CN113004384B - 一种海参肠促成骨肽的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于活性物质筛选及应用领域，具体涉及一种海参肠促成骨肽的制备方法及其应用。海参肠经清洗匀浆后，调节PH为5～10；加入蛋白酶后在50～60℃下酶解4～8h；再经高温灭酶、离心后，经截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，将超滤后的液体干燥，即得到海参肠促成骨肽。本发明方法工艺步骤简单，设备投资少、无环境污染，适于工业化生产；所得小分子肽具有较强的促成骨活性，既可以作为一种促进骨生成的功能食品直接食用，也可以作为食品配料或者保健品。
Description
技术领域：
本发明属于活性物质筛选及应用领域，具体涉及一种海参肠促成骨肽的制备方法及其应用。
背景技术：
随着人口老龄化的加剧，骨健康已成为影响生存质量的决定性因素。继高血压、糖尿病、冠心病之后，世界卫生组织将骨健康系列问题疾病列为对人体危害最广泛的问题。据统计，我国是全球骨质疏松患者最多的国家，骨质疏松症患者超过1.6亿，已成第四大慢性疾病。到2020年，我国骨质疏松和低骨量患者人数将增加至2.8亿。然而，目前用于提升骨量，改善骨相关疾病的药物存在较多副作用，开发具有促骨生成作用且无副作用的天然活性成分十分紧迫且必须。
海参作为我国传统药食两用的海珍品，已被证明拥有多种营养功效，如抗动脉硬化、抗炎、提高免疫力等。随着我国海参产业的不断发展，2019年全国海参年产量达到17万吨。海参肠是海参消化吸收的场所，含有丰富的活性物质，蛋白质含量超过干重的60％，高于海参体壁，是优质的蛋白来源。数据显示海参肠重量能达到海参重量的30～40％，即每年海参肠产量可达5-7万吨。然而，在实际海参生产加工过程中，海参肠因携带大量泥沙，往往被当作废弃物丟弃，未得到充分的开发利用，造成了严重的资源浪费及环境污染。
目前市面上的海参肠产品较少，有广药集团的“生命搭档”复合多肽饮品，有增强机体免疫力、抗病毒、抗疲劳等效果；修正铁哥海参肠肽压片糖果，也具有抗疲劳、恢复体力的功效。对已有专利进行检索，有使用超声波辅助酶解制备海参肠多肽(201610683008.1)，利用海参肠多肽制备具有抗疲劳、降血脂等保健功能的海参肠多肽胶囊(CN101422205)及利用海参肠自溶制备具有抗氧化功能活性物质的方法(CN103141872A)。然而，尚未见到关于海参肠与骨生成之间的联系，以及制备具有促骨生成作用的海参肠促成骨肽的相关报道。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是实际海参生产加工过程中，海参肠因携带大量泥沙，往往被当作废弃物丟弃，未得到充分的开发利用，造成了严重的资源浪费及环境污染；而且也尚未见到关于海参肠与骨生成之间的联系，以及制备具有促骨生成作用的海参肠小分子肽的相关报道。
为解决上述问题，本发明提供了一种海参肠酶解物的制备方法及其在促骨生成制品中的应用，通过离心-超滤-干燥分离纯化工艺制备得到了一种海参肠促成骨肽，并验证了该小分子肽具有较强促成骨能力。
为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：一种海参肠酶解物，为海参肠经蛋白酶酶解后，再经离心超滤得到分子量小于3kDa的酶解物。小分子肽具有吸收快速、高效等特点，有助于其促成骨活性。
一种海参肠促成骨肽的制备方法，海参肠经清洗匀浆后，调节PH为5～10；加入蛋白酶后在50～60℃下酶解4～8h；再经高温灭酶、离心后，经截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，将超滤后的液体干燥，即得到海参肠小分子肽。该酶解条件可以保持海参内源自溶酶的活性，一方面提升了酶解效率，另一方面保持自溶酶活性，使其与外蛋白酶协同作用，高效的酶切得到更多低分子量活性、更高成骨活性的肽片段。
进一步的，清洗匀浆步骤具体为将新鲜海参肠洗净去泥沙，加入料液比为1:4～1:8的去离子水匀浆。该料液比在保证酶解效率的前提下，最大程度的节约资源，降低后续干燥处理难度。
