CN113265437A - 一种促进mc3t3-e1细胞增殖分化的海参蛋白肽的制备方法及应用 - Google Patents

一种促进mc3t3-e1细胞增殖分化的海参蛋白肽的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种促进MC3T3‑E1细胞增殖分化的海参蛋白肽的制备方法，包括以下步骤S1、海参均质；S2、酶解；S3、粗分离制备；S4、精细分离制备；S5、冷冻干燥。本发明制备的海参蛋白肽对MC3T3‑E1细胞增殖、骨密度调节活性效果明显，并且提取工艺简单，制备功工艺流程简便，可满足大规模工业化生产，为海参在保健品或者药品领域的开发提供理论参考。

Description

一种促进MC3T3-E1细胞增殖分化的海参蛋白肽的制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物活性肽领域，更具体地说，涉及一种以海参为原料在制备和开发具有促进MC3T3-E1细胞增殖分化的多功能保健食品及药品中的应用。
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身代谢性骨病，其典型特征为骨密度下降、骨微观结构破坏以及骨脆性增加。据统计，在全球范围内超过50岁的人群中有三分之一的女性和五分之一的男性会因骨质疏松症而骨折。随着我国进入老龄化社会，人群骨质疏松症发病率也呈现逐年增加的态势。2018年我国首次骨质疏松流行病学调查结果显示，50岁以上女性患病率为32.1％，而65岁以上女性患病率高达51.6％，且女性患病率显著高于欧美国家。随着骨质疏松患者逐渐增多，由于骨质发生疏松后造成的机体骨折导致了患者病残率和病死率的逐年上升，己成为全球范围内广泛存在的严重社会公众健康问题。因此，对骨质疏松的防治研究也得到越来越多研究者的关注。
成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。人类及动物体骨组织不断地进行着重建，骨重建过程包括骨的分解吸收与新骨的形成。破骨细胞负责骨分解与吸收，而成骨细胞负责新骨形成。机体的骨量多少是由成骨细胞和破骨细胞功能的平衡决定的，破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝，而成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。因此，破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)能够特异性表达成骨相关转录因子Runx-2和碱性磷酸酶(ALP)等早期成骨分化表型标志物，目前已被广泛应用于成骨细胞分化的研究中。
海参(Stichopusjaponicus)是一种重要的可食用的海洋生物，同时也是中医中具有“补益养生”功能的药品。研究表明，海参富含丰富的胶原蛋白、多糖、脂质、皂苷及碘、钙、磷等人体的必需元素等多种活性物质，具有抗衰老、降血糖、降血脂、增强免疫力以及抗癌等功效。此外，有研究表明海参皂苷能够降低去卵巢小鼠尿钙、尿磷浓度，减少骨矿流失，增强骨密度和骨矿化沉积，同时通过抑制骨吸收表现出良好的改善骨质疏松症的作用。目前海参作为原料或复配产品在开发预防或治疗骨质疏松的保健食品中有广泛的应用，但不同品种海参中成分组成的差异以及加工工艺的区别往往导致其对机体健康的促进作用和机制的差别。此外，海参酶解物由于溶解性差，大大限制了其在功能食品开发过程中的应用。
生物活性肽作为当前具有较好开发前景的功能因子，由于其具有多种人体代谢、生理调节功能和易消化吸收等特点被越来越多的研究者关注。活性肽可通过酶解工艺从蛋白质序列中释放出来，发挥多种生物功能或生理效应。近年来，关于从不同食源性蛋白中寻找具有调节骨密度活性的蛋白水解物研究逐渐受到关注。黄瓜籽多肽、狭鳕鱼皮胶原多肽、罗非鱼鱼鳞胶原蛋白多肽等物质均被报道有较好的调节骨密度活性。但由于技术的限制以及工艺成本高等因素，限制了其进行工业化生产和利用。因此，开发一种提取工艺简便，且具有潜在调节骨密度生物活性多肽对于骨质疏松保健食品和药品的开发具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于解决海参酶解物溶解性差难以开发功能食品的问题，以促进MC3T3-E1细胞增殖分化，调节骨密度或预防骨质疏松。
