，喷雾干燥，得蛋黄磷酸肽。
2.根据权利要求1所述的一种蛋黄磷酸肽的高效富集制备方法，其特征在于，步骤1所述脱脂蛋黄粉来源于鸡蛋、鸭蛋中任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种蛋黄磷酸肽的高效富集制备方法，其特征在于，步骤3所述灭酶的条件为：75-100℃加热5-30min。
4.根据权利要求1所述的一种蛋黄磷酸肽的高效富集制备方法，其特征在于，步骤3所述离心的条件为：1000-10000g离心5-30min。
5.根据权利要求1所述的一种蛋黄磷酸肽的高效富集制备方法，其特征在于，步骤4所述过超滤膜为过截留分子量10000Da的超滤膜。
6.根据权利要求1所述的一种蛋黄磷酸肽的高效富集制备方法，其特征在于，步骤4所述浓缩为浓缩至固形物的质量百分含量为5％-45％。
7.权利要求1-6任一项所述制备方法制备得到的蛋黄磷酸肽。
8.权利要求7所述蛋黄磷酸肽应用于制备具有促进骨骼生长的功能食品和/或保健食品中。
9.根据权利要求8所述蛋黄磷酸肽应用于制备具有促进骨骼生长的功能食品和/或保健食品中，其特征在于，所述具有促进骨骼生长的功能食品和/或保健食品包括所述蛋黄磷酸肽和可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述蛋黄磷酸肽应用于制备具有促进骨骼生长的功能食品和/或保健食品中，其特征在于，所述可接受的辅料为淀粉、硬脂酸镁、甜菊糖、山梨醇中的一种以上。
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