进一步的，所述蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的任一种或一种以上的混合物。以上蛋白酶均为常见市售蛋白酶，价格低廉，易于获得。
进一步的，酶解时加酶量为1000～4000u/g。该加酶量选择有较为合适的酶底比，可以较好的获取适当分子量大小的促成骨肽。
进一步的，所述高温灭酶步骤具体为酶解时间结束后，迅速升温至90～95℃，保持10～20分钟。将所加入蛋白酶灭活。
进一步的，所述离心步骤具体为所得酶解液在5000-9000rpm离心10～30min，收集上清液。
进一步的，所述超滤步骤具体为将离心后的上清液在0.01～0.2MPa，20～40℃条件下超滤，选择截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集滤过液体。
进一步的，所述干燥方式为喷雾干燥、冷冻干燥或真空干燥。得到的白色或淡黄色粉末，即为海参肠促成骨肽。
一种海参肠促成骨肽在促骨生成制品中的应用。该成骨肽能够促进成骨细胞的增殖和矿化，增加间充质干细胞的向成骨细胞的分化，从而促进骨生成。
进一步的，所述制品为保健食品、功能食品或特殊医用食品。
本发明的有益效果如下：
本发明所用的原料丰富易得，所述方法工艺步骤简单，设备投资少、无环境污染，适于工业化生产。所得小分子肽具有较强的促成骨活性。既可以作为一种促进骨生成的功能食品直接食用，也可以作为食品配料或者保健品。
附图说明
图1是海参肠促成骨肽对MC3T3-E1前成骨细胞分化的影响；
图2是海参肠促成骨肽骨髓间充质干细胞成骨分化的影响；
图3是海参肠促成骨肽对生长期小鼠骨矿化沉积的影响。
具体实施方式：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种海参肠促成骨肽的制备方法：
1)原料预处理：新鲜海参肠洗净去泥沙，加入料液比为1:5的去离子水匀浆；
2)酶解：海参肠匀浆液调节PH至7，加入中性蛋白酶，置于55℃恒温反应容器中，搅拌酶解；
3)灭酶：酶解时间结束后，迅速升温至95℃，保持15分钟，将所加入蛋白酶灭活；
4)离心：所得酶解液在8000rpm离心20min，收集上清液；
5)超滤：上清液在0.1MPa，25℃条件下超滤，选择截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集滤过液体；
6)冷冻干燥：超滤后的液体干燥至白色或淡黄色粉末，即为具有促骨生成作用的海参肠酶解物。
本发明制备方法中所述海参肠酶解物的冷冻干燥，可改用真空干燥，或室温下鼓风干燥；所述的蛋白酶可改为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、及上述两种或两种以上酶的复合。酶解时的料液比为1:4～1:8，酶用量均为1000～4000u/g，酶解时间为4～8h，反应温度为50～60℃，pH为5～10。
本发明制得的海参肠促成骨肽可作为促骨生成的保健食品及相关药物的活性成份，根据保健及治疗需要，与食用及药用辅料制成各种食品或制剂。
下面对本发明制得的海参肠促成骨肽的促骨生成的作用进行说明：
(一)体外实验：
1.1海参肠促成骨肽对MC3T3-E1前成骨细胞增殖分化的影响
1.11海参肠促成骨肽对MC3T3-E1前成骨细胞增殖的影响
取对数生长期的成骨细胞MC3T3-E1，经0.25％胰酶消化，用α-MEM完全培养基调成密度为2×104个/ml的MC3T3-E1细胞悬液接种于96孔板中，贴壁24h后吸弃培养液，分别加入不含或含有不同浓度海参肠促成骨肽的完全培养基(100、200、400μg/ml)，0.2ml/孔，每个浓度4个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中分别培养24h、48h。采用MTT法检测MC3T3-E1细胞的增殖活性。
1.12海参肠促成骨肽对MC3T3-E1前成骨细胞分化的影响