为了实现上述目的，本发明提供一种海参蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、海参均质：将海参按照终浓度8～10％加水均质，得到海参均质液；
S2、酶解：将步骤S1中所述海参均质液调pH值至6.5～7.5，按照0.3～0.5％比例加入中性蛋白酶，搅拌均匀，酶解至水解度38～42％，再升温至80～100℃灭酶10-15min，冷却至室温后，在4500～5500rpm转速下离心取上清液，得到海参蛋白酶解液；
S3、粗分离制备：将步骤S2中所述海参蛋白酶解液进行渗透脱盐除杂处理，待灰分全部除去以后，得到粗分离的海参蛋白酶解液；
S4、精细分离制备：根据酶解物极性大小的不同，将一部分步骤S3中所述粗分离的海参蛋白酶解液过滤除去不溶物，得到水溶海参酶解液；另一部分冷冻干燥后，按1：8～12(g:V)的比例溶解到70～80％的乙醇中，在4500～5500rpm转速下离心取上清液得到醇溶海参酶解液；
S5、冷冻干燥：将步骤S4中所述水溶海参酶解液和所述醇溶海参酶解液进行冷冻干燥，得到海参蛋白肽。
优选方式下，所述海参蛋白肽分子量分布于500～5000Da之间，含氮量为75～85％。
优选方式下，步骤S3中所述渗透脱盐除杂的方法包括将所述海参蛋白酶解液倒入300～500Da透析袋中，于4℃去离子水中，透析40～50h。
优选方式下，步骤S4中所述过滤除去不溶物的方法包括将所述海参蛋白酶解液通过0.20～0.22μM的滤膜进行过滤。
一种权利要求1所述海参蛋白肽的应用，用于MC3T3-E1细胞增殖。
进一步的，用于骨密度调节和预防骨质疏松。
与现有技术相比，本发明有如下优点和有益效果：
1、本发明以海参为原料开发了两种具有促进MC3T3-E1细胞增殖分化的活性酶解物，目前并未见相关专利文献报道，本发明拓展了海洋生物在开发预防或治疗骨质疏松保健品和药品的开发中的用途。
2、本发明与现有技术相比，本发明获得蛋白肽的方法更为简单，且获得的酶解物拥有较强的骨密度调节活性。
3、本发明通过实验发现海参酶解物在较低剂量下显示较高的促进MC3T3-E1细胞增殖分化活性，即低剂量高效果；在100μg/mL浓度下海参水溶酶解物和醇溶酶解物对细胞增殖活性分别提高了23％和20％。且以海参生物为原材料，安全性高。
4、本技术首次采用膜过滤和醇溶提取的方法开发了两种海参活性酶解物的提取工艺，且骨密度调节活性效果相当，具有方法可选择性。
5、本技术采用海参为原料开发以生物活性肽为主的酶解物，原料丰富，来源广泛，制备功工艺流程简便，可满足大规模工业化生产。对于海参生物活性肽在功能性食品、保健食品或者药品中的开发利用具有重要的意义。
附图说明
图1是海参水溶酶解物和海参醇溶酶解物对MC3T3-E1细胞的增殖24h后情况影响图；
图2是海参水溶酶解物和海参醇溶酶解物对MC3T3-E1细胞的增殖48h后情况影响图；
图3是海参水溶酶解物和海参醇溶酶解物对MC3T3-E1细胞的增殖72h后情况影响图；
图4是不同浓度海参水溶酶解物对MC3T3-E1细胞的中碱性磷酸酶(ALP)活性影响图；
图5是不同浓度海参水溶酶解物对MC3T3-E1细胞矿化拍摄结果图；
图6是显微镜下观察不同浓度海参水溶酶解物对MC3T3-E1的细胞矿化情况图；
图7是不同浓度海参水溶酶解物对MC3T3-E1细胞分裂周期分布比例图。
具体实施方式
本发明下面结合细胞实验数据结果对本发明进行阐述，实施例中使用的试剂，如无特殊说明，均为常规市售产品或按常规方法配制的试剂，实施例中方法如无特殊说明，均为常规实验方法。
具有骨密度调节活性的海参蛋白肽的制备：
(1)海参均质：将洗净后的海参置于高压均质机中，按照终浓度8％～10％加入适量的水进行均质，得到海参均质液。
(2)酶解：将步骤(1)所得海参均质液调pH值至6.5-7.5，按照0.3～0.5％比例加入中性蛋白酶，搅拌均匀，酶解2～3h(水解度达到38-42％)，然后升温至80～100℃灭酶10-15min，冷却至室温后，通过4500～5500rpm进行离心分离取上清液，得到海参蛋白酶解液。
(3)粗分离制备：将步骤(2)得到的海参蛋白酶解液倒入300～500Da透析袋中，至于3～6℃去离子水中进行渗透脱盐除杂处理，透析40-50h，待灰分全部除去以后，得到粗分离的海参蛋白酶解液。
(4)精细分离制备：根据酶解物极性大小的不同，将极性大的所述海参蛋白酶解液进行滤膜过滤(大小为0.20～0.22μM)，除去不溶物，得到水溶海参酶解液；极性小的部分冷冻干燥后醇溶，即将步骤(3)中粗分离的部分海参蛋白酶解液进行冷冻干燥至水分含量占0～6％(冻干条件：冷阱温度-60～-70℃，真空度0.5～1.5Pa)，将得到的该部分酶解物按质量体积比1：8～12(g:V)的比例溶解到70～80％的乙醇中，经过4500～5500rpm离心取上清液得到醇溶海参酶解液。
(5)冷冻干燥(喷雾干燥)：将步骤(4)得到的水溶海参酶解液和醇溶海参酶解液进行冷冻干燥(喷雾干燥)处理，得到水溶海参酶解物和醇溶海参酶解物，即海参蛋白肽。
(6)两种海参酶解物分子量分布均于500～5000Da之间，且含氮量为75～85％。
实施例1
一、使用中性蛋白酶酶解制备具有骨密度调节活性的海参蛋白肽的方法按以下步骤实现：
(1)海参均质：选用洗净后的刺参置于高压均质机中，按照终浓度8％加入适量的水进行均质，得到海参均质液。
酶解过程酶制剂：蛋白酶(枯草芽胞杆菌)，采用丹麦诺维信(中国)生物技术有限公司生产的产品；酶解条件：温度50℃，pH 6.8，加酶量0.3％，反应时间2h，得到枯草芽孢杆菌蛋白酶。
(2)酶解：将步骤(1)所得海参均质液调pH值至6.5，按照0.3％比例加入适量枯草芽孢杆菌蛋白酶，搅拌均匀，酶解2h，然后升温至80℃灭酶10min，冷却至室温后，通过4500rpm进行离心分离，得到海参蛋白酶解液。
(3)粗分离制备：将步骤(2)得到的海参蛋白酶解液倒入500Da透析袋中，至于4℃去离子水中进行渗透脱盐除杂处理，透析40h后得到粗分离的海参蛋白酶解液。
(4)精细分离制备：根据酶解物极性大小的不同，将一部分步骤(3)中粗分离的海参蛋白酶解液进行膜过滤(大小为0.22μM)，除去不溶物，得到水溶海参酶解液；另一部分冷冻干燥后醇溶，即将步骤(3)中粗分离的部分海参蛋白酶解液进行冷冻干燥，将得到的该部分酶解物按1：12(g:V)的比例溶解到70～80％的乙醇中，经过4500rpm离心得到醇溶海参酶解液。
(5)冷冻干燥(喷雾干燥)：将步骤(4)得到的水溶海参酶解液和醇溶海参酶解液进行冷冻干燥(喷雾干燥)处理，得到水溶海参酶解物和醇溶海参酶解物。
(6)海参水溶海参酶解物和醇溶海参酶解物分子量分布均于500～5000Da之间，含氮量分别为81.32％和79.01％。
二：海参蛋白肽调节骨密度活性评价
通过测定海参酶解物对MC3T3-E1细胞增殖水平、分化(骨生成相关标记物ALP)、矿化以及对细胞分裂周期分布情况的影响来评价海参酶解物的骨密度调节活性。
1、MC3T3-E1细胞的培养及促增殖活性的测定
(1)将MC3T3-E1细胞接种在含10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素(100U/mL)和链霉素(100mg/mL)的混合抗生素的α-MEM培养基中，在37℃、5％的CO2和95％空气的潮湿环境中培养；
(2)采用MTT法测海参肽对MC3T3-E1细胞增殖情况的影响。将培养后的MC3T3-E1细胞以5×103个/孔接板于96孔板中，培养24h后，吸走培养基，样品组分别加入不同浓度的两种海参酶解物，空白组更换培养基，继续培养24h。培养完成后，每孔加入10μL、5mg/mL的MTT试剂，继续培养4h后。培养结束后，除去培养基，加入150μL的DMSO，在暗处充分震荡10min后，在490nm下测定吸光值。
根据公式：细胞增殖率(％)＝样品组/空白组×100％，计算细胞增殖比率。
2、海参水溶酶解物对MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性及周期分布的影响
将培养好的MC3T3-E1细胞以1×105个/孔接板于6孔板中，培养24h后，每孔加入不同浓度的水溶酶解物(1，10，100μg/mL)，继续培养72h，收集培养基，根据碱性磷酸酶活性测定试剂盒的方法测定ALP活性；而细胞收集后使用4℃下预冷的70％乙醇进行固定过夜，之后按照细胞周期测定试剂盒，通过流式细胞仪对细胞周期分布情况进行测定。
3、海参水溶酶解物对MC3T3-E1细胞矿化情况的影响
将培养好的MC3T3-E1细胞以5×104个/孔接板于12孔板中，培养24h后，每孔加入不同浓度的水溶酶解物(1，10，100μg/mL)，空白组更换培养基，连续培养21天，(每隔一天更换一次干预样品，空白组更换培养基)。根据茜素红(Alizarinred staining)染色剂说明书方法分别在培养第7，14和21天进行细胞矿化情况的测定。
4、实验结果
4.1两种海参酶解物对MC3T3-E1细胞均有一定增殖活性