将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞接种于24孔板中，密度设为2x104个/孔，实验分组为：正常对照组，海参肠促成骨肽低剂量组(50μg/ml)，海参肠促成骨肽高剂量组(100μg/ml)。待细胞密度生长至90％时，将细胞培养液换为含50mg/L维生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10％牛血清蛋白、90％α-MEM的诱导分化培养液，记为细胞分化第0天。此后，每3d换诱导分化液一次。诱导分化至21d后，进行茜素红染色。
1.2海参肠促成骨肽对间充质干细胞(BMSCs)成骨增殖分化的影响
1.21骨髓间充质干细胞的提取
3-5周龄SD大鼠麻醉处死后无菌环境中分离股骨和胫骨，以无菌注射器吸取完全培养液反复冲洗骨髓腔至腔体发白，冲出的骨髓细胞悬液经200目筛网过滤后接种于25cm2的塑料培养瓶内，置于37℃、5％CO2、湿度饱和的培养箱中进行培养。24小时后换液除去不贴壁杂细胞，之后每隔2-3天换液一次，此时的细胞为原代细胞。实验均采用生长状态良好且纯度较高的P2代细胞，当贴壁细胞接近85％汇合时，使用含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化，传代比例为1：2。
1.22海参肠促成骨肽对间骨髓充质干细胞增殖的影响
用DMEM低糖培养基调成密度为2×104个/ml的BMSCs细胞悬液接种于96孔板中，贴壁24h后吸弃培养液，分别加入不含或含有不同浓度海参肠促成骨肽的完全培养基(100、200和400μg/ml)，0.2ml/孔，每个浓度4个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中分别培养24h、48h。采用MTT法检测BMSCs细胞的增殖活性。
1.23海参肠促成骨肽对间骨髓充质干细胞成骨分化的影响
将BMSCs以3×103个/孔接种到24孔板中，实验分组为：正常对照组，海参肠促成骨肽低剂量组(50μg/ml)，海参肠促成骨肽高剂量组(100μg/ml)。待细胞汇合至90％左右时更换为成骨诱导分化液，成骨诱导分化液组成为：10％(v/v)胎牛血清，DMEM低糖培养液，10-7M地塞米松，10mMβ-甘油磷酸酯和50μM抗坏血酸。成骨诱导分化液每两天更换一次，分化至第21天时，进行茜素红染色。
(二)体外实验结果：
2.1海参肠促成骨肽对MC3T3-E1前成骨细胞增殖的影响
成骨细胞是体内参与骨形成过程的主要功能细胞，其增殖是骨基质形成和矿化的前提。结果表明，海参肠促成骨肽能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖，且剂量效应和时间效应关系明显(见表1)。
表1海参肠促成骨肽对MC3T3-E1细胞增殖活性(％)的影响
注：“*”：P＜0.05，与正常对照组相比具有显著性差异；“**”P＜0.01，与正常对照组相比具有极显著性差异
2.2海参肠促成骨肽对MC3T3-E1前成骨细胞分化的影响
矿化结节是成骨细胞分化成熟的标志，在一定程度上可以代表骨的形成。由图1茜素红染色结果表明，海参肠促成骨肽能显著促进MC3T3-E1细胞矿化，且剂量效应和时间效应关系明显。
2.3海参肠促成骨肽对骨髓间充质干细胞增殖的影响
骨髓间充质干细胞是一种多能分化细胞，其增殖与骨生成密切相关。结果表明，海参肠促成骨肽能显著促进骨髓间充质干细胞细胞的增殖，且剂量效应和时间效应关系明显(见表2)。
表2海参肠促成骨肽对骨髓间充质干细胞增殖活性(％)的影响
注：“*”：P＜0.05，与正常对照组相比具有显著性差异；“**”P＜0.01，与正常对照组相比具有极显著性差异
2.4海参肠促成骨肽对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
骨髓间充质干细胞具有多方向分化(如脂肪和骨)的特点，其成骨分化能够促进骨生成。由图2茜素红染色结果表明，海参肠促成骨肽能显著促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，且剂量效应和时间效应关系明显。
(三)体内实验
3.1实验动物
SPF级3周龄雄性ICR小鼠30只，体重12～14克，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。
3.2实验方法：
3.21动物分组与建模