如图1-3所示，在10μg/mL和100μg/mL海参肽干预下，培养24h后，MC3T3-E1细胞有明显的增殖活性，与空白组相比有显著性差异(p<0.05)。随时培养时间的增加，其增殖率逐渐升高，当培养至48h时，两种海参肽均显示出较强的促增殖活性，与空白组相比均有显著性差异(p<0.05)。而当培养时间达到72h时，细胞增殖率相较于48h来说略微减弱，这可能是因为细胞密度较大，部分发生了接触抑制，但该增殖活性与空白组相比仍有显著性差异(p<0.05)，与空白组相比，海参水溶酶解物和醇溶酶解物在100μg/mL浓度干预下细胞的增殖活性分别提高了25.23％和20.18％。
4.2海参水溶酶解物能提高MC3T3-E1细胞中ALP的活性
如图4所示，在用不同浓度的海参肽干预MC3T3-E1细胞72h后，MC3T3-E1细胞早期成骨分化的表型标志物ALP的活性显著增强，与空白组相比有一定的统计学差异(p<0.05)，且呈现一定的剂量依赖性，其中100μg/mL浓度下ALP活性提高了23.81％。说明经过海参肽干预诱导后，海参肽可以促进MC3T3-E1细胞向成骨相比分化。
4.3海参水溶酶解物可以促进MC3T3-E1矿化
通过茜素红与成骨细胞表明沉积的钙离子进行螯合得到深红色复合物的水平，来评价海参肽促进MC3T3-E1矿化的能力。结果如图5-6所示，当用不同浓度的海参肽干预时，MC3T3-E1细胞中逐渐形成矿化结节，且呈现一定的剂量和时间依赖性。当100μg/mL海参肽干预21天后，经过茜素红染色的MC3T3-E1细胞中出现明显的深红色复合物，即细胞明显的矿化，说明海参肽能明显促进MC3T3-E1细胞的矿化。
4.4海参水溶酶解物可促进MC3T3-E1细胞由G0/G1期向G2/M期分裂
图7为1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL海参水溶酶解物处理后的细胞周期分布比例图，不同浓度的海参肽干预MC3T3-E1细胞72h后，与空白组相比，样品干预组的细胞分裂周期中G0/G1期显著减少，而G2/M期细胞比例显著增加。其中当海参肽浓度为100μg/mL时，MC3T3-E1细胞处于G0/G1期的细胞由67％降低至61％，而G2/M期细胞比例由14％升高至20％，说明海参肽可以调控细胞周期分布，促进MC3T3-E1细胞由G0/G1期向G2/M期分裂，进而促进其增殖。
综上所述两种海参酶解物均能促进MC3T3-E1细胞的增殖分化，有一定的骨密度调节活性。两种海参酶解物均可应用于开发骨密度调节或预防骨质疏松等疾病相关的保健食品和药品中。该发明开拓了海参酶解物的用途，为海参活性肽在功能性食品领域的应用等奠定了一定的基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，对其等效的各种改动、修改和修饰以及根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种海参蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、海参均质：将海参按照终浓度8～10％加水均质，得到海参均质液；
S2、酶解：将步骤S1中所述海参均质液调pH值至6.5～7.5，按照0.3～0.5％比例加入中性蛋白酶，搅拌均匀，酶解至水解度38～42％，再升温至80～100℃灭酶10-15min，冷却至室温后，在4500～5500rpm转速下离心取上清液，得到海参蛋白酶解液；
S3、粗分离制备：将步骤S2中所述海参蛋白酶解液进行渗透脱盐除杂处理，待灰分全部除去以后，得到粗分离的海参蛋白酶解液；
S4、精细分离制备：将步骤S3中所述粗分离的海参蛋白酶解液极性大的部分过滤除去不溶物，得到水溶海参酶解液；极性小的部分冷冻干燥后，按质量体积比1：8～12的比例溶解到70～80％的乙醇中，在4500～5500rpm转速下离心取上清液得到醇溶海参酶解液；
S5、冷冻干燥：将步骤S4中所述水溶海参酶解液和所述醇溶海参酶解液进行冷冻干燥至水分含量为0～6％，得到海参蛋白肽。
2.根据权利要求1所述海参蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述海参蛋白肽分子量分布于500～5000Da之间，含氮量为75～85％。
3.根据权利要求1所述海参蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述渗透脱盐除杂的方法包括将所述海参蛋白酶解液倒入300～500Da透析袋中，于3～6℃去离子水中，透析40～50h。
4.根据权利要求1所述海参蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述过滤除去不溶物的方法包括将所述海参蛋白酶解液通过0.20～0.22μM的滤膜进行过滤。
5.一种权利要求1所述海参蛋白肽的应用，其特征在于，用于MC3T3-E1细胞增殖。
6.根据权利要求5所述海参蛋白肽的应用，其特征在于，用于骨密度调节。
7.根据权利要求6所述海参蛋白肽的应用，其特征在于，用于预防骨质疏松。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114522183A (zh) * 2022-01-24 2022-05-24 江南大学 一种增加骨密度的海参提取物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514354A (zh) * 2009-02-25 2009-08-26 山东大学 一种海参多肽及其制备方法与应用
CN105132498A (zh) * 2015-07-30 2015-12-09 北京天肽生物科技有限公司 一种小分子海参肽及其制备方法
CN108660177A (zh) * 2018-04-03 2018-10-16 金华市艾力生物科技有限公司 一种海参多肽
CN109757601A (zh) * 2019-03-14 2019-05-17 舜甫科技(固安)有限公司 一种海参肽及其生产方法
CN111235205A (zh) * 2020-03-26 2020-06-05 琛蓝(美国)营养制品股份有限公司 一种海参蛋白肽的制备方法与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514354A (zh) * 2009-02-25 2009-08-26 山东大学 一种海参多肽及其制备方法与应用
CN105132498A (zh) * 2015-07-30 2015-12-09 北京天肽生物科技有限公司 一种小分子海参肽及其制备方法
CN108660177A (zh) * 2018-04-03 2018-10-16 金华市艾力生物科技有限公司 一种海参多肽
CN109757601A (zh) * 2019-03-14 2019-05-17 舜甫科技(固安)有限公司 一种海参肽及其生产方法
CN111235205A (zh) * 2020-03-26 2020-06-05 琛蓝(美国)营养制品股份有限公司 一种海参蛋白肽的制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEILIAN YANG等: "Characterizations and the Mechanism Underlying Osteogenic Activity of Peptides from Enzymatic Hydrolysates of Stichopus japonicus" *
MEILIAN YANG等: "Characterizations and the Mechanism Underlying Osteogenic Activity of Peptides from Enzymatic Hydrolysates of Stichopus japonicus." *
YANJIE WANG等: "Stichopus japonicus Polysaccharide stimulates Osteoblast differentiation through activation of the bone morphogenetic protein pathway in MC3T3-E1 cells." *
苏永昌;刘淑集;吴成业;: "海参多肽的制备工艺优化及其抗氧化测定" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114522183A (zh) * 2022-01-24 2022-05-24 江南大学 一种增加骨密度的海参提取物
CN114522183B (zh) * 2022-01-24 2024-08-27 江南大学 一种增加骨密度的海参提取物

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