将小鼠随机分为三组：正常对照组、海参肠促成骨肽低剂量组、海参肠促成骨肽高剂量组，每组10只实验小鼠。1组为正常对照组，2组为海参肠促成骨肽低剂量组，3组为海参肠促成骨肽高剂量组。每天早上灌胃给予相应受试药，连续灌胃21天。实验结束前14天，每组随机挑选3只小鼠腹腔注射20mg/kg·bw盐酸四环素，续注射2天；实验结束前4天，将注射过盐酸四环素的小鼠再次注射5mg/kg·bw钙黄绿素，连续注射2天。
3.22血清指标测定
实验结束后，颈椎脱臼处死小鼠，摘眼球取血，离心，分离血清。取血清，按照试剂盒的方法进行碱性磷酸酶(ALP)，骨钙素(OCN)，Ⅰ型胶原(Col1)的测定。
3.23骨矿化沉积分析
选取注射过盐酸四环素和钙黄绿素的小鼠，95％酒精固定股骨，置于8％EDTA-Na2中脱钙6h，流水冲洗24h，脱水透明后进行石蜡包埋及切片(10um)，二甲苯脱蜡后滴加抗荧光猝灭剂，封片后在荧光显微镜下观察。使用Image J软件定量黄绿荧光线之间的距离，与注射时间相除得骨矿化沉积率。
3.24统计学分析
采用SPSS17.0统计分析软件进行t检验，数据用“均数±标准差”表示，双侧检验以P＜0.05表示差别有统计学意义。
(四)体内实验结果：
4.1海参肠促成骨肽对生长期小鼠的血清骨生成相关指标的影响
ColⅠ、ALP和OCN是骨基质合成、沉积和矿化的重要标志物。与正常组小鼠相比，海参肠促成骨肽干预的小鼠血清中ALP、Col1和OCN水平显著升高(P＜0.05)，且呈现剂量效应。结果见表3。
表3海参肠促成骨肽对生长期小鼠血清成骨标志物的影响
注：“*”：P＜0.05，与正常对照组相比具有显著性差异；“**”P＜0.01，与正常对照组相比具有极显著性差异；“#”P＜0.05，与海参肠促成骨肽低剂量组组相比具有极显著性差异
4.2海参肠促成骨肽对生长期小鼠股骨矿化沉积的影响
如图3所示，与正常对照组小鼠相比，海参肠促成骨肽小鼠股骨中黄绿两条荧光线间距显著增加，骨矿化沉积率显著升高，骨形成速率较快。
以上体外实验和体内实验的实验结果证明，海参肠促成骨肽可显著促进成骨细胞的增殖和分化，促进骨髓间充质促进的成骨分化，促进骨形成，具有显著的促骨生成作用。
另外，在研究中发现，不同蛋白酶酶解制备出的海参肠促成骨肽，其促成骨活性不同。经过长期的研究发现中性蛋白酶和碱性蛋白酶制备出的海参肠促成骨肽的效果最好，对于成骨细胞和骨髓间充质干细胞的增殖和分化的促进效果最显著。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (5)
1.一种海参肠促成骨肽在制备促骨生成制品中的应用，其特征在于：为海参肠经蛋白酶酶解后，再经离心超滤得到分子量小于3kDa的小分子肽；
其制备方法为海参肠经清洗匀浆后，调节PH为5~10；加入蛋白酶后在50~60℃下酶解4~8h；再经高温灭酶、离心后，经截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，将超滤后的液体干燥，即得到海参肠小分子肽；
其中，所述蛋白酶为中性蛋白酶；酶解时的加酶量为1000~4000u/g；
所述超滤步骤具体为将离心后的上清液在0.01~0.2MPa，20~40℃条件下超滤，选择截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集滤过液体。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：清洗匀浆步骤具体为将新鲜海参肠洗净去泥沙，加入料液比为1:4~1:8的去离子水匀浆。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述高温灭酶步骤具体为酶解时间结束后，迅速升温至90~95℃，保持10~20分钟。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述离心步骤具体为所得酶解液在5000-9000rpm离心10~30min，收集上清液。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述制品为保健食品、功能食品或特殊医用食品。
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